dicarbonylés les plus abondants dans le vin par la réaction

RESOLUCIÓN OIV/OENO 386B/2010
MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE LOS COMPUESTOS α-DICARBONILICOS DEL
VINO POR CROMATOGRAFÍA EN FASE GASEOSA TRAS DERIVACIÓN CON 1,2DIAMINOBENCENO
LA ASAMBLEA GENERAL
Visto el artículo 2, apartado 2 iv, del Acuerdo del 3 de abril de 2001 relativo a la creación de
la Organización Internacional de la Viña y el Vino
A propuesta de la Subcomisión de Métodos de análisis,
DECIDE completar el Anexo A del Compendio Internacional de métodos de análisis con el
método de tipo IV siguiente:
MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE LOS COMPUESTOS α-DICARBONILICOS DEL
VINO POR CROMATOGRAFÍA EN FASE TRAS DERIVACIÓN CON 1,2-DIAMINOBENCENO
1. Introducción
Los principales compuestos α-dicarbonílicos del vino (Figura 1) son: glioxal, metilglioxal,
diacetilo y pentano-2,3-diona; sólo las α-dicetonas son suficientemente abundantes en el vino.
Los compuestos carbonílicos existen en todos los tipos de vinos y, en especial, después de la
fermentación maloláctica y en los vinos tintos. Además, los vinos blancos dulces producidos a
partir de uvas botritizadas pueden contener niveles elevados de glioxal y metilglioxal.
Glioxal: OCH−CHO (etanodial)
Metilglioxal: CH3−CO−CHO (2-oxopropanal)
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Diacetilo: CH3−CO−CO−CH3 (butano-2,3-diona)
Pentano-2,3-diona: CH3−CH2−CO−CO−CH3
Hexano-2,3-diona: CH3−CH2−CH2−CO−CO−CH3
Figura 1. Los principales compuestos α-dicarbonílicos del vino, (la hexano-2,3-diona no se
encuentra naturalmente presente en el vino pero se utiliza como patrón interno).
Los compuestos dicarbonílicos son importantes en el vino por diferentes razones: impacto
sensorial, reactividad con otros componentes del vino o posibles efectos microbiológicos.
2. Ámbito de aplicación
Este método se aplica a todo tipo de vinos (blancos, tintos, azucarados o fortificados), para
contenidos en derivados dicarbonílicos comprendidos entre 0,05 mg/L y 20 mg/L.
3. Principio
El método se basa en la formación de derivados de tipo quinoxalina a partir de compuestos αdicarbonílicos del vino con el 1,2-diaminobenceno (Figura 2).
R
NH2
O C
N
R
N
R
+
NH2
1,2-Diaminobenceno
O C
R
Dicarbonilo
Quinoxalina
Figura 2 Formación de los derivados.
La reacción tiene lugar directamente en el vino a pH 8 y tras un tiempo de reacción de 3 h a 60
°C. El análisis de los derivados se efectúa a continuación tras extracción de los derivados
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mediante el diclorometano y análisis por cromatografía en fase gaseosa con una detección por
espectrometría de masas (GC-MS) o por medio de un detector específico de compuestos
nitrogenados.
4. Reactivos y productos
4.1 Compuestos dicarbonílicos
4.1.1 Glioxal (n° CAS 107-22-3) en solución al 40 %
4.1.2 Metilglioxal (n° CAS 78-98-8) en solución al 40 %
4.1.3 Diacetilo (n° CAS 431-03-8) de pureza > 99 %
4.1.4 Pentano-2,3-diona (n° CAS 600-14-6) de pureza > 97 %
4.1.5 Hexano-2,3-diona (n° CAS 3848-24-6) de pureza > 90 %
4.2 1,2-Diaminobenceno (n° CAS 95-54-5) en forma de polvo, de pureza > 97 %
4.3 Agua para HPLC (por ejemplo microfiltrada y de una resistividad de 18,2 MΩ)
4.4 Etanol (n° CAS 64-17-5) puro para HPLC
4.5 Hidróxido de sodio (n° CAS 1310-73-2) en solución M.
4.6 Ácido sulfúrico (n° CAS 7664-93-9) en solución 2M
4.7 Diclorometano (n° CAS 75-09-2)
4.8 Sulfato de sodio anhidro (n° CAS 7757-82-6)
4.9 Solución hidroalcohólica al 50 % vol.
Mezcle 50 ml de etanol puro para HPLC (4.4) con 50 ml de agua (4.3)
4.10 Solución de patrón interno hexano-2,3-diona a 2,0 g/L
Coloque 40 mg de hexano-2,3-diona (4.2) en un frasco de 30 ml, diluya en 20 ml de
solución hidroalcohólica al 50 % vol (4.9) y agite hasta que se disuelva completamente.
4.11 Sulfato de sodio anhidro (n° CAS 7757-82-6)
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5. Instrumental
5.1 Cromatografía en fase gaseosa con detección por espectrometría de masas (GC-MS) o por
medio de un detector específico de compuestos nitrogenados.
5.1.1 Columna analítica capilar polietileno glicol medianamente polar (C 20M, BP21… ) con las
siguientes características (a título de ejemplo) 50 m x 0,32 mm x 0,25 µm.
5.1.2 Sistema de adquisición de datos.
5.2 Aparato de medición del pH
5.3 Agitador magnético
5.4 Balanza de precisión de 0,1 mg
5.5 Horno capaz de ser ajustado a 60 °C
5.6 Material de vidrio corriente de laboratorio, entre los cuales pipetas, frascos con tapón de rosca
y microjeringas.
6. Preparación de la muestra
No se requiere ninguna preparación específica
7. Método de trabajo
Colocar 50 ml de vino en un frasco (5.6)
Llevar a pH 8 mediante agitación, con hidróxido de sodio M (4.5)
Añadir 25 mg de 1,2-diaminobenceno (4.2)
Añadir 50 µl de hexano-2,3-diona (patrón interno) a 2,0 g/L (4.10)
Cerrar el frasco mediante un tapón de rosca provisto de una junta de cara teflonada
Agitar hasta que desaparezca completamente el reactivo (5.3)
Colocar en el horno a 60 °C durante 3 h (5.5)
Enfríar.
7.1 Optimización y condiciones analíticas (este estudio ha sido realizado con análisis por medio
de HPLC, véase este método)
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El rendimiento de formación de derivados de los compuestos dicarbonílicos con 1,2diaminobenceno es óptimo a pH 8, a 60 °C después de 3 horas de reacción.
Por otra parte, no se ha notado ninguna interferencia del SO2 con la formación de las
quinoxalinas durante el estudio del método.
7.2 Análisis mediante cromatografía de gases
7.2.1 Extracción de las quinoxalinas
- El medio de reacción preparado en 7, se lleva a pH 2 por medio de H2SO4 2M (4.6);
- Extraer 2 veces utilizando 5 ml de diclorometano (4.7) mediante agitación magnética durante 5
minutos;
- Decantar cada vez la fase inferior;
- Mezclar las dos fases de disolvente;
- Secar con alrededor de 1 g de sulfato de sodio anhidro (4.11);
- Decantar.
7.2.2 Análisis cromatográfico (dado a título de ejemplo)
- Detección. Para el análisis mediante GC-MS, se ha acoplado un cromatógrafo en fase gaseosa
Hewlett Packard HP 5890 con una chemstation y un espectrómetro de masas HP 5970 (impacto
electrónico 70eV, 2,7 kV),
Observación: también es posible utilizar un detector específico de compuestos nitrogenados Columna. La columna es una BP21 (SGE, 50 m x 0,32 mm x 0,25 µm).
- Temperaturas. Las temperaturas del inyector y el detector son respectivamente de 250 °C y 280
C; la del horno se mantiene a 60 °C durante 1min y, a continuación, se programa a razón de 2
C/min hasta 220 C y el isotermo final dura 20 min.
- Inyección. El volumen inyectado es de 2 µl y el tiempo de cierre de las válvulas del inyector
(splitless) es de 30 s.
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7.2.3 Análisis de las quinoxalinas formadas
- Separación. El cromatograma de los derivados mediante 1,2-diaminobenceno de un vino según
el método de selección de iones (SIM) se muestra en la Figura 3. Se han obtenido buenas
separaciones con todos los tipos de vinos (blancos, tintos, azucarados o fortificados), e incluso
mostos en fermentación.
- Identificación de los picos. La utilización de la GC-MS ha permitido identificar los compuestos
dicarbonílicos derivatizados del vino utilizando el método de la corriente iónica total (escaneo)
que permite obtener los espectros de masa de los derivados quinoxalinicos y compararlos con
aquellos memorizados en la biblioteca de espectros; por otra parte, los tiempos de retención han
sido comparados con aquellos de compuestos puros tratados del mismo modo. El cuadro 1
muestra los iones principales de los espectros de masa de los compuestos dicarbonílicos
derivatizados obtenidos.
- Dosificación. La determinación cuantitativa de los compuestos dicarbonílicos se efectúa con el
modo SIM, seleccionando iones M / Z = 76, 77, 103, 117, 130, 144, 158 y 171. Los iones M/Z =
76 y 77 se utilizan para la cuantificación y los demás comocaracterizadores, es decir glioxal:
iones M/Z =103 y 130, metilglioxal : iones M/Z =117 y 144, diacetilo: iones M/Z = 117 y 158,
pentano-2,3-diona: iones M/Z = 171 y hexano-2,3-diona: iones M/Z = 158 y 171.
7.2.4 Características del método
Ciertos elementos de validación interna han sido determinados pero no se trata de una
validación formal según el protocolo para la planificación, la dirección y la interpretación de
estudios de rendimiento de los métodos de análisis (OIV 6/2000)
- Repetibilidad. La repetibilidad del método por GC-MS-SIM. Muestra coeficientes de variación
comprendidos entre el 2 y 5 % para los cuatro compuestos dicarbonílicos;
- Tasa de recuperación. Las cantidades añadidas a un vino han sido reencontradas con una tasa
de recuperación variante de 92 a 117%
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- Linealidad. Se han obtenido correlaciones lineales en los rangos de concentración
comprendidos entre 0,05 y 20 mg/l.
- Límite de detección. El límite de detección de la mayoría de los productos dicarbonílicos
derivatizados utilizando el vino como matriz es de 0,05 mg/l
Cuadro 1. Espectros de masa (ión m/z (intensidad del ión molecular relativa a la del pico de
base)) de los derivados de compuestos dicarbonílicos con 1,2-diaminobenceno
Compuesto
dicarbonilado
Derivado
Espectro de masa (principales iones y abundancia)
Glioxal
Quinoxalina
130 (100), 103 (56.2), 76 (46.8), 50 (20.2),
75 (10.4), 131 (9.4)
Metilglioxal
2-Metilquinoxalina
144 (100), 117 (77.8), 76 (40.5), 77 (23.3),
50 (21.9), 75 (11.3), 145 (10.3)
Diacetilo
2,3-Dimetilquinoxalina
117 (100), 158 (75.6), 76 (32.3), 77 (23.1),
50 (18.3), 75 (10.4)
Pentano-2,3-diona
2-Etil-3-metilquinoxalina171 (100), 172 (98), 130 (34.1), 75 (33.3),
77 (21), 50 (19.4), 144 (19), 143 (14.1),
103 (14)
Hexano-2,3-diona
2,3-Dietilquinoxalina 158 (100), 171 (20.1), 76 (13.7), 77 (12.8),
159 (11.4), 157 (10.8), 50 (8.1)
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Figura 3. Cromatograma en fase gaseosa del extracto de los compuestos dicarbonílicos derivados
con 1,2-diaminobenceno de un vino blanco, detectados por espectrometría de masas escogiendo
los iones m/z =76, 77, 103, 117, 130, 131, 144, 158, 160 y 171. Columna BP21, 50 m, 0,32mm,
0,25 µm temperatura de horno 60 °C durante 1min y, a continuación programación a 2 °C/min
hasta 220 °C. temperatura del inyector: 250 °C.
1. glioxal ; 2. metilglioxal ; 3. diacetilo ; 4. pentano-2,3-diona ; 5. hexano-2,3-diona (patrón
interno) ; 6. fenilglioxal (no estudiado en este método).
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Bibliografía
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