n"? 66 actividad arginasica y variaciones

N"? 66
Arch. Biol Med. Exper. 4:244-261,
1967
ACTIVIDAD ARGINASICA Y VARIACIONES CUANTITATIVAS DE
LAS PROTEÍNAS Y DEL PESO DURANTE LA EMBRIOGENESIS DEL
SAPO BUFO
SPINOLOSUS.
Arginase activity, a m o u n t of proteins and body weight during t h e
embryogenesis of the toad Bufo
spinolosus.
MARTA BRETOS, CARLOS MARTÍNEZ y J U L I O CABELLO
Instituto
de
Química
Fisiológica
y Patológica,
Borgoño
1470,
Escuela
Santiago,
de Medicina,
Chile.
Recibido para su publicación el 10 de Enero de
Universidad
de
Chile,
1967.
RESUMEN
S e h a n e s t u d i a d o l a s m o d i f i c a c i o n e s q u e e x p e r i m e n t a n el p e s o , la c a n t i d a d
d e p r o t e í n a s y la a c t i v i d a d a r g i n á s i c a d u r a n t e la e m b r i o g é n e s i s del s a p o .
L a s v a r i a c i o n e s q u e se o b s e r v a n e n el peso h ú m e d o de l o s e m b r i o n e s de
Bufo spinolosus
s o n d e b i d a s p r i n c i p a l m e n t e a la p é r d i d a e i n c o r p o r a c i ó n d e
a g u a al m e d i o a m b i e n t e .
L a c a n t i d a d de p r o t e í n a s t o t a l e s a u m e n t a e n l a s 3 p r i m e r a s horas, a l c a n z a n d o u n n i v e l q u e s e m a n t i e n e c o n s t a n t e h a s t a l a s 45 h o r a s , e s decir, n o
m u e s t r a v a r i a c i o n e s d u r a n t e la s e g m e n t a c i ó n y la b l a s t u l a c i ó n . D e s d e l a s 45 a
l a s 75 h o r a s e x p e r i m e n t a una e l e v a c i ó n debida a u n a a c t i v a s í n t e s i s p r o t e i c a ,
y d e s d e l a s 75 a l a s 100 h o r a s se p r o d u c e u n d e s c e n s o . E s t a s v a r i a c i o n e s o b e d e c e n a c a m b i o s q u e e x p e r i m e n t a n l a s p r o t e í n a s del s e d i m e n t o , y a q u e l a s
p r o t e í n a s de l a f r a c c i ó n s o b r e n a d a n t e se m a n t i e n e n casi c o n s t a n t e s . E n esta
ú l t i m a f r a c c i ó n se e n c u e n t r a la arginasa.
L a a c t i v i d a d arginásica p r e s e n t a u n n i v e l b a j o e n el h u e v o sin f e c u n d a r
y l u e g o d e s c i e n d e h a s t a l l e g a r a u n m í n i m o e n la b l a s t u l a c i ó n . A p a r t i r de
l a s 45 h o r a s ( g a s t r u l a c i ó n ) s e o b s e r v a u n a u m e n t o q u e s e m a n t i e n e h a s t a
q u e l o s e m b r i o n e s c o m i e n z a n a e c l o s i o n a r . E n las l a r v a s se p r o d u c e u n a dism i n u c i ó n de la a c t i v i d a d de esta e n z i m a . E s p o s i b l e q u e estas m o d i f i c a c i o n e s
d e la a c t i v i d a d a r g i n á s i c a e s t é n v i n c u l a d a s n o s ó l o c o n la e l i m i n a c i ó n de n i t r ó g e n o , y a q u e g r a n p a r t e de él se e x c r e t a e n f o r m a de a m o n í a c o , s i n o t a m b i é n
c o n i m p o r t a n t e s p r o c e s o s b i o s i n t é t i c o s de la m o r f o g é n e s i s . A p o y a r í a n este p l a n t e a m i e n t o l a s r e l a c i o n e s q u e s e h a n d e m o s t r a d o entre las r e a c c i o n e s d e l ciclo
de la urea y la b i o s í n t e s i s de p r o t e í n a s , e s p e c i a l m e n t e básicas, y de n u c l e ó t i d o s
purínicos y pirimidínicos.
INTRODUCCIÓN
Los animales deben encarar u n problema importante, íntimamente ligado a la
cantidad de agua q u e les ofrece el medio
ambiente, la eliminación de los residuos
nitrogenados provenientes del metabolismo de los aminoácidos y d e los nucleótidos. Los vertebrados solucionan este problema utilizando varios productos de excreción de estos residuos. E n t r e los principales figuran: el amoníaco (peces Acti-
nopterigios) (vertebrados amonio télicos),
el ácido úrico (aves y reptiles, exceptuando algunas tortugas) (vertebrados uricotélicos) y la urea ( 1 , 2). L a eliminación
del nitrógeno fundamentalmente por medio del ciclo de la ornitina (Fig. 1) se lleva a cabo en los siguientes grupos: elasmobranquios, coanictios (dipnoos), anfibios
(anuros y urodelos), algunos anápsidos
(reptiles quelónidos) y los mamíferos.
Son ellos los vertebrados ureotélicos (2,
3, 4, 5, 6 ) .
ARGINASA EN EMBRIOGENESIS DEL SAPO
CONEXIONES
PURINAS
<—<
GLUTAMINA
<
<
META BOL/CAS
SEMIALDEHIDO
DEL
CICLO
245
UREOGENETICO
OLUTAMICO
Fig. 1: Esquema que representa las reacciones del ciclo ureogenético y sus relaciones mefcabólioas.
El ciclo d e la ureogénesis tiene múltiples relaciones metabólicas (Fig. 1) que
conviene tener presentes al analizar este
ciclo en organismos e n formación.
Se ha estudiado el ciclo de la ornitina
d u r a n t e el desarrollo de algunos tetrápodos, observándose en mamíferos q u e
la urea no se sintetiza e n una proporción
significativa en el hígado sino hasta fines
de la época fetal. En el período embrionario de la rata y el cerdo se h a n encontrado niveles significativos de algunas enzimas del ciclo ureogénico: ornitina-transcarbamilasa y arginasa (7, 8 ) . En anuros se ha observado que las larvas precoces son fundamentalmente amoniotélicas
y a medida que avanza la metamorfosis
aumenta la excreción de urea y disminuy e la de amoníaco. Posteriormente, al
producirse la adaptación a la vida terrestre, hay una marcada elevación d e la actividad de las enzimas del ciclo de la ornitina, lo q u e d a a entender q u e este ciclo
sería inducido en ese m o m e n t o ( 5 ) . Durante el desarrollo embrionario de otros
anuros se h a n identificado pequeñas can-
tidades de urea en el medio d e cultivo de
los embriones d u r a n t e la segmentación,
aumenta en los últimos períodos del desarrollo embrionario y desciende hacia la
eclosión. Se han encontrado, además, en
el medio de cultivo, cantidades crecientes
de amoníaco e n niveles bastante superiores a los de la urea (9). E n urodelos se
ha comprobado alguna actividad arginásica d u r a n t e la gastrulación, después de
la cual esta actividad se incrementa hasta
antes de la eclosión (10). Los autores de
este último trabajo creen que el ciclo de
la ornitina comienza a operar desde el estado de néurula.
Entre las enzimas d e este ciclo, u n a
de las más estudiadas h a sido la arginasa
(L-arginina u r e a hidrolasa E.C. 3.5.3.1),
que cataliza la transformación d e la arginina en ornitina y urea (8, 11, 12, 13, 14,
15). La arginasa está presente no sólo e n
el hígado sino también en otros tejidos.
Considerando: a) q u e la condición
ureotélica definitiva en anuros se establece al final d e la metamorfosis y b ) q u e
a pesar de esto último no se puede excluir
246
M . BRET0S, C. MARTINEZ Y J.
la posibilidad de q u e funcione completa
o parcialmente el ciclo d e la ornitina en
la embriogénesis de los anuros, se ha estimado interesante estudiar la actividad
de la arginasa d u r a n t e las primeras etapas del desarrollo del sapo Bufo spinolosus y relacionarla con otros aspectos que
se observan en las mismas etapas.
MATERIAL Y MÉTODO
Obtención
de los huevos
y embriones.
Se
u s a r o n e j e m p l a r e s de Bufo spinolosus
Wiegm a n n , 1834, q u e p r o v e n í a n de las s i g u i e n t e s
l o c a l i d a d e s de la p r o v i n c i a de S a n t i a g o : TilTil, El A r r a y á n y P e ñ a l o l é n . L o s distintos
estados del d e s a r r o l l o e m b r i o n a r i o se o b t u v i e r o n e m p l e a n d o los m é t o d o s descritos para
a n u r o s por H a m b u r g e r ( 1 6 ) y V a l e n c i a ( 1 7 ) .
Se t o m a r o n h e m b r a s a d u l t a s r e c i e n t e m e n te r e c o l e c t a d a s y se l e s i n d u j o la o v u l a c i ó n
i n y e c t á n d o l e s h i p ó f i s i s e n t e r a s de h e m b r a s
de la m i s m a e s p e c i e , s u s p e n d i d a s en s o l u c i ó n
H o l t f r e t e r al 1 0 % , en la c a v i d a d p e r i t o n e a l .
El n ú m e r o de g l á n d u l a s i n y e c t a d a s a cada
h e m b r a f l u c t u ó entre 3 y 7, de a c u e r d o con
la e s t a c i ó n del año, para lo cual se usó c o m o
guía la tabla de V a l e n c i a para Bufo
spinolosus ( 1 7 ) .
Los machos producen espermios funcionales todo el año, por lo cual no se l e s a d m i nistró hipófisis ( 1 7 ) . L o s h u e v o s o b t e n i d o s
se c o l o c a r o n en una s u s p e n s i ó n de e s p e r m i o s
fresca, p r e p a r a d a de la s i g u i e n t e m a n e r a : se
e x t r a j e r o n l o s t e s t í c u l o s a u n o o dos m a c h o s
a d u l t o s y se d e s m e n u z a r o n con tijeras finas
e n s o l u c i ó n H o l t f r e t e r al 2 0 % , utilizando 10
m i por cada par de estículos. A n t e s de c o l o car esta s u s p e n s i ó n con los h u e v o s se c o m p r o b ó el m o v i m i e n t o de los e s p e r m i o s al m i c r o s copio. L o s g a m e t o s se m a n t u v i e r o n en c o n tacto d u r a n t e m e d i a hora.
S e v e r i f i c ó la f e c u n d a c i ó n o b s e r v a n d o al
m i c r o s c o p i o e l l e v a n t a m i e n t o de la m e m b r a n a
de f e c u n d a c i ó n y el giro de los h u e v o s , q u e
a n t e s de este p r o c e s o se e n c o n t r a b a n con el
p o l o v e g e t a t i v o , m á s p e s a d o y m á s claro, h a cia arriba. L u e g o se l a v a r o n los h u e v o s y se
d e j a r o n en s o l u c i ó n H o l t f r e t e r al 1 0 % , d o n d e
p e r m a n e c i e r o n d u r a n t e toda la e m b r i o g é n e s i s .
E l m e d i o se r e n o v ó una v e z al día y se e x t r a j e r o n de él los h u e v o s c i t o l i z a d o s y l o s e m briones muertos.
El t i e m p o de d e s a r r o l l o se c o m e n z ó a m e dir d e s d e el m o m e n t o e n q u e los g a m e t o s s e
p u s i e r o n e n c o n t a c t o . L o s estados u s a d o s p a ra las m e d i c i o n e s se clasificaron a t e n d i e n d o
al a s p e c t o y e s t r u c t u r a s que se o b s e r v a r o n
al m i c r o s c o p i o ( F i g . 2 ) , de a c u e r d o con la
tabla de d e s a r r o l l o n o r m a l h e c h a por V a l e n cia ( 1 7 ) para Bufo spinolosus.
P a r a cada una
de l a s m e d i c i o n e s se t o m ó u n p r o m e d i o de
100 h u e v o s o e m b r i o n e s .
Técnica del pesaje. L o s h u e v o s e s t á n e n v u e l tos por cubiertas g e l a t i n o s a s : u n a capa d o b l e
c o n c é n t r i c a e n cada h u e v o y u n c i l i n d r o de
d o b l e p a r e d dentro del cual v a n todos e l l o s
( 1 7 ) . P a r a h a c e r las d e t e r m i n a c i o n e s se c o locaron los huevos o embriones en un vi-
CABELLO
drio de reloj y se l e s e x t r a j e r o n m e c á n i c a m e n t e las e n v o l t u r a s de g e l a t i n a . L u e g o se
p e s a r o n e n u n a b a l a n z a de p r e c i s i ó n ( p e s o
húmedo).
A n t e s de la n e u r u l a c i ó n ( h a s t a las 47 h o ras de desarrollo a p r o x i m a d a m e n t e ) es m u y
difícil e x t r a e r las e n v o l t u r a s g e l a t i n o s a s en
su totalidad p o r m e d i o s m e c á n i c o s . D e b i d o a
esto fue preciso rectificar los p e s o s h ú m e d o s
de las etapas p r e c o c e s del d e s a r r o l l o e m b r i o nario u s a n d o u n factor de c o r r e c c i ó n que se
o b t u v o al digerir estas e n v o l t u r a s con p a paína. P a r a e l l o se s i g u i ó la técnica descrita
por S p i e g e l ( 1 8 ) con a l g u n a s m o d i f i c a c i o n e s .
S e p r e p a r ó una s o l u c i ó n de p a p a í n a ( H a r m a
D r u g , F r a n c i a ) al 5% e n H o l t f r e t e r al 1 0 % ,
se le a g r e g a r o n 120 m g de c l o r h i d r a t o de
cisteína a 100 m i de esta s o l u c i ó n y se ajustó
el pH a 6,7. L o s h u e v o s o e m b r i o n e s p r e c o ces se e x p u s i e r o n a esta s o l u c i ó n a g i t a n d o
c o n t i n u a m e n t e . Se e x a m i n a r o n al m i c r o s c o pio p e r i ó d i c a m e n t e para c o m p r o b a r si q u e d a b a n restos de g e l a t i n a . A s í se e s t a b l e c i ó
q u e 90 m i n u t o s era el t i e m p o a d e c u a d o para
la a c c i ó n c o m p l e t a de la papaína. L o s h u e v o s
o e m b r i o n e s s o m e t i d o s a este p r o c e s o se l a v a r o n en H o l t f r e t e r al 1 0 % y se p e s a r o n .
C o m p a r a n d o estos v a l o r e s con a q u e l l o s obten i d o s por d e s g e l a t i n i z a c i ó n m e c á n i c a se c a l c u l ó u n factor de c o r r e c c i ó n que se a p l i c ó a l o s
r e s u l t a d o s del p e s a j e .
Determinación
de la actividad
arginásica.
Los
h u e v o s o e m b r i o n e s q u e se t o m a r o n para l a s
d e t e r m i n a c i o n e s de arginasa y p r o t e í n a s se
h o m o g e n e i z a r o n e n suero f i s i o l ó g i c o y los h o m o g e n e i z a d o s se c e n t r i f u g a r o n a 30-00 R P M
d u r a n t e 15 m i n u t o s .
La a c t i v i d a d arginásica se d e t e r m i n ó seg ú n el m é t o d o descrito p o r C r u z - C o k e , Cabello, J a d r e s i c y P r a j o u x ( 1 1 ) m o d i f i c a d o
( 1 4 ) y a d a p t a d o al m a t e r i a l e n q u e se realizó e s t e e x p e r i m e n t o . D e s p u é s de la a c t i v a c i ó n e i n c u b a c i ó n , se d e j a r o n reposar l a s
m u e s t r a s d u r a n t e 15 m i n u t o s y l u e g o se filtraron dos o tres v e c e s , hasta o b t e n e r u n
líquido totalmente transparente. En seguida
se d e t e r m i n ó la c a n t i d a d de urea p r o d u c i d a
e m p l e a n d o el m é t o d o c o l o r i m é t r i c o de A r chibald ( 1 9 ) .
U n a u n i d a d de arginasa es la c a n t i d a d de
e n z i m a q u e p r o d u c e u n m i c r o m o l de urea
p o r m i n u t o en las c o n d i c i o n e s e x p e r i m e n t a les ya indicadas. L a a c t i v i d a d específica s e
define c o m o u n i d a d e s de e n z i m a por m i l i g r a m o de proteína. N o se hizo c o r r e c c i ó n para
las u n i d a d e s de arginasa p o r q u e las e n v o l turas g e l a t i n o s a s no p o s e e n a c t i v i d a d arginásica.
Determinación
de la cantidad
de
proteínas.
S e r e a l i z ó la d e t e r m i n a c i ó n de p r o t e í n a s seg ú n el m é t o d o de L o w r y m o d i f i c a d o ( 2 0 ) .
L a c e n t r i f u g a c i ó n de los h o m o g e n e i z a d o s
dio o r i g e n a dos f r a c c i o n e s e n las c u a l e s se
d e t e r m i n ó el c o n t e n i d o de p r o t e í n a s separad a m e n t e . D e b i d o a q u e el s e d i m e n t o c o n t e n í a
casi todo el p i g m e n t o y éste dificultaba la
lectura e n el c o l o r í m e t r o , se c o l o c a r o n s i e m p r e b l a n c o s de p i g m e n t o para corregir las
l e c t u r a s o b t e n i d a s . L a r e a c c i ó n se l e y ó e n
660 m i l i m i c r o n e s , u s a n d o una s o l u c i ó n de ser o a l b ú m i n a de b u e y cristalina ( 0 , 2 m g / m l )
247
ARGINASA EN EMBRIOGENESIS DEL SAPO
I mm
I— H u e v o
4.-
sin
fecundar
(Ohoras).
Ne'urulalT: Tubo n e u r a l , v e n t o s a s
yema caudal
(75 horas).
y
G a ' s t r u l a ( 45 h o r a s ).
5.- N e u r u l a l : P l i e g u e s
(65 horas )
neurales
e n contacto
9.- Larva: Se ha completado
la e c l o s i o ' n
(120 h o r a s ) .
Flg. 2: Principales estados del desarrollo embrionario de "Bufo spinolosus" que se h a n exami­
nado. Las horas corresponden al desarrollo a 18°C.
c o m o p a t r ó n de p r o t e í n a s e n cada oportuni­
dad en q u e se hizo la r e a c c i ó n . S e m i d i ó el
c o n t e n i d o de p r o t e í n a s de las e n v o l t u r a s de
g e l a t i n a y se c o r r i g i e r o n l o s v a l o r e s p r o t e i ­
cos e n l o s e s t a d o s del d e s a r r o l l o a n t e r i o r e s a
la n e u r u l a c i ó n , de a c u e r d o c o n e l factor de co­
rrección o b t e n i d o para el p e s o .
248
M . BRETOS, C. MARTINEZ Y J.
RESULTADOS
Peso. Desde el huevo sin fecundar hasta
el estado de dos blastómeras se observa
u n pequeño incremento del peso (Fig. 3 ) ,
el cual se estabiliza durante la segmentación. E n la gástrula y en el período en
que aparecen los pliegues neurales y se
ponen en contacto, la curva del peso se
eleva hasta valores máximos. Luego se
produce un descenso considerable, relacionado con el cierre del intestino y la
reducción de la cavidad interna del embrión. A partir de las 75 horas de desarrollo h a y cierto crecimiento del animal
por alargamiento y el peso a u m e n t a
otra vez. Por último, disminuye algo inmediatamente después de la eclosión.
Arginasa.
Al centrifugar los homogeneizados de huevos y embriones se obtuvieron dos fracciones: u n sedimento y un
sobrenadante. La arginasa fue encontrada
sólo en el sobrenadante.
Las variaciones de esta enzima durante el desarrollo se observan en la Fig. 4.
Las unidades de arginasa por embrión
presentan un nivel relativamente bajo en
el huevo sin fecundar y disminuyen en las
primeras etapas de la segmentación, llegando a u n mínimo e n la blástula. A partir de la gastrulación (45 horas) se observa un ascenso que continúa en las néurulas y alcanza su m á x i m o al finalizar
la neurulación. En la larva la actividad
arginásica desciende a menos de la mitad del valor máximo a q u e llegó durante el período embrionario.
Se creyó de interés agregar en la Fig.
4 las variaciones q u e experimentan las
proteínas del sobrenadante, que es la
30
60
90
120
HORAS
Fig. 3: Variaciones del peso húmedo durante el desarrollo embrionario del sapo "Bufo spinolosus", desde
«1 (huevo sin fecundar (0 ñoras) hasta la larva recién
eclosionada (120 horas).
CABELLO
fracción q u e posee actividad arginásica.
Proteínas.
L a cantidad de proteínas totales por embrión experimenta u n increm e n t o d u r a n t e las primeras fases del desarrollo (Fig. 5 ) . No obstante, e l aumento ¡más notable de las proteínas comienza
a manifestarse a p a r t i r d e las 45 horas,
llegando a su máximo cuando se completa el cierre del tubo neural y hacen su aparición la región b r a n q u i a l y la yema caudal. En esta época se está completando la
regionalización del animal, es decir, la diferenciación del cuerpo en zonas: cabeza, cuello, tronco y cola. Posteriormente
se produce u n descenso en las proteínas
totales y se estabilizan d u r a n t e la eclosión.
Era importante conocer las variaciones
q u e experimentaban las proteínas de las
dos fracciones obtenidas por medio de la
centrifugación en forma separada, por
cuanto sólo una de ellas presentaba actividad arginásica, como ya se ha señalado. Por ello, en la Fig. 5 se h a n representado además las curvas de las proteínas
de ambas fracciones. Se puede apreciar
que son las proteínas del sedimento las
que presentaban fluctuaciones notables,
en tanto que la parte proteica del sobrenadante se mantiene prácticamente const a n t e a través d e la embriogénesis del
sapo.
DISCUSIÓN
D u r a n t e la embriogénesis, los anuros
no utilizan del medio externo sino agua,
oxígeno y sales minerales y eliminan a
él anhídrido carbónico y sustancias muy
difusibles, tales como amoníaco y urea
(21). Desde el punto d e vista del aporte
de energía, el embrión es u n sistema cerrado y por ello debe satisfacer los requerimientos energéticos d e su mantención
y desarrollo con sus reservas d e vitelo.
Al iniciarse el período larval se produce
una serie de cambios metabólicos y humorales, como adaptación a un nuevo estado
en el cual el individuo comienza a aumentarse. La hidratación es uno de los
fenómenos característicos del crecimiento embrionario (22) y tiene su expresión
en el peso húmedo. El aumento de peso
que se observa en los embriones de B.
spinolosus
(Fig. 3) se debería esencialmente a la incorporación de agua. El descenso que se observa e n t r e las 55 y 75
horas sería debido a la reducción de la
cavidad i n t e r n a del embrión y a la eli-
ARGINASA EN EMBRIOGENESIS DEL SAPO
249
huevo. Contemporáneo con estos fenómenos es el aumento cuantitativo d e las proteínas, lo q u e no significa necesariamente
q u e sea su consecuencia. P o r otra parte,
la curva alcanza u n nivel que se mantiene constante durante la segmentación y
la blastulación.
Hcras
30
60
90
120
Fig. 4: Variaciones de la actividad arginásica (•
•)
en el sobrenadante de faomogenelzados de huevos y
embriones de "Bufo spinolosus" y cantidad de proteínas (o - - - - o) en el misino sobrenadante, durante el
desarrollo embrionario.
minación de g r a n cantidad de agua, tal
como se ha señalado para otros anfibios (22).
Además d e los intercambios de agua
con el medio ambiente, la embriogénesis
d e los anfibios es un período en el cual
se producen cambios (metabólicos importantes, como las variaciones q u e se observan en las proteínas (Fig. 5 ) , en la actividad arginásica (Fig. 4) y e n los ácidos
nucleicos (23, 24, 25, 26, 27, 28).
Los principales cambios cuantitativos
de las proteínas totales de B. spinolosus
encontrados en el presente trabajo ocurren en el transcurso d e : a) las 3 primeras horas, b ) las 45 a 75 horas y e ) las
75 a 100 horas.
a) En este período se observan una serie de cambios morfofuncionales en relación con la fecundación: la penetración
del espermio, modificaciones del citoplasma cortical y levantamiento de la membrana vitelina, además d e la rotación del
30
60
HORAS
90
120
Fig. 5: Cantidad de proteínas durante la embriogénesis de Bufo spinolosus.
proteínas del sobrenadante;
proteínas del sedimento;
proteínas
de ambas fracciones sumadas (proteínas totales).
b ) Una nueva elevación de esta curva
comienza a producirse en la gastrulación
y culmina d u r a n t e la neurulación (45 a
75 horas). E n otros anfibios se h a observado, en este período, activa síntesis proteica (23), especialmente d e ribonucleoproteínas y de proteínas contráctiles, que
proporcionan elasticidad a las células que
deben moldear las estructuras axiales más
primitivas que constituyen los rasgos fundamentales del Phylum Chordata. En la
embriogénesis de B. vulgaris se ha encontrado aumento de la actividad de algunas
enzimas proteolíticas (21). Este fenómeno podría tener relación con la síntesis
proteica que se ha observado en este período en este trabajo, pues dichas enzimas participan en la hidrólisis de las proteínas del vitelo, contribuyendo así a la
mantención del "pool" de aminoácidos del
embrión (21, 23). Como se sabe, el vitelo
contiene una alta concentración de fosfoproteínas, que proporcionan materias primas para la síntesis proteica (29).
c) A partir de las 75 horas, el nivel de
las proteínas totales decae notablemente
(Fig. 5 ) . Esta declinación podría e s t a r relacionada con la disminución de las reservas de vitelo q u e ocurre a fines d e la
neurulación (alrededor de las 90 horas),
lo que provocaría u n retardo en los procesos de síntesis y crecimiento (21). Además se ha encontrado u n a disminución
del nitrógeno total del embrión y u n aumento del amoníaco excretado al medio
de cultivo en las etapas finales de la embriogénesis d e B. vulgaris ( 9 ) . Esta disminución del nitrógeno se debería, en
parte, a la salida de enzimas q u e hidrolizan las envolturas del embrión d u r a n t e
la eclosión. Probablemente, la disminución del nivel de proteínas totales que
hemos observado en este período esté en
relación con otros cambios metabólicos
que no son aún bien conocidos.
No sólo se h a n observado cambios cuantitativos en las proteínas embrionarias,
sino también cualitativos. Las variaciones más notorias de la actividad
arginásica se e n c u e n t r a n en los mismos tres pe-
250
M . BRETOS, C. MARTINEZ Y J.
ríodos q u e en el caso de las proteínas
(Fig. 4 ) . Estos cambios en la arginasa
concuerdan en primer lugar con una creciente eliminación de urea al medio de
cultivo, observada d u r a n t e la embriogénesis de B. vulgaris, alcanzando un máximo cerca del final de la neurulación y
declinando hacia la eclosión (9); esta excreción de urea al medio de cultivo sugiere la aparición de otras enzimas del
ciclo de la ornitina, además de la arginasa, d u r a n t e el desarrollo embrionario.
Los cambios de la arginasa concuerdan
también con el hallazgo de una cierta actividad arginásica a partir de la gastrulación que aumenta hacia el estado de
pre-eclosión, observada en Hynobius
leechii, un urodelo (10).
En el desarrollo embrionario precoz de
la rata se ha observado una curiosa coincidencia: se ha obtenido una curva de
actividad arginásica (8) muy parecida a
la q u e hemos encontrado en B. spinolosus,
pues presenta un valor máximo cuando se
han formado el tubo n e u r a l y el brote
caudal y una disminución a fines de la
embriogénesis.
Se plantea el problema de cuál sería la
función q u e desempeñaría la arginasa en
los comienzos del desarrollo. No se ha
efectuado un estudio enzimático completo
del ciclo de la ornitina en la embriogénesis de anfibios, de modo que no podría
afirmarse categóricamente que la elevación que experimenta la arginasa vaya
acompañada de aumento en la actividad
de las otras enzimas. En todo caso, no puede negarse la posibilidad de que en este
período funcione este ciclo, completo o
incompleto, y que su actividad tenga que
ver con el aporte de materias primas para la síntesis de otras sustancias (Fig. 1),
además de la ureogénesis.
Estas posibilidades podrían resumirse
así:
1) Las variaciones de la urea excretada al medio de cultivo encontradas en B.
vulgaris (a partir del estado de blástula)
(9) coinciden con las variaciones de la
actividad arginásica que hemos encontrado, lo que pone de manifiesto la relación
entre urea producida y actividad arginásica. No hay que olvidar, sin embargo,
que a p a r t i r de la aparición del brote
caudal el nitrógeno se excreta en su mayor parte en forma de amoníaco ( 9 ) , alcanzando éste valores 10 o más veces su-
CABELLO
periores a la urea excretada en ese mismo período.
2) En el desarrollo embrionario del sapo se producen modificaciones cuantitativas y cualitativas de las proteínas, tal
como lo indican las Figs. 4 y 5, el descenso del nitrógeno total (9) y las variaciones de las enzimas proteolíticas
(21). Además, es sabido q u e la arginina
es un aminoácido esencial para la síntesis proteica y, en particular, de las nucleoproteínas q u e poseen una parte proteica de carácter básico (30, 31, 32).
3) También el metabolismo de los ácidos nucleicos d e los anfibios en desarrollo
revela variaciones importantes (23, 25,
26) y se sabe q u e el ciclo de la ornitina
está relacionado con la biosíntesis de las
bases nitrogenadas purínicas y pirimidínicas. El arginín-succinato puede transformarse en anhídrido arginino-succínico
(33) el cual al desdoblarse puede dar
ácido dihidro orótico, molécula básica en
la síntesis de las .pirimidinas, y ornitina,
que puede volver al ciclo o bien transformarse en semi-aldehido glutámico y éste
llegar a glutamina, sustancia q u e aporta
los átomos de nitrógeno números 3 y 9
de la molécula purínica (34).
Puede concluirse que si el ciclo de la
ornitina funciona, completo o incompleto, durante el desarrollo embrionario de
B. spinolosus, antes de alcanzarse la condición ureotélica del adulto (lo que es
muy probable), seguramente tiene más
relaciones con la biosíntesis de proteínas
y de nucleótidos q u e con la ureogénesis,
ya que ésta no es muy importante en esos
períodos por cuanto la mayor parte del
nitrógeno se elimina como amoníaco. En
los urodelos el ciclo ureogenético probablemente tiene relaciones similares con
los procesos de biosíntesis de proteínas y
de nucleótidos.
SUMMARY
Modifications in wet weight, protein
content and arginase activity during embryonic development of the toad Bufo
spinolosus Wiegmann have been studied.
The stages used for t h e determinations
are detailed in Fig. 2.
Variations in weight (Fig. 3) are mainly due to loss or incorporation of water
from the environment.
The total amount of protein increased
251
ARGINASA E N E M B R I O G E N E S I S D E L SAPO
during t h e first 3 hours (Fig. 5) until a
level which remained constant during
cleavage and blástula stage (45 h o u r s ) .
F r o m 45 to 75 hours t h e total amount
of protein increased again, in relation
with an active protein biosynthesis. From
75 to 1O0 hours a decrease w a s observed,
possibly d u e to reduction in t h e amount
of yolk, to the loss of hatching enzymes
a n d / o r to other metabolic changes. Fluc­
tuations i n total protein followed t h e
sediment protein changes because t h e
proteins of the s u p e r n a t a n t fraction ex­
hibited an almost constant level. Arginase was found in t h e latter.
Arginase activity was low in t h e egg and
even lower in t h e blástula stage (Fig. 4 ) .
An increase was observed from 45 to 100
hours. Modifications in arginase activity
should be related not only w i t h t h e eli­
mination of nitrogen during embryogenesis, since it is excreted mainly as ammonia
in this period, b u t also w i t h some biosynthetic processes. This interpretation is
supported by the relations of u r e a cycle
w i t h the synthesis of proteins, specially
basic, and nucleotide synthesis (see Fig. 1).
AGRADECIMIENTOS
N u e s t r o s a g r a d e c i m i e n t o s a l a s Srtas. V i c ­
toria P r a j o u x y María P l a z a p o r su a s i s t e n ­
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