Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por
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Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neoadyuvante en pacientes con cáncer de mama Investigador Principal: Carlos Alberto Parra López M.D. Ph.D. Universidad Nacional de Colombia – Facultad de Medicina Co-Investigadores: David Andrés Bernal Estévez M.D. Ph.D. (c) Universidad Nacional de Colombia – Facultad de Medicina Rafael Tejada Cabrera M.D. Internista – Oncólogo Universidad Nacional de Colombia – Facultad de Medicina Hospital El Tunal – Servicio Oncología Ramiro Sánchez R. M.D. Mastólogo – Oncólogo Universidad Nacional de Colombia – Facultad de Medicina Director Clínica del Seno - Bogotá UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA BOGOTA - 2011 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama TABLA DE CONTENIDOS LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................................................ 3 PALABRAS CLAVE: ....................................................................................................................................... 5 TEMATICA: ................................................................................................................................................................. 5 RESUMEN EJECUTIVO ............................................................................................................................................ 5 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................................................................. 6 JUSTIFICACION ......................................................................................................................................................... 7 OBJETIVOS .................................................................................................................................................................. 8 MARCO DE REFERENCIA ...................................................................................................................................... 9 Quimioterapia neo-adyuvante ...............................................................................................................................9 Activación del sistema inmune durante la terapia neo-adyuvante ................................................... 10 Inmunoterapia y autoinmunidad en cáncer ................................................................................................. 14 Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) ........................................................................................ 15 Antígenos Asociados a Tumor (TAAs) .............................................................................................................. 16 Diversidad del repertorio del receptor de células T (TCR)..................................................................... 18 Importancia de la frecuencia de precursores de LT en cáncer ............................................................ 19 METODOLOGIA PROPUESTA ................................................................................................................ 20 GRUPOS DE ESTUDIO: ......................................................................................................................................... 21 Criterios de inclusión y exclusión ....................................................................................................................... 21 Metodología detallada utilizada para alcanzar cada uno de los objetivos específicos: .......... 22 CONSIDERACIONES ÉTICAS Y AMBIENTALES ................................................................................. 30 PROCEDIMIENTO PARA LA TOMA DEL CONSENTIMIENTO INFORMADO ............................................................ 30 IDENTIFICACION DE LA POBLACION Y/O AREA TERRITORIAL BENEFICIADA ................... 31 PRODUCTOS DEL PROYECTO................................................................................................................ 31 POSIBLES RIESGOS Y DIFICULTADES................................................................................................. 31 IMPACTOS ................................................................................................................................................... 31 CRONOGRAMA ........................................................................................................................................... 33 PRESUPUESTO GLOBAL .......................................................................................................................... 34 ANÁLISIS SITUACIONAL DE LA TEMÁTICA DEL PROYECTO ...................................................... 35 BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................................... 37 ANEXOS ........................................................................................................................................................ 43 Página 2 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama LISTA DE ABREVIATURAS APC Célula presentadora de antígeno AINEs Anti-inflamatorios no esteroideos ANAs Anticuerpos anti-nucleares BFA Brefeldina A CD Cluster de diferenciación CF Citometría de flujo CRT Calreticulina CTA Cancer testis antigens CTL Linfocitos T citotóxicos DC Célula dendrítica DMSO Dimetil sulfóxido FITC Isotiocianato de fluoresceína GM-CSF Factor estimulante de colonia granulocito macrófago HLA Antígeno leucocitario humano HMGB1 High mobility group box 1 HSP Proteína de choque térmico IDO indolamina 2,3-dioxigenasa IFN-γ Interferón gamma IL Interleuquina LT Linfocito T LT-CD4+ Linfocito T CD4+ LT-CD8+ Linfocito T CD8+ M-CSF Factor estimulador de colonia de monocitos Melan-A Antígeno de diferenciación de melanocitos Melan-A/MART-1 26-35 MHC Complejo Mayor de Histocompatibilidad NF-κβ Factor Nuclear Kappa beta NK Linfocitos asesinos naturales NLR Receptor tipo NOD PBMC del inglés Peripheral Blood Mononuclear Cells (Células mononucleares de sangre periférica) PCR-SSP PCR con iniciadores específicos de secuencias PE Ficoeritrina pMHC Complejo MHC - péptido SEB Superantígeno de staphylococcus sp. SFB Suero fetal bovino STAT-3 Signal Transducer and Activator of Transcription-3 TAAs del inglés Tumor Associated Antigens (Antígenos asociados a tumor) TCM Linfocito T de memoria central TCR Receptor de células T TEF Linfocito T efector TEM Linfocito T de memoria efectora TIL Linfocitos infiltrantes de tumor TLR Receptor tipo Toll Página 3 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama TN Linfocito T virgen TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa Treg Linfocitos T reguladores VEGF Factor de crecimiento de vénulas y endotelio Página 4 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama PALABRAS CLAVE: Inmunoterapia, quimioterapia, cáncer de mama, antígenos asociados a tumor (TAA) TEMATICA: MEDICINA REGENERATIVA, INGENIERIA DE TEJIDOS, MEDICINA MOLECULAR E INMUNOTERAPIA RESUMEN EJECUTIVO El cáncer de mama es la tercera causa de muerte por cáncer en Colombia y la primera causa de muerte por cáncer de mujeres en el mundo. Por lo anterior explorar nuevas u optimizar viejas estrategias terapéuticas es importante. La quimioterapia es una importante herramienta para el manejo del cáncer. La quimioterapia con Doxorrubicina y Ciclofosfamida es utilizada ampliamente en esquemas de terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama y otros tumores. Aunque clásicamente se le ha atribuido a este régimen de quimioterapia un papel supresor de la respuesta inmune, estudios recientes en ratones sugieren: (i) que la Doxorrubicina induce muerte de células tumorales con liberación de señales de peligro y antígenos tumorales que estimulan eficientemente la inmunidad contra el tumor y (ii) que la Ciclofosfamida inhibe selectivamente linfocitos supresores de la respuesta inmune. No obstante la trascendencia de estos resultados, ellos no han sido demostrados en pacientes con cáncer tratados con Doxorrubicina/Ciclofosfamida. Para demostrar si existe un efecto inmuno-estimulador de Doxorrubicina/Ciclofosfamida utilizados en terapia neo-adyuvante, en este estudio se monitoreará en sangre de pacientes con cáncer de mama en quimioterapia con Doxorrubicina/Ciclofosfamida el inmunofenotipo y grado de expansión de linfocitos T de memoria específicos contra el tumor y células supresoras antes y después del tratamiento con el fin de evaluar si: (i) la quimioterapia aumenta el reconocimiento del tumor por el sistema inmune y (ii) si hay relación entre reconocimiento inmune y evolución clínica del tumor en cada paciente. Para ello se implementarán metodologías que permitan detectar, cuantificar y analizar la respuesta de LT específicos contra antígenos tumorales en mujeres distribuidas en dos grupos: (i) pacientes con cáncer de mama que recibirán terapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida y (ii) mujeres sanas no tratadas como grupo control. Con la metodología y diseño experimental propuestos en este proyecto buscamos responder las siguientes preguntas: ¿Se favorece la expansión de linfocitos T de memoria con actividad anti-tumoral y la liberación de señales de peligro por las células tumorales con el uso de la quimioterapia neo-adyuvante?, ¿Existe relación entre el grado de activación del sistema inmune inducido por la quimioterapia y la respuesta clínica del tumor? Y por último ¿qué valor predictivo tienen los inmuno-fenotipos analizados con la respuesta clínica de las pacientes? Confiamos que los resultados de este proyecto brinden información que permita proponer el uso de la quimioterapia con Doxorrubicina y Ciclofosfamida como complemento útil de la inmunoterapia en pacientes con cáncer. Página 5 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El carcinoma de mama es una de las principales patologías tumorales en la mujer que ha venido experimentando un incremento en la incidencia y mortalidad durante las últimas décadas. En el 2002, este tumor representó un 22,8% de los casos de cáncer en las mujeres del mundo, por lo que se estima que se diagnostican aproximadamente un millón de casos nuevos por año [1]. Estas cifras de prevalencia de países desarrollados no difieren mucho de las registradas en nuestro país. Según el Anuario Estadístico del 2008 [2], el porcentaje de casos nuevos (sin discriminar los pacientes por género) de cáncer de mama en Colombia fue de 11.8%, un porcentaje similar al del cáncer de cuello uterino, siendo éste el segundo cáncer más frecuente después del cáncer de piel (16.2%) y duplicando al cáncer de estómago y de próstata (6% cada uno). Clásicamente se le ha atribuido a la quimioterapia un papel supresor de la respuesta inmune, sin embargo, existe abundante evidencia experimental en modelos animales que sugieren que el éxito de ciertos regímenes de quimio- o radio-terapia es en parte debido a que con ellos se logra una activación de la inmunidad adaptativa contra los tumores. Las evidencias demuestran que la Doxorrubicina induce en las células tumorales un tipo especial de apoptosis (apoptosis inmunogénica), caracterizada por la liberación de señales de peligro endógenas responsable de la maduración de células dendríticas y la generación de CTL de memoria específicos contra antígenos del tumor. No obstante la trascendencia que estos resultados pudiesen tener para las pacientes con cáncer de mama tratadas con Doxorrubicina, el papel inmuno-estimulante de la Doxorrubicina en pacientes con cáncer de mama tratadas con este fármaco, aún no ha sido examinado. De otra parte, la posibilidad de que el tratamiento con Doxorrubicina tenga capacidad inmuno-estimulante en algunas pacientes, hace necesario la implementación de metodologías confiables que permitan evaluar la calidad de la respuesta inmunológica contra el tumor (expansión de linfocitos T anti-tumorales y el fenotipo de memoria en pacientes tratadas con estos fármacos), con el fin de evaluar si en pacientes con una evolución y pronóstico clínico favorables estas drogas inducen un mejor reconocimiento del tumor por el sistema inmune. Con el fin de demostrar un efecto inmuno-estimulador de la Doxorrubicina y Ciclofosfamida, en este estudio se monitoreará – antes y después del tratamiento – el nivel de LT anti-tumorales en sangre de pacientes con cáncer de mama en quimioterapia con estos fármacos con el fin de evaluar: (i) si la quimioterapia aumenta el reconocimiento del tumor por el sistema inmune y (ii) si hay relación entre reconocimiento inmune y evolución clínica del tumor en cada paciente tratada. Página 6 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama JUSTIFICACION Doxorrubicina y Ciclofosfamida son dos fármacos ampliamente utilizados en terapia neoadyuvante en cáncer de mama que han evidenciado en modelos animales poseer propiedades inmuno-potenciadoras de la respuesta inmune contra los tumores. En este trabajo evaluaremos en pacientes con cáncer de mama la capacidad de estas drogas para favorecer el reconocimiento de los tumores por el sistema inmune. El demostrar con este trabajo una correlación entre respuesta clínica y reconocimiento inmunológico del tumor atribuible a la quimioterapia con Doxorrubicina y Ciclofosfamida permitiría revelar por primera vez en pacientes con cáncer de mama las propiedades inmuno-estimulantes de dos medicamentos de bajo costo ampliamente utilizados en quimioterapia del cáncer de mama y otros tumores. Esto y la implementación de tecnologías de punta como la citometría de flujo multi-paramétrica y tetrámeros fluorescentes HLA-A2 para monitorear LT-CD8+ anti-tumorales utilizadas en este proyecto para monitorear la respuesta inmune contra los tumores en pacientes con cáncer tratadas con Doxorrubicina y Ciclofosfamida, hacen de este un proyecto de investigación clínica orientado a aportar posibles alternativas de monitoreo inmunológico y manejo futuro del cáncer de mama en Colombia. Además de contribuir a la generación de nuevo conocimiento y al fortalecimiento de la comunidad científica con la formación de un estudiante de Doctorado, si podemos demostrar por primera vez en nuestro medio una capacidad adyuvante de la quimioterapia, los resultados de este trabajo quizás tenga importantes implicaciones para la implementación en Colombia del uso combinado de esquemas de quimio e inmunoterapia combinados. Página 7 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama OBJETIVOS Objetivo general: Evaluar la capacidad inmuno-estimulante de la quimioterapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida en pacientes con cáncer de mama. Objetivos específicos: Objetivo específico 1: Evidenciar un aumento de la respuesta inmune contra el tumor (inmunogenicidad de los tumores) inducida por la Doxorrubicina y Ciclofosfamida en pacientes con cáncer de mama en quimioterapia neo-adyuvante. Objetivo específico 2: Cotejar la inmunogenicidad de los tumores inducida por la quimioterapia con el grado de regresión tumoral en pacientes con cáncer de mama en quimioterapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida. Objetivo específico 3: Evaluar en pacientes con cáncer de mama en terapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida si la liberación de señales de peligro inducida por la quimioterapia favorece la inmunogenicidad de los tumores. Objetivo específico 4: Examinar si existe relación entre el grado de regresión del tumor inducida por la quimioterapia neo-adyuvante con la inmunogenicidad de los tumores; con la liberación de señales de peligro o con el polimorfismo de receptores específicos para estas señales. Página 8 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama MARCO DE REFERENCIA Quimioterapia neo-adyuvante La terapia neo-adyuvante también llamada terapia sistémica primaria o terapia de inducción, ha venido ganando importancia en el tratamiento multidisciplinario del cáncer. Inicialmente reservada para tumores localmente avanzados – en un intento de convertirlos en tumores operables – y ante el beneficio que significa el descenso del estadiaje tumoral después de dicha terapia (downstaging), hoy en día es alternativa terapéutica incluso para pacientes que se encuentran en estadio temprano, y en casos de progresión que no han recibido ningún tipo de tratamiento [3]. Estudios recientes sugieren que la quimioterapia en combinación con la inmunoterapia podría ofrecer ventajas terapéuticas cuando se compara con la quimioterapia administrada bajo los regímenes tradicionales [4]. Las ventajas del uso de la quimioterapia en combinación con la inmunoterapia pueden ser explicadas por diferentes razones sustentadas por evidencia experimental reciente: (i) el efecto de la quimioterapia en el estroma tumoral resulta en una mejor penetración al tumor de Linfocitos T Citotóxicos (CTLs); (ii) la quimioterapia induce la disminución local de la actividad supresora de las células tumorales mediada por: ligandos de muerte programada (PD1), disminución de los niveles de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) [5] y/o citoquinas inmunosupresoras; (iii) la quimioterapia favorece el aumento de la permeabilidad de las células tumorales a las granenzimas; (iv) la muerte masiva de células tumorales inducidas por la quimioterapia aumenta la expresión de antígenos asociados a tumor (TAAs) circulantes, lo que hace a las células tumorales un mejor blanco de CTLs; (v) la quimioterapia induce el aumento de Fas – y otros receptores de muerte – en las células tumorales, o de Fas-L en los CTLs; y finalmente (vi) se ha reportado un efecto inducido por la quimioterapia de sinérgia de la caspasa-3, granenzimas y Fas y elevación de ciertos marcadores pro-inflamatorios [6]. Evidencias recientes sugieren que la quimio- y la radio-terapia al favorecer la muerte de células tumorales, aumenta la presentación cruzada de antígenos tumorales in vivo [7, 8] y que la mielo-supresión inducida por la quimio- o radio-terapia favorece la proliferación homeostática de células del sistema inmune que producen citoquinas y/o la inhibición de la actividad de células T reguladoras (Treg) [9, 10], este último efecto especialmente asociado a la administración de bajas dosis de ciclofosfamida [11]. La quimioterapia adicionalmente aumenta el número de TAAs circulantes los cuales son posiblemente tomados por las Células Presentadoras de Antígeno (APCs) como las células dendríticas (DCs), procesados y presentados eficientemente a los LT. Señales en células tumorales que mueren por un tipo de apoptosis pro-inflamatoria inducida por la quimioterapia tienen un importante impacto en la eficiencia de fagocitosis, procesamiento de antígenos tumorales y maduración de DCs [12] que al migrar hacia órganos linfoides favorecen la expansión clonal de LT antitumorales [13, 14]. La muerte por quimioterapia induce la expresión del receptor transmembrana Fas tipo 1 y DR4/DR5 que son mediadores importantes de la apoptosis celular inducida por sus respectivos ligandos Fas-L y TRAIL expresados en los linfocitos NK y en LT-CD8+ activados [4]. Las concentraciones sub-tóxicas de las drogas quimioterapéuticas restauran la respuesta de Fas-L y Página 9 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama TRAIL en las células cancerosas, las cuales no son espontáneamente sensibles a estas citoquinas. Así los quimio-fármacos como Cisplatino, Doxorrubicina, Mitomicina C y el Fluoracilo, inducen efectos citotóxicos directos, ya que preparan las células tumorales para su propia eliminación por las células inmunes como las NK o CTLs usando una vía dependiente de Fas o TRAIL [12]. Activación del sistema inmune durante la terapia neo-adyuvante El manejo clásico de la patología tumoral persigue inducir una toxicidad directa sobre las células cancerosas sin ser esto suficiente para su completa destrucción. El daño producido por fármacos y por la radioterapia a células tumorales genera un microambiente inflamatorio de activación de LT efectores tempranos y la migración al tumor de APCs que fagocitan las células en proceso de muerte que cargan sus antígenos y migran al encuentro de LT vírgenes en nódulos linfoides en los que inducen la diferenciación hacia células efectoras y de memoria específicas contra el tumor. Las células efectoras deben haber adquirido receptores para quemoquinas y modular la expresión de distintas integrinas que les permite viajar desde el nódulo linfoide al tumor, lo cual es necesario para su eliminación. Estas células (en su mayoría LT-CD8+ y LT-CD4+), se activan a expensas de la estimulación de antígenos presentados por las APCs en el contexto del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) clase I y clase II respectivamente. Para que este proceso ocurra, es necesario que ocurra un tipo especial de muerte de las células tumorales, y contrario a lo que se consideraba hasta hace poco tiempo, es la muerte por apoptosis la que dispara la cadena de eventos inmunológicos descritos, y no la muerte por necrosis [15] [16], probablemente debido a que su desencadenamiento no depende del tipo de muerte per se, sino de la naturaleza de la célula y de estímulos que indujeron su muerte [16]. Las células reaccionan ante agentes citotóxicos con alteraciones en la diferenciación celular, detención de la proliferación y muerte. Un tipo de muerte por apoptosis de células tumorales que genera inflamación ha sido demostrada con el uso de antraciclinas [17-20]. En ensayos in vivo con Doxorrubicina se evidenció importante actividad tumoricida mientras que la medición de inmuno-fenotipos del sistema inmune del hospedero permanecieron indemnes [21]. Sorprendentemente, a pesar de la infiltración del fármaco en células sanas, incluidas las células del sistema inmune, en algunos casos se ha demostrado que lejos de ser tóxicas para ellas estos fármacos potencian su acción antitumoral [22]. Estas observaciones han llevado a considerar la posibilidad de combinar este tipo de terapia anti-tumoral farmacológica con la terapia inmune, esta última en distintas modalidades que van desde la transferencia adoptiva de células hasta la infusión de citoquinas (IL-2 recombinante, Interferones de tipo I, Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α)), entre otros. La combinación de quimio- e inmuno-terapia en distintos tipos de tumores ha evidenciado en varios estudios clínicos regresión de los tumores acompañada de la prolongación del periodo de sobrevida con limitada toxicidad [23-25]. Estudios recientes en modelos animales, demuestran claramente que el tratamiento con Doxorrubicina de células tumorales, incrementa su inmunogenicidad al punto que cuando son utilizadas como vacuna confieran inmunidad contra el tumor a expensas de LT-CD8+ antitumorales específicos [17-20, 26-29]. Página 10 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama Hasta hace poco la quimioterapia y la inmunoterapia eran consideradas como tratamientos antagónicos. Siempre se ha considerado que el uso de agentes quimioterapéuticos no sólo afecta a las células tumorales sino que también generan supresión medular secundaria que compromete la integridad de los linfocitos y otras células del sistema inmune. Sin embargo, actualmente se ha encontrado evidencia de que estas dos estrategias pueden complementarse, e incluso potenciarse de diferentes maneras, entre ellas, incrementando de manera altamente específica la respuestas de LT a antígenos tumorales [30]. Varios son los mecanismos propuestos como responsables de la inmunogenicidad de los tumores inducida por la quimio-terapia. La generación de una muerte celular inmunogénica, acompañada de la expresión de proteínas de choque térmico (HSP) en la superficie de las células tumorales muertas ha sido analizada en estos casos [31]. Lo anterior estimula la activación de una respuesta inmune adaptativa antitumoral, que a su vez ayuda a erradicar las células de cáncer residual (Stem cells). Entre los agentes que se han identificado que producen una muerte celular de tales características se encuentran las antraciclinas (Doxorrubicina, Daunorubicina o Idarrubicina), los taxanos (docixatel y Taxol), Imanitib, Bortezumib y la irradiación gamma [31]. Algunas de las características que se han encontrado en este tipo de muerte, es la translocación de moléculas que se encuentran a nivel intracelular a la superficie de la célula que entró en muerte celular programada, que incluso aparecen mucho antes de que ocurran cambios típicos de la apoptosis. Dichas moléculas incluyen la calreticulina (CRT, esta es una proteína soluble que actúa como chaperona en el Retículo endoplásmico y que está asociada con la modulación y homeostasis del calcio (Ca2+) e involucrada en la presentación de péptidos en el MHC) y la fosfatidilserina como señal de inversión de la cara interna de la membrana plasmática hacia el medio extracelular. Estas actúan como una señal “cómeme” para las DCs, facilitando que las células tumorales sean fagocitadas, aumentando así el procesamiento y presentación de antígenos tumorales a los CTLs [32-35]. En experimentos con células de cáncer de colon murino (CT26) y fibrosarcoma (MCA205) tratadas con antraciclinas o radiación ionizante se encontró traslocación del 5-10% del contenido de CRT desde el retículo endoplásmico hacia la superficie celular en etapas tempranas del proceso, incluso antes de la exposición de la fosfatidilserina [36]. La traslocación de CRT estuvo acompañada de la expresión de Erp57 formando un complejo protéico en la superficie como indicador de estrés del retículo endoplásmico; este proceso de traslocación no ocurrió en la muerte celular no inmunogénica [37, 38]. Al parecer la expresión de este tipo de señales no es suficiente para generar una muerte celular inmunogénica; se necesita simultáneamente la activación de toda una cascada de señalización que induce una muerte celular programada con la activación de algunas caspasas pero que generan inflamación [32, 35]. Además de lo anterior se ha observado que se requieren de otras señales como la liberación de nucleoproteínas de la célula apoptótica como la proteína High Mobility Group Box 1 (HMGB-1) la cual una vez liberada se fija al TLR-4 lo cual induce la maduración de las DCs [31]. La complejidad del proceso de activación de las DCs por células tumorales es sugerida por evidencia experimental a favor de que células tumorales deficientes en CRT tratadas con Doxorrubicina no tienen la Página 11 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama capacidad de inducir maduración de DCs a pesar de la adición de CRT y HMGB-1 de manera exógena [39]. Además de la Doxorrubicina, actualmente se explora el poder adyuvante de otras moléculas que han mostrado ser capaces de inducir inmunogenicidad en los tumores in vitro. En este nuevo grupo de antineoplásicos se encuentran fármacos como los taxanos (docetaxel y paclitaxel), los cuales tienen su acción principal sobre la polimerización de los microtúbulos, aunque se ha descrito que a bajas dosis actúan sobre moléculas reguladoras del ciclo celular como p53 y p21, logrando la detención de la célula tumoral en fase G2 y favoreciendo la senescencia celular o la apoptosis [40-42]. Estudios in vitro con células de cáncer de mama muestran como el Taxol altera la expresión y funcionalidad de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl2/Bcl-X(L) por disminución en el mRNA o fosforilación directa de éstas, favoreciendo la inducción de la apoptosis [43]. Adicionalmente, otros estudios han postulado la capacidad del Taxol de mimetizar ligandos de TLR-4 a altas dosis, pero con dosis normales se observa un incremento en la producción de IL-6; este hallazgo muestra que el taxol involucra mecanismos de activación del sistema inmune innato para la inducción de apoptosis [40, 44]. Sin embargo, en diferentes líneas celulares de ovario y carcinoma de mama la muerte inducida por taxol es independiente de caspasa 3 y caspasa 9 [45]. Además de las antraciclinas y los taxanos, se han 12erán12ir anti-inflamatorios no esteroideos (AINEs) logrando disminución de la masa tumoral en diferentes modelos como cáncer de colon [46, 47] y cáncer gástrico [48]. Al parecer el efecto apoptótico de medicamentos como la Mesalazina en carcinoma de colon, está relacionado con la inhibición de las ciclooxigenasas, favoreciendo de forma indirecta la acumulación de ceramidas, conocidas como potentes inmunomoduladores al actuar como quimio-atrayentes de CTLs [46, 49]. Finalmente, se ha reportado un aumento de Linfocitos Infiltrantes de Tumor (TIL) considerado como un factor pronóstico positivo en el seguimiento de la respuesta al tratamiento en carcinoma de colon con la administración del Sulindac [47]. Inmunogenicidad generada por liberación de señales de peligro Es de particular interés poder encontrar las alteraciones metabólicas o bioquímicas que emplea el sistema inmune para poder distinguir las células en muerte inmunogénica y no inmunogénica [50]. La muerte fisiológica de las células no induce una respuesta inmune e incluso son tolerogénicas para evitar el reconocimiento de patrones moleculares por receptores TLR o NLR que se encargan del reconocimiento de patógenos y patrones moleculares asociados a peligro [51, 52]. Ciertos regímenes de quimioterapia como oxaliplatino y antraciclinas como la Doxorrubicina generan una muerte celular que favorece la activación del sistema inmune[53]. La muerte celular inmunogénica inducida por estos agentes quimioterapéuticos se caracteriza, primero por la traslocación preapoptótica de Calreticulina (CRT) [36] y segundo por la liberación de HMGB-1 que actúa sobre el TLR-4. Estos dos componentes facilita el procesamiento de antígenos por las células dendríticas induciendo una activación de Linfocitos T específicos [54]. No obstante la activación mediada por CRT y HMGB-1, no es suficiente para la generación de una respuesta inmune anti-tumoral[55]. En macrófagos, el inflamosoma (complejo protéico de la familia de NLR que activa caspasa-1) sirve Página 12 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama como un sensor central de PAMPs y DAMP (patrones moleculares asociados a patógenos o a peligro – respectivamente)[56]. La activación del inflamosoma por el NLRP3 activa la caspasa 1 la cual madura la IL-1B y posterior secreción dependiente de la activación del receptor purinérgico P2XR7 (receptor de ATP) y TLR-4[57-59]. La HMGB-1 es una nucleoproteína que tiene una función chaperona, permanece unida a las histonas durante la apoptosis favoreciendo la formación de segmentos de DNA con un tamaño definido (observable en un corrido electroforético del DNA). Durante la necrosis o la apoptosis inflamatoria, la HMGB-1 es liberada del núcleo hacia el citoplasma [28, 60, 61]. La HMGB-1 permanece en el núcleo de la célula y actúa como factor de transcripción [62], pero cuando es liberada al medio extracelular ejerce su acción sobre receptores de DCs (TLR-2 y TLR-4) [62-65]. Su acción sobre DCs se ha relacionado con la inducción de una respuesta inflamatoria similar a la desencadenada por el lipopolisacárido (LPS), la cual se caracteriza por la traslocación del factor NFκB, induciendo la maduración de DCs [27, 63]. De estos receptores, el TLR-4 es el más relevante en la respuesta a la quimioterapia dado que facilita la presentación de antígenos vía MHC clase I [27]. La muerte celular inmunogénica inducida por antraciclinas favorece la liberación de HMGB1, la cual puede ser detectada en el sobrenadante de los cultivos de células tumorales tratadas con este grupo de agentes quimioterapéuticos. En relación con esto, se encontró que la falta de liberación de HMGB-1 por parte de células tumorales tratadas con quimioterapia, inhibe la capacidad de éstas últimas para inducir la maduración de DCs [66, 67]. Por último, pacientes con cáncer de seno en quimioterapia que portan el alelo TLR-4Asp299Gly el cual es disfuncional para la unión de HMGB-1 a este receptor, tienen una probabilidad de 17 veces mayor de desarrollar metástasis comparados con aquellos que exhiben una copia normal del alelo de TLR-4 [65]. Recientemente, Zitvogel y cols [68] han mostrado como el tratamiento de las células tumorales con antraciclinas, oxaliplatino o radio-terapia favorecen la liberación de ATP, el cual activa receptores purinérgicos, específicamente el receptor P2RX7 (miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral TNF) en las células dendríticas induciendo la activación del inflamosoma (conformado por NLRP3, ASC y Caspasa-1). Una vez activado el inflamosoma la caspasa-1 madura la IL-1B (de pro-IL-1B a IL-1B). Esta misma señalización (ATP – receptor P2XR7), favorece la secreción de la IL-1B[59]. Zitvogel y cols y Ferrari y cols, evidencian la importancia de todo el proceso de la señalización: (i) la detección de las señales de peligro (HMGB-1 y CRT) para favorecer la producción de la forma inmadura de IL-1B a través de la activación de TLR-4, (ii) la activación del inflamosoma para la maduración de esta citoquina y (iii) la activación de P2XR7 para favorecer su secreción. Sin embargo la evaluación de este sistema no ha sido realizada en pacientes con cáncer de mama que entran en quimioterapia neo-adyuvante. Memoria inmunológica Se describen 4 sub-poblaciones de memoria, tanto en LT-CD4+ como en LT-CD8+ [69, 70], determinados fenotípicamente por la expresión diferencial de marcadores de membrana, capacidad funcional (producción de citoquinas, migración a tejidos linfoides) y por la capacidad Página 13 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama proliferativa para su mantenimiento homeostático o para su diferenciación hacia otro fenotipo de memoria o efector (análisis de proliferación por longitud del telómero o cuantificación de TRECs – del inglés T-cell Receptor Excision Circle-) [71, 72]. Los LT vírgenes (TN) se caracterizan por no haber experimentado un contacto previo con el antígeno. Una vez estimulados por APCs maduras cargadas con el péptido específico para la TN y bajo un ambiente pro-inflamatorio, comienza el proceso de diferenciación a LT de memoria o LT efectores [73]. LT de memoria central (TCM) expresan receptores de migración a nódulos linfáticos (como CCR7) y unión a células endoteliales (como L-selectina, CD62-L). Se ha descrito que TCM poseen un telómero más largo lo cual sugiere una mayor capacidad de proliferación a diferencia de los LT de memoria efectora (TEM) [70], los cuales disminuyen la expresión en superficie de CD45RO, CD28 y CD27 durante su proceso de diferenciación a LT-CD8+ efectores terminales (TEF) [74]. Este proceso de maduración parece ser dirigido adicionalmente por presencia del antígeno o por ciertas citoquinas como IL-7 e IL-15 para TEM, mientras que estas citoquinas no tienen tanto efecto sobre TCM y ningún efecto sobre TN [75]. Cada una de estas cuatro sub-poblaciones posee funciones particulares que las diferencian entre sí, por ejemplo TCM produce principalmente IL-2, mientras que TEM se caracteriza por la rápida expresión de funciones efectoras como la producción de citoquinas (IL-4 o IFN-γ) [69]. Los TEF migran a los tejidos donde se encuentra activo un proceso inflamatorio, expresan grandes cantidades de TNF-α, perforina y granulosinas, poseen una reducida capacidad para proliferar y producir IL-2 [70]. Memoria inmunológica y cáncer Con el desarrollo de diferentes ensayos clínicos con inmunoterapia, se ha analizado el papel que juegan los diferentes tipos de perfiles de memoria en esquemas de transferencia adoptiva de LT para el manejo de cáncer. Estos ensayos han sido realizados tanto en modelos animales como en algunos ensayos clínicos en humanos. Inicialmente se postularía que un perfil de tipo efector proporcionaría una respuesta anti-tumoral eficiente, pero estudios realizados por Gattinoni y cols [76] muestra el efecto anti-tumoral en los diferentes niveles de diferenciación de TEF, observando que a menor diferenciación mayor actividad anti-tumoral. En concordancia con ello, en modelos in vivo de melanoma, se comparó la transferencia de TCM con la transferencia de TEM, ambas generadas de cultivo in vitro en medio condicionado con citoquinas, y describen como los TCM tienen una mejor capacidad para la reducción de un tumor preestablecido [77]. Por otra parte, el estudio de la diferenciación de la memoria a través de la vía de señalización Wnt β-catenina, conocida por regular el proceso de maduración de LT post-tímicos, ha mostrado que la generación de TCM similares a células madre (inducidos por la presencia de IL-2 e IL-21) genera una mejor respuesta anti-tumoral de LT-CD8+ [78] comparado con la transferencia adoptiva de TEM o TCM. Inmunoterapia y autoinmunidad en cáncer Los diferentes ensayos clínicos con inmunoterapia contra el cáncer han permitido evidenciar diversos grados de respuesta clínica e inmunológica, junto con algunos efectos colaterales; entre los cuales se han reportado en pacientes con melanoma, casos de 14erán14ir transitorio tras la administración de DCs pulsadas con antígenos del melanocito [79, 80]. De manera interesante, en Página 14 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama un modelo animal de melanoma fue demostrado en ratones que padecieron este efecto tuvieron una mejor respuesta antitumoral [81, 82]. Esto ha hecho que el temor de generar autoinmunidad con vacunas terapéuticas basadas en DCs no sea hoy en día un tema que despierte mayor preocupación; por el contrario, algunos autores han sugerido que este tipo de reacciones pueden estar asociadas a una mejor eficacia de la inmunoterapia [83]. En algunos casos, el carácter autoinmune de estas terapias está dado por la elevación de anticuerpos antinucleares (ANAs), en especial DNA de doble cadena (anti-dsDNA), que reaccionan preferencialmente contra las células de tipo tumoral, inhibiendo su crecimiento [81, 84]. Es por ello que no suelen observarse manifestaciones clínicas o histológicas de un proceso patológico autoinmune, o se presentan sólo de manera transitoria, como el 15erán15ir en el caso de tratamientos con péptidos de Melan-A. Esto también ha sido analizado en el modelo murino, en el cual se ha observado que al aplicar DCs sin antígeno, se presenta una autoinmunidad transitoria, especialmente dirigida contra las células tumorales [84]. Evidencias que los auto-anticuerpos no reaccionen con las células normales es el hecho que tales anticuerpos suelen estar aumentados en el suero tanto de humanos como de ratones seniles sin procesos clínicos de enfermedad autoinmune [81], la elevación podría ser una resultante de procesos de citotoxicidad dependiente de anticuerpos que aumenta con la edad [85]. Algunos investigadores han sugerido la inducción de autoinmunidad como alternativa para tratar el cáncer [83, 84], debido a que existen resultados altamente sugestivos de que la inducción deliberada de reactividad autoinmune luego de la vacunación con antígenos de diferenciación, puede permitir la destrucción del tumor [84]. Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) Para una buena actividad antitumoral por parte del sistema inmune, incluyendo la lisis de las células tumorales por parte de CTLs, se requiere del adecuado reconocimiento de péptidos específicos de tumor presentado por las células tumorales. Para ello, es necesario la generación inicial de LT-CD4+ con actividad “helper” junto con la activación de LT-CD8+ con actividad citotóxica; esta generación requiere de la presentación y co-estimulación adecuada de TAAs por parte de APCs como las DCs. Inicialmente, la presentación de los TAAs debe realizarse en un MHC específico con una afinidad adecuada para resistir los procesos de selección y edición por parte de HLA-DM [86] para clase II y por parte de Tapasina para MHC de clase I [87] y finalmente este complejo péptido/MHC (pMHC) debe ser reconocido adecuadamente por un TCR específico. Posteriormente se requiere de una co-estimulación (segunda señal) por parte de las APCs mediante la expresión de CD40, CD80 y CD86 a sus ligandos CD28 o CD40L en los LT; todo lo anterior debe estar dentro de un ambiente pro-inflamatorio mediado por citoquinas como IL-12 [88] para una adecuada activación de los LT. Con el proceso de maduración de las DCs (evidenciado fenotípicamente por incremento de la expresión de señales de co-estimulación y pérdida de CD209), los pMHC de clase II se acumulan en la superficie de la DC permitiendo una interacción de los TAAs con los LT-CD4+, cuyo papel en la respuesta anti-tumoral no solo radica en la función “helper” a los CTLs sino también en la generación de memoria [89]. Página 15 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama Antígenos Asociados a Tumor (TAAs) En los últimos 15 años se ha logrado la identificación, purificación y síntesis de múltiples antígenos peptídicos provenientes de moléculas que se expresan de forma diferencial en células tumorales [90], tanto por aparición de proteínas que normalmente no se expresan, como por una sobreexpresión o mutación de proteínas normales; estos antígenos son conocidos como TAAs (del inglés Tumor Associated Antigens). La gran mayoría de estos antígenos peptídicos han sido estudiados en personas HLA-A*0201 (por su alta frecuencia en caucásicos, 48% [91]), describiendo secuencias de péptidos restringidos a este alelo capaces de generar una respuesta celular en LT-CD8+. Estos TAAs al ser HLA-A*0201 restringidos, requiere que los estudios en voluntarios donde se empleen, deban presentar al menos una copia de este alelo, motivo por el cual en el presente estudio todas las mujeres participantes (tanto pacientes con cáncer de mama como mujeres sanas) deben ser HLA-A*0201; para ello ya se ha identificado la frecuencia de expresión de este alelo en la población de Bogotá por Alfonso R. y cols [92], encontrando una frecuencia fenotípica de 27.4% similar al encontrado en otro estudio en la ciudad de Cali (29%) [93]. La caracterización de los diferentes tipos de péptidos ha permitido clasificarlos en 3 grupos [94]: (i) Antígenos de diferenciación, expresados según el grado de progresión del tumor, como tirosinasa, melan-A, gp100 y TRP-1 y TRP-2; (ii) Antígenos testiculares asociados a cáncer (Cancer testis antigens), normalmente expresados en órganos invisibles al sistema inmune, como MAGE, BAGE, CAGE, NY-ESO-1 y SSX [95, 96]; y (iii) antígenos sobre-expresados, que se encuentran normalmente en los tejidos sanos, lo que puede generar fenómenos de tolerancia, como, HER2/neu [97], Survivina y Telomerasa. Antígenos de diferenciación Comprenden un linaje de antígenos específicos que se expresan en células tumorales también como en células normales de las cuales se origina el tumor. Los pacientes tienen LT capaces de reconocer antígenos codificados por los genes de diferenciación de los melanocitos normales. En el caso de diferenciación de antígenos de melanoma significa que ellos son expresados a través de los estados de progresión del tumor melanocítico empezando en el melanocito, tales como tirosinasa, melan-A, gp100 y TRP-1 y 2. Muchos de los antígenos de diferenciación de melanoma tienen que ver con la producción de melanina. Antígenos testiculares asociados a cáncer – CTAs (Cancer testis antigens) Los CTAs fueron originalmente descubiertos en melanoma y se expresan de forma normal en testículos y placenta, órganos no visibles al sistema inmune. Se agrupan en varias subfamilias que incluyen varios miembros. Estos antígenos son expresados en diferentes tipos de tumores malignos y son restringidos en tejidos normales a células germinales del testículo, los cuales son ocasionalmente expresados en bajos niveles en órganos reproductivos de la mujer. Los CTAs no son presentados por las células germinales ya que no expresan HLA en la superficie para ser Página 16 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama reconocidos por los LT. Los CTAs están codificados principalmente en el cromosoma X en el que están los genes de la familia MAGE, BAGE, CAGE, NY-ESO-1 y SSX. Antígenos sobre-expresados Genes ampliamente expresados en muchos tejidos normales que pueden algunas veces dar origen a respuesta inmunológica. Cuando hay sobre-expresión de estas proteínas en tumores pueden ser reconocidos por LT como resultado de rompimiento de la tolerancia antigénica. El gen PRAME fue identificado como sobre-expresado en melanomas y otros tipos de cáncer y es reconocido por CTLs; survivina, que inhibe la familia de proteínas de 17erán17irá (IAP) y telomerasa, que es funcionalmente necesaria para la inmortalización de las células tumorales. HER-2/neu Es un proto-oncogen, con actividad kinasa involucrada en la transducción de señales de crecimiento, de la familia receptores del factor de crecimiento epidermal (EGF), localizado en el cromosoma 17q21 22. Se expresa en tumores epiteliales y en el 30% de los tumores primarios de mama, siendo éste un factor de pobre pronóstico. Posee un dominio extracelular que puede ser blanco de Linfocitos B y ambas regiones poseen péptidos que pueden ser presentados en HLA-I y II. Se clasifica como un TAA mutado y sobre-expresado, pertenece a la familia de receptores transmembranales incluído HER-1 (EGFR), HER-3 y HER-4 que guardan una alta homología. HER2/neu posee un dominio intracelular de 50aa con actividad tirosin kinasa que es activado por ligandos de unión a EGFR y un segmento regulatorio, una región transmembranal lipofílica y una extracitoplasmática rica en cisteínas. Los ligandos de HER tienen mayor afinidad por los receptores excepto para HER-2 que es importante para la heterodimerización. La señalización a través de los receptores lleva a la activación de múltiples segundos mensajeros e interacciones entre dominios proteicos, lo que conduce a la transcripción de genes nucleares, los más importantes son protein kinasa ras/ mitogen- activated, la ruta PI3 kinasa y la fosfolipasa C-g y genes como c-fos, c-jun, c-myc y EGR1. Los niveles de dominio extracelular clivado de HER-2/neu circulante predice con éxito la presencia y progresión de cáncer de mama HER-2/neu positivo y se correlaciona con sobrevida y ausencia de respuesta clínica a la terapia hormonal en tumores ER positivos demostrado por algunos estudios [98]. La sobre-expresión de HER-2/neu consistentemente se asocia a formas más agresivas y extensas de carcinoma ductal in situ y enfermedad de Pager’s. Bajos niveles de HER-2/neu han sido identificados en biopsias de cáncer de mama inicial y se asocia con un incrementado riesgo de subsecuente cáncer de mama invasivo [99]. La determinación de HER-2/neu aprobada por la FDA es por técnicas de inmunohistoquímica (IHC) (proteína) y FISH (gen). Otras de las metodologías no aprobadas pero que ampliamente son manejadas con fines investigativos son Southern blot, PCR, RT-PCR y ELISA. A pesar que existen CTLs específicos anti-HER-2/neu en pacientes con cáncer de mama, en muchos casos no previene Página 17 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama la progresión de la enfermedad y es posiblemente debido a que es un antígeno propio que induce tolerancia activa por deleción de clonos que reconocen las epítopes inmunodominantes presentadas; sin embargo, la mayoría de péptidos son epítopes subdominantes inmunogénicos [100]. Diversidad del repertorio del receptor de células T (TCR) La composición de los ligandos péptidicos propios presentes en el timo juega un papel importante en el repertorio pre-inmune[101]. Timocitos inmaduros que expresan TCR de baja afinidad para complejos péptido propio con MHC sobreviven y maduran posteriormente (denominado selección positiva). Por el contrario, LT autoreactivos son eliminados por la inducción de muerte celular programada (selección negativa). Los timocitos maduros de baja afinidad para péptidos propios, migran del timo a la periferia, creando un en el sistema inmune un repertorio altamente diverso [102]. Adicionalmente ligandos de péptidos propios con MHC envían señales de sobrevida a los TN para su persistencia en la periferia [103]. El reconocimiento de péptidos propios por LT a través del TCR posee una gran especificidad como lo demuestra la sustitución de un solo aminoácido con efectos muy drásticos [104], sin embargo, el alto grado de reactividad cruzada en el repertorio asegura teóricamente el reconocimiento de cualquier péptido presentable. Las librerías de péptidos sintéticos han contribuido a la identificación de múltiples ligandos que estimula el mismo clono de LT sin que necesariamente muestren homología en su secuencia [105]. Se ha estimado que la frecuencia de células TN específicas para una epítope oscila entre 1 a 5 x10-5 [106], la cual está por debajo de los límites de detección directa por las técnicas estándar. En humanos, la baja frecuencia de los LT específicos de péptidos propios en el repertorio pre-inmune ha limitado su investigación. El antígeno de diferenciación de melanocitos Melan-A/MART-126-35 (Melan-A) es una proteína cuya función es desconocida y se expresa en melanocitos y en la mayoría de células de melanomas pero no en otros tejidos [107, 108]. Con el empleo de multímeros de Melan-A26-35 (con un análogo A27L ELAGIGILTV) restringido a HLA-A*0201 en LTCD8+, se ha podido establecer ex vivo, LT específicos de Melan-A tanto en ganglios linfáticos infiltrados por tumor como LT circulantes de pacientes con melanoma e incluso en individuos sanos [109, 110]. Posteriormente, se identificó que LT Melan-A específicos son fenotípicamente vírgenes (CCR7+, CD45RAaltas, CD45RO- y CD28+) y de forma llamativa comprenden alrededor de 10-3 de los LT-CD8+ circulantes, 102 veces más que las calculadas para los precursores vírgenes [111, 112]. Estos hallazgos cuestionan cómo se establece y se mantiene un repertorio amplio de LT no esperado como el de Melan-A. Estudios previos donde se emplean marcadores de superficie no reflejan el estado funcional de LT-específicos. Con relación a esto, se ha mostrado que TN pueden expandirse sin cambiar su fenotipo [113] o devolverse al estado virgen posterior a una fase de activación transitoria [114, 115]. Aún más, células de memoria pueden revertirse a un fenotipo de TN. Estudios realizados por Romero P. muestran que la alta frecuencia de LT-CD8+ específicos de Melan-A, proviene de un repertorio pre-inmune [71]. Página 18 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama Importancia de la frecuencia de precursores de LT en cáncer El monitoreo clínico de la respuesta de LT específicos de tumor es muy importante durante y posterior a los tratamientos tanto de inmunoterapia como quimioterapia. Estos tratamientos pueden afectar el repertorio de LT que responde a una epítope blanco [116, 117]. Actualmente existen diversos métodos para evaluar tanto la respuesta de LT como el repertorio, utilizando dilución límite, ELISPOT, determinación por citometría de flujo del segmento variable del TCR, análisis de la longitud del TCR-CDR3 o espectratipo o mediante el empleo de complejos multiméricos de MHC péptido específicos (tetrámeros). Este tipo de análisis sirve para definir si la respuesta de LT específicos es policlonal, monoclonal o con predominio de algunos clonotipos de TCRs con su respectiva capacidad funcional (mediante la determinación de la producción de citoquinas intracelulares) [118]. La especificidad de un TCR reside principalmente en el CDR3 que es la resultante dela recombinación somática de los elementos del TCR, región variable (V), de unión (j – del inglés joining) y de la región constante (C) del heterodímero del TCR [119]. El tipo de respuesta de un LT específico de un antígeno dado se puede describir mediante tres características: (i) la especificidad de las funciones efectoras de una población de LT, (ii) la cuantificación de la respuesta, mediante el número de células que responden (tanto LT-CD4+ como LT-CD8+) y (iii) la calidad de la respuesta definido por la afinidad de un TCR por el péptido estudiado. Diversos estudios han analizado el TCR de pacientes con cáncer mediante espectratipo [120-123] y algunos estudios han mostrado durante la inmunización en terapias contra el cáncer una activación y proliferación de clonos de LT [124, 125]. Página 19 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama METODOLOGIA PROPUESTA Basados en resultados de estudios en animales y algunos estudios clínicos en que se atribuyen a la Doxorrubicina la capacidad de favorecer la generación de linfocitos T CD8+ anti-tumorales y a la Ciclofosfamida la capacidad para reducir los niveles de LT supresores, en este proyecto proponemos realizar un estudio observacional prospectivo con el fin de evaluar en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama en quimioterapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida (esquema A/C), si un aumento del reconocimiento del tumor y actividad antitumoral de LT CD8+ específicos para HER-2/neu (utilizado como antígeno tumoral modelo) se relacionan con una reducción del tamaño del tumor en las pacientes tratadas. Esta relación se tratara de establecer cotejando el inmuno-fenotipo y tamaño del repertorio de linfocitos T de memoria específicos contra HER-2/neu presentes en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama antes y después de la quimioterapia neo-adyuvante con el grado de regresión del tumor en cada paciente. Una línea base del inmuno-fenotipo y tamaño del repertorio de linfocitos T CD8+ específicos para el antígeno HER-2/neu se establecerá en un grupo de mujeres sanas sin antecedentes familiares de cáncer de mama. Confiamos que la metodología y diseño experimental propuestos permitan evidenciar que estos fármacos potencia la respuesta inmune contra los tumores a expensas de la generación de linfocitos T CD8+ de memoria con potente actividad antitumoral. Adicional a lo anterior, se evaluará si tres señales de peligro endógenas (HMGB-1, ATP e IL-1β) liberadas por células tumorales que mueren en respuesta al tratamiento con A/C juega un papel inmuno-potenciador de la respuesta inmune contra el tumor. Estudios en modelos animales de cáncer han demostrado que estas tres señales de peligro son inducidas por células que mueren como consecuencia de la quimioterapia y que su liberación es importante para el control de los tumores por el sistema inmune. Los estudios en animales e in vitro sugieren que HMGB-1 estimula el TLR-4; que el ATP es censado por el receptor purinérgico P2XR7 y que la IL-1β es liberada como consecuencia del ensamble del inflamosoma y que estas son tres señales de alarma que promueven la maduración de células dendríticas necesaria para la generación de linfocitos T CD8+ anti-tumorales. En este estudio se cuantificará por ELISA en plasma de las participantes los niveles de HMGB-1 e IL-1β antes y durante la quimioterapia y se analizara la frecuencia de polimorfismos específicos de nucleótidos (SNPs) de los receptores TLR-4 y P2XR7 como posibles marcadores biológicos de resistencia/susceptibilidad al desarrollo de enfermedad sistémica (desarrollo de metástasis). Finalmente, luego de los tres primeros ciclos de quimioterapia neo-adyuvante se cotejarán en cada paciente los datos obtenidos de estos estudios con la respuesta clínica (ver diagrama diseño metodológico – Anexo), con el fin de cotejar la liberación de estas señales de peligro como posibles marcadores biológicos de respuesta inmune celular de LT CD8+ antitumorales con valor pronóstico de respuesta clínica favorable a la quimioterapia neoadyuvante en pacientes con cáncer de mama. Página 20 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama GRUPOS DE ESTUDIO: En el presente proyecto se compararán los siguientes grupos: Pacientes: Mujeres con diagnóstico de cáncer de mama Controles: Mujeres sanas apareadas por edad En cada grupo se incluirán un total de 10 participantes que cumplan los criterios de inclusión y exclusión (ver más adelante). Las pacientes invitadas a participar en el estudio serán pacientes de la Clínica del Seno y del Hospital el Tunal gracias a la participación como co-investigadores en este proyecto del Dr. Ramiro Sánchez y el Dr. Rafael Tejada. A en estas entidades se les presentará el presente protocolo (Aprobado por Comité de Ética Facultad de Medicina -Universidad Nacional, ver Anexo). Criterios de inclusión y exclusión Criterios de inclusión Ambos grupos: o Mujeres mayores de edad que no se encuentren en gestación ni en periodo de lactancia. Índice de Karnofsky superior al 70% (Ver Anexo) o Presencia del alelo HLA-A*0201 o Aceptación voluntaria del consentimiento informado. Grupo Pacientes: o Confirmación histológica de carcinoma primario de mama de tipo ductal. o Cáncer de mama clasificación TNM: IIA, IIB, IIIA o IIIB (Ver Anexo); quienes recibirán quimioterapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida por un mínimo de 3 ciclos (esquema A/C). o Sobre-expresión de HER-2/neu por FISH/SISH o IHC Criterios de exclusión Pacientes que hayan recibido previamente algún tipo de terapia como tratamiento a su patología tumoral (radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia o terapia génica). Enfermedad autoinmune activa requiriendo tratamiento o historia de enfermedad autoinmune, que podría ser exacerbada por el tratamiento. Pueden incluirse pacientes con enfermedad endocrina controlada por terapia de reemplazo, incluyendo enfermedad tiroidea, enfermedad adrenal y vitiligo. Presencia de una infección crónica o aguda, como VIH, hepatitis viral o tuberculosis, antes o después de la firma del consentimiento informado. Uso de inmunosupresores dentro de las 4 semanas anteriores al ensayo (p. ej. corticosteroides), como azatioprina, prednisona o ciclosporina A. Puede aceptarse el uso de esteroides locales (tópico, nasal o inhalado). Cardiomiopatía clínicamente significativa, la cual requiera tratamiento. Página 21 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama Pacientes esplenectomizadas. Pacientes que no reciban el esquema de quimioterapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida por tres ciclos, o que reciban algún otro tipo de terapia complementaria como taxanos. Metodología detallada utilizada para alcanzar cada uno de los objetivos específicos: Objetivo 1. Evidenciar un aumento de la respuesta inmune contra el tumor (inmunogenicidad de los tumores) inducida por la Doxorrubicina y Ciclofosfamida en pacientes con cáncer de mama en quimioterapia neo-adyuvante. RACIONAL: La baja frecuencia de Linfocitos T específicos para un antígeno (calculada entre 10 a 40 células por cada 10^6 Linfocitos T en sangre), y la baja sensibilidad para su detección de las técnicas actualmente disponibles, han forzado el desarrollo de metodologías resientes que buscan incrementar la probabilidad de detección y cálculo del número de precursores de LT específicos para cualquier antígeno. Para alcanzar el primer objetivo de nuestro trabajo emplearemos la metodología descrita por Geiger y cols [126]en la cual se induce la expansión policlonal del repertorio total de LT-CD8 con el fin de calcular la frecuencia de precursores de LT-CD8 específicos para dos epítopes HLA-A2 del antígeno HER-2/neu expresado por los tumores de las pacientes participantes en este estudio. Para monitoreara el fenotipo de linfocitos T específicos para estos antígenos presentes en sangre periférica se utilizara un sistema in vitro que optimiza la presentación del antígeno a los LT-CD8+ por células dendríticas en un cultivo de PBMCs de 7 días como el descrito por Martinuzzi y cols [127] que permitira determinar de forma rápida y específica el fenotipo de memoria y la secreción de citoquinas en respuesta al antígeno HER-2/neu en nuestro trabajo. Tanto la evaluación de la frecuencia de precursores como el inmuno-fenotipo de linfocitos T anti tumorales se analizara en sangre de las pacientes antes y después de la quimioterapia neo-adyuvante con el fin de evaluar el efecto del esquema A/C en el incremento de la frecuencia y el fenotipo de los LT específicos contra el tumor. Los mismos análisis serán realizados en muestras de sangre de mujeres HLA-A2 sanas sin antecedentes familiares de cáncer de mama; tanto los resultados del número de precursores como del inmuno-fenotipo de LT específicos para los dos antígenos de HER-2/neu seleccionados encontrado en ellas, serán utilizados para establecer una línea base en mujeres sanas lo cual será utilizado como referente útil para la interpretación de los resultados obtenidos en las muestras de las pacientes. ACTIVIDADES: Toma y crio-preservación de muestras: A las voluntarias del grupo control se les tomará una muestra de sangre de 50mL. A las pacientes se les tomará dos muestras de sangre de 50mL cada una la primera antes de iniciar la quimioterapia y la segunda al finalizar el tercer ciclo de quimioterapia neo-adyuvante con esquema A/C. De cada muestra se obtendrán células mononucleares (PBMCs) por gradiente de densidad por Ficoll-Histopaque en la que se logra una separación por centrifugación de PBMCs del plasma, plaquetas y glóbulos rojos. Las células Página 22 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama obtenidas (aproximadamente 5x107 PBMCs por muestra) serán crio-preservadas en medio suplementado con suero fetal bovino (40% SFB), RPMI (50%) y dimetil sulfóxido (10% DMSO), a una concentración de 5x10^6 PBMCs por mL por vial y mantenidas en nitrógeno líquido hasta su uso en los ensayos descritos a continuación. Determinación de la frecuencia de precursores de Linfocitos T CD8+ de memoria: De las células crio-preservadas, se descongelará un vial de PBMCs para purificar por separación magnética por perlas (MIltenyi, Biotech. Alemania) linfocitos T CD8+ de memoria (CD8+ CD45RA- CD45RO+). La metodología propuesta para la determinación del repertorio es una adaptación de dos metodologías descritas por Geiger y Lanzavecchia [126] y Lonchay y cols [128]. Brevemente se cultivaran 2x10^3 LT-CD8+ por pozo en 192 pozos de 2 platos de 96 pozos fondo plano. La importancia de dispensar 2x10^3 LT-CD8+ por pozo se basa en que a esta dilución según Geiger y cols [126] mejora considerablemente la probabilidad de tener un LT-CD8+ por pozo específico para el antígeno seleccionado (en este estudio (HER-2/neu)). Cada pozo tendrá 2x10^3 LT-CD8+, los cuales se expandirán de forma policlonal con mitógeno (PHA-L), IL-2 en presencia de 2.5x10^4 monocitos heterólogos (células alimentadoras o feeders) por un periodo de 14 días con recambio de medio con IL-2 cada 3 días. En estas condiciones se espera una expansión de entre 100 y 1000 veces del repertorio inicial con lo cual se espera incrementar el nivel de detección de LT específicos para HER-2/neu. Posterior a la expansión policlonal inducida por el mitógeno, cada micro-cultivo será estimulado con monocitos autólogos pulsados previamente durante 3 horas con dos péptidos HLA-A2 de HER-2/neu (KIFGSLAFL y RLLQETELV) por 3 días. El cálculo del número de precursores de LT-CD8+ específicos para HER-2/neu se determinara mediante la determinación del número de cultivos positivos para la producción de IFN-γ medido por ELISA (BD) en el sobrenadante. El cálculo de la frecuencia de precursores será determinado por distribución de Poisson como lo describe Geiger y Lanzavecchia [126] teniendo en cuenta el número de pozos positivos para la producción de IFN-γ por millón de células utilizadas para construir la librería de LT CD8+ , es decir estableciendo el número de cultivos positivos para la producción de IFN-γ en el total de 2 millones de LT-CD8+ presentes al inicio en los 192 pozos y los cuales fueron amplificados a razón de 2000 células por pozo. Determinación del inmuno-fenotipo de LT específicos: Para la determinación del fenotipo de LTCD8+ específicos para HER-2/neu, se empleará una metodología descrita por Martinuzzi y cols [127], en un cultivo de PBMCs en el cual se realiza la inducción acelerada de DCs que son pulsadas con el antígeno. El procedimiento consta de 2 formas de detección de células específicas, el primero en sangre total y el segundo en PBMCs purificados el cual se empleará en el presente proyecto. Para el análisis del inmuno-fenotipo de PBMCs se cultivarán 10^6 PBMCs por pozo en plato de 96 pozos fondo plano en cuatro réplicas (200µL de medio AIM-V por pozo), se adiciona IL4 (500UI/mL) y GM-CSF (1000UI/mL) con lo cual se busca la inducción a DCs de monocitos presentes en la muestra y 5µg/mL del pool de péptidos de HER-2/neu. Un cultivo adicional no será pulsado con antígenos y se empleará como control de células no estimuladas. A las 24 horas de pulso con el antígeno se adiciona IL-1β, IL-6, TNF-α, y PGE2 (coctel de citoquinas empleado para maduración de las DCs) e IL-7 y se adicionara nuevamente los péptidos HLA-A2 de HER-2/neu. Este Página 23 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama cultivo se dejara progresar por 6 días adicionales (7 días en total). Al cabo de los 7 días se realiza por citometría de flujo, el análisis de la respuesta de los PBMCs al estímulo antigénico mediante la medición de citoquinas TH1/TH2 (IL-2; IFN-y; TNF-alfa; IL-6; IL-4; IL-10) por CBA (ver más adelante) y el análisis del inmuno-fenotipo de memoria de LT-CD8+ específicos para los dos antígenos peptídicos HLA-A2 de la proteína HER-2/neu seleccionados para estudio en este proyecto como se describe a continuación. El inmuno-fenotipo de LT-CD8+ de memoria se realizará por citometría multicolor mediante la marcación de las células luego del cultivo por 7 días con Tetrámero HLA-A2 específicos para dos epítopes A2 de HER-2/neu y con anticuerpos fluoromarcados para CD3, CD8, CD27 y para las moléculas CD45RA y CCR7 utilizados con el fin detectar LT-CD8+ multifuncionales productores de IL-2, TNF-α e IFN-γ presentes en tres sub-poblaciones de LT memoria y en los que analizará el grado de activación midiendo la expresión de CD154 (CD40-L). El panel de anticuerpos seleccionado permitirá de forma simultánea analizar parámetros de memoria y de LT efectores multifuncionales empleando 3 láseres de excitación (azul, rojo y violeta) del citómetro de flujo FACS Aria II de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional. El panel de anticuerpos que permite el análisis multicolor está conformado por los siguientes anticuerpos fluoromarcados: CD3 Pacific Orange, CD8 PE Texas Red, Tetrámero PE, CD154 (CD40L) APC H7, CD197 (CCR7) FITC, CD45RA PE Cy7, CD27 PE Cy5, IFN-γ Alexa Fluor 700, IL-2 APC y TNF-α Pacific Blue. El proceso de tinción se realizará de forma estándar como se describe a continuación. Luego del cultivo por 7 días y previo a la tinción una alícuota de sobrenadante (50µL) será almacenada a 20°C para el análisis de liberación de citoquinas por CBA luego de lo cual a las células del cultivo se les bloqueará el tráfico de citoquinas del retículo endoplasmático al aparato de Golgi por medio de Brefeldina A (BFA; 5µg/mL) por 6 horas. Posteriormente, una vez lavadas las células se marcarán por una hora con tetrámero HLA-0201 específicos para cada uno de los dos péptidos de Her2/neu, luego de lavar las células estas se re suspenderán en la mezcla de anticuerpos de superficie (CD3, CD8, CD154, CD45RA, CD27 y CD197) en un volumen final de 50µL/muestra. Estas células se incubarán a 4°C en oscuridad durante 20 minutos. Luego de lavado, se fijarán y permeabilizarán con el kit de Cytofix/Cytoperm de BD; se fijarán con Cytofix por 15 minutos, y luego seran permeabilizadas con PermWash durante 15 minutos. Luego de lavadas, las células se marcan con los anticuerpos para detección de citoquinas intracelulares (TNF-α, IFN-γ e IL-2) durante 30 minutos. Finalmente estas células se mantienen en PermWash hasta su lectura en el citómetro de flujo (se leerán de forma inmediata para evitar cualquier efecto sobre la medición de tetrámero y de citoquinas intracelulares). Determinación de la respuesta de poblaciones de LT-CD8+ de memoria y efectores: Para el análisis citométrico se empleará el software Flowjo 7.2.5 (Treestar). Se capturarán 200 mil eventos en la región linfoide seleccionada por SSC y FSC. Dentro de esta región se seleccionarán los LT según su expresión de CD3+. En los LT CD3+ se determinarán las poblaciones CD8+, se compararán Página 24 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama las poblaciones de LT de memoria según la expresión de los marcadores CD45RA, CCR7 y CD27, así: linfocitos T vírgenes (TN) [CCR7+/CD45RA+/CD27+]; linfocitos T efectores (TEF) [CCR7/CD45RA+/CD27-]; linfocitos T efectores de memoria (TEM) [CCR7-/CD45RA-]; y linfocitos T de memoria central (TCM) [CCR7+/CD45RA-]. Finalmente, se analizará la producción intracelular de las citoquinas (IL-2, TNF-α e IFN-γ) de manera independiente y en combinación con el fin de determinar la generación de LT multifuncionales (productores de las tres citoquinas ariba anotadas). Mientras que la expresión de CD154 señalará el grado de activación de las diferentes poblaciones de memora de LT CD8+ específicos contra el tumor, la tinción con tetrámero permitirá establecer el nivel de activación de LT-CD8+ específicos contra HER-2/neu. Medición de la respuesta efectora de citoquinas de linfocitos T específicos contra el tumor: En los sobrenadantes de los cultivos colectados al día 7, se analizarán 6 citoquinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL10, IFN-γ, TNF-α) mediante el kit TH1/TH2 Cytokine Bead Array (CBA) siguiendo las instrucciones del fabricante (BD). En resumen, se prepararán los estándares de cada citoquina a una concentración de 10000pg/mL. Posteriormente se preparará una curva de calibración con 9 diluciones del estándar y uno blanco. Se preparará la mezcla de las perlas (un tipo de perla por citoquina) que permitirá cuantificar las citoquinas en las muestras. A cada una de las muestras a analizar se agregará la mezcla de perlas con anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección, esta mezcla se incuba a temperatura ambiente por 2 horas. Finalmente, se realizan lavados y se procesa la muestra en un citómetro de flujo. La concentración de cada citoquina en la muestra se establece mediante interpolación del valor de fluorescencia emitido por el anticuerpo de detección con el valor correspondiente de concentración arrojado por una curva de calibración construida con distintas concentraciones del patrón recombinante para cada citoquina incluido en el estuche. Objetivo 2: Cotejar la inmunogenicidad de los tumores inducida por la quimioterapia con el grado de regresión tumoral en pacientes con cáncer de mama en quimioterapia neo-adyuvante con doxorrubicina y ciclofosfamida. RACIONAL: Parte esencial de la quimioterapia administrada bajo un principio neo-adyuvante es la evaluación por el clínico del grado de regresión del tumor luego del tercer ciclo de quimioterapia en que se realiza una valoración de la paciente por el oncólogo tratante en la que se hace una medición del tamaño del tumor o se registra enfermedad sistémica (p. ej. aparición de metástasis). Parte importante del objetivo 2 es tratar de correlacionar los datos obtenidos de la valoración por el oncólogo (clasificados según el nivel de respuesta clínica, ver anexo) con los datos de los análisis inmunológicos realizados; esto se propone con el fin de identififcar entre los parámetros inmunológicos analizados (inmuno-fenotipo de LT de memoria; perfil de citoquinas producido etc), posibles marcadores biológicos asociados al buen o mal pronóstico de progresión tumoral o hacia enfermedad sistémica. Página 25 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama ACTIVIDADES: Medición de respuesta clínica: La evaluación del cambio del tumor en respuesta al tratamiento es uno de los aspectos más importantes de la evaluación clínica de pacientes con cáncer en los que se monitorea el tamaño tumoral y grado de progresión hacia la enfermedad sistema. La parametrización más utilizada para este tipo de análisis se basanen las guías revisadas por la OMS de los criterios de evaluación de la respuesta en tumores sólidos RECIST (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors) [129], sin embargo, en este trabajo solo se utilizarán elementos diagnósticos habitualmente utilizados en nuestro medio en las pacientes para monitorear el curso de su enfermedad (inmuno-histoquimica, laboratorio, imágenes diagnosticas etc). La evaluación clínica estará a cargo de personal especializado en cáncer de mama de la Clínica del Seno (Dr. Ramiro Sánchez) o por el Dr. Rafael Tejada en el Hospital el Tunal (ver cartas de intención anexas), quienes harán este tipo de evaluación a las pacientes al momento del ingreso al estudio y al final del tercer ciclo de tratamiento neo-adyuvante y diagnosticaran el grado de respuesta clínica al tratamiento en cada paciente. Luego de la evaluación clínica se espera poder establecer que pacientes respondieron y cuáles no a la quimioterapia neo-adyuvante de acuerdo a los siguientes parámetros: Las pacientes que han respondido al tratamiento serán clasificadas como respondedoras totales o parciales (teniendo en cuenta el grado reducción de las lesiones tumorales observadas previo al tratamiento). Las pacientes que se considerarán no respondedoras al tratamiento neo-adyuvante serán pacientes signos y síntomas de enfermedad progresiva (incremento del tamaño tumoral en más del 20% de las lesiones iniciales o/o aparición de metástasis) o con enfermedad estable (sin cambios notorios en lesiones iniciales tomadas como referencia para su monitoreo). Según la experiencia en la Clínica del Seno, aproximadamente un 50% de las pacientes que entran al tratamiento neo-adyuvante responden en un cierto grado al tratamiento neoadyuvante con doxorrubicina y ciclofosfamida. Por esta razón confiamos que al menos un 50% de las voluntarias que ingresen al estudio exhiban una respuesta favorable al tratamiento y que sea posible asignar a las pacientes en una de las dos categorías mencionadas. Objetivo 3: Evaluar en pacientes con cáncer de mama en terapia neo-adyuvante con doxorrubicina y ciclofosfamida si la liberación de señales de peligro inducida por la quimioterapia favorece la inmunogenicidad de los tumores. RACIONAL: Evidencias recientes muestran como las antraciclinas principalmente la Doxorrubicina induce un tipo especial de muerte en las células tumorales (apoptosis pro-inflamatoria) caracterizado por la liberación de señales de peligro, como CRT, HMGB-1 e IL-1β [130, 131]. No obstante los resultados descritos en modelos animales, no se ha analizado los niveles de estas señales de peligro en las pacientes con cáncer de mama sometidas a un esquema de neoPágina 26 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama adyuvancia con Doxorrubicina y Ciclofosfamida. En nuestro estudio, estas mediciones tienen gran importancia dado que ha sido propuesto en modelos murinos de inmunoterapia de cáncer que una adecuada liberación de ellas, es requisito importante para la activación del sistema inmune y para potenciar la respuesta de linfocitos T CD8+ anti-tumorales. Por lo anterior, en este trabajo se medirá el grado de liberación de estas señales de peligro en las pacientes en quimioterapia con el fin de determinar si el nivel de activación de la respuesta inmune contra el tumor (p. ej., inmunofenotipo y frecuencia de precursores de LT-CD8+ específicos de HER-2/neu) esta asociando con los niveles de HMGB-1 e IL-1β en suero de las pacientes en quimioterapia. ACTIVIDADES: Monitoreo y medición de señales de peligro: Para la medición de las señales de peligro, se medirá en plasma de las pacientes, antes, durante (mitad de los 3 ciclos) y después de la quimioterapia (3 meses luego de iniciado el primer ciclo), la concentración de HMGb-1 e IL-1β por ELISA en una muestra de sangre (1mL). El punto de corte se establecerá mediante la medición de los niveles de estas moléculas en plasma de mujeres del grupo control de mujeres sanas. Para la medición de HMGB-1 se empleará un estuche comercial de ELISA (Shino-test corp – Japón) para la detección de IL-1β se empleara el estuche comercial CBA de inflamación siguiendo las instrucciones del fabricante (BD). Objetivo 4: Examinar si existe relación entre el grado de regresión del tumor inducida por la quimioterapia neo-adyuvante con la inmunogenicidad de los tumores; con la liberación de señales de peligro o con el polimorfismo de receptores específicos para estas señales. RACIONAL: Estudios clínicos han mostrado como 2 polimorfismos de los receptores de señales de peligro, TLR-4 y P2XR7 disminuyen la progresión libre de tumor en pacientes con cáncer de mama [28, 132]. Estos receptores al estar relacionados con la medición de las señales de peligro, tienen gran importancia en la capacidad de activar el sistema inmune. Por lo anterior con este objetivo deseamos correlacionar los polimorfismos determinados en las voluntarias junto con los datos de la respuesta clínica y los diferentes análisis realizados en los objetivos anteriores. El conjunto de datos proveerá información relevante sobre el papel que juega el sistema inmune durante la quimioterapia neo-adyuvante y así poder proponer esquemas de inmunoterapia que favorezcan tanto un fenotipo de células de memoria efectora, como la liberación de señales de peligro y la secreción de citocinas que puedan enfrentar de forma adecuada al tumor. ACTIVIDADES: Aislamiento de DNA y secuenciamiento de receptores: Se aislará DNA genómico con el kit Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) según instrucciones del fabricante. Brevemente, a 300µL de la muestra de sangre se le agrega solución de lisis celular. Se incuba por 10 minutos a temperatura ambiente. Se centrifuga por 40 segundos a 13.000rpm y se desecha todo el sobrenadante. Se lisa el núcleo y se precipitan las proteínas. Se centrifuga (13.000rpm por 3 min) y se transfiere el sobrenadante a otro tubo con isopropanol. Se centrifuga y lava nuevamente. Se Página 27 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama agrega etanol. Se centrifuga y se desecha el etanol, se deja secar la muestra y el DNA se rehidrata. Finalmente, el DNA se mantiene a 4°C y se cuantifica por espectrofotometría. Para la secuenciación se amplificará el TLR-4 con primers diseñados en Primer3 y enviado a secuenciar de forma bi-direccional en el servicio de secuenciación del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia. Recolección de datos: Para el análisis de resultados, los datos de las participantes serán almacenados en una base de datos en Excel (Microsoft Crop.). La información que se almacenará será la siguiente: Datos demográficos: Código de la participante, edad, estrato, antecedentes familiares de cáncer de mama, patologías asociadas, estadificación del tumor, nivel de expresión de HER-2/neu, dosificación de Doxorrubicina y ciclofosfamida, respuesta a la quimioterapia neo-adyuvante (múltiples criterios clínicos y valoración general). Resultados de Citometría: porcentajes dados por el análisis en FlowJo de cada subpoblación de memoria, el porcentaje de producción de citoquinas (solas y en combinación), producción de citoquinas en cada población de memoria. Todos los datos anteriores tanto en cultivo con péptido como en cultivo control. Análisis de frecuencia de precursores para HER-2/neu: Pozos positivos por muestra, número de células cultivadas, frecuencia calculada de precursores en línea base y 3 meses luego de iniciada la quimioterapia neo-adyuvante. Frecuencias de polimorfismos de los receptores TLR-4 y P2XR7. Análisis de SNPs encontrado a comparación de la secuencia consenso reportada en el NCBI. A partir de la base de datos se realizarán las consultas necesarias para generar las tablas con los resultados necesarios para su posterior análisis estadístico. Definición del tamaño de la muestra: El tamaño de la muestra (pacientes n=10 y controles n=10) fue calculado con el programa STATA versión 10.0. los parámetros para el cálculo se basaron en la probabilidad de que los resultados sean al alzar (valor “p”) menor de 0.05, este es a 2 colas (diferencias mayores o menores en la comparación de los grupos). El poder estadístico se determinó en 0.8 y se mantendrá una proporción 1:1 entre los grupos (pacientes vs controles). Esperamos una desviación estándar de 25% en las variables analizadas y que entre los grupos la diferencia de las medias sea de mínimo de 7%. Se tiene en cuenta la frecuencia de pacientes que puedan cumplir todos los criterios de inclusión y exclusión, uno de ellos dado por la presencia del alelo HLA-A*0201 (~28% de la población bogotana) [92]. Correlaciones: en este último objetivo se buscarán las posibles correlaciones entre los diferentes análisis realizados en los objetivos anteriores con el grado de regresión tumoral observado. En primera medida, una vez establecido el grado de regresión de la masa tumoral (ver criterios mencionados anteriormente), que según las observaciones clínicas de los oncólogos participantes en este estudio, aproximadamente un 50% de las pacientes en este esquema muestran evidencias de regresión tumoral al finalizar los tres primeros ciclos de quimioterapia neo-adyuvante, el grupo Página 28 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama de pacientes se dividirá en respondedoras o no al tratamiento. Entre esos grupos se compararán las siguientes variables. Inmunogenicidad: Comparación entre el número de precursores de LT-CD8+ específicos de antígenos tumorales (HER-2/neu) con la respuesta clínica. Se analizará de dos formas, una comparación de medias de la frecuencia de cada paciente entre respondedoras y no respondedoras a la quimioterapia, y una correlación lineal entre el tamaño de la masa tumoral (en mm) con la frecuencia de precursores de LT-CD8+. Estos análisis mostrarán la relevancia de poseer más o menos cantidad de LT-CD8+ (antes y después de la quimioterapia) con la regresión de la masa tumoral. Inmuno-fenotipo: El fenotipo de LT-CD8+ luego de la exposición a los péptidos de HER2/neu se comparará entre los grupos de pacientes respondedoras o no al tratamiento. Cada fenotipo de LT-CD8+ de memoria, junto con las poblaciones productoras de citoquinas se comparará igualmente mediante correlación lineal entre el tamaño de la masa tumoral (en mm) con el porcentaje de cada población analizada por citometría de flujo. Los análisis anteriores determinarán el grado de diferenciación, activación o supresión de LT-CD8+ específicos de HER-2/neu que puedan asociarse con una regresión favorable de la masa tumoral. Niveles de señales de peligro: Como se comentó anteriormente, las señales de peligro evaluadas durante la quimioterapia pueden ser reflejo de la muerte de células tumorales. Para ello,las mediciones antes, durante y después de la quimioterapia serán comparadas con el tamaño de masa tumoral mediante un análisis pareado. Así se podrá observar el comportamiento de cada participante de forma independiente y se analizará si hay o no un incremento en suero de estas señales de peligro dependiente del tratamiento con quimioterapia. Polimorfismos de TLR-4 y P2XR7: se analizará la presencia o no de los polimorfismos de estos dos receptores de señales de peligro en las participantes, y si esta variable puede afectar la inmunogenicidad de los tumores inducida por la Doxorrubicina y la Ciclofosfamida. Se comparará la frecuencia de cada polimorfismo encontrado mediante la secuenciación con el grado de regresión tumoral de cada participante. Este análisis será importante para definir las frecuencias de dichos polimorfismos en una muestra pequeña de personas y su relación con la capacidad de respuesta del sistema inmune ante el tratamiento neo-adyuvante. Página 29 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama CONSIDERACIONES ÉTICAS Y AMBIENTALES De acuerdo a la resolución N° 008430 de 1993 que establece las normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en humanos, Artículo 11, este proyecto se clasifica como investigación con riesgo leve a moderado: “estudios prospectivos que emplean el registro de datos a través de procedimientos comunes consistentes en: exámenes físicos o sicológicos de diagnóstico o tratamientos rutinarios, entre los que se consideran: pesar al sujeto, electrocardiogramas, pruebas de agudeza auditiva, termografías, colección de excretas y secreciones externas, obtención de placenta durante el parto, recolección de líquido amniótico al romperse las membranas, obtención de saliva, dientes deciduales y dientes permanentes extraídos por indicación terapéutica, placa dental y cálculos removidos por procedimientos profilácticos no invasores, corte de pelo y uñas sin causar desfiguración, extracción de sangre por punción venosa en adultos en buen estado de salud, con frecuencia máxima de dos veces a la semana y volumen máximo de 450 ml en dos meses excepto durante el embarazo ...”. La norma no es clara en cuanto a volumen de sangre tomado en pacientes, por el volumen de 50mL consideramos que el riesgo es leve, sin embargo se le explicará a la paciente todos los posibles riesgos que conlleva la toma de estas muestras. Las muestras obtenidas en el presente estudio solo serán utilizadas para los experimentos aquí establecidos o que complementen el presente proyecto, por ningún motivo serán compartidos ni empleados en otros proyectos. Adicionalmente las muestras congeladas que al finalizar el proyecto no sean empleadas serán descartadas, por lo tanto no se generará un banco de células ni muestras biológicas de las participantes. El presente proyecto fue revisado y aprobado por el Comité de Etica de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia en el acta No. 4 del 10 de marzo del 2011 (Ver anexos). Procedimiento para la toma del consentimiento informado Verificación y obtención de datos de contacto de pacientes o controles que deseen participar en el estudio. Presentación del consentimiento informado y resolución de cualquier duda al respecto a los grupos seleccionados de casos y controles. Obtención del consentimiento informado firmado tanto por el participante y un testigo (Ver Anexo). Página 30 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama IDENTIFICACION DE LA POBLACION Y/O AREA TERRITORIAL BENEFICIADA Todos los resultados y futuros desarrollos generados a partir de este proyecto beneficiarán en primera medida la comunidad científica internacional especializada en el tema de inmunología, inmunoterapia y oncología, con los desarrollos posteriores en el área de inmunoterapia se beneficiarán a futuro los pacientes con cáncer. Adicionalmente, el desarrollo científico del país será beneficiado gracias al fortalecimiento de grupos de investigación y capacitación de estudiantes de posgrado. PRODUCTOS DEL PROYECTO Estandarización del análisis de la frecuencia de linfocitos T específicos contra HER-2/neu, mediante citometría de flujo. Publicación de un artículo en revista internacional indexada con los resultados de frecuencia de LT-CD8 específicos, niveles de señales de peligro, polimorfismos de receptores y posibles correlaciones con regresión tumoral. Presentación de resultados obtenidos mediante poster en un congreso internacional de inmunoterapia. Formación de un estudiante de Doctorado en Ciencias Biomédicas y un estudiante de Maestría de la Universidad Nacional de Colombia en el área de inmunología y oncología. POSIBLES RIESGOS Y DIFICULTADES El presente proyecto involucra una fase de reclutamiento de pacientes con criterios de inclusión específicos, la frecuencia de consecución de las pacientes puede ser variable y por lo tanto los tiempos de inicio del análisis de laboratorio dependerán de la obtención de las muestras de sangre requeridas. Por otra parte la importación de ciertos reactivos especializados como el ELISA de HMGB-1 y los tetrámeros para HER-2/neu pueden retrasar el análisis donde son requeridos, sin embargo al poder emplear muestras congeladas (suero como células) se puede controlar el tiempo de su desarrollo. IMPACTOS EPIDEMIOLOGICOS (2013): El presente proyecto es un estudio observacional prospectivo en pacientes con cáncer de mama quienes entrarán a un esquema de quimioterapia neo-adyuvante en la ciudad de Bogotá. Los resultados de este proyecto servirán de base para ensayos clínicos de inmunoterapia en cáncer los cuales con potencial terapéutico. A largo plazo estas terapéuticas Página 31 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama combinadas con esquemas de quimioterapia que potencien la inmunogenicidad de los tumores, impactarán favorablemente sobre la incidencia de cáncer de mama en Colombia. SOCIO-ECONOMICOS (2013): Los resultados generados con el desarrollo de este proyecto con respecto a las capacidades inmunopotenciadoras de la Doxorrubicina y de la Ciclofosfamida utilizadas en un esquema de quimioterapia de neo-adyuvancia, podrá impactar sobre las decisiones clínicas al momento de seleccionar el tratamiento neo-adyuvante para las pacientes con cáncer de mama. Adicional al efecto inmunológico de estos fármacos y a diferencia de las nuevas tendencias terapéuticas, la Doxorrubicina y la Ciclofosfamida son fármacos de bajo costo que reducirían considerablemente los costos del manejo del cáncer al sistema de salud del país. CALIDAD Y OPORTUNIDAD EN LA PRESTACION DE SERVICIO (2013): Con el desarrollo de este proyecto se implementarán técnicas de punta a nivel de inmunología del cáncer como base fundamental para la investigación de terapéuticas convencionales como nuevas alternativas en desarrollo como la inmunoterapia. Todos los procesos se realizarán con controles de calidad, que podrán extrapolarse en un futuro a ser implementados como un servicio a nivel clínico. MEDIO AMBIENTE Y SOCIEDAD (2012): Todos los procesos de laboratorio como la toma de muestras generan desechos ambientales de tipo biológico y químico por el empleo de los reactivos. El manejo de desecho y residuos que se generen se hará de acuerdo a los estándares establecidos para la protección del medio ambiente, siguiendo las normativas de bioseguridad y protección de individuos que participan en actividades de investigación en el Laboratorio de Equipos Comunes ubicado en el tercer piso (Edificio 471) de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia en Bogotá. El proyecto controlará la exposición tanto de los investigadores a sustancias que requieran especial cuidado generadas en este proyecto (desecho de material corto-punzante, agujas, tubos con desechos de sangre humana, desechos químicos, etc.), con el fin de prevenir daños a otras personas y al medio ambiente, como lo dicta la resolución 8430 de 1993, Art. 63. IMPACTOS CIENTIFICOS Y TECNOLOGICOS EN LAS ENTIDADES PARTICIPANTES (2013): El conocimiento generado con el desarrollo del proyecto se divulgará mediante la publicación de un artículo en una revista internacional indexada, el fortalecimiento del grupo de Investigación en Inmunología y Medicina Traslacional bajo la dirección del Dr. Carlos Parra y su participación en congresos internacionales especializados en el área de inmunoterapia del cáncer como los organizados por el ISBTC, el desarrollo de una tesis de Doctorado en Ciencias Biomédicas y en la estandarización de procesos de alta sensibilidad para la detección de la inmunogenicidad inducida por fármacos como la Doxorrubicina y Ciclofosfamida con tecnología de punta como la citometría de flujo multiparamétrica. Página 32 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama CRONOGRAMA ID 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Actividades INICIO 1 1- Pacientes y toma de muestras Consecución pacientes y controles 1 Aislamiento de DNA (tipificación y secuenciación) 1 Tipificación HLA-A*0201 1 Ingreso datos demográficos a base de datos 1 Obtención de sangre periférica 50mL línea base 1 Obtención de sangre periférica 1mL mitad 3 quimioterapia y 50mL mes 3 1 Separación de células (PBMCs) Crio-preservación de PBMCs 1 9 2- Objetivo 1 9 Determinación de la frecuencia de precursores 9 Inmunofenotipo de LT específicos 13 Medición citoquinas CBA 3 3- Objetivo 2 3 Análisis respuesta clínica 12 Realización ELISA HMGB-1 e IL-1β por CBA 12 4- Objetivo 4 12 Secuenciación de TLR-4 y P2XR7 15 5- Análisis de resultados 15 Ingreso resultados a bases de datos Correlaciones entre: inmunogenicidad, niveles de señales de peligro, frecuencia de polimorfismos 16 de TLR-4 y P2XR7 con quimioterapia y regresión tumoral 16 Escritura y envío de manuscrito 18 Redacción informe final FIN 9 6 6 6 6 6 9 9 9 14 14 14 14 15 9 14 15 15 24 16 18 22 24 Página 33 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama PRESUPUESTO GLOBAL ITEM Costos operativos Equipos Gastos de viajes Mantenimiento de equipos e infraestructura Materiales Prestación de servicios técnicos Publicaciones y patentes Recurso humano Seguimiento y evaluación Seguros ENTIDAD U. Nacional U. Nacional U. Nacional U. Nacional U. Nacional U. Nacional U. Nacional U. Nacional U. Nacional U. Nacional SUB-TOTAL ESPECIE $ 15.000.000 $ 30.000.000 $ - $ 10.000.000 $ - $ - $ - $ 32.000.000 $ - $ - DINERO $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ - $ 87.000.000 $ $ - imprevistos U. Nacional $ TOTAL PROYECTO PORCENTAJE CONTRAPARTIDA 43% - ENTIDAD FINANCIADORA FIANANCIADO Colciencias $ Colciencias $ Colciencias $ Colciencias $ Colciencias TOTAL $ 15.000.000 7.500.000 $ 37.500.000 3.000.000 $ 3.000.000 - $ 10.000.000 $ 79.050.000 $ 79.050.000 Colciencias $ 7.000.000 $ 7.000.000 Colciencias $ 2.000.000 $ 2.000.000 Colciencias $ 15.000.000 $ 47.000.000 Colciencias $ - $ - Colciencias $ - $ - $ Colciencias $ PORCENTAJE COLCIENCIAS 57% - 113.550.000 $ - 200.550.000 $ $ 200.550.000 Página 34 de 43 - Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama ANÁLISIS SITUACIONAL DE LA TEMÁTICA DEL PROYECTO El cáncer en la glándula mamaria se desarrolla generalmente como una proliferación maligna de las células epiteliales de los lobulillos mamarios. Al igual que los demás cánceres, es una enfermedad clonal, resultado de mutaciones en su mayoría somáticas o de línea germinal en un 10%, hallándose varios genes defectuosos en las pacientes como la mutación del gen supresor BRCA 1 y 2 que aumenta el riesgo de padecer éste cáncer en un 85-90% y que predomina en ciertos grupos étnicos. Se ha demostrado que se trata de una enfermedad hormono-dependiente, por lo que la relación de padecimiento mujer:hombre es de 150:1. Sin embargo, la incidencia en la población general es lo suficientemente alta como para ocupar el primer lugar en los países desarrollados donde se reportan casos de patología tumoral maligna hasta en 99.4 /100.000 hab. en USA; 71.69/100.000 en Australia y Nueva Zelanda, 13.62/100.000 para el África, 11.77/100.000 en la china, y 32.00/100.000 en Colombia donde se ubica en la tercera causa de muerte por cáncer. En Colombia, el cáncer de mama ocupaba el tercer lugar en causa de muerte por tumores malignos en la escala general para ambos géneros, después del cáncer gástrico y de cuello uterino. Las estadísticas existentes son parciales debido a que no existe un reporte de casuística de todo el país; en el año 2003 la Clínica San Pedro Claver reportó 207 casos de cáncer mamario. La edad promedio fue 58 años, 30% tenía menos de 50 años. El carcinoma ductal infiltrante con el 86,5% de los casos fue el tipo histológico más frecuente. La distribución según los estadios concentró el mayor número de pacientes en los estados 0 al II (61%) por tratarse de un centro de referencia. Los tumores midieron más de 2 cm (52%), y el tratamiento quirúrgico se realizó en 82% de los pacientes. Los tumores malignos de la mama se han convertido en una de las principales patologías tumorales en la mujer, presentando un incremento en su incidencia y mortalidad durante las últimas décadas, tanto en los países desarrollados como en nuestro medio. Las medidas preventivas no han logrado el éxito esperado, y las terapias tanto quirúrgicas como farmacológicas ofertadas hoy en día no mejoran las expectativas de sobrevida de los casos de mal pronóstico, como por ejemplo aquellas pacientes que tienen una sobre-expresión del oncogén HER-2/neu y no presentan positividad para receptores hormonales, los cuales llegan a ser hasta un 30% de todos los casos; esta proteína ha sido asociada con un grado histológico pobre, extensión a ganglios axilares y un número mayor de ganglios afectados. Estas pacientes suelen recibir terapia adyuvante con Trastuzumab, un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra la molécula HER-2/neu, que ofrece una disminución en las recaídas hasta del 34%, pero suele presentar efectos cardiotóxicos y de resistencia, además de contar con un muy elevado costo. El cáncer es un conjunto de enfermedades caracterizado por la proliferación descontrolada de células mutadas que adquieren la capacidad de invadir tejidos adyacentes, e incluso de hacer siembras metastásicas en otros órganos. La carcinogénesis está dada por la expansión clonal de una única célula que presenta anormalidades en su material genético de forma heredada o por errores no reparados durante la replicación de su DNA, sumados a la influencia de los Página 35 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama desencadenantes medioambientales y a los factores epigenéticos, lo que ocasiona una transformación de la célula originaria durante sus divisiones, que le permite oponer resistencia y crear anergia a los componentes del sistema inmune. Los mecanismos de respuesta que normalmente ofrece el sistema inmune "fallan" ante la presencia de células tumorales, ya que éstas producen ciclo-oxigenasa-2, Prostaglandina E2 (PGE2), Factor de crecimiento tumoral Beta 1 (TGFB-1) y óxido nítrico, sumado a los defectos inmunes que suelen presentar los pacientes con cáncer de mama, tales como disminución de linfocitos periféricos, incremento en el número de linfocitos supresores (CD4+CD25+) periféricos e intratumorales y disfuncionalidad de las DCs (bajos niveles de MHC II, CD86 y poca secreción de IL12). Desde inicios de los 80's fue reportada la capacidad de los LT CD8+ para destruir células cancerosas al observar que la lisis por los linfocitos infiltrantes de tumor en un paciente con melanoma destruían eficazmente líneas celulares del mismo tipo de cáncer en un ensayo in vitro. Aunque los LT específicos contra estos antígenos existen en la periferia, no reconocen debidamente el antígeno dada su gran similitud con las moléculas propias, los bajos niveles de expresión en la célula u otros mecanismos de escape que hacen que los tumores pasen desapercibidos para el sistema inmune en las primeras etapas favoreciendo su crecimiento. Sin embargo, en un organismo inmuno-competente el sistema inmune es de vital importancia en el control de la tumorogénesis; y es así como la predisposición de individuos inmuno-deficientes a desarrollar tumores y la mayor frecuencia de los mismos en edad avanzada son evidencias indirectas de que en condiciones normales el sistema inmune juega un papel importante en el control del cáncer. Por otra parte, se ha hallado que existe un mejor pronóstico en la evolución de diferentes tipos de tumores malignos si se evidencia la infiltración de tumores primarios con linfocitos; pero ha de tenerse en cuenta que este tipo de respuestas son infrecuentes y por lo tanto distintos tipos de inmunoterapia son necesarios para promover la re-estimulación de aquellos precursores de linfocitos específicos de tumor, que aunque escasos y difíciles de estimular, se generan normalmente durante cualquier proceso neoplásico. Página 36 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama BIBLIOGRAFIA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. Jemal, A., et al., Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin, 2009. 59(4): p. 225-49. Cancerología, I.N.d., Anuario Estadístico 2008. 2009. 6: p. 100. 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Página 42 de 43 Estudio de la inmunogenicidad de los tumores inducida por Doxorrubicina y Ciclofosfamida utilizadas como terapia neo-adyuvante en pacientes con cáncer de mama ANEXOS Lista de anexos en formato PDF. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Diagrama de flujo de metodología Resultados preliminares Carta de aprobación comité de Ética Acta de constitución del comité de ética de la facultad de medicina Carta del investigador principal de compromiso de residencia Carta de participación de los co-investigadores Aval institucional DIB Consentimiento informado Trayectoria de investigación del grupo Carta designación Ing. Niño Página 43 de 43
