Application Note 5

Application Note 5
Uso de materiales de referencia
certificados para la cuantificación de
OMG respecto al cociente del número de
copias de ADN
Noviembre 2007
Autor: Philippe Corbisier
Comisión Europea – Centro Común de
Investigación – Instituto de Medidas y
Materiales de Referencia (IRMM)
Retieseweg 111, 2440 Geel, Bélgica
La presente nota de aplicación orienta sobre el uso correcto de los
E-mail: [email protected]
materiales de referencia europeos certificados en cuanto a su fracción del
www.erm-crm.org
número de copias MG (modificadas genéticamente) correspondientes a
un determinado evento de MG. Los detalles que se dan a continuación se refieren particularmente al uso
de los MRC ERM-BF413d y ERM-AD413 y a los próximos MRC certificados en cuanto a su cociente del
número de copias.
INTRODUCCIÓN
El JRC-IRMM ha desarrollado recientemente dos
nuevos tipos de materiales de referencia certificados
(MRC) de OMG, que permiten la correcta aplicación de
la Recomendación 2004/787/CE [1] mediante el uso de
un sistema rastreable metrológicamente. La presente
nota da instrucciones sobre la forma de aplicar los
nuevos MRC.
CARACTERÍSTICAS DE LOS NUEVOS MRC
DE OMG
A. Nuevos MRC matriciales de OMG
Los valores certificados se basan en dos unidades de
medición diferentes. Además de un valor certificado de
la fracción másica de un evento de modificación
genética específico (véase la nota de aplicación 4), el
nuevo MRC se certifica en cuanto al cociente del
número de copias de ADN. Este parámetro, expresado
en %, se calcula de la forma siguiente:
nº copias ADN MG [cp]
coc. nº copias ADN [%] =
nº copias ADN específico del taxón diana [cp]
x 100
La certificación se basa en mediciones de la reacción
cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real.
(RCP-TR). Estas mediciones se calibran mediante un
calibrador de ADN plasmídico específico, certificado
respecto a que cada plásmido contiene una sola copia
tanto de la secuencia MG como de la secuencia
específica del taxón diana (véase la parte B).
Por tanto, el cociente del número de copias de ADN de
maíz MG está relacionado directamente con el evento
de MG analizado. Por otra parte, en el ejemplo
siguiente, el MRC ERM-BF413d sólo debe utilizarse
junto con el calibrador plasmídico ERM-AD413 y el
método de detección específico de MON 810 [2]. El
cociente certificado del número de copias de ADN de
MON 810 (0,57 %) es distinto de la fracción másica
certificada (10,0 g/kg o 1,0 %) ya que el cociente
certificado del número de copias de MON 810 tiene en
cuenta la situación en cuanto a la cigosidad, la ploidía y
la endorreduplicación de las semillas utilizadas para
producir este material.
El MRC matricial se destina al control de calidad de los
métodos analíticos, incluidas la extracción y
purificación de ADN, así como las fases de medición de
la RCP en relación con un evento concreto de MG.
B. Nuevos MRC plasmídicos de OMG
Los calibradores certificados contienen un determinado
fragmento de ADN específico de una modificación
genética, así como un determinado fragmento de ADN
específico del taxón analizado. Estos plásmidos
contienen un fragmento de 170 pares de bases (pb) de
la unión 5' plant-P35S de MON 810 y un fragmento de
351 pb del gen del grupo de alta movilidad endógeno
del maíz (hmg).
Los valores certificados son el número de fragmentos
de ADN MG clonado y el de fragmentos de ADN
específico del taxón, por cada plásmido. El cociente
entre los números de estos dos fragmentos de ADN se
da como valor indicativo obtenido mediante RCP
simple y doble en tiempo real.
USO DEL CALIBRADOR PLASMÍDICO MG
El calibrador ha de utilizarse junto con un método de
RCP-TR definido [1].
Cada calibrador se entrega en un tubo de plástico
cerrado, en nieve carbónica, y debe mantenerse a 20 °C hasta su utilización. El contenido debe
descongelarse antes de homogeneizarse, y finalmente
abrirse y diluirse bajo flujo laminar para reducir el
riesgo de contaminación. Cada tubo contiene alrededor
6
de 2 x 10 copias (cp) de plásmido por µL y el volumen
recomendado inicial para la serie de diluciones es de
50 µL. Debe seguirse el protocolo de dilución indicado
en el certificado. No se proporciona el amortiguador de
dilución.
La serie de diluciones debe estar siempre recién
preparada y los eventuales restos se desechan en
tubos cerrados. La serie de diluciones se utiliza para
preparar dos curvas de calibración (CC), una del
transgén y otra del gen específico del taxón; cada
curva cuenta con 5 puntos, cada uno de ellos medido
por triplicado en la RCP (véase el ejemplo). Un tubo
proporciona suficiente calibrador para preparar 10 CC
de ambas dianas, lo que significa que pueden
cuantificarse con un solo tubo hasta 100 o 250
muestras. La dosis recomendada de muestra para la
RCP-TR es de 5 µL de ADN molde en cada pocillo de
RCP.
Los valores umbral de fluorescencia medidos (valores
Ct) deben representarse frente al número teórico de
© Comunidades Europeas, 2007. Reproducción autorizada con indicación de la fuente.
Ni la Comisión Europea ni cualquier persona que actúe en nombre de la Comisión se responsabilizan del uso que pueda hacerse de la
información contenida en esta nota de aplicación
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copias de ambos fragmentos, para obtener dos CC.
Estas CC se utilizan para cuantificar la diana MG en
relación con la diana específica del taxón en una
muestra problema. Los resultados pueden calcularse a
continuación como el cociente de ambas dianas y
expresarse en porcentaje según la Recomendación
2004/787/CE. Puede hacerse una RCP de control de
calidad interno, calculando el cociente medio de los
valores Ct medidos relativos a la diana específica del
taxón y la transgénica, en los puntos de calibración
correspondientes a 2 000 cp/µL. Ese cociente debe
concordar con el 1,04 % (incertidumbre ampliada del
0,06 %) en caso de RCP simple, según indica el
informe de certificación (véase asimismo la nota de
aplicación de MRC 1).
EJEMPLO
El ADN genómico extraído de una muestra problema y de ERMBF413d utilizado como material de control de calidad se analiza
mediante RCP-TR, con ERM-AD413 como calibrador. Se obtienen
los valores Ct correspondientes al calibrador ERM-AD413 previa
amplificación de los fragmentos hmg y MON 810 (Cuadro 1). Se
obtienen los valores medios de Ct de 32,76 y 25,44 para la
amplificación de los fragmentos MON 810 y hmg, respectivamente,
en la muestra problema. En cuanto al material de control de
calidad, se obtienen los valores de Ct medios de 31,22 y 22,20
para los fragmentos MON 810 y hmg, respectivamente.
Hay que determinar las pendientes y las ordenadas en el origen de
las dos curvas de calibración para calcular el contenido de
MON810 en ambas muestras, suponiendo que la función más
adecuada es una recta. Para calcular las pendientes y las
ordenadas en el origen pueden utilizarse los módulos incorporados
en MicrosoftExcel o en cualquier otro programa disponible de
determinación/calibración.
Las pendientes (b) de las dos rectas de regresión lineal pueden
calcularse con esta fórmula:
b=
Número total de cp
del fragmento MON 810
50000
10000
1000
100
25
NTC
Número total de cp del
fragmento hmg
500000
100000
10000
5000
1000
NTC
Valor 1
25,30
27,57
31,19
33,99
35,79
45,00
Valores Ct medidos
Valor 2
Valor 3
25,19
25,15
27,62
27,66
30,89
31,14
35,12
34,80
35,67
36,37
45,00
45,00
20,76
22,92
26,39
27,31
29,38
45,00
20,67
23,00
26,36
27,29
29,19
45,00
20,63
23,04
26,33
27,37
29,57
45,00
Ct
medio
25,21
27,62
31,07
34,64
35,95
45,00
20,69
22,99
26,36
27,32
29,38
45,00
Cuadro 1: Ejemplo de valores Ct experimentales
obtenidos con ERM-AD413 como calibrador. NTC1 = sin
control de molde.
∑ (log( x) − log( x))( y − y ) ,
∑ (log( x) − log( x))
2
donde x representa el número de copias del fragmento amplificado e y representa el valor Ct correspondiente. Las pendientes de las
curvas de calibración de los fragmentos hmg y MON 810 que se recogen en el Cuadro 1 son respectivamente de -3,25 y -3,32.
Las ordenadas en el origen (a) de las rectas de regresión se calculan con la fórmula:
a = y − bx
cuando log (x) = 0. En nuestro
ejemplo, los valores a de las rectas de regresión de hmg y MON 810 son 39,26 y 40,93, respectivamente. Estos valores representan
los valores Ct teóricos correspondientes a 1 cp de ambos fragmentos. La pendiente sirve para calcular la eficiencia de la RCP (ε) con
la fórmula: ε = (10-1/b - 1)*100. En nuestro ejemplo, las eficiencias de la RCP son 99,7 % y 103,1 % en la amplificación de los
fragmentos MON 810 y hmg, respectivamente. El número de copias (cp) de MON 810 presentes en la muestra problema se calcula
con esta fórmula:
 Ct MON 810 − a MON 810 


bMON 810
,
cpMON810 = 10
donde CtMON810, aMON810 y bMON810 son los valores Ct, la ordenada en el origen y la
pendiente obtenidos en la amplificación de MON 810. Se hace el mismo cálculo para determinar el número de copias del fragmento
hmg con la fórmula:
cphmg = 10
 Ct hmg − a hmg


bhmg





. En nuestro ejemplo, la media estimada del número de copias de los fragmentos
MON810 y hmg presentes en la muestra problema es 289 y 17 878 cp, respectivamente. El contenido de MON 810 de la muestra
problema, expresado en porcentaje, es por tanto igual a: 289 cpMON 810
. Se hace el mismo cálculo para el material de
* 100 = 1,62 %
17878 cphmg
control de calidad, que contiene un: 841 cpMON 810
* 100 = 0,47 %
de MON 810. Teniendo en cuenta la incertidumbre asociada con el
177513 cphmg
ERM-BF413d y la incertidumbre de la medición (véase la nota de aplicación de ERM 1), puede comprobarse que el valor medido se
ajusta a los valores certificados de ERM-BF413d. En el ejemplo anterior, el cociente de los valores Ct medios (1,05) obtenido con
10 000 cp (5 µL de ERM-AD413 de 2 000 cp/µL) está de acuerdo con el valor indicativo de 1,04 ± 0,06 comunicado en el certificado
de ERM-AD413, lo que significa que esta cuantificación de la MG está controlada.
[1] Recomendación 2004/787/CE de la Comisión, de 4 de octubre de 2004, relativa a las directrices técnicas de muestreo y detección
de organismos modificados genéticamente y de material producido a partir de organismos modificados genéticamente, como
productos o incorporados a productos, en el marco del Reglamento (CE) nº 1830/2003 (DO L 348 de 24.11.2004, p.18).
[2] ISO 21570:2005 Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products Quantitative nucleic based methods. Annex D2 Event-specific method for the relative quantitation of maize line MON 810 DNA using
real-time PCR. 93-99.
1
Debe sospecharse que hay contaminación cruzada o amplificación inespecífica si los valores Ct en la situación NTC difieren del
número de ciclos de RCP realizados.
.
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