“NANOSISTEMES PER DIAGNÒSTIC, UNA PORTA CAP AL FUTUR

“NANOSISTEMES PER DIAGNÒSTIC, UNA PORTA CAP AL FUTUR”
APLICACIONS EN LA DETECCIÓ DE MARCADORS MOLECULARS
Jornada sobre aplicaciones industriales de la nanotecnología
Nodus Barberà, Barcelona, 27 de noviembre de 2007
™ Overview sobre AROMICS
™ Nanodiagnóstico
o Diagnóstico in vitro
o Diagnóstico por imagen
o “Theranostica”
™ Limitaciones
™ Oportunidades para las empresas
¿Quiénes somos?
• Empresa biotecnológica
biotecnología definida como la aplicación de
los conocimientos biológicos en procesos
tecnológicos e industriales
Biotecnología roja: biotecnología aplicada al
sector sanitario.
Dedicada a…
Pharmacology
Molecular
Biology
Biochemistry
Proteomics
Genomics
Biomarcadores
Cell
biology
Pharmacogenetics
In vivo
studies
Drug
Screening
Engineering
•La aplicación de distintas disciplinas en el proceso de
investigación y desarrollo de fármacos
•permite, la identificación,
biomarcadores
selección
y
validación
de
Aplicabilidad de los BIOMARCADORES
Diagnóstico: integrar estos biomarcadores en el diseño y desarrollo de
métodos de diagnóstico que ayuden a:
ƒEntender las bases moleculares de la enfermedad
ƒDetección precoz y prevención de la enfermedad
ƒPredecir respuesta a terapia
ƒMonitorear incio y progresión de la enfermedad
ƒPromover la medicina personalizada (incluyendo
variabilidad interindividual) y prescribir medicación
“Objetivo”: diagnóstico más concreto y fiable”
la
Terapéutica: ofrecer una nueva aproximación a:
•Identificación de nuevas dianas terapéuticas
•Desarrollar fármacos más eficaces (cómo funcionan y cuándo
dejan de funcionar) y seguros (toxicidad, efectos adversos)
•Incrementar el éxito clínico (identificación de marcadores de
respuesta)
“Objetivo”: terapias más efectivas y con menos efectos secundarios
ENFERMEDADES:
Cáncer,
neurodegenerativas,
infecciosas y enfermedades asociadas a dolor crónico
enfermedades
Objetivo
Desarrollar una cartera de
productos propios, con un
clara
“orientación
a
pacientes”
desde
prevención a diagnóstico
con énfasis particular en
el
tratamiento
individualizado y efectivo,
promoviendo la medicina
traslacional (aplicación de
los
conocimientos
en
biología al manejo de la
enfermedad
y
el
tratamiento “from bench
to bed”)
I+D
PRODUCTOS
Área diagnóstico
Área terapéutica
BIOTECNOLOGIA /
NANOTECNOLOGÍA
Aplicaciones de la nanotecnología en diagnóstico
Nanodiagnóstico
Diagnóstico
In Vitro
(ex-vivo)
Diagnóstico
In Vivo
Diagnóstico
por imagen
Teranóstica
Aplicaciones de la nanotecnología en diagnóstico
1. Nanotechnology-based Diagnostics
a) Diagnóstico in-vitro:
o I:
Nanopartículas acopladas a biosensores capaces de
detectar ciertas moléculas
o II: Nanocristales de material semiconductor “Quantum
Dots”: Dispositivos capaces de realizar múltiples análisis a
escala subcelular
o III: Nanodispositivos: dispositivos nanométricos para
detectar biomarcadores
Un biosensor es un dispositivo analítico que utiliza las interacciones específica
entre el analito de interés y el elmento de reconocimiento para proporcionar
resultados cualitativos ó cuantitativos.
Consecuencia de esta unión se produce la variación de una o varias propiedades
físico-químicas (como pueden ser el pH, transferencia de calor, cambio de
potencial, de masa, variación de las propiedades ópticas, etc.) que detecta el
transductor.
I: Nanopartículas acopladas a biosensores
Tipo de nanopartículas
•Liposomas
•Emulsiones
•Polimeros
•Nanopartículas cerámicas
•Partículas metalicas
•Gold shell nanoparticles
•Nanoparticulas basadas en carbono
•Fulerenos
•Nanotubos (SWNCT and MWNCT)
•Dendrimers
•Quantum Dots
La forma y el tamaño de estas nanopartículas les confieren
características físicas específicas (magnéticas, ópticas, térmicas, …)
Estas propiedades son pues moldeables en función del tamaño y la forma
La funcionalización de superficies permite reconocer analitos específicos
Nanopartículas acopladas a
biosensores
Magnetic Nanoparticles
Nanopartículas magnéticas funcionalizadas con elementos de
reconocimiento específicos (anticuerpos, secuencias de ADN,…) para
biosensorización magnética
En esta aproximación, el “label” clásico (p.ej fluorescente) se
reemplaza con una partícula superparamagnetica, que puede ser
detectada mediante sensores magneto-resistivos.
Ventajas: mayor sensibilidad, habilidad de manipular estas partículas
controlando las fuerzas magnéticas (transportarlas hacia una
localización específica en un chip), capacidad de utilizarse en
immunoseparaciones de biomoléculas
Mercado Global para Magnetic nanoparticles: 750 millones $ para
2012 (250 millones en 2008)
Inorganic Nanoparticles: Gold
Gold nanoparticles presentan características ideales para
aplicaciones diagnósticas:
o Aumento sensibilidad en varios ordenes de magnitud: luz
dispersada de una nanopartícula equivale a luz emitida por
5x105 (500,000) fluorophores.
o Tests que usan partículas de oro funcionalizadas con
anticuerpos, son 2-3 veces más sensibles que métodos ELISA
o Mayor especificidad para detección de acidos nucleicos y
proteina.
o Poco ruido de fondo, aumento de señal: unión inespecífica a la
partícula de oro es mínima
o Partículas estables en el tiempo
Ejemplo: Verigen®, Nanosphere Inc. : “Detection
of DNA or RNA targets using gold nanoparticles”
Verigen: Uses of gold nanoparticles in array formats
SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold
nanoparticle probes
•Genomic DNA is fragmented and hybridized to a microarray containing
allele-specific capture probes
•After a wash step, a second hybridization step designed to attach
oligonucleotide-modified gold nanoparticle probes to the capture targets
•It forms a “sandwich” beteween immobilized capture probes and gold
nanoparticle probes
•A silver development step is used to precipitate silver around the gold
nanoparticle (improve scatter light)
•Detection Light from LED (630 nm). The evanescent wave (SPR effect)
excite the silver-amplified gold nanoparticle. A Photosensor captures the
image
Nanosphere Inc., Nucleic Acid Res 2005
Lateral Flow : Uses of gold in POC testing
Durante los ultimos cinco años, se han
utilizado partículas de oro en sensore
tipo lateral flow,
Aplicación: POC tests para:
•Biomedical application
•Food manufacturing
•Quality control Tests
•Veterinary practice
•Environment monitoring
Tradicionalmente se utilizaba Dyed Latex. Actualmente es substituido por
nanopartículas Oro
Ventajas:
•Tamaño (5-200 nm), permite pasar a través de membrana nitrocelulosa
de 8-10 µm
•Mayor cantidad de partículas (packing) que ayuda a visualización
•Buena calidad: monodispersas, esféricas, estables
•Fácil funcionalización con biomoléculas específicas
Ejemplos: Phadia AB (Sweden) y Merck KgGA (GE), POC testing para
patógenos en sector alimentación y medioambiente
Láser
SERS signal
SERS-tag metal nanoparticle
Functionalized with reporter
And antibodies
Biomarker (Troponin, CKMB,…)
Immobilized capture antibody
SERS benefits : high specificity, attomole to high zeptomole mass sensitivity ultra
low concentrations sensitivity and interfacial generality
Future trends: alternatives to spheres: triangles, rods…)
Oxonica Inc.
Sistemas híbridos
La proteína de interés se captura por hibridación
simultanea a:
•MP funcionalizadas con anticuerpos primarios contra
la proteína de interes
•Gold nanoparticles, funcionalizadas con anticuerpos
secundarios contra la misma proteína
El resultado es un complejo, donde la proteína de interés
está entre la partícula magnetica y la partícula de oro.
Ejemplo: Ultrasensitive protein detection (Nanosphere Inc)
Ej:Ultrasensitive protein detection
Antibody-coated
Gold Ps (10-30nm)
Antibodycoated MPs
Supernatant
Washing
Protein
Incubation
Separation
Resuspend
Release
Sequence-specific
DNA detection array
VERIGENE® system
Tª
Bar-code DNA dehybridization
Detection
(Nanosphere Inc)
Nanopartículas: “Nanoshells”
•Nanoshells son pequeñas partículas
(dielectric core, silicon)
recubiertas de metal (generalmente oro).
•Las propiedades ópticas de estas
partículas dependen del tamaño del core
y del grosor de las distintas capas
metálicas.(http://www.nanospectra.com/physics/physic
s.asp).
•Nanoshells funcionalizadas con proteínas
específicas permitirían seleccionar distintos
tipos de células.
•Penetran en los tejidos hasta algunos
centímetros de profundidad
• Las más utilizadas, nanoshells que absorben
en la luz IR cercana (NIR). La absorción de la
luz por estas nanoshells calienta las células,
hasta matarlas. (L. R. Hirsch, et al, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 2003,100, 13549-554)
Nanocristales de material
semiconductor
II: Quantum Dots
•QDs son nanonocristales semiconductores que
fluorecen cuando se les expone a la luz
•Las
propiedades
ópticas,
electrónicas,
magnéticas o incluso químicas dependen de su
tamaño
(típicamente
<10nm),
forma
y
propiedades intrínsecas.
•Unidos a un anticuerpo o una biomolécula de
interés, actúan como fuente de luz y permiten
detectar un analito concreto
•Presentan ventajas claras respecto otros fluoróforos: tunable,
photostability, high signal to noise ratio, brightness, narrow
emission, sensitive and precise, easilly excitable.
•Los quantum dots pueden combinarse según su tamaño para
poder detectar varias moléculas simultáneamente
II: Quantum Dots
Aplicaciones
•Life-sciences: Western Blot, Citometría de flujo, Uptake
celular, FRET, Microarrays de ADN/ARN, Immunoensayos, etc.
•Medical Imaging and Disease detection
•QD LEDS: unexpensive, industrial white light (intermixing red,
green and blue dots). Improvement over traditional phosphorLED
•Solar cells and photovoltaics (aumenta eficiencia en la
producción electricidad (60% versus 33%) con menor
superficie)
•Trazabilidad: caracteristicas de absorcion/emision
El mercado global para QDs en 2005 fue de 13 millones $.
Se espera alcanzar hasta 37.2 millones $ para 2009.
Examples of companies commercialising nanomaterials
for biomedical applications
COMPANY
MAJOR AREA OF ACTIVITY
TECHNOLOGY
Membrane Filtration
Nanoporous ceramic materials
for endotoxin filtration, DNA
and protein separation
MRI
Nanomagnetic/carbon
composites materials to shield
medical devices from RF fields
Luminiscent biomarkers
Semiconductor QDs with amine
or carboxyl groups on the
surface
Immunicon
Separation of cell types
Magnetic particles sourrounded
by a polymeric layer coated with
antibodies for capturing cells
Nanoplex technologies Inc
Nanobarcodes for bioanalysis
Nanoprobes Inc
Gold nanoparticles for biological
markers
Gold nanoparticles bioconjugates for TEM and
fluorescent microscopy
Nanosphere Inc
Gold biomarkers
DNA barcode attached to each
nanoprobe for identification
purposes
QuantumDot Corporation
Luminiscent Biomarkers
Bioconjugated semiconductor
quantum dots
Argonide
Biophan Technologies, INC
Evident Technologies
Nanodispositivos
Los dispositivos de escala nanométrica se basan en muchas de las
técnicas estándar empleadas para los circuitos electrónicos
integrados
Nanoestructuras
(litografia)
Los sistemas más sofisticados son
los llamados lab-on-a-chip que
integran:
Microfluidica + superficie sensora +
transductor de señal
Revestimiento
con
biomoléculas
III. Nanodispositivos : “nanocantilevers”
Son pequeñas estructuras de distintas formas
(cuadradas, rectangulares, triangulares, …)
formadas generalmente por silicio.
•Cuando el analito a detectar se une a la
superficie del nanocantilever,
se
producen
cambios
en
la
tensión
superficial y el nanocantilever se dobla
(estructuras resonantes).
•Monitoreando estos cambios, podemos
cuantificar
el
número
de
moléculas/analito
presentes
en
la
muestra
•Como tienen una medida tan pequeña, tienen una gran resolución en
un rango muy pequeño: permiten detectar cantidades muy pequeñas
del analito
III. Nanodispositivos: “Nanoporos”
•Los nanoporos poseen un diamétro entre 10 y 20 nm y unos cientos
nanometros de longitud.
•Fabricados a base de Silicio, estos nanoporos permiten el paso de una
sola hebra de ADN.
•Al pasar el ADN a través del poro, se puede monitorear la forma y
las propiedades electricas de cada base nucleotídica de la hebra,
pudiéndose detectar con rapidez y eficacia las secuencias de ADN
1. Nanotechnology-based Diagnostics
a) Diagnóstico in-vitro. Aumentar la eficiencia y precisión del
diagnóstico a partir de muestras de fluidos corporales o de
tejidos mediante:
-Nanodispositivos capaces de detectar ciertas moléculas
-Múltiples análisis a escala subcelular
b) Diagnóstico in-vivo.
Dispositivos que penetren en el cuerpo humano para identificar una
enfermedad. Impulsar el diagnóstico molecular
-Identificar y cuantificar moléculas, células cancerígenas, etc.
-Técnicas in-vivo no invasivas de elevada sensibilidad y
fiabilidad. Mejora diagnóstico por imagen.
- Validación para uso clínico.
La nanotecnología ha impulsado un nuevo avance para las técnicas de
diagnóstico por imagen:
-desarrollando nuevas técnicas
-mejorando las esistentes aumentando la resolución y sensibilidad. De
hecho las nanopartículas estan siendo utilizadas como trazadores y
agentes de contraste
Algunas partículas utilizadas:
•Quantum dots
•Nanopartículas magnéticas
•Estructuras derivadas de carbono: Nanotubos, Dendrímeros
Actualmente la mayoría están en estudio. Entre las enfermedades target
se encuentra el cáncer y enfermedades cardiovasculares
Principales técnicas de imagen
• Técnicas ópticas, espectroscopía y fluorescencia:
Algunos ejemplos de estas técnicas son:
•la microscopía confocal
•microscopias de fluorescencia
QDs applications
•FRET (fluorescence resonance energy transfer)
•TIRF (total internal reflection)
•NIRF (near infrared fluorescence).
Aplicaciones: Investigación biomédica (expresión de genes relevantes en
ciertas patologías)
In vivo Imaging : QDs
Target: tumores de próstata (marcador: PSMA)
In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots
Gao X, et al. Nature Biotechnology 2004, 22 (8):969-976
C
D
Imagen del QD-PMSA conjugados
animales que presentan el tumor
Alta especificidad
(C=control, D= disease)
Mayor sensibilidad comparado con
fluoróforos comunes
en
Ensayos multiplex
In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots
Gao X, et al. Nature Biotechnology 2004, 22 (8):969-976
• Técnicas de imagen nuclear:
Las técnicas de imagen nuclear son métodos no invasivos
Detectan y analizan la distribución de un radioisótopo en el cuerpo
humano.
La Tomografía por Emisión Positrones PET, es capaz de medir actividad
metabólica en distintos tejidos del cuerpo humano.
Aplicación en oncología, cardiología y neurología.
Ejemplo: SWNT-RGD
In vivo imaging: SWNT-targeted molecules
•Single walled carbon nanotubes exhiben una propiedades físicas
estructurales, mecánicas, eléctricas y ópticas
•Los SWNT pueden solubilizarse añadiendo grupos PEG
SWNT-PEG (AFM picture)
SWNT-PEG (Estable en suero, PBS)
SWNT atraviesan la membrana celular via endocitosis
Aplicación:
•Diagnóstico imagen
•Delivery de proteinas, plasmidos, RNAi
SWNT solubles funcionalizados con PEG, marcados con Cu, y
funcionalizados con péptido RGD
Dimensiones:
Diámetro 1-5 nm
Longitud: 100nm
Targeting: RGD se une a αvβ3 integrin (receptores de membrana)
0,5 h
6h
24 h
MicroPet Images. Las flechas
marcan el tumor (glioblastoma).
La radiación persiste por
encima de las 24h.
Future trends: “Theranostics”
Utilizar la propiedad de SWNT de absorber en NIR
Irradiando tumor con luz láser, se produce un “calentamiento local”
capaz de matar célula tumoral
Dr. Cheng , et al. Nature 2006
In vivo imaging: paramagnetic particles
• Resonancia magnética (MRI):
•Las imágenes por MRI se obtiene mediante la exposición del
organismo a un campo magnético generado por un electroimán
•Cada tejido produce una señal diferente
•Permite obtener información en tres dimensiones de la estructura
del organismo
Ej: Endothelial αvβ3 integrin-targeted fumagillin nanoparticles inhibit
angiogenesis in atheroesclerosis
Winter PM et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2006: 2013-2019
Contrast agents: Dendrimers
Agentes de contraste actuales (MRI, tomografías (CT), X-ray
imaging)
Problemas :
•Tiempo circulación torrente sanguíneo corto (t1/2 excreción = 60 min)
•Difunde rápidamente (tras 5 min 80% agentes de contraste
difundido)
•Rápida detección
•Necesitas altas concentraciones para determinadas imágenes
•A veces generan reacciones adversas
PAMAMs como agentes de contraste (muy prometedores)
Ventajas
•Se pueden funcionalizar fácilmente
•Se pueden utilizar par complejar diferentes iones metálicos (gold,
platinum, magnetic)
•“Stealh-like” propiedades
•Biocompatibles, biodegradables
•Preparación escalable, bajo coste
Aplicaciones de la nanotecnología en diagnóstico
1. Nanotechnology-based Diagnostics
a) Diagnóstico in-vitro. Aumentar la eficiencia y precisión del
diagnóstico a partir de muestras de fluidos corporales o de
tejidos mediante:
-Nanodispositivos capaces de detectar ciertas moléculas
-Múltiples análisis a escala subcelular
b) Diagnóstico in-vivo.
Dispositivos que penetren en el cuerpo humano para identificar una
enfermedad
-Identificar y cuantificar moléculas, células cancerígenas, etc.
-Técnicas in-vivo no invasivas de elevada sensibilidad y
fiabilidad. Mejora diagnóstico por imagen
- Validación para uso clínico.
2. Theranostics: “Therapy + Diagnostics”
Theranostics = “Terapia + diagnóstico”
El objetivo es crear un nanodispositivo que sea capaz de
detectar una célula/tejido específico, mejorar la imagen (y por
tanto el diagnóstico in vivo) de las células específicas, y
finalmente penetrar sólo en estas células y liberar un fármaco
(mejorando la eficacia del tratamiento)
Dendrimeros sirven como
“plataformas nanoescala”
para crear dispositivos
multifuncionales capaces
de
detectar
células
cancerosas
y
liberar
fármacos
•Folate receptor that bounds cancer cell
•Fluorescein label (indica la unión del dendrímero a la celula)
•MTX or PTX drugs (deliver eficaz, menor dosis
•Algunos de estos constructos basados en dendrimeros están
actualmente en fases clínicas para tratar una variedad de cánceres
Multi-functional particles
Silica-coated micelles containing LHRH as a targeting agent
Deliver iron oxide particles to LH-RH
receptor positive cancer cells
•They can be imaged using MRI
(enhanced sensitivity)
•Applying rapidly oscillating magnetic
field causes the entrapped Fe2O3
molecules to become hot, killing the
cells
En resumen…
o Mercado emergente
o Comercialización de productos están en estadio inicial
o Gran numero de iniciativas y movilización de fondos para nuevos
desarrollos
o Elevadas Inversiones públicas:
•Europa (31,5%)
•USA (37,2%)
•Japón (37,2%)
Oportunidad:
Representan una mejora en el diagnóstico y en la terapia
Problemas a resolver:
•Altos costes de produccion
•Dificultad escalado
•Toxicidad (AROMICS está desarrollando métodos toxicológicos)
•Inexistencia regulación específica
•Largo proceso de aprobación por agencias reguladores
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