artículo científico-pablo alvarez-maestria en suelos

SELECCIÓN Y EVALUACIÓN DE MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE
FOSFATOS EN SUELOS CALCÁREOS DEL VALLE DEL MANTARO
Pablo Alvarez Figueroa1
Sady García Bendezú2
RESUMEN
El fósforo (P) es un elemento limitante para la productividad de ecosistemas terrestres.
Una estrategia para aprovechar eficientemente el P del suelo es el uso de microorganismos
solubilizadores de fosfatos (MSP). El presente trabajo fue planteado para evaluar la presencia
de MSP en suelos calcáreos del valle del Mantaro y su capacidad para solubilizar fosfatos de
calcio in vitro, con énfasis en la roca fosfórica de Bayóvar. Siete suelos agrícolas del valle del
Mantaro y un suelo de La Molina fueron evaluados por su presencia de MSP mediante el
método de placas de dilución empleando el medio de Pikovskaya (PVK). En total, 13 cepas
bacterianas y 7 de hongos promisorias fueron aisladas. Tres cepas bacterianas (Pseudomonas
sp., Bacillus sp. y Clostridium sp.) y una cepa de hongo (Penicillium sp.) fueron seleccionadas
por presentar mayores halos de solubilización. La eficiencia de solubilización in vitro de las
cuatro cepas fue evaluada empleando el medio líquido PKV adicionado con 1000 mg P L-1
como fosfato tricálcico [Ca3(PO4)2] o roca fosfórica de Bayóvar. El P soluble, el pH y la
acidez titulable fueron medidos. Clostridium sp. mostró la mayor eficiencia de solubilización
con 429 mg P L-1 a partir del fosfato tricálcico. Una estrecha relación entre la concentración de
P soluble y la acidez titulable fue encontrada en todas las cepas. La solubilización de P a partir
de la roca fosfórica fue notablemente menor que para el fosfato tricálcico. Clostridium sp. es
promisoria en su capacidad solubilizadora in vitro, pero mayores estudios se requieren para
recomendar su aplicación en campo.
Palabras clave: MSP, Pseudomonas sp., Clostridium sp., roca fosfórica, fosfato tricálcico.
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Ingeniero Agrónomo, Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Loja-Ecuador.
Dr. Profesor Principal, Departamento de Suelos, Facultad de Agronomía, Universidad Nacional Agraria La Molina
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SELECTION AND EVALUATION OF PHOSPHATE SOLUBILIZING
MICROORGANISMS IN CALCAREOUS SOILS OF MANTARO VALLEY
SUMMARY
Phosphorus is a limiting factor for the productivity of terrestrial ecosystems. A
promising strategy for efficiently using the soil P pools is the use of phosphate solubilizing
microorganisms (PSM). The objective of this work was evaluating the presence of
microorganisms with ability to solubilize calcium phosphates in calcareous soils from Mantaro
Valley, and their efficiency for in vitro P solubilization with emphasis in Bayovar rock
phosphate. Seven soils from Mantaro valley and one from La Molina were screened for
presence of PSM applying the technique of dilution plates with the nutrient medium of
Pikovskaya (PVK). In total, 13 bacterial and 7 fungal isolates with P solubilization capacity
were identified. Three bacterial isolates (Pseudomonas sp., Bacillus sp. y Clostridium sp.) and
one fungal isolate (Penicillium sp.) were selected due to the appearance of clear solubilization
haloes. For all the isolates, the in vitro P solubilization efficiency was evaluated using the
liquid nutrient medium of Pikovskaya added with 1000 mg L-1 of P as tricalcium phosphate
[Ca3(PO4)2] and Bayovar rock phosphate. The amount of dissolved P, pH and titratable
acidity were measured in the medium at 5, 10, 15 20, 15 and 30 days after inoculation (dai).
The maximum solubilization rates were reached between 15 to 25 dai. Clostridium sp. was the
most efficient, with 429 mg L-1 of P solubilized. A close correlation between soluble P
concentration and titratable acidity was found in all the isolates. Phosphorus solubilization
from Bayovar rock phosphate was noticeably lower than that from tricalcium phosphate.
Clostridium sp. is an isolate with promising capacity for P solubilization in vitro, but further
studies are required to be recommended for field applications.
Keywords: PSM, Pseudomonas sp., Clostridium sp., rock phosphate, tricalcium phosphate.
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I.
INTRODUCCIÓN
El fósforo (P) es un elemento escaso en la naturaleza. El contenido total de P en la capa
superior del suelo varía entre 50 a 3000 mg kg-1 (Sims y Pierzynski 2005). El P absorbido por
las plantas alcanza solamente un 0.1% del total (Chen et al. 2006, Sample et al. 1980), y está
representado por los iones ortofosfato H2PO4- y HPO42- (Walker y Syers 1976, Foth y Ellis
1997). En la mayoría de suelos el P en solución es insuficiente para cubrir los requerimientos
de la planta (Kirkby y Johnston 2008).
Diversos investigadores advierten sobre una inminente crisis de fósforo, ya que las
reservas mundiales de fósforo se encuentran en un proceso de agotamiento (Cordell et al.
2009, Vaccari 2009). La distribución de estas reservas es desigual; a lo que se añaden
dificultades de suministro (FAO 2005). Este desequilibrio convierte al fósforo en un recurso
geoestratégico.
El Perú tiene reservas importantes de roca fosfórica (RF) en los depósitos
sedimentarios de Bayóvar, ubicados en la costa norte en el desierto de Sechura, con reservas
potenciales estimadas en 10 mil millones de TM (Alegre y Chumbimune 1991) con una
riqueza de 30.5 % de P2O5 (Aguirre 1993).
Dada la baja solubilidad de este mineral fosfatado, surge la necesidad de investigar en
microorganismos con capacidad para solubilizar RF y fosfatos de calcio. Una cantidad
importante de investigaciones han sido orientadas a mejorar la eficiencia de la nutrición
fosfórica de las plantas a través de microorganismos que solubilizan FePO4 y AlPO4 en suelos
ácidos y Ca3(PO4)2 en suelos básicos.
El objetivo del presente trabajo de investigación fue determinar la presencia de
microorganismos con capacidad de disolución de fosfatos de calcio en suelos calcáreos del
valle del Mantaro y evaluar su potencial para solubilizar la RF de Bayóvar.
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II.
MATERIALES Y MÉTODOS
Selección de suelos para el aislamiento de cepas.
Los suelos empleados para el aislamiento e identificación de cepas fueron
seleccionados de una colección de 50 muestras de suelo obtenidas de las comunidades de
Chacrampa, Aramachay y Sincos (Distrito de Sincos, Provincia de Jauja, Región Junín) en el
valle del Mantaro.
La colección fue preparada entre los meses de julio a agosto del 2011, como parte del
subproyecto 4 del proyecto de investigación en evaluación de sistemas productivos en el
marco del convenio IUC-VLIR-UNALM. Las muestras fueron obtenidas de los primeros 30
cm de campos agrícolas cultivados con papa, cebada, avena y leguminosas de grano,
manejadas bajo un sistema de rotación que incluye periodos de descanso entre 1 a 2 años.
Las propiedades físico-químicas de los suelos relacionadas con su fertilidad fueron
determinadas en el Laboratorio de Análisis de Suelos, Plantas, Aguas y Fertilizantes de la
Universidad Nacional Agraria La Molina (LASPAF-UNALM). Siete suelos fueron
seleccionados por su alto contenido de carbonato de calcio y bajo fósforo disponible. El
fósforo disponible fue medido por el método Olsen (Olsen et al. 1954), después de realizar la
extracción de las muestras de suelo con NaHCO3 0.5 M a pH 8.5.
Un suelo del campo “Libres” ubicado en el campus de la UNALM, con contenido
medio de calcáreo total, fue también incluido en el proceso de selección.
En el cuadro 1, se muestra las características de los ocho suelos utilizados para el
aislamiento de microorganismos solubilizadores de fósforo (MSP)
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Cuadro 1: Descripción de los suelos utilizados para el aislamiento
P2O5 CaCO3 Clasificación taxonómica
CE(1:1)
dS m-1 mg kg-1
%
Soil Taxonomy (2010)
Suelo
Localidad
Altitud
msnm
pH*
1
Aramachay
3698
7.96
0.26
4.0
33.90
2
Chacrampa-1
3607
7.81
0.25
3.5
6.30
Typic Ustorthents
Typic Ustorthents
3
Chacrampa-2
3588
7.46
0.82
14.7
19.10
Typic Ustorthents
4
Sincos-1
3413
7.91
0.28
3.4
24.80
Typic Ustorthents
5
Chacrampa-3
3605
7.59
0.48
39.2
10.10
Typic Ustorthents
6
Sincos-2
3307
7.57
1.37
16.4
14.30
Typic Ustifluvents
7
Sincos-3
3301
7.49
2.40
13.3
13.40
Typic Ustifluvents
Ustic Torrifluvents
*Los análisis de caracterización fueron realizados en el LASPAF-UNALM
8
La Molina
234
7.33
2.30
28.6
6.30
Aislamiento de microorganismos
Para el aislamiento de MSP, las muestras fueron secadas al aire por 48 horas,
tamizadas a través de una malla de 2 mm de diámetro para remover los fragmentos gruesos;
posteriormente fueron homogenizadas y almacenadas en recipientes herméticos de plástico.
Bacterias y hongos se aislaron a partir de ocho suelos mencionados anteriormente,
mediante la técnica de dilución en placas. El medio PKV fue utilizado para el cultivo de los
microorganismos. Se trabajó con las diluciones 10-5, 10-6, 10-7 para bacterias y con 10-4, 10-5,
10-6 para hongos; a partir de las cuales se realizó el conteo de colonias totales y colonias que
solubilizan fósforo, y en base a esto se determinó la población.
Selección de cepas con capacidad de disolución en medio sólido
Para la detección selectiva de los MSP se empleó el medio sólido de PKV
complementado con 5.0 g L-1 de fosfato tricálcico grado reactivo ó 7.63 g L-1 de roca fosfórica
de Bayóvar, para aportar 1000 mg L-1 de P inorgánico. Después de 5 días de incubación a 24
°C, se evaluó si los microorganismos desarrollaron zonas transparentes alrededor de las
colonias (halozonas). Las cepas que presentaron esta característica fueron repicadas por un
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procedimiento de picado con punta de aguja y a los 4 días fue determinado el índice de
solubilización. Es importante mencionar que el fosfato tricálcico y la RF se adicionaron en
tratamientos diferentes para determinar la presencia de MSP en ambos medios; ya que
presentan diferente constante de producto de solubilidad (Kps), siendo la RF más difícil de ser
solubilizada.
Las colonias dentro de las placas y sus halos de solubilización fueron fotografiados
mediante una cámara digital Sony Easyshare®. Los diámetros de crecimiento de cada colonia
y los diámetros de los halos de solubilización respectivos fueron medidos con ayuda del
software AutoCAD 2012 en español. Los diámetros fueron determinados utilizando
fotografías de las placas y calibrándolas dentro del programa a un tamaño real usando
referencias de tamaño conocido como el diámetro de la placa, monedas y el tamaño real de las
etiquetas presentes en las placas.
El índice de solubilización (IS) en los repiques fue calculado mediante la fórmula
siguiente (Kumar y Narula 1999):
Donde:
Ø Halo = diámetro del halo de solubilización (diámetro colonia + halozona)
Ø Colonia = diámetro de la colonia
Con el mismo programa y calibrada la fotografía al tamaño real, se determinó el área
del halo de solubilización que corresponde al área total (área de la colonia más área de la
halozona).
Prueba de solubilización in vitro en medio líquido
Las cepas puras que desarrollaron halo en medio sólido y que presentaron el índice más
alto de solubilización y/o mayor área del halo de solubilización se evaluaron en medio líquido.
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En frascos conteniendo 150 mL de medio líquido PVK modificado con 1000 mg L-1 de
fosfato tricálcico o roca fosfórica de Bayóvar, fue inoculado 1 mL de una suspensión de
Bacillus sp., Clostridium sp. y Pseudomonas sp. a una concentración de 3 x 108 ufc mL-1
validada previamente con la escala de McFarland, y Penicillium sp. a una concentración de 1 x
106 esporas mL-1 determinada por conteo de conidios con el hemocitómetro de Neubauer
según el procedimiento descrito por French y Hebert (1980). La temperatura de incubación fue
28 °C.
La concentración de fósforo en la solución nutritiva fue medida a los 5, 10, 15, 20, 25 y
30 días. El muestreo se realizó por descarte tomando una alícuota de las tres repeticiones por
tratamiento y un blanco por cada cepa y fuente de P insoluble. Fue determinada también la
acidez titulable por el método descrito por Cerezine et al. (1988) y el pH de los filtrados.
El ensayo estuvo conformado por cuatro cepas y dos enmiendas que fueron las fuentes
de P insoluble (cuadro 2) con un total de 144 unidades experimentales.
Cuadro 2: Estructura del ensayo de solubilización in vitro
Cepa
Bacillus sp.
Clostridium sp.
Penicillium sp.
Pseudomonas sp.
Bacillus sp.
Clostridium sp.
Penicillium sp.
Pseudomonas sp.
Fuente de P
insoluble
Fosfato
tricálcico
Roca fosfórica
de Bayóvar
Nº
repeticiones
3
3
3
3
3
3
3
3
Nº
evaluaciones
6
6
6
6
6
6
6
6
Total
repeticiones
18
18
18
18
18
18
18
18
La cantidad de fósforo soluble fue medida por el método azul de molibdeno (Watanabe
y Olsen 1965), y se expresó en mg P L-1 solubilizado por cada unidad muestreada. Para ello, la
alícuota de caldo microbiano se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos, y posteriormente
se filtró con papel Whatman No. 40.
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III.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento
Fueron encontradas 13 cepas de bacterias y de 7 de hongos con capacidad para disolver
P insoluble. La población de bacterias solubilizadoras de P en el medio adicionado con RF fue
de 0.55 % del total; mientras que la población de estas en medio con fosfato tricálcico (FTC)
fue 9.25%. La población de hongos solubilizadores en medio de cultivo con RF fue de 15.50
% mientras que en medio con FTC la población de solubilizadores fue de 28.40 %. En general,
la población fue más alta en el medio adicionado con FTC en comparación con la población
encontrada en medio con RF, ya que esta última es un compuesto de difícil solubilización, y al
no proveer P al medio nutritivo la población fue notablemente menor.
Fue realizada la identificación de las cepas mediante pruebas bioquímicas.
Índice de solubilización
El índice de solubilización (IS) in vitro en medio sólido presentó alta diferencia
significativa entre las 20 cepas seleccionadas para su estudio por su capacidad de disolución
de P inorgánico. La mejor cepa bacteriana fue Pseudomonas sp. que supera ampliamente a las
demás alcanzando 3.05, seguida por Clostridium sp. y la CBact6, que fueron el segundo grupo
con 1.94 y 1.75 respectivamente. En relación a las cepas fúngicas la que destacó sobre las
demás fue Penicillium sp. con 1.45. Es importante mencionar que lo que pretende el trabajo es
aportar con cepas promisorias que solubilicen P, en este sentido el objetivo fue seleccionar tres
cepas bacterianas para realizar pruebas en la siguiente fase, y de acuerdo al índice de
solubilización se seleccionó a la Pseudomonas sp. y Clostridium sp. por presentar los valores
más altos.
Área del halo de solubilización
Se realizó para diferenciar entre bacterias que presentando índices de solubilización
similares pueden presentar diferentes áreas de solubilización, es decir, una bacteria pequeña
puede presentar el mismo índice de solubilización que una bacteria de mayor tamaño y en este
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sentido el área del halo de solubilización nos permitió diferenciar cepas que solubilizaron una
mayor área y por lo tanto son más promisorias.
Las cepas bacterianas con el mayor área de halo de solubilización fueron Clostridium
sp., Pseudomonas sp. y Bacillus sp. con 196.8, 186.4 y 144.4 mm2 respectivamente.
Relacionando las mejores cepas por la mayor área de halo de solubilización y el alto
índice de solubilización, se observa que Pseudomonas sp. y Clostridium sp. presentan los
mejores resultados en ambas mediciones y por lo tanto constituyen las cepas más promisorias.
Estas dos bacterias fueron seleccionadas para estudios posteriores.
Aunque Bacillus sp. presentó un área del halo solubilización menor que las dos
bacterias mencionadas, también fue considerada para la siguiente fase de laboratorio, ya que el
área de halo solubilizado en medio sólido fue uno de los más altos.
La CBact6 considerada dentro de las tres mejores por su alto IS, no fue considerada
para la siguiente prueba ya que el área del halo de solubilización estuvo entre los más bajos, es
decir presentó uno de los menores diámetros totales.
Aunque las cepas fúngicas CFung2, CFung4, CFung5 y CFung1 fueron las que
presentaron la mayor área de halo de solubilización; durante los repiques, las tres primeras
redujeron gradualmente el área del halo de solubilización, llegando incluso a dejar de ser
visible; mientras que la CFung1 siempre presentó la misma área de halo de solubilización y se
mantuvo así durante todo el ensayo, por tanto, la cepa fúngica más promisoria de acuerdo al
área del halo de solubilización fue la CFung1 que corresponde a una especie de Penicillium
sp., que presentó además el mayor IS.
Por las razones mencionadas, las bacterias Pseudomonas sp., Bacillus sp., Clostridium
sp. y el hongo Penicillium sp. fueron considerados como microorganismos solubilizadores de
fosfatos promisorios.
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Prueba de solubilización in vitro en medio líquido
Se encontró una alta variabilidad temporal en la concentración de P que las cuatro
cepas mencionadas solubilizaron in vitro. Se determinó además una relación entre la acidez
titulable, pH, y el P solubilizado en medio liquido adicionado con RF y FTC, pero la
intensidad de cada uno de estos varía en función de la cepa y la fuente de P insoluble utilizada.
Diferencias altamente significativas fueron encontradas para los efectos principales
cepas microbianas y enmienda; así como para los efectos de interacción respectivos. En los
diferentes tiempos de medición también se encontraron diferencias altamente significativas, es
decir que el P solubilizado para una misma cepa y enmienda varió notablemente a través de las
evaluaciones realizadas. En el cuadro 3 se puede observar la separación de medias para la
fuente de variación cepa.
Cuadro 3: Promedio total de P solubilizado por cepa
durante el periodo evaluación
P soluble (mg P L-1)
196.77 a
147.89 b
74.55 c
48.93 d
Cepas
Clostridium sp.
Bacillus sp.
Pseudomonas sp.
Penicillium sp.
Se observa que cada cepa forma un grupo estadísticamente distinto en relación a la
cantidad de P solubilizada en medio líquido. Clostridium sp. presenta la mayor capacidad para
solubilizar P con 196.77 mg P L-1, seguida por Bacillus sp., Pseudomonas sp. y Penicillium sp.
respectivamente, siendo esta ultima la que presenta menor solubilización de P con 48.93 mg P
L-1. Es importante mencionar que el cuadro 3 considera el promedio de todos los valores
registrados en las 6 evaluaciones para cada cepa con valores muy bajos en sus inicios y
también con valores muy altos de P liberado en los picos de solubilización.
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Fósforo soluble
La variación temporal de la concentración de P soluble en el medio nutritivo para las
cuatro cepas microbianas, puede apreciarse en la figura 1.
Figura 1: Variación de la concentración de P soluble en medio nutritivo
adicionado con fosfato tricálcico y roca fosfórica
Con Bacillus sp. la mayor concentración de P soluble se alcanzó a los 15 días en las
dos fuentes de P insoluble, sin embargo la concentración de P liberado a partir del fosfato
tricálcico fue de 304 mg P L-1 mientras que de la roca fosfórica se liberaron solamente 99 mg
P L-1. Es importante mencionar que aunque el pico de solubilización para el fosfato tricálcico
ocurrió a los 15 días, la concentración de P soluble disminuyó en las dos evaluaciones
subsecuentes, pero en la última evaluación realizada, se produjo un incremento de la
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concentración de P soluble alcanzando esta vez 280 mg P L-1 de P solubilizado que si bien es
inferior al pico encontrado, no deja de ser un valor importante. Esta variación en la
concentración de P, se explicaría por la incorporación de P soluble al metabolismo de la
bacteria, pero luego de este periodo, se comienza nuevamente a liberar P al medio, es decir la
bacteria empieza nuevamente a solubilizar P. En la roca fosfórica luego del pico de
solubilización encontrado a los 15 días, no ocurre este proceso y el P soluble en el medio
presenta valores similares a los registrados antes del valor más alto, esto debido a que la roca
fosfórica al tener la constante de producto de solubilidad más alta, es más difícil que se
solubilice y por lo tanto la cantidad de P liberado en el medio es escasa.
En el medio inoculado con Clostridium sp. se observa que la concentración de P
solubilizado a partir de la roca fosfórica a lo largo del tiempo es casi similar durante todo el
periodo de evaluación y la máxima concentración liberada a partir de esta fuente de P
insoluble fue 59 mg P L-1. En el medio con fosfato tricálcico se observó que a los 20 días
ocurrió la mayor liberación de P soluble registrándose una concentración de 429 mg P L-1.
Cabe resaltar que las diferencias en las concentraciones P solubilizado a partir de ambas
fuentes de P insoluble son mucho mayores que en las otras cepas y que claramente se observa
que esta cepa es la que solubilizó la mayor cantidad de P a partir del fosfato tricálcico en
comparación con las demás. Además se observó que la concentración de P soluble en el medio
líquido adicionado con fosfato tricálcico varió notablemente durante todo el ensayo, lo cual
coincide con lo encontrado por Illmer y Schinner (1994), incrementándose gradualmente hasta
alcanzar su máximo valor a los 20 días pero luego disminuyó en las dos últimas evaluaciones.
Esta disminución puede deberse a que este microorganismo puede utilizar una parte del P
soluble que se encuentra en el medio líquido e incorporarlo a su metabolismo.
En la solubilización del FTC y la RF realizada por el hongo Penicillium sp. se observa
un patrón similar en la concentración P soluble liberado a partir de estas dos fuentes de P
insoluble en todo el periodo de evaluación. La máxima concentración de P liberado a partir del
fosfato tricálcico fue de 102 mg P L-1 y es el menor valor registrado en esta fuente de P
insoluble; mientras que a partir de la roca fosfórica se liberaron 57 mg P L-1, que igualmente
es el valor más bajo para esta fuente de P. Ambos valores se registraron 25 días. Por lo tanto,
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esta cepa fúngica solubilizó la menor cantidad de P en comparación con las tres cepas
bacterianas en ambas fuentes de P insoluble.
En el medio inoculado con Pseudomonas sp. la mayor concentración de P solubilizado
fue 151 mg P L-1 la cual se alcanzó a los 15 días en el medio adicionado con fosfato tricálcico;
mientras que cuando se utilizó roca fosfórica la mayor concentración de P solubilizado fue 116
mg P L-1 pero esto ocurrió a los 25 días. Para esta cepa bacteriana, las concentraciones de P
liberado al medio a partir del fosfato tricálcico fueron las más bajas en comparación con las
otras dos cepas bacterianas, pero superior a las registradas para la cepa fúngica. En relación a
la roca fosfórica, aunque Pseudomonas sp. alcanzó el pico más alto en solubilización de P
superando a las demás cepas bacterianas y a la fúngica, esta cantidad es baja en comparación
con el P liberado a partir del fosfato tricálcico.
pH
El valor inicial de pH para el medio de cultivo antes de la esterilización fue 6.98 para
el fosfato tricálcico y 7.26 para la roca fosfórica; después de la esterilización el pH para en el
medio con fosfato tricálcico varió ligeramente hasta 6.90, mientras que en el medio con roca
fosfórica el pH se mantuvo exactamente en el mismo valor.
El pH promedio durante todas las evaluaciones en medio adicionado con fosfato
tricálcico fue de 4.22, 4.43, 4.59 y 5.26 para Clostridium sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp. y
Penicillium sp. respectivamente.
El pH promedio en medio con roca fosfórica fue de 4.09, 4.21, 4.24 y 4.61 para
Pseudomonas sp., Bacillus sp., Clostridium sp., y Penicillium sp. respectivamente.
Las diferentes variaciones en el pH son como resultado de la producción de acidez
realizada por las diferentes cepas microbianas y explicada por la producción de ácidos
orgánicos como el glucónico, cítrico, málico, láctico entre otros, la liberación de H+ que se
produce en la asimilación del amonio, o por la producción de H2CO3 que se supone es una
ayuda inicial.
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La variación temporal del pH en el medio nutritivo para las cuatro cepas microbianas,
puede apreciarse en la figura 2.
Figura 2: Variación del pH en medio nutritivo adicionado con fosfato
tricálcico y roca fosfórica
A los 5 días después de la inoculación (ddi) el pH disminuyo drásticamente, el cual
para Pseudomonas sp., Bacillus sp. y Clostridium sp. estuvo en el rango de 4.24 a 4,10 en el
medio con fosfato tricálcico y de 4.08 a 4.17 en el medio con roca fosfórica. Para
Pseudomonas sp. y Bacillus sp. el pH fue ligeramente menor en el medio con roca fosfórica,
pero en Clostridium sp. ocurre lo contrario ya que el pH es ligeramente inferior para el medio
adicionado con fosfato tricálcico. En el medio inoculado con Penicillium sp. el pH fue de 5.36
14
para el fosfato tricálcico y de 5.08 para la roca fosfórica, observándose por lo tanto que el
menor valor de pH fue observado en el medio con roca fosfórica.
Relacionando el pH con el P solubilizado (figura 3) a los 5 ddi en el medio con fosfato
tricálcico, la variación de pH no es alta entre las tres cepas bacterianas, a pesar de esto,
Clostridium sp. tiene la mayor cantidad de P solubilizado con 255 mg P L-1, seguida por
Bacillus sp. con 228 mg P L-1 y Pseudomonas sp. con 57 mg P L-1; mientas que Penicillium
sp. que registró un pH notablemente más alto que las tres cepas mencionadas anteriormente,
solubilizó únicamente 32 mg P L-1; lo cual quiere decir que la cepa fúngica está generando
menor acidez que las otras cepas y esta es considera como uno de los factores responsables de
la solubilización, debido a la relación inversamente proporcional que se ha reportado entre el
pH y la cantidad de P liberado; pero en las tres cepas bacterianas el pH es similar y por lo
tanto no es únicamente el pH el factor que interviene como mecanismo de solubilización.
Figura 3: Relación entre el pH y concentración de P soluble en medio
adicionado con fosfato tricálcico
15
En relación al fosfato tricálcico, es importante hacer énfasis que para Pseudomonas sp.,
Bacillus sp. y Clostridium sp. el valor más bajo de pH se registró a los 5 ddi y aunque se
produjeron variaciones de pH durante las evaluaciones subsiguientes la tendencia siempre fue
a incrementarse ligeramente el pH. En relación a Penicillium sp. se observa claramente que el
pH a los 25 ddi fue más bajo que en la otras evaluaciones y es aquí donde se observó la mayor
cantidad de P solubilizado. Para Clostridium sp. al igual que con Penicillium sp. se observa
que la mayor solubilización ocurrió cuando el pH disminuyó, mientras que para Pseudomonas
sp. y Bacillus sp. cuando se alcanzaron los picos más altos de P solubilizado, no se registraron
necesariamente los valores más bajos de pH, por lo que otro mecanismo tiene que estar
involucrado en la solubilización de P realizada por estas dos cepas bacterianas cuando fosfato
tricálcico fue utilizado como fuente de P insoluble.
En relación al pH y el P solubilizado en el medio con roca fosfórica (figura 4) se
observa que inicialmente, a los 5 ddi, Bacillus sp y Clostridium sp. solubilizaron la mayor
cantidad de P con 56 y 53 mg P L-1 respectivamente, seguidas por Pseudomonas sp. con 28
mg P L-1 y Penicillium sp. que solubilizó únicamente 9 mg P L-1. Bacillus sp. que es la que
más solubiliza tiene el menor valor de pH con 4.08 y Penicillium sp. que es la que solubiliza la
menor cantidad de P tiene el pH más alto con 5.08. Clostridium sp. presentó valores de pH y P
similares a Bacillus sp., pero Pseudomonas sp. aunque también logró disminuir el pH
signicativamente hasta 4.14, la cantidad de P liberado fue mucho menor con 28 mg P L-1.
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Figura 4: Relación entre la concentración de P soluble y el pH en medio con
roca fosfórica
En Bacillus sp. no se observa una relación entre la máxima cantidad de P solubilizado
y el pH. En el medio inoculado con Clostridium sp. el P soluble liberado al medio se mantiene
prácticamente constante al igual que el pH durante todo el ensayo y se constituye en la cepa
con el pico más bajo de solubilización. En Penicillium sp. se observa claramente que la mayor
cantidad de P solubilizado ocurrió cuando el pH presentó el valor más bajo, por lo tanto en el
medio adicionado con roca fosfórica el pH es el mecanismo que mayor influencia tiene sobre
la solubilización, sin embargo en comparación con las cepas bacterianas no logró disminuir el
gran medida el pH y por lo tanto el P liberado es menor.
En el medio inoculado con Pseudomonas sp. se observa que la mayor cantidad de P
liberado a partir de la roca fosfórica fue determinado cuando el pH del medio estuvo en 3.72
que está entre los dos valores más bajos registrados durante todo el ensayo. Además se aprecia
17
claramente en las cepas bacterianas que la disminución en la concentración de P en las ultimas
evaluaciones se debe principalmente a que el pH se incrementó, mientras que con Penicillium
sp. en las tres últimas evaluaciones ocurrió lo contrario, es decir se produjo la disminución
más notable del pH y la concentración de P se incrementó. De las cuatro cepas microbianas,
Pseudomonas sp. y Penicillium sp. presentaron una evidente relación inversamente
proporcional entre el P solubilizado y el pH en el pico de solubilización. En Bacillus sp. y
Clostridium sp. la máxima disminución de pH no coincide con el valor más alto de P liberado,
pero en comparación con el pH inicial del medio, la disminución del pH si sería la responsable
de la solubilización.
Acidez titulable
Con Bacillus sp., Clostridium sp. y Penicillium sp. se observa claramente que la mayor
cantidad de acidez titulable se produce en el medio adicionado con fosfato tricálcico aunque
con algunas particularidades. Bacillus sp. produjo acidez titulable en forma irregular con dos
picos pero siempre en mayor cantidad que cuando se utilizó roca fosfórica; Clostridium sp.
incrementó gradualmente la acidez titulable (a excepción de penúltima evaluación) y presenta
los valores más altos registrados para esta medida; y Penicillium sp. fue quien produjo la
menor cantidad de acidez titulable en comparación con todas las cepas, pero igualmente en
cantidades superiores al medio con roca fosfórica. En Pseudomonas sp. la mayor cantidad de
acidez titulable se produjo en el medio adicionado con roca fosfórica y su valor más alto se
registró entre los 20 y 25 ddi, mientras que con fosfato tricálcico la AT muestra una ligera
disminución lineal desde la segunda evaluación. La variación temporal de la AT en el medio
nutritivo para las cuatro cepas microbianas, puede apreciarse en la figura 5.
18
Figura 5: Variación de la acidez titulable en medio adicionado con
fosfato tricálcico y roca fosfórica
Relacionando la acidez titulable y el P solubilizado en el medio adicionado con fosfato
tricálcico (figura 6), se observa una relación directamente proporcional y muy evidente entre
la cantidad de P solubilizado y la AT, es decir que para todas las cepas, a mayor cantidad de
acidez titulable se observa mayor concentración de P solubilizado. Se puede apreciar que la
línea de variación del P soluble en todo el periodo de evaluación tiene el mismo
comportamiento que la línea de variación de la acidez titulable. Por lo tanto la variable que
mayor incidencia tiene sobre la solubilización, o que explicaría de mejor forma la
solubilización del fosfato tricálcico es la acidez titulable y en menor medida el pH. La menor
cantidad de acidez titulable fue determinada en Penicillium sp. y Pseudomonas sp. y estos dos
cepas se registra también la menor cantidad de P soluble. La mayor cantidad de acidez
19
titulable se registró en Clostridium sp. y es en esta cepa donde se encontró la mayor cantidad
de P soluble en comparación con las demás cepas, luego le sigue Bacillus sp. que produjo una
cantidad menor de acidez titulable y fue la cepa que ocupo el segundo lugar en solubilización
de P a partir del fosfato tricálcico.
Figura 6: Relación entre la concentración de P soluble y la acidez titulable en
medio adicionado con fosfato tricálcico.
En relación a la acidez titulable y el P solubilizado en el medio con roca fosfórica, se
observa, al igual que en el caso del fosfato tricálcico, una relación directamente proporcional
entre la cantidad de P solubilizado y la acidez titulable. El pico más alto de producción de
acidez titulable en medio con roca fosfórica lo produjo Pseudomonas sp. y es aquí donde
también se registró la mayor cantidad de P solubilizado, lo cual ocurrió entre los 20 a 25 ddi,
la que le sigue es Clostridium sp. que si bien no alcanzó un pico tan alto de acidez titulable,
esta se mantuvo prácticamente sin mayor variación durante todas las evaluaciones pero con
20
promedio más alto que el determinado para Pseudomonas sp. en todo el periodo de
evaluaciones y como resultado la concentración de P soluble también se mantuvo sin
variaciones importantes. Le sigue Bacillus sp. y finalmente Penicillium sp. con la menor
producción de acidez titulable y por lo tanto la menor cantidad de P solubilizado. Por lo tanto,
también para la roca fosfórica la variable que mayor incidencia tiene sobre la solubilización es
la acidez titulable y no únicamente el pH (figura 7).
Figura 7: Relación entre la concentración de P soluble y la acidez
titulable en medio adicionado con roca fosfórica.
A los 20 ddi se registró el valor más alto de solubilización en Clostridium sp. en medio
de cultivo con FTC, seguida por Bacillus sp., Penicillium sp. y Pseudomonas sp. Además
Clostridium sp. fue la cepa que mayor cantidad de P solubilizó en todas las evaluaciones
realizadas a partir del FTC. En la RF se observó poca variabilidad entre el P que puede
solubilizar cada cepa. Las cuatro cepas microbianas evaluadas son más efectivas en la
solubilización del fosfato tricálcico en comparación con la roca fosfórica (figura 8).
21
Figura 8: Solubilización de fosfato tricálcico y roca fosfórica
a los 20 días después de la inoculación
En el cuadro 4 se resume los valores más altos de solubilización alcanzados por cada
cepa, la disminución del pH y la acidez titulable producida en la evaluación respectiva.
Cuadro 4: Solubilización de fosfato tricálcico y roca fosfórica en medio líquido por
las cepas microbianas
Cepa
Clostridium sp.
Bacillus sp.
Pseudomonas sp.
Penicillium sp.
Fuente de fósforo
Fosfato tricálcico
Roca fosfórica
pH
Acidez
P
pH final Acidez
final
titulable mg L-1
titulable
meq L-1
meq L-1
4.11
31.69
429.11
4.32
11.76
4.38
28.42
304.42
4.18
12.41
4.47
11.43
151.40
3.72
13.72
4.87
12.09
101.91
4.01
9.47
22
P
mg L-1
58.90
99.34
115.73
56.94
IV.
CONCLUSIONES
• Fueron aisladas 13 cepas de bacterias y 7 de hongos con capacidad para solubilizar
fosfatos. De acuerdo al índice y el área del halo de solubilización se consideró como
las cepas promisorias la CBact1, CBact2 y CBact3 y la CFung1.
• La cepa bacteriana CBact1 corresponde a Pseudomonas sp. (fluorescente), la CBact2 a
Bacillus sp. y la CBact3 a Clostridium sp. La CFung1 corresponde a una especie de
Penicillium sp.
• Clostridium sp. fue la cepa con mayor eficiencia de solubilización in vitro, mientras
que Penicillium sp. resultó en los valores más bajos a partir del fosfato tricálcico.
• La solubilización de fósforo a partir de la roca fosfórica fue notablemente menor en
comparación con el fosfato tricálcico.
23
V.
1.
BIBLIOGRAFÍA
Aguirre, G. 1993. Evaluación de fuentes de fósforo en el rendimiento del cultivo de papa,
con énfasis en roca fosfatada y fuentes orgánicas. Anales Científicos Universidad Nacional
Agraria La Molina (en línea). Perú. Consultado 27 abr. 2012. Disponible en
http://tumi.lamolina.edu.pe/resumen/anales/1999_92.pdf
2.
Alegre, J; Chumbimune, R. 1991. Investigaciones y usos de la roca fosfórica en el Perú. II
Reunión de la Red Latinoamericana de Roca Fosfórica. Táchira, Venezuela. 13 al 16 de
marzo.
3.
Cerezine, P; Nahas, E; Banzatto, D. 1988. Soluble phosphate accumulation by Aspergillus
niger from fluoroapatite. Applied Microbiology and Biotechnology 29: 501-505.
4.
Chen, Y; Rekha, P; Arun, A; Shen, F; Lai, W; Young, C. 2006. Phosphate solubilizing
bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities. Applied
Soil Ecology 34:33–41.
5.
Cordell, D; Drangert, J; White, S. 2009. The story of phosphorus: global food security and
food for thought. Global Environmental Change 19:292–305.
6.
FAO. 2005. Tendencias mundiales actuales y perspectivas de los fertilizantes (en línea).
Italia. Consultado 26 abr. 2012. Disponible en ftp://ftp.fao.org/agl/agll/docs/-cwfto08s.pdf
7.
Foth, H; Ellis, B. 1997. Soil Fertility. 2 ed. Boca Raton, Florida. CRC Press. 290 p.
8.
French, E; Hebert, T. 1980. Métodos de investigación fitopatológica. San José, Costa
Rica. IICA. 289 p.
9.
Illmer, P; Schinner, F. 1994. Solubilization of inorganic calcium phosphates,
solubilization mechanisms. Soil Biology and Biochemistry 27(3):257-263.
10. Kirkby, E; Johnston, A. 2008. Soil and fertilizer phosphorus in relation to crop nutrition.
In Hammond, JP; White, PJ. eds. The ecophysiology of plant–phosphorus interactions.
Dordrecht, Holanda, Springer. p. 177–223.
24
11. Kumar, V; Narula, N. 1999. Solubilization of inorganic phosphates and growth emergente
of wheat as affected by Azotobacter chroococum mutans. Biol. Fertil. Soils 28:301-305.
12. Olsen, SR; Cole, CV; Watanabe, FS; Dean, LA. 1954. Estimation of available phosphorus
in soils by extraction with sodium bicarbonate. USDA Circ. 939. U.S. Govt. Print. Office,
Washington, DC.
13. Sample, E; Soper, R; Racz, G. 1980. Reactions of phosphate fertilizers in soils. In
Khasawneh, FE; Sample, EC; Kamprath, EJ. eds. The role of phosphorus in agriculture. USA,
American Society of Agronomy. p. 263–310.
14. Sims, J; Pierzynski, G. 2005. Chemistry of phosphorus in soil. In Tabatabai, AM; Sparks,
DL. eds. Chemical processes in soil, SSSA book series 8. SSSA, Madison, USA. p. 151–192.
15. Soil Survey Staff. 2010. Keys to Soil Taxonomy. 11 ed. USDA-Natural Resources
Conservation Service, Washington, DC. 365 p.
16. Vaccari, D. 2009. La crisis del fósforo. Investigación y Ciencia, edición española de
Scientific American. España 395:22-27.
17. Walker, T; Syers, J. 1976. The fate of phosphorus during pedogenesis. Geoderma 15:1–19.
18. Watanabe, F; Olsen, S. 1965. Test of an ascorbic acid method for determining
phosphorous in water and NaHCO3 extracts from soil. Soil Sci. Soc. Am. Proc. 29:677–678.
25