UTILIZACION DE INTERLEUQUINA 10 PARA LA PREPARACION

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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ES 2 096 081
kInt. Cl. : A61K 38/00
11 N.◦ de publicación:
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ESPAÑA
A61K 48/00
//C12N 15/24
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 92912592.0
kFecha de presentación : 29.06.92
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 592 476
kFecha de publicación de la solicitud: 20.04.94
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54 Tı́tulo: Utilización de interleuquina 10 para la preparación de medicamentos con una actividad
inhibidora de tumores.
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73 Titular/es: Schering Aktiengesellschaft
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72 Inventor/es: Diamantstein, Tibor;
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74 Agente: Lehmann Novo, Marı́a Isabel
30 Prioridad: 04.07.91 DE 41 22 402
13342 Berlin, DE
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.03.97
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 096 081 T3
01.03.97
Aviso:
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Richter, Günther y
Blankenstein, Thomas
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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ES 2 096 081 T3
DESCRIPCION
El invento concierne a la utilización de interleuquina 10 para la preparación de medicamentos
con una actividad inhibidora de tumores.
Las interleuquinas (IL) son, tal como es sabido, sustancias mediadoras del sistema inmunológico, que son formadas predominantemente por
leucocitos. Pertenecen al grupo de las denominadas citoquinas; éstas son sustancias que son segregadas por las células a la sangre o al tejido
circundante y que influyen sobre las funciones de
otras células, tales como por ejemplo su división,
diferenciación o movimiento.
La mayorı́a de las interleuquinas estimulan las
funciones de otras células. Ası́, por ejemplo, la
interleuquina 2 (IL-2) segregada por las células
cooperantes T1, está capacitada para activar a
macrófagos, células asesinas naturales, linfocitos
B y linfocitos T - por lo tanto, a los glóbulos
sanguı́neos blancos, que dan lugar a la defensa inmunológica - y estimular su reproducción (Kendall A. Smith: Science 240, 1988, 1.169-1.176,
ası́ como Spektrum der Wissenschaft, mayo de
1990, 72-82).
En contraposición con ello, la interleuquina 10
(IL-10) formada en las células cooperantes T2,
inhibe la formación de interleuquina 2 y la formación de interferón γ en las células cooperantes
T1, por lo que es designada también como “factor inhibidor de la sı́ntesis de citoquinas” (CSIF,
del inglés “cytokine synthesis inhibitory factor”)
y produce, por lo tanto, un debilitamiento del sistema inmunológico (David. F. Fiorentino et. al.:
J. Exp. Med. 170, 1989, 2.081-2.095; Ning Fei
Go et. al.: J. Exp. Med. 172, 1990, 1.625-1.631;
Tim R. Mosmann et. al.: J. of Immunology 145,
1990, 2.938-2.945; P. Vieira et. al.: Proc. Natl.
Acad. Sci. 88, 1991, 1.172-1.176).
Por fin, se descubrió que la interleuquina 10
posee sorprendentemente una actividad inhibidora de tumores, tal como se explica más detalladamente en el siguiente Ejemplo de ejecución.
Esta actividad inhibidora de tumores debe de estar basada en una propiedad, desconocida hasta
ahora, de la interleuquina 10; esto se desprende
ya del hecho de que la interleuquina 10 desarrolla una actividad inhibidora de tumores, tanto en
ratones que no disponen de ningún sistema inmunológico especı́fico capaz de funcionar (ratones
SCID, que no poseen linfocitos B ni T), ası́ como
también en ratones, que no poseen ningún sistema
inmunológico especı́fico, capaz de funcionar, dependiente de las células T (ratones desprovistos
de inmunidad = “desnudos”).
A causa de esta propiedad, la interleuquina 10
puede utilizarse para la preparación de medicamentos con una actividad inhibidora de tumores.
Esto se puede realizar, a modo de ejemplo, preparando soluciones que contienen interleuquina 10
según uno de los procedimientos que se describen
en las ya citadas publicaciones de Fiorentino et.
al., Ning Fei Go et. al., Mosmann et. al. o Vieira
et. al..
Generalmente, será suficiente poner a disposición soluciones que contengan por cada ml
de 103 hasta 106 unidades de interleuquina 10.
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Estas soluciones se mezclan eventualmente con
adiciones isotonizantes, se filtran en condiciones
estériles y se envasan en ampollas o en frascos
para infusión de 1 a 250 ml de capacidad. Por
otra parte, también es posible, sin embargo, liofilizar las soluciones, a fin de disolverlas otra vez
antes de su uso.
Sin embargo, por otra parte también es posible incorporar los plásmidos portadores de IL-10,
que son conocidos con anterioridad a partir de
las publicaciones citadas, por ejemplo mediante
transfección (E. Neumann et. al. EMBO Journal 1, 1982, 841-845) en células, tales como por
ejemplo células TIL (del inglés “tumor infiltrating leukocytes”) y utilizar en medicamentos la
suspensión de células que se ha obtenido.
Para el tratamiento de tumores benignos y
malignos, los medicamentos conformes al invento
se aplican por vı́a intravenosa (i. v.) o local. La
cantidad del medicamento que se ha de aplicar
depende naturalmente del tipo de la enfermedad
y del estado del paciente, y debe de ser establecida por el médico en cada caso particular. Generalmente, será suficiente que se administren al
paciente desde 102 hasta 108 unidades de interleuquina 10 por dı́a.
El siguiente Ejemplo de ejecución sirve para
explicar con más detalle el invento:
Ejemplo
a) Aislamiento del gen para la IL-10 de ratón.
El gen para la IL-10 de ratón se aisló
con ayuda de un cebador especı́fico para una secuencia (sentido: AGAGTCGACCATCATGCCTGGCTGCAGCA y antisentido: GCAGTCGATCTAGCTTTCCATTTTGATCATCA) mediante una reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR del inglés“reverse transcription polymerase chain reaction)
(Ernst S. Kawaski et. al.: Proc. Natl.
Acad. Sci., 85, 1988, 5.698-5.702). Como fuente de ARN (ácido ribonucleico) sirvieron células T procedentes de bazo de
ratón, estimuladas con 3 µg/ml de concanavalina A. Con ayuda del cebador anteriormente indicado se introdujeron sitios de
corte por restricción para Sal 1 en el producto de la amplificación del gen, que permitı́a una clonación en el plásmido de expresión pBMGNeo cortado de manera correspondiente (Hajime Karasuyama et. al.:
Eur. J. Immunol. 18, 1988, 97-104).
b) transfección de células tumorales de CHO.
5x106 células tumorales de CHO (ovario de
hámster chino, del inglés ”chinese hamster ovary) Puck T.T; J. Exp. Med. 108,
1958, 945, se lavaron dos veces en PBS
(solución salina tamponada con fosfato) de
Dulbecco, sin iones de Ca2+ y Mg2+ (Dulbecco, R.: J. Exp. Med. 99, 1954, 167),
y se ajustaron a 0,5 ml. Luego éstas fueron añadidas a una cubeta de un electroporador de la entidad Biorad (Richmond,
California-EE.UU.), mezcladas con 10 µg
de un plásmido linealizado portador de IL-
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10 y conservadas durante 10 minutos a 0◦ C.
A continuación, se llevó a cabo la electroporación a 875 V/cm y r=5 m · s (BioRadiations, Bio-Rad Laboratories 1981, 6366).
Las células tratadas se conservan durante
10 minutos a 0◦ C, se transfieren a 30 ml
del medio RPMI-1640 de Click (fabricante
Biochrom GmbH; Berlin, Alemania) que
contenı́a glutamina 2 mM, penicilina 100
unidades/ml, estreptomicina 100 µg/ml y
suero de ternera fetal al 10% (fabricante
FCS/ Seromed; München, Alemania) y se
cultivan durante 48 horas a 37◦C bajo una
atmósfera que contiene 5% de dióxido de
carbono.
El gen de resistencia a la neomicina, que
estaba contenido en el plásmido de expresión portador de IL-10, sirvió como marcador de selección. Las células se ajustaron por lo tanto a una concentración
de 1x106 /ml, se mezclaron con 1 mg/ml
del compuesto análogo a neomicina G 418
(fabricante GIBCO-BRL; 7514-Eggenstein,
Alemania) y se seleccionaron durante 2 semanas en cuanto a su resistencia a antibióticos.
Para la determinación de la actividad biológica del gen de IL-10 se investigaron los
materiales sobrenadantes de los clones obtenidos, en un ensayo de proliferación, en
cuanto a D-36 (lı́nea de células progenitoras) (Schmitt, E. et. al. Cytokine 2
(6), 1990, 407). Uno de los clones presentó una actividad de 256 unidades/ml por
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5x104 células en 24 horas. Estas células se
utilizaron predominantemente para las investigaciones ulteriores.
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c) Determinaciones de la actividad inhibidora
de tumores de IL-10.
Puesto que las células tumorales de CHO
que provienen de un hámster son destruidas
en ratones con un sistema inmunológico intacto como trasplantados ajenos (xenotrasplantados), los experimentos para evitar el
rechazo del xenotrasplantado se llevaron a
cabo con ratones SCID, que debido a su insuficiencia de linfocitos T y B no disponen
de ningún sistema inmunológico especı́fico
capaz de funcionar, y con ratones “desnudos”, que debido a su deficiencia de células
T tampoco disponen de ningún sistema inmunológico especı́fico capaz de funcionar.
A 10 ratones SCID y 10 ratones “desnudos”
se les inyectaron 5x106 células tumorales de
CHO formadoras de IL-10 por vı́a subcutánea en la nuca. A los 25 dı́as después de la
aplicación vivı́an todos los ratones. No se
comprobaron tumores de ningún tipo.
Como testigos sirvieron 10 ratones SCID y
10 ratones “desnudos”, que recibieron aplicadas por vı́a subcutánea en la nuca 5x106
células tumorales de CHO, las cuales no estaban capacitadas para formar IL-10. La
investigación puso de manifiesto que en todos los animales se desarrollaron tumores
después de 14 dı́as. Todos los animales
habı́an muerto como muy tarde después de
25 dı́as.
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REIVINDICACIONES
1. Utilización de interleuquina 10 para la preparación de medicamentos con actividad inhibidora de tumores.
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2. Utilización de interleuquina 10 para la preparación de medicamentos de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque el medicamento contiene una suspensión de células capacitadas para formar interleuquina 10.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva
del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD
2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación
del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del
7-10-1992, no producirán ningún efecto en España
en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales.
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Esta información no prejuzga que la patente esté o
no incluı́da en la mencionada reserva.
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