08.3 genetica.doc

XIII Congreso Nacional Farmacéutico
Granada, 15-18 de octubre de 2002
Mesa Redonda: Análisis Clínicos: Futuro de las Especializaciones Farmacéuticas
Ponencia: Nuevas Salidas Profesionales: Genética-Citogenética-Genética Molecular
Eduardo Gómez Arqueros
Farmacéutico Genetista, Valladolid
Mesa Redonda: Análisis Clínicos: Futuro de las
Especializaciones Farmacéuticas
Genética-Citogenética-Genética Molecular
Eduardo Gómez Arqueros
Farmacéutico Genetista, Valladolid
La forma más sencilla de definir la genética es la rama de la medicina que estudia los
genes y su herencia.
En la genética humana existen muchos campos de interés, siendo las más importantes la
citogenética (estudio de los cromosomas), Genética molecular (Aplicación de las técnicas de
biología molecular al estudio de la estructura y función de genes individuales) y la genética
clínica (aplicación al diagnóstico y cuidado del enfermo).
La genética clínica es aplicada por un médico genetista (pediatra, ginecólogo, hematólogo,
etc.). La citogenética y la genética molecular son áreas de laboratorio que pueden ser ejercitadas
por un farmacéutico, biólogo, médico o químico.
Citogenética
La citogenética es la ciencia que estudia los cromosomas, su estructura y su herencia.
Estos cromosomas de aspecto homogéneo en el núcleo celular en interfase se condensan en la
división celular realizándose su estudio en la etapa de metafase de la mitosis. El análisis
cromosómico se ha convertido en un procedimiento diagnóstico importante en la práctica diaria de
la medicina y como describiremos más adelante, las anomalías cromosómicas constituyen causas
importantes de problemas de fertilidad, pérdidas reproductivas y defectos congénitos.
El cariotipo sin bandas es la clasificación por tamaño y la posición del centrómero de los
cromosomas en 7 GRUPOS (A, B, C, D, E, y G) según la ISCN(International Sistem for Human
Citogenetic Nomenclature, París 1971). Gracias a las técnicas de bandeado Giemsa se han
podido diferenciar los 23 pares de cromosomas.
Las células más utilizadas debido a su capacidad de crecer y dividirse rápidamente en
cultivo son:
Ø Linfocitos sangre periférica:
Extracción mediante una venopunción con heparina y cultivo de
linfocitos T estimulados con el mitógeno Fitohemaglutinina sacrificando
el cultivo a las 72 horas con colchicina. (cordocentésis).
Ø Vellosidades coriónicas o líquido amniótico:
cultivo de tejido trofoblástico(vía transcervical o transabdominal, 9
semanas de gestación, 1% pérdidas) o amniocitos
(amniocentésis
transabdominal, 14 semanas de gestación, 0,3 % pérdidas)
para
el diagnóstico prenatal
Ø células linfoblastoides de médula ósea:
Cultivo para el estudio de alteraciones cromosómicas producidas por
enfermedades hematológicas malignas como el linfoma de Burkitt(t
8,14) oncogén c-MYC o L.M.C.(t9,22).
La presencia de alteraciones da un valor diagnóstico y pronóstico de la
enfermedad.
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Análisis cromosómico
En los seres humanos el núcleo celular normal contiene 46 cromosomas (23 pares). 22
pares son iguales en las mujeres y en los varones y se denominan autosomas. El par 23
corresponde a los cromosomas sexuales, gonosomas, y contiene dos Xs en la mujer y un X y un
Y en el varón. Cada cromosoma normal en metafase puede ser visto como dos cromátidas que se
unen estrechamente en un punto llamado constricción primaria o centrómero (cen). El centrómero
divide al cromosoma en dos brazos denominados:
Según la posición del centrómero podemos clasificar los cromosomas en tres tipos:
• Cromosoma Metacéntrico: los cromosomas que tienen el centrómero en el
centro ( pares 1, 3, 16, 19 y 20).
• Cromosoma Acrocéntrico: Los cromosomas que tienen el centrómero muy cerca
del extremo. Los brazos cortos de estos cromosomas tienen al final unas estructuras llamadas
satélites (pares 13, 14, 15, 21, 22 e Y).
• Cromosomas submetacéntrico: tienen el centrómero en posición intermedia a
entre las anteriores.
En la nomenclatura citogenética el cariotipo se nombra primero el número de cromosomas
y después el complemento sexual. Ej. : 46,XX. Para nombrar una determinada banda se nombra
primero el cromosoma, después el brazo, la región y el número de banda que se enumera a
partir del 1, comenzando por la banda cercana al centrómero. Ej. 9p12: cromosoma 9, brazo corto,
región 1, banda 2.
CARIOTIPO HUMANO NORMAL
Cada especie tiene un complemento cromosómico, característico en número y morfología.
Esto es lo que conocemos como cariotipo. El estudio de las metafases del cultivo de células de un
tejido de un individuo es lo que conocemos como cariotipo constitucional.
El cariotipo de una mujer normal es 46,XX.
El cariotipo de un hombre normal es 46,XY.
VARIACIONES CROMOSÓMICAS EN UN CARIOTIPO NORMAL
En la cromatina (asociación de ADN y proteínas del que se componen los cromosomas)
podemos diferenciar la Eucromatina regiones codificantes y la heterocromatina regiones no
codifi cantes. La heterocromatina presenta una considerable variación entre individuos en la
cantidad y distribución.
Dentro de un cariotipo normal nos podemos encontrar tres regiones heterocromáticas
con alta variabilidad:
Ø
Heterocromatina centromérica: muy visible en los cromosomas 1, 9 y 16.
Según el ISCN se describe como qh+ ó qh-. Ej. : 46,XX, 16qh+. Cromosoma 16 normal con
región heterocromática mayor que el otro 16.
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Ø
Brazos cortos y satélites de los cromosomas acrocéntricos: el brazo
corto aparece como una extensión de la región centromérica y los satélites son las
pequeñas masas de cromatina en forma de bolas oscuras que aparece el extremo del
brazo y que codifican el RNA ribosómico. En el ISCN se denominan 46,XX, 13s+. Satélites
largos en el cromosoma 13. Y 46,XX, 22pss. Satélites dobles en el cromosoma 22h.
Ø
Brazo largo del cromosoma Y: la parte distal del brazo largo es una
región muy variable en el cromosoma Y. Normalmente estas variaciones se transmiten sin
cambios de padres a hijos. No tiene efectos clínicos conocidos. Según el ISCN se nombran
Yqh+ ó Yqh-.
EL CARIOTIPO HUMANO ANORMAL
Los cariotipos anormales se producen por errores en la meiosis durante la
fertilización o por errores en la división meiótica.
Las
anomalías
cromosómicas
pueden
ser
numéricas
o
estructurales:
ANOMALÍAS NUMÉRICAS
1.
ANOMALÍAS NUMÉRICAS DEL CONJUNTO: Poliploidía. Ej. Tetraploidía
92,XXXX ó 92,XXYY.Triploidía 69,XXY.
Tanto la triploidía como la tetraploidía se han observado en fetos que no llegan a término.
La triploidía es causa del 20% de los abortos espontáneos. 1/20.000 rnv. No hay evidencias de
relación con la edad materna.
Es probable que la triploidía ocurra por un fallo en una de las divisiones de maduración
en el óvulo (diginía) o en el espermatozoide (diandría) o por doble fertilización de un ovocito
(dispermia).
Las tetraploidías proceden de una incompleta segmentación del cigoto.
2.ANOMALÍAS NUMÉRICAS PARCIALES AUTOSÓMICAS: su nomenclatura es muy
simple se suma o resta el cromosoma implicado Ej. 47,XY, +13.
Ø
Trisomía 21 (Sr. De Down)
- Frecuencia 1/800 r.n.v. 85% sobreviven al año de vida.
-Fenotipo: Retraso mental (CI 40-70) estatura corta, cuello corto, puente nasal plano, boca
abierta con macroglosia, pliegue palmar simiesco, enfermedad cardiaca congénita(1/3), fístula
duodenal, mayor riesgo de leucemia, hipotiroidismo, inmunodepresión, Varón infértil, mujer con
baja fertilidad (50% de riesgo de recurrencia), alzheimer etc.
- ¾ abortan espontáneamente. Riesgo asociado con la edad materna.
Ø
Trisomía 18 (Sr. De Edwards)
- frecuencia: varía entre 1/3.000 y 1/7.000
- Fenotipo: retraso mental, fallo en el crecimiento CIR, hipotonía muscular,
malformaciones cardiacas, implantación de los pabellones auriculares baja y mal
formes, puños cerrados de manera característica( segundo y quinto dedo superponen
al tercero y cuarto), etc.
- 95% abortan espontáneamente y la supervivencia postnatal es escasa.
Influencia de la edad materna.
Ø
Trisomía 13 (Sr. De Patau)
- Frecuencia: 1/25.000
- Fenotipo: Grave retraso mental y de crecimiento, microcefalia, labio leporino, paladar
hendido, coloboma de iris e incluso ausencia de los ojos, polidactilia, alteraciones cardiacas
graves, criptorquidia, etc.
- La mayoría abortan antes del sexto mes de gestación y la supervivencia postnatal es
escasa.
3.ANOMALÍAS NUMÉRICAS PARCIALES, SEXUALES: Su nomenclatura es distinta a la
de los autosomas. Los cromosomas sexuales se incluyen juntos y simplemente se añaden u
omiten. Ej. 47,XXY. 48,XXXY. 45,X.
a.
Trisomías sexuales.
Ø
47,XXY. Sr. Klinefelter
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-Frecuencia: 1/1.500 -1.800 rnv. Mosaicismo en un 15%(mejor pronóstico).
-Origen: error en la disyunción meiótica materna o paterna.
-Fenotipo: Muy variable. Retraso mental poco probable (leve en el habla y
desarrollo psicomotriz). En la adolescencia aparece ginecomastia(30%), altura
superior a la media, retraso puberal( Tto. con testosterona), testículos de pequeño
tamaño(infertilidad), vello facial de escaso crecimiento. 87% de las parejas que lo
detectan por diagnóstico prenatal llevan a termino el embarazo.
-Tasa de supervivencia de un 97%.
Ø
47,XXX. Triple X o Trisomía del X
-Mujer con fenotipo muy variable: infertilidad, CI normal, desarrollo puberal
precoz.
-Origen: error en la disyunción meiótica materna.
47,XYY. Sr. XYY
-Frecuencia:1/1.000 rnv.
-Origen: Error meiosis paterna.
-Fenotipo: riesgo elevado de problemas de conducta(agresividad, 3% de
los presos). Fertilidad normal.
b.
Monosomías sexuales:
Ø
45,X. Sr. De Turner
-Frecuencia: 1/2.500 rnv. Mosaicismo en un 40% (45,X/46,XX)
-Diagnóstico prenatal: pliegue nucal
aumentado, Higroma quístico
cuello(desarrollo linfático anómalo debido a una hipoalbuminemia temprana).
-Fenotipo: inteligencia normal (dificultades en el habla y psicomotoras),
Pterigium coli (Desarrollo anormal sistema linfático en el cuello), algunas al nacer
presentan edema en el dorso del pie, anomalías cardiacas y renales, en el
desarrollo puberal aparece la corta estatura, digenesia gonadal, etc. Tto.
Estrógenos y GH mejoran el desarrollo de los caracteres sexuales secundarios y
la estatura.
-98-99% abortan espontáneamente(10% de los abortos). No hay relación
con la edad materna.
c.
Polisomías sexuales :
Ø
48,XXXY(1/20.000) y 49,XXXXY(1/80.000) variante del Sr. De Klinefelter
Ø
48,XXXX y 49,XXXXX variante femenina del Klinefelter
Ø
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RIESGO DE ALTERACIONES CROMOSÓMICAS POR EDAD
MATERNA Y EDAD GESTACIONAL(1/Nº en la tabla)
Edad
Matern
a
Trisomía 21
Trisomía 18
12
20
40
12
25
1.06
8
946
30
626
1.29
5
1.14
7
759
1.52
7
1.35
2
895
35
249
302
356
2.48
4
2.20
0
1.45
6
580
40
44
68
21
82
26
97
30
157
50
20
20
Trisomía 13
Edad gestacional(semanas)
40
12
20
40
12
4.897 18.01
3
4.336 15.95
1
2.869 10.55
4
1.114 4.202
2
310 1.139
98
359
7.82
6
6.93
0
4.58
5
1.82
6
495
156
14.65
6
12.97
8
8.587
3.419
927
292
42.42 1.47
3
1
37.56
7
24.85
6
9.876
Turner
Klinefelt
er
20
40
=
3.12
5
4.16
7
1.667
2.683
846
1.667
1.667
1.250
1.000
833
ANOMALÍAS ESTRUCTURALES
A) Reordenamientos desequilibrados:
En estos casos es probable que el fenotipo del paciente resulte anormal.
1.Deleciones: Pérdida de un segmento cromosómico que genera un desequilibrio. Las
consecuencias clínicas dependen del tamaño delecionado y el número o función de los genes que
contiene. Su abreviatura según el ISCN es del. Ej. 46,XX, del(6)(p22) deleción en el brazo corto del
cromosoma 6.
Ø
Sr. Cri du Chat (Síndrome del maullido de gato)
-Frecuencia: 1/30.000-50.000 rnv. 46,XY, del(5)(p15)
-Fenotipo: retraso mental grave, poca esperanza de vida(40 años),
llanto recién nacido característico,
microcefalia(cabeza pequeña),
hipertelorismo(ojos separados), pabello nes auriculares de implantación
baja, cara de luna, dificultades para comer, frecuentes infecciones
respiratorias, etc.
-80-85% de los casos son de aparición esporádica y el 10-15%
restante, son hijos de portadores de una translocación.
También podemos encontrarnos con microdeleciones o deleciones no visibles mediante
las técnicas de bandeado Giemsa, las cuales pueden ser detectadas por las técnicas de Biología
Molecular conocida como F.I.S.H. (Fluorescence in situ hibridization).
2.Duplicación: Duplicación de un segmento cromosómico. Puede ser directa o inversa. Su
abreviatura según la ISCN es dup. Ej. 46,XY, dup(4)(q11q21) duplicación de un segmento entre
las bandas 11 y 21 del brazo largo del cromosoma 4.
3.Cromosomas en anillo: Se forman cuando se producen dos roturas terminales en un
cromosoma y se unen los extremos. Son muy raros pero se han detectado para cada cromosoma
humano. Nomenclatura r. Ej. 46,X , r(X) debido al pérdida de la banda Xq21 cursan con un
fenotipo semejante al del Sr. de Turner (5%) y algunos pacientes manifiestan un leve retraso
mental.
4. Isocromosomas: cromosoma al que le falta un brazo y el otro está duplicado. Son
frecuentes los mosaicos. Nomenclatura i. Ej. 46,X, i(Xq) isocromosoma del brazo largo del
cromosoma X que suele cursar con un fenotipo semejante al Sr. de Turner (10%).
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5. Cromosomas marcadores: Son cromosomas diminutos formados por reordenamientos
complejos. Suelen estar formados por heterocromatina centromérica, pero pueden llegar a
contener parte de algún gen. Su identificación es normalmente compleja y su hallazgo en un
cariotipo fetal complica la evaluación clínica y el consejo genético. Las nuevas técnicas de pintado
cromosómico F.I.S.H. han facilitado su identificación, pero pueden llegar a incrementar el coste
económico y de tiempo. Nomenclatura +mar. Ej. 46,XX, +mar.
Frecuencia: 1,5/ 1.000 De lo que aparecen de novo, se calcula que el 13% se asocian a
alteraciones fenotípicas.
B) Reordenamientos equilibrados:
Estos no tienen efecto fenotípico, ya que toda la información genética se encuentra
presente. Sin embargo, estos reordenamientos estructurales constituyen una amenaza para la
siguiente generación ya que estos portadores pueden producir una alta frecuencia de gametos
desequilibrados y, por lo tanto tener descendencia anormal con cariotipos desequilibrados.
1. Inversiones: Se produce por dos roturas dentro de un cromosoma, inversión del
segmento entre ellas y unión de los fragmentos cromosómicos implicados. Estas, según sean las
roturas, en cada brazo o en un mismo brazo, las clasificamos en pericéntricas (incluyen del
centrómero) o paracéntricas. El fenotipo del paciente es normal y su importancia clínica se
relaciona con su descendencia.
La inversión del cromosoma 9, presente en más del 1% de la población
citogenéticamente estudiada, se considera una variante normal que no tiene repercusión clínica
en los portadores y parece no estar asociada con riesgo significativo de aborto o descendencia
desequilibrada. Nomenclatura inv. Ej. 46,XX, inv(9)(p11q12).
2.Translocaciones: Existen dos tipos:
2a.Translocaciones recíprocas: Intercambio de segmentos cromosómicos entre dos
cromosomas. El número cromosómico total no cambia. No suelen tener repercusión clínica en el
portador, pero se asocian con un riesgo elevado de gametos desequilibrados y descendencia
anormal. Nomenclatura t. Ej. 46,XY, t(3;22)(p21;q11) Translocación entre el brazo pequeño del
cromosoma 3 y el brazo largo del cromosoma 22.
2b. Translocaciones robertsonianas: Reordenamiento en el que intervienen dos
cromosomas acrocéntricos perdiendo generalmente los brazos cortos en los cuales están
codificados los genes del RNA ribosómico. Debido a que existen varias copias de estos en el resto
de cromosomas acrocéntricos, el portador suele ser fenotípicamente normal con un número
cromosómico total de 45 cromosomas. Tienen un riesgo elevado de gametos desequilibrados y
descendencia anormal. Ej. 45,XX, t(13;22)(q11;q12).
2c. Inserción: Translocación no recíproca en el que un segmento se retira de un
cromosoma y se inserta en otro de manera directa o inversa. Nomenclatura ins.
NUEVAS TECNOLOGÍAS
Ø FISH (hibridación in situ molecular)
Nueva tecnología que utiliza sondas de DNA marcadas con fluorescencia para detectar o
confirmar anomalías génicas o cromosómicas que no se pueden detectar con las técnicas
citogenéticas de rutina. Para su aplicación desnaturalizamos la muestra de DNA, hibridamos las
sondas marcadas y observamos en un microscopio de fluorescencia la señal emitida.
Esta técnica es útil para la detección en núcleos o metafases de microdeleciones,
cromosomas marcadores, confirmación de translocaciones, etc.
La sensibilidad de esta técnica es mayor que la citogenética de rutina pero depende de un
síndrome o alteración concreta. Su utilización se está incrementando para la detección en líquido
amniótico de las principales trisomías (13, 18 y 21) y determinación del sexo (X e Y) en 48-72
horas, siempre esperando a la citogenética de rutina para confirmar el resultado ya que esta
técnica no sustituye el análisis completo del cariotipo.
Recientemente ya se disponen técnicas que nos permiten pintar cada cromosoma de un
color (SKY) o con bandas características (RX-FISH). Estas técnicas tienen aún un coste elevado
pero esperamos que en un futuro próximo se conviertan en una herramienta habitual en el
laboratorio de Genética para facilitar la labor del citogenetista.
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Ø QF-PCR
Esta técnica de nueva generación está sustituyendo a la técnica FISH para la detección en
24-48 horas de las principales trisomías y cromosomas sexuales en líquido amniótico, siendo esta
un complemento a la citogenética de rutina.
El principio del método se basa en la proporcionalidad entre la cantidad inicial de una
secuencia de ADN y la cantidad del producto de amplificación generado durante el inicio de la fase
exponencial de la PCR. La cuantificación del producto de amplificación es posible gracias a la
utilización de cebadores marcados con fluorocromos. La señal fluorescente es capturada y
procesada por un sistema informático lo que facilita su interpretación por el citogenetista.
Ø BIO-Chips
También conocida como microarray DNA -chip, esta tecnología va a revolucionar el análisis
molecular. Como todas las grandes ideas es conceptualmente sencilla, aunque requiere de una
infraestructura notable.
El chip está formado por una placa de sílice o nylon donde inmovilizamos de forma
ordenada miles(hasta 40.000) de secuencias de c-DNA (DNA complementario), construyendo así
un panel de sondas semejante a un chip informático. La naturaleza de estas secuencias de DNA
estará en función de las aplicaciones que queramos darle a nuestro chip. Sobre este chip se
colocará el DNA a estudiar marcado con un fluorocromo y si híbrida algunas de las secuencias de
nuestro chip emitirá una señal que será capturada y procesada por un autoanalizador.
Este bio-chip va a permitirnos estudiar los más de 30.000 genes localizados en los
cromosomas y sus variaciones interindividuales, incluyendo las distintas propensiones a una u otra
enfermedad. Su utilización será crucial en la medicina del futuro será crucial para la prevención y
diagnóstico personalizado.
Aplicaciones del Bio-chip:
. Cáncer: la formación de un tumor se debe a una compleja acumulación de mutaciones de
los genes de una célula que provocan que escape de control y prolifere indebidamente. Algunas
de estas mutaciones son causadas por agresiones externas(tabaco, radiación ultravioleta solar,
etc.) y otras las lleva puestas un individuo desde su nacimiento, lo que explica la susceptibilidad de
algunas personas a desarrollar uno u otro tipo de cáncer. Conocer estas mutaciones nos va a
permitir si responderá a un tratamiento u otro.
. Enfermedades simples: de los 30.000 genes humanos hay unas 1.100 variaciones
asociadas a unas 1.500 enfermedades. Predecir el riesgo será ahora relativamente sencillo.
.Enfermedades complejas: la propensión genética a las enfermedades más comunes no se
debe a la alteración de un solo gen, sino a decenas o cientos a la vez. Los bio-chips
revolucionarán la medicina al analizar de una sola vez todas las variantes de esos genes.
.Fármacos a medida: el conocer las mutaciones especificas que provoquen una
enfermedad en un individuo, nos va a permitir personalizar el tratamiento. La administración de
EEUU ha calculado que las reacciones adversas a medicamentos causan en dicho país dos
millones de hospitalizaciones al año.
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