Determinación de la distribución del deuterio en el etanol

RESOLUCIÓN OIV-OENO 426-2011
DETERMINACIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN DEL DEUTERIO EN EL ETANOL DERIVADO DE LA
FERMENTACIÓN DE MOSTOS DE UVA, MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS, AZÚCAR DE
UVA (MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS RECTIFICADOS) Y VINOS POR RESONANCIA
MAGNÉTICA NUCLEAR (SNIFNMR/RMNFINS)
La ASAMBLEA GENERAL
CONSIDERANDO el Artículo 2 párrafo 2 iv del Acuerdo de 3 de abril de 2001 que
establece la creación de la Organización Internacional de la Viña y el Vino,
EN VISTA DE las acciones del Plan Estratégico de la OIV 2009-2012
CONSIDERANDO los trabajos de la Subcomisión de Métodos de Análisis
DECIDE sustituir el método actual de Determinación de la distribución del deuterio en el
etanol derivado de la fermentación de mostos de uva, mostos de uva concentrados,
mostos de uva concentrados rectificados y vinos por resonancia magnética nuclear
publicado en el Compendio Métodos Internacionales de Análisis del vino. Dicho método
se sustituye por el siguiente método de Tipo II.
Determinación de la distribución del deuterio en el etanol derivado de la
fermentación de mostos de uva, mostos de uva concentrados, azúcar de
uva (mostos de uva concentrados rectificados) y vinos por resonancia
magnética nuclear (SNIF-NMR/ RMNFINS 1)
1. Introducción
El deuterio contenido en los azúcares y en el agua del mosto de uva se redistribuye tras la
fermentación en moléculas I, II, III y IV del vino:
CH2D CH2 OH
I
CH3 CHD OH
II
CH3 CH2 OD
III
HOD
IV
Fractionnement Isotopique Naturel Spécifique étudié par Résonance Magnétique Nucléaire
(Site Specific Natural Isotope Fractionation studied by Nuclear Magnetic Resonance). Brevet:
France, 8122710; Europe, 824022099; Etats Unis, 854550082; Japon 57123249.
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2. Ámbito de aplicación
El método permite medir las relaciones isotópicas del deuterio (D/H) en el etanol del vino y el
etanol obtenido por fermentación de productos del vino (mostos, mostos concentrados,
mostos concentrados rectificados).
3. Definiciones
(D/H)I: relación isotópica asociada a la molécula I
(D/H)II: relación isotópica asociada a la molécula II
(D/H)QW: relación isotópica del agua en el vino (o en productos fermentados)
R = 2(D/H)II/(D/H)I
R expresa la distribución relativa del deuterio en moléculas I y II; R se mide directamente a
partir de las intensidades h (alturas pico) de las señales y, así, R = 3hII/hI.
4. Principio
Los parámetros arriba definidos R, (D/H)I y (D/H)II se determinan por resonancia magnética
nuclear del deuterio en el etanol extraído del vino o de los productos de fermentación del
mosto, el mosto concentrado o el azúcar de uva (mosto concentrado rectificado) obtenido en
ciertas condiciones.
5. Reactivos y materiales
5.1 Reactivos:
5.1.1 Reactivos para la determinación de agua mediante el método de Karl Fischer (cuando
dicho método se utiliza para la medición del grado alcohólico del destilado).
5.1.2 Hexafluorobenzeno (C6F6) utilizado como sustancia de bloqueo
5.1.3 Ácido trifluoroacético (TFA CAS: 76-05-1) o anhídrido trifluoroacético (TFAA, CAS:
407-25-0)
5.2 Materiales de referencia (disponibles en el Institute for Reference Materials and
Measurements IRMM de Geel (B)):
5.2.1 Tubos NMR sellados CRM-123, utilizados para comprobar la calibración de la
instrumentación NMR
5.2.2 N,N-tetrametilurea estándar (TMU); TMU estándar con una relación isotópica D/H
calibrada.
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5.2.3 Otros CRM disponibles utilizados para comprobar las etapas de destilación y
preparación:
CRM
CRM-656
Parámetro
Etanol del vino, 96%
vol.
tD (etanol) en
w/w
δ13C (etanol) en
VPDB
(D/H)I (etanol)
ppm
(D/H)II (etanol)
ppm
R (etanol)
CRM-660
Valor certificado Incertidumbre
solución
hidroalcohólica,
vol.
%
94,61
0,05
‰
-26,91
0,07
en
102,84
0,20
en
132,07
0,30
2.570
0,005
%
11,96
0,06
‰
-26,72
0,09
en
102,90
0,16
en
131,95
0,23
en
2.567
148,68
0,005
0,14
12%
tQ (etanol) en
vol.
δ3C (etanol) en
VPDB
(D/H)I (etanol)
ppm
(D/H)II (etanol)
ppm
R
(D/H)w (agua)
ppm
5.3 Aparatos
5.3.1
Espectrómetro NMR que incorpora una sonda de "deuterio" específica ajustada a la
frecuencia característica νo del campo Bo (por ejemplo, para Bo = 7,05 T, νo = 46,05
MHz y para Bo = 9,4 T, νo = 61,4 MHz) con un canal de desacoplamiento de protones
(B2) y un canal de estabilización de campo-frecuencia (bloqueo) en la frecuencia del
flúor. El instrumento NMR puede estar equipado con un intercambiador de muestras
automático y un software de procesamiento de datos adicional para la evaluación de
los espectros y la computación de los resultados. El rendimiento del espectrómetro
NMR puede comprobarse utilizando los Materiales de Referencia Certificados
(Certified Reference Materials) (tubos sellados CRM 123).
5.3.2
Tubos NMR de muestra de 10 mm
5.3.3
Aparatos de destilación
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Nota: puede utilizarse cualquier método para la extracción del etanol siempre que el
alcohol total contenido en el vino se recupere sin fraccionamiento isotópico. La columna
Cadiot que aparece en la figura 1 es un ejemplo de sistema de destilación manual que
permite la extracción del 96 al 98,5% de etanol de un vino sin fraccionamiento isotópico y
obtener un destilado con un grado de alcohol de 92 a 93 en %w/w (95% vol.)
Dicho sistema está compuesto por:
• Manta eléctrica con regulador de voltaje,
• Un frasco de base redonda de un litro de capacidad con junta de cuello de vidrio
esmerilado,
• Columna Cadiot con cinta helicoidal (pieza móvil de teflón),
• Frascos cónicos con juntas de cuello de vidrio esmerilado, para la recogida del
destilado.
También existen sistemas de destilación automática.
El rendimiento del sistema de destilación puede comprobarse periódicamente tanto por lo que
respecta a la tasa de extracción como a la precisión de la determinación isotópica. Dicho
control puede realizarse mediante destilación y medición de CRM -660.
5.3.4 Se necesita el equipo y los consumibles de laboratorio habituales siguientes:
-micropipeta con puntas adecuadas,
-equilibrio con una precisión de 0,1 mg o mayor,
-equilibrio con una precisión de 0,1 g o mayor,
-jeringa de un solo uso para la transferencia de líquidos,
-frascos graduados con precisión (50 ml, 100 ml, 250 ml…)
-frascos equipados con sistemas de cierre hermético y tabiques inertes (para el
almacenamiento de partes alícuotas de vinos, destilados y residuos hasta la medición)
-equipo y consumibles especificados en otros métodos a los que se hace referencia en el
presente documento.
El equipo de laboratorio y los consumibles que se indican en las listas anteriores son ejemplos
y pueden ser sustituidos por otros equipos de prestaciones similares.
6. Muestreo (Preparación de la muestra)
6.1 Si todavía no se cuenta con este dato, determinar el grado alcohólico del vino o del
producto fermentado (tv), midiendo hasta el 0,05% vol. más cercano (por ejemplo, utilizando
el método MA-F-AS312-01-TALVOL de la OIV).
6.2 Extracción del etanol
Utilizando el matraz graduado apropiado, introduzca una muestra homogénea de un volumen
adecuado V ml del vino o del producto fermentado en el matraz de base redonda del aparato
de destilación. Coloque un matraz cónico esmerilado para que se deposite en él el destilado.
Caliente el producto que desea destilar para obtener un ratio de reflujo constante al nivel del
condensador. Comience a recoger el destilado cuando se alcance una temperatura estable de
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78 °C de los vapores en el condensador típico del azeótropo de etanol y agua y deje de
recogerlo cuando la temperatura aumente. Debería continuar con la recogida del destilado
hasta que se el azeótropo de etanol y agua se recupere completamente.
Cuando se utilice manualmente una columna Cadiot (Figura 1), podrá aplicarse el
procedimiento siguiente:
-Recoja el líquido hirviendo que corresponde al azeótropo de alcohol y agua, cuando la
temperatura aumente, interrumpa la recogida durante cinco minutos. Cuando la temperatura
alcance de nuevo los 78 °C, reanude la recogida del destilado hasta que la temperatura de los
vapores vuelva a aumentar. Repita dicha operación hasta que la temperatura, tras interrumpir
la recogida y trabajando en un circuito cerrado, no vuelva a alcanzar los 78 ºC.
Como alternativa, también pueden utilizarse sistemas de destilación disponibles en comercios.
El peso mD de destilado recogido se pesa con un rango inferior a ±0,1 g.
Para evitar el fraccionamiento isotópico, el destilado debería conservarse en un frasco
hermético que impida cualquier evaporación hasta nuevo uso para determinación del grado
alcohólico (6.3) y preparación del tubo NMR (7.1).
Se conserva una parte alícuota de unos pocos ml de los residuos. En caso necesario, puede
calcularse su relación isotópica (D/H)QW.
6.3 Determinación del grado alcohólico del destilado
El grado alcohólico (%w/w) del destilado debe determinarse con un rango de error inferior a
±0,1% .
El contenido de agua del destilado (ρ' g) puede determinarse mediante el método de Karl
Fischer utilizando una muestra de aproximadamente 0,5 ml de alcohol de una masa ρ g
conocida con exactitud. El grado alcohólico por masa del destilado está determinado por:
tmD % w/w= 100 (1-ρ')/ ρ
De manera alternativa, el grado alcohólico puede determinarse mediante densimetría, por
ejemplo, utilizando un densímetro electrónico.
6.4 Rendimiento de destilación
El rendimiento de destilación se calcula utilizando la fórmula siguiente:
Rendimiento de dest. % = 100 tmD mD /(V.tv)
Dada la incertidumbre en relación con cada variable y, especialmente, en relación con tv, el
rendimiento de destilación se estima a ±0,5% (en el caso de un vino 10%v/v).
Cuando se utiliza una columna Cadiot, no se espera ningún efecto de fraccionamiento del
isótopo significante en el caso de un rendimiento de extracción superior al 96%. En cualquier
caso, el operario puede utilizar un volumen Vml suficiente de vino o de producto fermentado
para la destilación con el fin de garantizar que el rendimiento de la extracción sea suficiente.
Las partes alícuotas típicas de 750, 500, 400 y 300 ml de muestra de vino deberían ser
suficientes para obtener un rendimiento del 96% al realizar el procedimiento de destilación
arriba indicado con la columna Cadiot en vinos o productos fermentados de tv = 4, 6, 8 y 10%
vol, respectivamente.
6.5 Fermentación de mostos, mostos concentrados y mostos concentrados rectificados
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Antes de su uso, la levadura puede reactivarse en un pequeño volumen de mosto.
El recipiente de fermentación tiene un dispositivo de cierre hermético y que evita la pérdida
de etanol.
6.5.1 Mostos
Ponga aproximadamente un litro de mosto, cuya concentración de azúcares fermentables se
haya determinado previamente, en el recipiente de fermentación. Añada antes
aproximadamente 1 g de levadura seca eventualmente reactivada. Inserte el dispositivo de
cierre hermético. Deje que la fermentación se produzca a unos 20 °C hasta que el azúcar se
acabe. El producto fermentado puede destilarse siguiendo el procedimiento ya descrito para el
vino en los puntos 6.1 al 6.4.
Nota: los mostos preservados mediante incorporación de dióxido de azufre deben desulfitarse
introduciendo nitrógeno en burbujas en el mosto al baño maría a una temperatura de entre 70
y 80 °C en condiciones de reflujo con el fin de impedir el fraccionamiento del isótopo
mientras se produce la evaporación del agua. De manera alternativa, el dióxido de azufre
puede eliminarse añadiendo una pequeña cantidad de una solución de peróxido de hidrógeno
(H2O2).
6.5.2 Mostos concentrados
Ponga V ml de mosto concentrado que contenga una cantidad conocida de azúcar
(aproximadamente 170 g) en un recipiente de fermentación. Rellene hasta un litro con (1.000
- V) ml de agua. Añada levaduras secas (1 g) y 3 g de base de nitrógeno de levadura Bacto sin
aminoácidos. Homogenice y repita el procedimiento tal y como se describe en el 6.5.1..
6.5.3 Azúcar de uva (Mostos concentrados rectificados)
Haga lo mismo que en 6.5.2, rellenando hasta un litro con (1.000 - V) ml de agua que también
contenga 3 g de ácido tartárico disuelto.
Nota: Los mostos concentrados y los mostos concentrados rectificados se diluyen en agua
con una relación isotópica (D/H) distinta a la del mosto original. Normalmente, los
parámetros (D/H)I y (D/H)II medidos en etanol deben normalizarse como si el mosto hubiese
fermentado en agua, conservando la misma concentración del deuterio que la de V-SMOW
(155,76 ppm). Esta normalización de datos puede llevarse a cabo utilizando las siguientes
ecuaciones (Martin et al., 1996, J. AOAC, 79, 62-72):
Norm.V − SMOW
 D  S

D
=   − 0.19 ×   − 155.76
 H I
 H W

Norm.V − SMOW
 D  S

D
=   − 0.78 ×   − 155.76
 H  II
 H W

D
 
 H I
D
 
 H  II
 D S
en donde   es la relación isotópica del deuterio del mosto diluido. Este valor puede
 H W
calcularse utilizando la ecuación del Global Meteoric Water Line (Craig, 1961) :
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 (8 ×δ 18O +10) 
 D S
+1
  = 155.76 × 
 H W
1000


en donde δ 18O se mide en el mosto diluido mediante el método de 18O/16O para la
determinación de la relación isotópica de agua en vinos y mosto [OIV-MA-AS2-12]..
Conserve 50 ml de muestra de mosto, mosto tratado con dióxido de azufre, mosto
concentrado o mosto concentrado rectificado con el fin de llevar a cabo la posible extracción
de agua y la determinación de su relación isotópica.(D/H)WQ.
7. Procedimiento
7.1 Preparación de la muestra de alcohol para la medición de NMR
- sonda NMR de 10 mm de diámetro: en una botella previamente pesada, recoja 3,2 ml de
destilado tal como se describe en el apartado 6.2 y pésela haciendo la lectura en el ±0,1 mg
(mA) más cercano; tome una muestra de 1,3 ml del TMU patrón interno (5.2.2) y pésela
haciendo la lectura en el ±0,1 mg (mST) más cercano.
Dependiendo del tipo de espectrómetro y la sonda utilizados, añada una cantidad suficiente de
hexafluorobenzeno (5.1.2) como sustancia de estabilización de campo-frecuencia (bloqueo):
Espectrómetro
7,05 T
9,4 T
sonda de 10 mm
150 µl
35 µl
Estas cifras son indicativas y el volumen real que vaya a utilizarse debería ajustarse a la
sensibilidad del instrumento NMR. Al preparar el tubo y hasta la medición de NMR, el
operario debería tener cuidado para evitar cualquier evaporación de etanol y TMU ya que ello
provocaría el fraccionamiento isotópico, errores en los pesos (mA y mST) de los componentes y
resultados de NMR erróneos.
La exactitud del procedimiento de medición que incluye este paso de preparación puede
comprobarse utilizando el CRM 656.
Nota: el hexafluorobenzeno puede añadirse con un 10% (v/v) de ácido trifluoroacético (5.1.3)
para catalizar el intercambio rápido de hidrógeno en el enlace de hidroxilo resultante en un
único pico NMR tanto para la señales de hidroxilo como para las de agua residual.
7.2 Registro del espectro ²H NMR del alcohol
La homogeneidad del campo magnético B0 en la muestra se optimiza mediante el
procedimiento de “compensación” maximizando la señal de bloqueo 19F NMR observada en
el hexafluorobenzeno. Los espectrómetros NMR modernos pueden realizar de manera
automática y eficiente ese procedimiento de “compensación” siempre que los ajustes iniciales
sean lo bastante próximos a la homogeneidad del campo magnético óptimo para una muestra
determinada, como suele ser el caso de un lote de muestras de etanol preparadas tal como se
describe en 7.1. La eficacia de dicho procedimiento puede comprobarse mediante la
resolución medida en el espectro obtenido sin multiplicación exponencial (a saber, LB = 0)
(Figura 2b) y expresarse mediante la mitad de la anchura de las señales de metilo y metileno
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de etanol y la señal de metilo de TMU, que debe ser inferior a 0,5 Hz en condiciones óptimas.
La sensibilidad, medida con un factor multiplicador exponencial LB igual a 2 (Figura 2a)
debe ser superior o igual a 150 para la señal de metilo de etanol de grado alcohólico 95% vol
(93,5% máx.).
7.2.2 Comprobación de los ajustes instrumentales
Realice la estandarización habitual en busca de la homogeneidad y la sensibilidad de acuerdo
con las especificaciones del fabricante.
Utilice los tubos sellados CRM123 (H: Alto, M: Medio, L: Bajo).
Siguiendo el procedimiento descrito más adelante en 9.3, determine los valores del isótopo de
esos alcoholes, denominándolos Hmeas, Mmeas, Lmeas.
Compárelos con los valores estándar correspondientes facilitados, indicados por un
superíndice Hst, Mst, Lst.
Normalmente, a título indicativo, la desviación típica obtenida para 10 repeticiones de cada
espectro debería ser del orden de 0,01 para la relación R y 0,5 ppm para (D/H)I y 1 ppm para
(D/H)II.
Los valores medios obtenidos para los diversos parámetros isotópicos (R, (D/H)I, (D/H)II)
deben situarse dentro de la desviación típica de repetibilidad correspondiente dada para esos
parámetros para el CRM123. Si no se sitúan dentro de dicho rango, realice de nuevo las
comprobaciones.
Una vez que los ajustes se hayan optimizado también pueden utilizarse otros materiales CRM
para controlar la calidad de las medidas en los análisis rutinarios.
7.3 Condiciones para obtener el espectro NMR
Ponga una muestra de alcohol preparada tal como se indica en 7.1 en un tubo de 10 mm e
introdúzcalo en la sonda.
Las condiciones aconsejadas para la obtención del espectro NMR son las siguientes:
- una temperatura de sonda constante, ajustada para que la variación sea inferior a ±0,5°K en
el rango 302K a 306K dependiendo del poder calorífico generado por el desacoplamiento;
- tiempo de adquisición de al menos 6,8 s para una anchura del espectro de 1200 Hz (memoria
de 16K) (a saber, unas 20 ppm a 61,4 MHz o 27 ppm a 46,1 MHz);
- pulso de 90°;
- detección parabólica: establezca el offset 01 entre las señales de referencia OD y CHD en el
caso del etanol, y entre las señales de referencia HOD y TMU en el caso del agua;
- determine el valor del offset de desacoplamiento 02 desde el espectro de protones medido
por la bobina de desacoplamiento en el mismo tubo. Se obtiene un buen desacoplamiento
cuando 02 se sitúa en el centro del intervalo de frecuencia existente entre los grupos CH3- y
CH2-. Utilice el modo de desacoplamiento de banda ancha o las secuencias de pulso
compuesto (por ejemplo, WALTZ16) para garantizar un desacoplamiento homogéneo en el
espectro completo.
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Para cada espectro, realice un número de acumulaciones NS suficiente para obtener la
relación señal/ruido indicada como sensibilidad en 7.2 y repita NE veces este ajuste de
acumulaciones NS. Los valores de NS dependen de los tipos de espectrómetro y sonda
utilizados. Algunos ejemplos de posibles selecciones son:
Espectrómetro
7,05 T
9,4 T
sonda de 10 mm
NS = 304
NS = 200
El número de repeticiones NE debería ser estadísticamente significativo y suficiente para
lograr el rendimiento y la precisión del método como se indica más abajo en §9.
En el caso de que dos tubos de muestra NMR hayan sido preparados siguiendo el
procedimiento descrito en 7.1, pueden registrarse cinco repeticiones de espectros NMR
(NE=5) en cada tubo. El resultado final de cada parámetro isotópico corresponde al valor
medio de las mediciones obtenidas en dos tubos de muestra NMR. En ese caso, los criterios
de aprobación para la valoración de los resultados obtenidos con estos dos tubos son:
|Mes1(D/H)I-Mes2(D/H)I|<0.5ppm , |Mes1(D/H)II-Mes2(D/H)II|<0.8ppm )
8. Expresión de resultados
Para cada uno de los espectros NE (véase espectro NMR para etanol, Figura 2a), determine:
hII
R = 3 h1 = 3 ⋅
altura de señal II (CH3 CHD OH)
altura de señal I (CH2D CH2OH)
donde
•
TI =
•
TII =
____altura de señal I (CH2D CH2OH)____
altura de señal de patrón interno (TMU)
____altura de señal II (CH3CHD OH)____
altura de señal de patrón interno (TMU)
- mST y mA, véase 7.1
- tmD, véase 6.3
- (D/H)ST = relación isotópica de patrón interno (TMU) indicada en el certificado expedido
por IRMM.
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La utilización de alturas pico en lugar de área pico, que es menos precisa, supone que la
anchura pico a media altura es idéntica y es una aproximación razonable, en caso aplicable
(Figura 2b).
Para cada uno de los parámetros del isótopo, calcule la media y el intervalo de confianza para
el número de espectros repetidos adquiridos en una muestra dada.
Diversos programas informáticos opcionales permiten realizar dichos cálculos online.
9. Precisión
La repetibilidad y reproducibilidad del método SNIF-NMR han sido estudiadas a través de
estudios colaborativos en zumos de fruta como se indica en la bibliografía citada más abajo.
Sin embargo, estos estudios consideraron solamente el parámetro (D/H)I. En el caso del vino,
se pueden considerar datos de estudios internos llevados a cabo por varios laboratorios para
determinar la desviación típica de la repetibilidad y el límite de repetibilidad como se presenta
en el Anexo 1. Los resultados de los ensayos de aptitud presentados en el Anexo II brindan
datos que pueden utilizarse para calcular la desviación típica de la reproducibilidad y el límite
de reproducibilidad para los vinos.
Estas cifras se pueden resumir del siguiente modo:
(D/H)I
(D/H)II
R
Sr
0,26
0,30
0,005
r
0,72
0,84
0,015
SR
0,35
0,62
0,006
R
0,99
1,75
0,017
Donde:
- Sr: desviación típica de repetibilidad
- r: límite de repetibilidad
- SR: desviación típica de reproducibilidad
- R: límite de reproducibilidad
REFERENCIAS
MARTIN G.J., MARTIN M.L., MABON F., Anal. Chem., 1982, 54, 23802382.
MARTIN G.J., MARTIN M.L., J. Chim. Phys., 1983, 80, 294297.
MARTIN G.J., GUILLOU C., NAULET N., BRUN S., Tep Y., Cabanis J.C.,
CABANIS M.T., SUDRAUD P., Sci. Alim., 1986, 6, 385405.
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MARTIN G.J., ZHANG B.L., NAULET N. and MARTIN M.L., J. Amer. Chem. Soc., 1986, 108,
51165122.
MARTIN G.J., GUILLOU C., MARTIN M.L., CABANIS M.T., TEP Y. et AERNY J., J. Agric. Food
Chem., 1988, 36, 316.
MARTIN G. G., WOOD R., MARTIN, G. J., J. AOAC Int., 1996 , 79 (4), 917-928.
MARTIN G.G., HANOTE V., LEES M., MARTIN Y-L.,. J. Assoc Off Anal Chem, 1996, 79, 62-72
CRAIG H., Science , 1961, 133,. 1702 – 1703.
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motor
junta
hermética
ATMÓSFERA
termómetro
columna
termómetro
tapón
sonda
recipiente
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Figura 1 – Aparato para extraer etanol
Figura 2a
Espectro 2H NMR de un etanol procedente de vino con un patrón interno (TMU: N, N-tetrametilurea)
Figura 2b
Espectro 2H de etanol tomado en las mismas condiciones que las de la Figura 2a, pero sin multiplicación exponencial (LB = 0)
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Anexo I: Estimación de la repetibilidad a partir de estudios de repetibilidad internos
Los estudios internos de repetibilidad llevados a cabo en cuatro laboratorios ofrecen datos que
permiten la estimación de la repetibilidad del método SNIF-NMR.
Estos estudios internos de repetibilidad han sido realizados mediante destilaciones duplicadas
y mediciones de 10; 9 ó 15 diferentes muestras de vino por los laboratorios 1; 2 y 3.
De manera alternativa, el laboratorio 4 realizó 16 destilaciones y mediciones en el mismo
vino en condición de repetibilidad durante un corto período de tiempo.
Cuadro I-1:
Laboratorio 1: 10 vinos analizados por duplicado
(D/H)I
Muestra
(D/H)I
(D/H)II
1
103,97
130,11
2,503
104,52
130,79
2,503
103,53
130,89
2,529
103,94
130,57
2,513
2
3
4
5
6
7
8
9
10
(D/H)II
abs(∆(D/H)I)
Cuadra
dos
0,55
R
abs(∆(D/H)II)
Cuadra
dos
abs(∆(R))
Cuadra
dos
0,302
0,68
0,462
0,000
0,00000
0,41
0,168
0,32
0,102
0,016
0,00026
0,32
0,102
0,20
0,040
0,004
0,00002
0,14
0,020
0,20
0,040
0,000
0,00000
0,48
0,230
0,20
0,040
0,016
0,00026
0,30
0,090
0,36
0,130
0,001
0,00000
0,15
0,023
0,75
0,563
0,011
0,00012
0,24
0,058
0,42
0,176
0,003
0,00001
0,04
0,002
0,44
0,194
0,007
0,00005
0,50
0,250
0,18
0,032
0,010
0,00010
R
102,72
130,00
2,531
103,04
130,20
2,527
105,38
132,39
2,513
105,52
132,59
2,513
101,59
127,94
2,519
101,11
128,14
2,535
103,23
132,14
2,560
102,93
131,78
2,561
103,68
130,95
2,526
103,53
130,20
2,515
101,76
128,86
2,533
101,52
128,44
2,530
103,05
129,59
2,515
103,01
129,15
2,508
101,47
132,63
2,614
100,97
132,45
2,624
Suma de los
cuadrados:
1,245
1,779
0,00081
Sr
0,25
0,30
0,006
r
0,71
0,84
0,018
Certificado conforme
Porto, 24 de junio de 2011
El Director General de la OIV
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Federico CASTELLUCCI
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Cuadro I-2:
Laboratorio 2: 9 vinos analizados por duplicado
(D/H)I
Muestra
(D/H)I
(D/H)II
R
1
105,02
133,78
2,548
104,76
133,88
2,556
102,38
130,00
2,540
101,65
129,60
2,550
3
100,26
126,08
2,515
99,42
125,44
2,523
4
101,17
128,83
2,547
100,66
128,38
2,551
101,47
128,78
2,538
101,47
128,52
2,533
106,14
134,37
2,532
106,26
134,41
2,530
103,62
130,55
2,520
103,57
130,66
2,523
103,66
129,88
2,506
103,38
129,33
2,502
103,50
129,66
2,506
103,93
129,44
2,491
2
5
6
7
8
9
(D/H)II
abs(∆(D/H)I)
Cuadrados
0,26
R
abs(∆(D/H)II)
Cuadrados
abs(∆(R))
Cuadrados
0,068
0,10
0,010
0,008
0,00007
0,73
0,533
0,40
0,160
0,010
0,00011
0,84
0,706
0,64
0,410
0,008
0,00007
0,51
0,260
0,45
0,203
0,004
0,00002
0,00
0,000
0,26
0,068
0,005
0,00003
0,12
0,014
0,04
0,002
0,002
0,00000
0,05
0,003
0,11
0,012
0,003
0,00001
0,28
0,078
0,55
0,302
0,004
0,00001
0,43
0,185
0,22
0,048
0,015
0,00021
Suma de los
cuadrados:
1,846
1,214
0,00053
Sr
0,32
0,26
0,005
r
0,91
0,74
0,015
Certificado conforme
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Cuadro I-3:
Laboratorio 3: 15 vinos analizados por duplicado
(D/H)I
Muestra
(D/H)I
(D/H)II
R
1
101,63
125,87
2,477
101,57
125,41
2,470
99,24
124,41
2,507
99,19
124,37
2,508
101,23
125,07
2,471
101,17
125,23
2,476
100,71
125,29
2,488
100,78
124,13
2,464
5
99,89
124,02
2,483
99,71
123,46
2,476
6
100,60
124,14
2,468
100,41
124,80
2,486
101,47
125,60
2,476
101,70
125,74
2,473
102,02
124,00
2,431
102,15
123,93
2,426
99,69
124,60
2,500
100,09
125,13
2,500
99,17
123,71
2,495
99,47
123,90
2,491
100,60
123,89
2,463
101,00
124,43
2,464
99,38
124,88
2,513
99,05
124,33
2,511
13
99,51
125,24
2,517
99,95
125,25
2,506
15
101,34
124,68
2,460
101,77
125,09
2,458
2
3
4
7
8
9
10
11
12
(D/H)II
abs(∆(D/H)I)
Cuadrados
0,06
R
abs(∆(D/H)II)
Cuadrados
abs(∆(R))
Cuadrados
0,004
0,46
0,212
0,007
0,00005
0,05
0,002
0,04
0,002
0,001
0,00000
0,06
0,004
0,16
0,026
0,005
0,00002
0,07
0,005
1,16
1,346
0,024
0,00058
0,18
0,032
0,56
0,314
0,007
0,00005
0,19
0,036
0,66
0,436
0,018
0,00032
0,23
0,053
0,14
0,020
0,003
0,00001
0,13
0,017
0,07
0,005
0,005
0,00002
0,40
0,160
0,53
0,281
0,000
0,00000
0,30
0,090
0,19
0,036
0,004
0,00002
0,40
0,160
0,54
0,292
0,001
0,00000
0,33
0,109
0,55
0,302
0,002
0,00000
0,44
0,194
0,01
0,000
0,011
0,00012
0,43
0,185
0,41
0,168
0,002
0,00000
Suma de los
cuadrados:
1,050
3,437
0,00120
Sr
0,19
0,34
0,006
r
0,53
0,96
0,018
Certificado conforme
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Cuadro I-4:
Laboratorio 4: un vino analizado 16 veces
Repetición
(D/H)I
(D/H)II
R
1
101,38
126,87
2,503
2
101,30
126,22
2,492
3
100,98
125,86
2,493
4
100,94
126,00
2,497
5
100,71
125,79
2,498
6
100,95
126,05
2,497
7
101,17
126,30
2,497
8
101,22
126,22
2,494
9
100,99
125,91
2,494
10
101,29
126,24
2,493
11
100,78
126,07
2,502
12
100,65
125,65
2,497
13
101,01
126,17
2,498
14
100,89
126,05
2,499
15
101,66
126,52
2,489
16
100,98
126,11
2,498
(D/H)I
(D/H)II
R
Varianza:
0,0703
0,0840
0,000013
Sr
0,27
0,29
0,004
r
0,75
0,82
0,010
Los datos combinados para la desviación típica de repetibilidad y para el límite de
repetibilidad pueden, por tanto, estimarse del siguiente modo:
(D/H)I
(D/H)II
R
Sr
0,26
0,30
0,005
límite de repetibilidad r
0,72
0,84
0,015
Los datos de los estudios de repetibilidad internos fueron proporcionados por (en orden
alfabético):
- Bundesinstitut für Risikobewertung,
Thielallee 88-92 PF 330013 D-14195 BERLÍN – ALEMANIA
- Fondazione E. Mach-Istituto Agrario di San Michele all'Adige ,
Via E. Mach, 1 - 38010 San Michele all'Adige (TN), ITALIA
- Joint Research Centre - Institute for Health and Consumer Protection,
I-21020 ISPRA (VA) – ITALIA
Certificado conforme
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- Laboratorio Arbitral Agroalimentario, Carretera de la Coruña, km 10,7
E-28023 MADRID – ESPAÑA
Anexo II: Evaluación de la reproducibilidad a partir de los ensayos de aptitud
Desde diciembre de 1994, se han organizado con regularidad ejercicios de ensayos de aptitud
sobre la determinación de parámetros isotópicos en el vino y varias otras matrices de
alimentos. Estos ejercicios de ensayos de aptitud permiten a los laboratorios participantes
evaluar su rendimiento y la calidad de sus análisis. La utilización estadística de estos
resultados obtenidos sobre una gran cantidad de muestras a lo largo de un período de tiempo
prolongado permite la apreciación de la variabilidad de las mediciones bajo condiciones de
reproducibilidad. Esto permite una buena estimación de los parámetros de varianza y del
límite de reproducibilidad del método. Los resultados de 40 rondas de ensayos de aptitud
desde 1994 hasta 2010 para distintos tipos de vino (tinto, blanco, rosado, seco, dulce y
espumoso) se resumen en el cuadro II-1 presentado abajo.
Para (D/H)I y (D/H)II la SR combinada puede, por tanto, ser calculada usando la siguiente
ecuación:
donde Ni ,y SR,i son el número de valores y la desviación típica de la reproducibilidad de la
ronda iº, y K el número de rondas.
Considerando la definición de la relación intramolecular R, y aplicando las reglas estándar de
propagación de errores, asumiendo que (D/H)I y (D/H)II no están correlacionadas (los
términos de covarianza corresponden a cero), se puede también calcular la desviación típica
de reproducibilidad para este parámetro.
Se pueden calcular, por tanto, las siguientes cifras:
(D/H)I
(D/H)II
R
SR:
0,35
0,62
0,006
Límite de reproducibilidad R
0,99
1,75
0,017
Certificado conforme
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Cuadro II-1: : Ensayo de aptitud FIT – Resumen de los valores estadísticos observados en las muestras de vino:
(D/H)I
(D/H)II
Muestra
Año
Ronda
N
Media
SR
N
Media
SR
Vino tinto
1994
R1
10
102,50
0,362
10
130,72
0,33
Vino rosado
1995
R1
10
102,27
0,333
10
128,61
0,35
Vino tinto
1995
R2
11
101,45
0,389
11
127,00
0,55
Vino tinto
1996
R1
11
101,57
0,289
11
132,23
0,34
Vino rosado
1996
R2
12
102,81
0,322
12
128,20
0,60
Vino blanco
1996
R3
15
103,42
0,362
15
127,97
0,51
Vino tinto
1996
R4
15
102,02
0,377
13
131,28
0,30
Vino rosado
1997
R1
16
103,36
0,247
16
126,33
0,44
Vino blanco
1997
R2
16
103,42
0,444
15
127,96
0,53
Vino blanco dulce
1997
R2
14
99,16
0,419
15
130,02
0,88
Vino
1997
R3
13
101,87
0,258
15
132,03
0,61
Vino dulce
1997
R3
12
102,66
0,214
12
128,48
0,48
Vino rosado
1997
R4
16
102,29
0,324
16
129,29
0,63
Vino dulce
1997
R4
15
102,04
0,269
13
131,27
0,30
Vino blanco
1998
R1
16
105,15
0,302
16
127,59
0,59
Vino dulce
1998
R3
16
102,17
0,326
16
129,60
0,56
Vino tinto
1998
R4
17
102,44
0,306
17
131,60
0,47
Vino blanco
1999
R1
14
102,93
0,404
13
129,64
0,46
Vino dulce
2000
R2
15
103,19
0,315
14
129,43
0,60
Vino
2001
R1
12
105,28
0,264
16
131,32
0,68
Vino dulce
2001
R2
14
101,96
0,249
15
128,99
1,05
Vino
2002
R1
17
101,01
0,365
16
129,02
0,74
Vino
2002
R2
17
101,30
0,531
17
129,28
0,93
Vino
2003
R1
18
100,08
0,335
18
128,98
0,77
Vino dulce
2003
R2
17
100,51
0,399
18
128,31
0,80
Vino
2004
R1
18
102,88
0,485
19
128,06
0,81
Vino dulce
2004
R3
16
101,47
0,423
16
130,10
0,71
Vino
2005
R1
19
101,33
0,447
19
129,88
0,76
Vino dulce
2005
R2
15
102,53
0,395
15
131,36
0,38
Vino seco
2006
R1
18
101,55
0,348
18
131,30
0,51
Vino dulce
2006
R2
18
100,31
0,299
18
127,79
0,55
Vino
2007
R1
18
103,36
0,403
18
130,90
0,90
Vino dulce
2007
R2
19
102,78
0,437
19
130,72
0,55
Vino
2008
R1
24
103,20
0,261
23
131,29
0,59
Vino dulce
2008
R2
20
101,79
0,265
19
129,73
0,34
Vino seco
2009
R1
24
102,96
0,280
23
130,25
0,49
Vino dulce
2009
R2
21
101,31
0,310
21
127,07
0,50
Vino seco
2010
R1
21
101,80
0,350
20
129,65
0,40
Vino espumoso
2010
R1
11
101,51
0,310
11
129,09
0,68
Vino seco
2010
R2
20
104,05
0,290
19
133,31
0,58
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