Comparación de dos metodologías para la determinación de glifosato, glufosinato y AMPA mediante UHPLC-MS/MS. Demonte L., Repetti M.R., Michlig N., García S.R., De Jesús J.J., Beldomenico H.R. P R I N A R C Programa de Investigación y Análisis de Residuos y Contaminantes Químicos (PRINARC –FIQ-UNL) Laboratorio Central, Facultad de Ingeniería Química, Universidad Nacional del Litoral (FIQ-UNL) Santiago del Estero 2654, Piso 6, (3000) Santa Fe, Argentina. e-mail: [email protected] INTRODUCCIÓN “Glifosato” es un herbicida de amplio espectro, no selectivo, post emergente empleado a nivel mundial para el control de hojas y vegetación. Si bien es potencialmente menos tóxico y perjudicial para el medioambiente comparado con otros herbicidas, es necesaria su evaluación debido a su extensiva aplicación. Esto es especialmente relevante en nuestro país ya que es el agroquímico más extensamente utilizado (210 milliones kg-L en 2011), con un incremento constante en la última década. Sus posibles efectos, comportamiento y destino final en el medioambiente resultan controversiales, haciéndose necesario realizar estudios específicos y controles periódicos. Uno de los principales problemas debido a su carácter anfotérico, alta polaridad y bajo peso molecular, es el análisis a niveles de traza, ineludible para su determinación en muestras medioambientales (suelos y aguas). En este trabajo se describe el desarrollo de un método de cromatografía-espectrometría de masas (UHPLC-MS/MS) para la determinación de glifosato, AMPA y glufosinato en agua y sedimentos, con estudios de alternativas de derivatización con FMOC y etapa de preconcentración, y su aplicación a muestras regionales seleccionadas. ENFOQUES ANALÍTICOS LC – ESI – MS/MS MÉTODO DE ANÁLISIS Se evaluaron y validaron alternativas del método analítico basado en la derivatización con 9-fluorenilmetilcloroformato (FMOC-Cl). Durante la etapa de preparación de la muestra fueron optimizados: la cantidad de muestra y la relación muestra/solvente de extracción (para sedimentos); en la etapa de derivatización: reactivos empleados, tiempo de reacción, pH, mientras que en la etapa de limpieza se evaluaron las alternativas de SPE y partición líquido-líquido. COMPUESTO EXTRACCIÓN H2O (0.1 % ácido fórmico) Diclorometano Glifosato-FMOC ION MOLECULAR (m/z) 392.0 CONO (V) 20 AMPA-FMOC 334.0 20 Glufosinato-FMOC 404.0 30 GLI 2-C13 N15-FMOC 395.0 20 AMPA C13 N15-FMOC 336.0 20 ION HIJO (m/z) 88.1* 214.1 112.1 179.1* 136.1* 208.2 91.1* 217.1 114.1* 181.1 FILTRACIÓN 40 mL Isótopos marcadores -13C, 15N glifosato y AMPA Acidificación + HCl 6M (pH~1) + Agitar y esperar *ION DE CUANTIFICACIÓN Neutralización + KOH 6M (pH~7) Tabla 2. Parámetros de validación para 10 mL de muestra de agua, 3 g de muestra de suelo y limpieza SPE. RESULTADOS SUELO COMPUESTO RECUPERADO (%) GLIFOSATO 80-109 AMPA 76-97 GLUFOSINATO 112-127 Buffer borato 5% (pH~9) FMOC-Cl 12 mg/mL DERIVATIZACIÓN Durante la noche a temperatura ambiente Filtración 0.45 μm filtro de jeringa AGUA LOD (ng/g) RECUPERADO (%) 0.4 87-105 0.4 84-92 0.4 123-160 RSD (%) 11 15 22 GLIFOSATO Ácido fórmico (pH~3) y = 54,069x - 55,936 R² = 0,9995 y = 48,433x - 38,944 R² = 0,9992 MATRIZ - PARTICIÓN Área de analito SPE Oasis HLB 3cc 5000 ESTANDAR - SOLVENTE 4000 MATRIZ - SPE MATRIZ- PARTICIÓN 6000 ESTANDAR - SOLVENTE 5000 y = 44,714x + 143,88 R² = 0,9973 3000 2000 4000 18000 3000 LOD (ng/mL) 0.02 0.02 0.02 16000 ESTANDAR - SOLVENTE 14000 MATRIZ - SPE y = 125,72x + 150,72 R² = 0,9993 y = 150,38x - 25,824 R² = 1 y = 166,85x + 9,4325 R² = 0,9988 12000 10000 8000 6000 4000 1000 2000 0 0 0 0 20 40 60 80 100 0 120 20 40 Concentración de analito (ng/mL) -1000 LC – MS/MS MATRIZ - PARTICIÓN 2000 1000 Filtración 0.22 μm Filtro de jeringa 20000 y = 50,288x + 121,02 R² = 0,9973 y = 49,294x - 17,992 R² = 0,9999 y = 60,773x + 30,351 R² = 0,9995 MATRIZ - SPE RSD (%) 9 7 25 GLUFOSINATO AMPA 7000 6000 LIMPIEZA PARTICIÓN Diclorometano C. E. (V) 30 10 15 20 25 10 30 10 15 20 Área de analito 10 mL Área de analito 4 mL Función: MRM ESI+ Dwell time (seg): 0.01 Capilar (Kv): 2 Flujo gas de cono (L/h): 10 Temperatura de fuente (ºC): 145 Flujo gas de desolvatación (L/h): 400 Temperatura de desolvatación (ºC): 250 Software: MassLynx 4.1 Volumen de inyección: 10mL Columna: ACQUITY UPLC® HSS C18 1.8mm, 2.1x100 mm Temperatura de columna: 40ºC 3 g muestra CENTRIFUGACIÓN (capa superior) SISTEMA TQD Tabla 1. Parámetros MS/MS AGUA SUELOS Y SEDIMENTOS SISTEMA UHPLC Fase móvil A: Agua/Acetonitrilo 98:2 + 0.1% AF Fase móvil B: Acetonitrilo + 0.1% AF Flujo: 0.35 mL/min 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 Concentración de analito (ng/mL) Concentración de analito (ng/mL) Figura 2. Curvas de calibrado para 10 mL de muestra de agua, limpieza SPE y PARTICIÓN. Figura 1. Método de análisis. RESULTADOS 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 3.57 584 % 100 0 1.00 06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1) 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 3.07 256 % 100 0 1.00 06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1) 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 3.07 598 % 100 0 1.00 06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1) 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 3.25 251 % 100 0 1.00 06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1) 2.00 3.00 3.25 83 % 100 4.00 3.43 3 3.58 2 5.00 6.00 7.00 8.00 4.57 4.84 3 2 0 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 100 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 404 > 136.1 (GLUFOSINATE-FMOC) 1.54e4 Area 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 392 > 214.1 (GLYPHOSATE-FMOC) 5.93e3 Area 1.00 06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1) 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 392 > 88.1 (GLYPHOSATE-FMOC) 1.41e4 Area 1.00 06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1) 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 334 > 112.1 (AMPA-FMOC) 2.04e3 Area Time 9.00 10.00 3.00 4.00 3.55 183 2.42 4 0 1.00 06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1) 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 334 > 179.1 (AMPA-FMOC) 6.41e3 Area 2.00 2.00 3.00 3.84 5 5.00 7.00 8.00 1.3 ng/mL 4.20 6 4.00 6.00 5.00 6.00 7.00 8.00 3.55 524 100 0 2.00 3.00 3.05 223 100 0 100 0 2.00 4.00 6.00 7.00 8.00 0.7 ng/mL 3.50 6 3.00 2.00 100 3.00 2.67 6 0 1.00 06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1) 5.00 5.00 6.00 7.00 8.00 3.05 442 1.08 10 1.00 06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1) 4.00 2.00 3.24 218 3.00 4.00 3.32 8 3.75 4 6.00 7.00 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 404 > 136.1 (GLUFOSINATE-FMOC) 1.38e4 Area 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 392 > 214.1 (GLYPHOSATE-FMOC) 6.22e3 Area 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 392 > 88.1 (GLYPHOSATE-FMOC) 1.18e4 Area 8.00 0.3 ng/mL 4.56 9 4.00 3.24 151 100 5.00 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 404 > 208.2 (GLUFOSINATE-FMOC) 5.35e3 Area 5.00 6.00 7.00 8.00 4.57 19 0 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 334 > 179.1 (AMPA-FMOC) 5.63e3 Area 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 334 > 112.1 (AMPA-FMOC) 4.33e3 Area Time 9.00 10.00 SEDIMENTO % 0 1.00 06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1) MRM of 6 Channels ES+ TIC 1.24e6 Area 3.56 3.05 43668 6736 100 2.00 3.00 4.00 5.00 4.00 5.00 6.00 6.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 404 > 208.2 (GLUFOSINATE-FMOC) 2.85e5 Area 7.00 8.00 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 404 > 136.1 (GLUFOSINATE-FMOC) 9.58e5 Area 7.00 8.00 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 392 > 214.1 (GLYPHOSATE-FMOC) 5.23e4 Area 17.9 ng/g 3.56 9838 100 % % 0 1.00 06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1) 4.56 34 3.74 20 06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1) 0 1.00 06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1) 2.00 3.00 3.56 34209 100 % 2.00 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 404 > 208.2 (GLUFOSINATE-FMOC) 3.19e3 Area MRM of 6 Channels ES+ TIC 2.13e4 Area 0 1.00 06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1) 2.00 3.00 2.7 ng/g 3.05 2118 100 % 8.00 3.55 704 0 1.00 06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1) 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 392 > 88.1 (GLYPHOSATE-FMOC) 1.18e5 Area 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 334 > 179.1 (AMPA-FMOC) 7.95e4 Area 9.00 10.00 MRM of 6 Channels ES+ 334 > 112.1 (AMPA-FMOC) 4.05e4 Area Time 9.00 10.00 3.05 4576 100 % 7.00 % 6.00 % 5.00 3.56 118 0.95 4 1.00 06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1) 4.00 % 3.00 3.05 665 100 % % 0 2.00 06DIC12_33 Sm (Mn, 1x1) % % 0 1.00 06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1) MRM of 6 Channels ES+ TIC 2.14e4 Area 3.57 705 % 3.07 849 100 100 111A_V0.5 127A_V0.5 06DIC12_4 Sm (Mn, 1x1) 0 1.00 06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1) 2.00 3.00 3.24 3212 100 % STD_CONJ_FM 1.00 06DIC12_17 Sm (Mn, 1x1) 2.00 3.00 4.00 3.24 1643 100 2.00 3.00 5.00 6.00 7.00 8.00 5.00 6.00 7.00 8.00 4.57 46 0 1.00 1.5 ng/g 4.58 67 0 % Muestras ESTANDAR MIX AGUA SUPERFICIAL Para demostrar la utilidad de este ensayo en diferentes matrices de agua y suelo, se analizaron muestras de varios sitios. 1) Aguas superficiales: de los ríos locales que corren a través de las zonas agrícolas. 2) Aguas superficiales: de los canales locales con alto contenido de metales pesados. 3) Aguas superficiales: efluentes de lavado de silo-bolsa. 4) Suelo de la superficie agrícola de 1.5 y 4.5 m de profundidad. Figura 3. Ejemplos de TIC y MRM para solución estandar y 2 muestras. 5) Sedimentos de los ríos locales. 4.00 CONCLUSIONES La metodología evaluada permite determinar los residuos de glifosato, glufosinato y AMPA en muestras de agua y suelo con características diferentes. Las ventajas del uso de bajos volúmenes fueron significativos especialmente cuando fue introducido el paso de SPE, en términos de simplicidad, de limpieza de los extractos finales y de la posibilidad de una mayor concentración. A pesar de las diferencias entre los dos enfoques respecto a la capacidad de detección, los LOD conseguidos en los dos casos cumplen con la legislación vigente. REFERENCIAS Y AGRADECIMIENTOS [1] Arregui C., Beldomenico H.R., Cassano A., Collins P. et alter 17 authors (2011). “UNL Report on toxicity of glyphosate”. ISBN Nº 9876575066, http://www.unl.edu.ar/noticias/noticia.php?nid=7487 accessed April 2012. [2] PAITI Programa de Promoción y Apoyo a la Investigación en Temas de Interés (PAITI), Proyecto i+D.-2011. “Methodologies by UHPLC MSMS for the determination of glyphosate residues and applications to priority matrices of Santa Fe Province”. Resolución C.S. N° 563/11. [3] Hanke I., Singer H., Hollender J. (2008). Anal Bioanal Chem , 391, 2265–2276. [4] Ibañez M., Pozo O., Sancho J., López F., Hernández F. (2006). J. of Chrom. A, 1134, 51-55. UNL CAI+D-PAITI