Teórico_4_2015. SEPARACIÓN SOLIDO
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Separación Sólido-Líquido Dra. María Victoria Miranda Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología Facultad de Farmacia y Bioquímica. UBA Separación Sólido-Líquido Casos posibles FERMENTACIÓN SSL 1 SOBRENADANTE SSL 2 SSL 3 CÉLULAS RECUPERACIÓN RUPTURA PURIFICACIÓN CELULAR PRODUCTO EXTRACELULAR HOMOGENATO SSL 2 SOBRENADANTE SSL 3 SSL 4 PELLET RECUPERACIÓN PURIFICACIÓN PRODUCTO INTRACELULAR DESCARTE Separación Sólido-Líquido Técnicas • Centrifugación • Filtración Separación Sólido-Líquido Modos operativos • Batch (tanda) • Continuo Separación Sólido-Líquido Velocidad de sedimentación Vs = d2 x Δρ x g 18 x η Vs: velocidad de sedimentación de una partícula d: diámetro de la partícula ∆ρ: diferencia de peso específico entre el sólido y el líquido g: aceleración de la gravedad (9,81 m/seg2) η: viscosidad Separación Sólido-Líquido Tamaño de distintos sólidos • Levadura: 10 µm • Escherichia coli : 1-2 µm • Desechos celulares: 0,5 µm Separación Sólido-Líquido Centrífuga continua de discos cónicos apilados Discos apilados ENTRADA SALIDA Circulación del fluido Depósito de sólidos Funcionamiento Una centrífuga de discos apilados puede separar el 99% de los sólidos de una suspensión y producir un concentrado con 80-90 % de sólidos peso húmedo. Separación Sólido-Líquido Centrifugación continua: parámetros a optimizar • Flujo de alimentación • Intervalo entre descargas • Velocidad de giro Separación Sólido-Líquido Operación de centrífugas: factores • Generación de: » » » Calor Aerosoles Ruido Separación Sólido-Líquido Tipos de filtros • Tradicionales (de profundidad) – Batch: Filtro prensa – Continuo: Filtro de tambor rotatorio al vacío • Modernos (de superficie) – Membranas filtrantes Separación Sólido-Líquido Filtro prensa Placa Marco FUNCIONAMIENTO DEL FILTRO PRENSA Placas filtrantes son montadas en marcos Canales de flujo Separación Sólido-Líquido Filtro de tambor rotatorio al vacío Filtro rotatorio al vacio Separación Sólido-Líquido Filtro de tambor rotatorio al vacío Separación Sólido-Líquido Filtración tangencial Pi Po CONCENTRATE OR OR FILTRATE Microfiltración Ultrafiltración Nanofiltración Ósmosis reversa Separación Sólido-Líquido Modos operativos UF: Concentración Separación Sólido-Líquido Modos operativos UF: Diafiltración Separación Sólido-Líquido Modos operativos UF: Purificación Separación Sólido-Líquido Centrifugación vs Ultrafiltración Ruptura celular 1. Susceptibilidad de la célula 2. Características de estabilidad de los productos 3. Velocidad del método 4. Facilidad de extracción de los restos celulares 5. Costo del proceso Factores que influyen DEPENDIENTES DEL MICROORGANISMO • • • • • • Medio de cultivo Tipo de microorganismo Estado fisiológico Tamaño Forma Velocidad de crecimiento DEPENDIENTES DEL PRODUCTO • Sensibilidad al shear • Sensibilidad al calor • Localización Métodos químicos y biológicos QUÍMICOS BIOLÓGICOS Álcalis Solventes Detergentes Ácidos Sustancias caotrópicas Enzimas Alcalis Tratamiento de las células con soluciones alcalinas (KOH, NaOH, pH 10,512,5; 20-30 min) Hidrólisis de la pared celular Ventajas: Simple, barato Fácil aplicación a gran escala Reducción de la contaminación con pirógenos en preparaciones de uso Terapéutico Las células intactas son no viables Aplicación SÓLO si las enzimas a aislar son estables a pH alcalino Solventes Tolueno Etanol Metanol Isopropanol Butanol Acetona Disuelve la capa de fosfolípidos Se usa especialmente en levaduras Concentración del 5 % Inflamables Detergentes Permeabilización de células por solubilización de proteínas de membrana, debido a apertura de poros Concentración al 2% Tipos: 1. Iónicos: provoca desnaturalización proteica Aniónicos: Lauril sulfato sódico, colato sódico, SDS Catiónicos: Bromuro de cetil-trimetil-amonio 2. No iónicos: preservan estructura nativa (Tween, Triton) Ej.: el Tritón es usado para permeabilizar células de Nocardia en la extracción y purificación de colesterol oxidasa a escala industrial. Agentes caotrópicos Guanidina Urea Concentración 6 M Romper estructuras de agua Debilitan uniones hidrofóbicas Lisozima Proteína de 14 kDa Potente acción antimicrobiana Digestión de las paredes celulares por ruptura de los enlances beta-(1.4) glicosídicos entre el ácido N-acetilmurámico y la N-acetilglucosamina del mucopéptido Tiempo de reacción: 10 min Mayor susceptibilidad GRAM + Asociado a EDTA (quelante del Ca2+) para GRAM - Composición de las paredes celulares Métodos físicos NO MECÁNICOS MECÁNICOS • Shock osmótico Agitación con abrasivos Homogeneización a alta presión Escala industrial Homogenizador de alta presión Molino de bolillas
