Inserto Antígeno Prostático Específico Total (CLIA)

Distribuidora de Reactivos y Agentes de Diagnóstico para Laboratorio
Blvd. J. Alonso de Torres 312 PTE. Col. San Jerónimo León Gto.
(477) 718-5948 [email protected]
Inserto Antígeno Prostático Específico Total (CLIA)
MONOBIND, INC.
ANTIGENO PROSTÁTICO ESPECIFICO (tPSA)
Código de Producto: 2175-300
Intención de uso:
La determinación cuantitativa de la concentración de antígeno prostático específico
total (tPSA) por un inmunoanálisis con un microplato de quimioluminiscencia en
suero humano.
Simultáneamente, el complejo es depositado en el pozo a través de la alta afinidad
con la reacción del streptavidin y el anticuerpo biotinilado.
Esta interacción es ilustrada como sigue:
RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA
El antígeno prostático específico (PSA) es un protease del suero con actividad
parecida al cimotripsin (1.2). La proteína es una glicoproteína de cadena individual
con un peso molecular de 28.4kDA (3). El PSA deriva su nombre de la observación
que es un antígeno normal de la próstata pero no se encuentra en ningún otro
tejido fino normal o maligno. El PSA se encuentra como cáncer de próstata
benigno, malo y metastático. Puesto que el cáncer de la próstata es la segunda
forma más frecuente de enfermedad masculina, la detección de los niveles
elevados de PSA desempeña un papel importante en el diagnostico temprano. Los
niveles del suero de PSA se han encontrado demasiado más útiles que la fosfatasa
ácida prostática (PAP) en el diagnostico y en el manejo de los pacientes debido a
la sensibilidad creciente (4).
En este método, el calibrador de PSA, el espécimen paciente o el control primero
se agrega a un pozo cubierto de streptavidin biotinilado monoclonal y los
anticuerpos etiquetados enzima (dirigidos contra epítomes distintos y diversos de
PSA) se agregan y se mezclan los reactivos. La reacción entre los anticuerpos
varios de PSA y el PSA nativo forma un complejo de sándwich que ata con el
streptavidin cubierto al pozo.
Después de la terminación del período requerido de incubación, el anticuerpo de la
enzima-PSA atada a la conjugación es separada de la conjugación desatada de la
enzima-PSA por la aspiración o la decantación. La actividad de la enzima presente
en la superficie del pozo es cuantificada por la reacción con un sustrato
conveniente para producir luz (luminiscencia). El empleo de niveles de varias
referencias de suero conocidos del antígeno prostático específico (PSA) permite la
construcción de una curva a la reacción de cierta dosis de la actividad y de la
concentración. De la comparación de la curva a la reacción a cierta dosis, la
actividad de un espécimen desconocido se puede correlacionar con la
concentración de PSA.
PRINCIPIO
ANÁLISIS INMUNOENZIMOMÉTRICO:
Los reactivos esenciales requeridos para un análisis inmunoenzimométrico
incluyen una alta afinidad y especificidad de anticuerpos (enzima e inmovilizado),
con reconocimiento diverso y distinto del epitome, en exceso, y el antígeno nativo.
En este procedimiento, la inmovilización ocurre durante el análisis en la superficie
de una microplaca bien con la interacción de la cubierta de streptavidin en el pozo
y exógeno agregado biotinilado del anticuerpo monoclonal del antígeno de PSA.
Mezclando el anticuerpo monoclonal biotinilado, el anticuerpo enzima-etiquetado y
un suero que contenían el antígeno nativo, resultados de la reacción entre el
antígeno nativo y los anticuerpos, sin la competición o el obstáculo esteárico, para
formar un sándwich complejo soluble. La interacción es ilustrada por la ecuación
siguiente:
Después de que el equilibrio se obtiene, la fracción del anticuerpo- atado es
separado del antígeno desatado por la decantación o la aspiración. La actividad
enzimática determinada por la reacción con un sustrato que genera luz, el
anticuerpo-limita la fracción es directamente proporcional a la concentración del
antígeno nativo. Utilizando varias diversas referencias del suero de los valores
sabidos del antígeno, una curva de la reacción a cierta dosis puede ser generada
de la cual la concentración del antígeno de un desconocido puede ser comprobada.
REACTIVOS
MATERIAL PROVEEIDO
A. Antígeno Prostático Específico (PSA) 1ml/frasco - Iconos A-F Seis (6)
frascos de antígeno de referencia de PSA en los niveles de 0(A), 5(B), 10(C),
25(D), 50(E) y 100(F) ng/ml.
Almacén a 2-8ºC. Se ha agregado un preservativo.
El material es calibrado contra el WHO (Instituto Nacional para Estándares y
controles Biológicos) IS#96/670.
B. Reactivo Trazador de PSA – 13 ml/frasco - icono
Un (1) frasco que contiene la enzima del anticuerpo etiquetada, Biotinilado
monoclonal de ratón IgG en solución, tinte, y preservativo. Almacén en 2-8º
C. 96 Pozos de Reacción de Luz ?
Un Micro plato blanco cubierto con streptavidin y empaquetado en una bolsa de
aluminio con un elemento deshidratador. Almacén en 2-8ºC.
D Solución Concentrada de Lavado -20 ml - icono
Un (1) frasco que contiene un surfactante en solución salina. Se ha agregado un
preservativo. Almacén en 2-30ºC.
A
E. Reactivo de Señal A -- 7ml/frasco - Icono S
Un (1) bote que contiene luminol en solución. Almacén en 2-8ºC. (Ver la Sección
de preparación de Reactivos).
B
F. Reactivo de Señal B -- 7ml/frasco - Icono S
Un (1) frasco que contiene el peróxido de hidrógeno (H²O²) en solución. Almacén
en 2-8ºC. (Ver Sección de Preparación de Reactivos).
G. Inserto de Producto.
Nota 1. No use los reactivos más allá de la fecha de caducidad.
Nota 2. Los reactivos abiertos son estables por 60 días cuando se guardan a 28°C.
Nota 3. Los reactivos son para un solo micro plato de 96 pozos.
MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO:
1.
Pipetas capaces de entregar volúmenes de 25µl y 100µl con una precisión
mejor que 1.5%.
2.
Dispensadores para las entregas repetidas de los volúmenes 0.100ml y 0.350
ml con una precisión de mejor de 1.5% (opcional).
3.
Lavador de Micro placas o una botella de apretón (opcional).
4.
Luminómetro de micro platos.
5.
Contenedor(es) para mezclar los reactivos (ver abajo).
6.
Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la microplaca.
7.
Plástico envolvente o tapa para la micro placa para los pasos de la
incubación
8.
Aspirador de vacío (opcional) para los pasos de lavado.
9.
Contador de tiempo.
10. Contenedor de almacén para guardar la solución de lavado.
11. Agua destilada o desionizada.
PRECAUCIONES
RESULTADOS
Para el uso de diagnóstico in Vitro no para el uso interno o externo en seres
humanos o animales
Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser
no-reactivos para el antígeno superficial de la hepatitis B, los anticuerpos del VIH
1&2 y de HCV por los reactivos con licencia del FDA. Puesto que ninguna prueba
sabida puede ofrecer la seguridad de que los agentes infecciosos están ausentes,
todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como potencialmente
peligroso y capaces de transmitir enfermedad. Los buenos procedimientos del
laboratorio para manejar productos de la sangre se pueden encontrar en el centro
para el control de enfermedad/el instituto nacional de la salud, "Bioseguridad en
laboratorios microbiológicos y biomédicos," 2da Edición, 1988, publicación No.
(CDC) 88-8395 de HHS.
Una curva de la reacción a cierta dosis se utiliza para comprobar la concentración
de tPSA en especimenes desconocidos.
1. Registre los RLU’s (Unidades de Luz Relativa) obtenidas desde la impresora del
lector de micro plato como se presenta en el Ejemplo 1.
2. Trace los RLU’s para cada referencia duplicada del suero contra la
concentración correspondiente de tPSA en ng/ml en el papel de gráfico linear (no
haga un promedio de los duplicados de las referencias del suero antes de trazar).
3. Dibuje la mejor curva correspondiente a través de los puntos trazados.
4. Para determinar la concentración de PSA para un desconocido, localizar el
promedio de RLU’s de los duplicados para cada uno desconocido en el eje vertical
del gráfico, encontrar el punto que se interseca en la curva, y leer la concentración
(en ng/ml) del eje horizontal del gráfico (los duplicados del desconocido se pueden
hacer un promedio según lo indicado). En el ejemplo siguiente, el promedio de
RLU’s (17210) del desconocido interseca la curva de calibración a (12.3ng/ml) la
concentración de tPSA (véase el cuadro 1)*.
Nota 1: El software de la reducción de datos de la computadora diseñado para los
análisis de CLIA se puede también utilizar para la reducción de datos. Los
duplicados de los desconocidos pueden ser promediados como se indica. (Ver
figura 1).
RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION
Los especimenes serán la sangre, suero en tipo y las precauciones generalmente
en la colección de muestras del veni-puntura deben ser observados. La sangre se
debe recoger en un tubo llano del venipuntura del tapón rojo sin los añadidos o los
anticoagulantes. Permita que la sangre coagule. Centrifugue el espécimen para
separar el suero de las células. Las muestras se pueden refrigerar en 2-8°C. por un
período máximo de cinco (5) días. Si el espécimen no se puede probar dentro de
este tiempo, la muestra se puede almacenar en las temperaturas de -20°C. por
hasta 30 días. Evite congelar y deshelar. Cuando está probado en duplicado,
0.050ml del espécimen se requiere.
EJEMPLO 1
PREPARACION DE LOS REACTIVOS.
1.
SOLUCIÓN DE LAVADO.
Diluya los contenidos del concentrado a 1000ml con agua destilada o
desionizada en un envase de almacenaje conveniente. Almacén en la
temperatura ambiente 20-27°C. por hasta 60 días.
2.
REACTIVO SOLUCION SEÑAL DE TRABAJO.
– Guárdese a 2 – 8°C. Determine la cantidad de reactivo necesitada y prepárese
mezclando porciones iguales del reactivo de señal A y del reactivo de señal B en
un envase limpio. Por ejemplo, agregue 1ml de A y 1ml de B por dos (2) ocho tiras
de micropozos (Se produce un exceso leve de la solución). Deseche la porción sin
usar si no es usada dentro de las próximas 36 horas antes de mezclar. Si la
completa utilización de los reactivos es anticipada, dentro del tiempo, vaciar los
contenidos del reactivo de señal B en el reactivo de señal A y etiquete
adecuadamente.
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA.
Antes de proceder con el análisis, traiga todos los reactivos, referencias del suero y
controles a la temperatura ambiente (20 - 27°C.).1. Separe los pozos de los
microplatos para cada referencia de suero, control y espécimen del paciente para
ser ensayado por duplicado. Guarde nuevamente dentro de la bolsa de aluminio las
tiras de micropozos que no use, selle la bolsa y consérvese a 2-8°C.
2. Pipetear 0.025ml (25µl) de las referencias de suero apropiadas, control o
espécimen en el pozo asignado.
3. Añada 0.100 ml (100µl) de Reactivo Traza líneas de PSA en cada pozo. Es muy
importante dispensar todos los reactivos cerca del fondo del pozo cubierto.
4. Mezcle los microplatos gentilmente por 20-30 segundos y cubra.
5. Incube por 30 minutos a temperatura ambiente.
6. Deseche los contenidos del micro plato por decantación o aspiración. Si decanta,
tape y de un golpecito al plato seco con papel absorbente.
7. Añada 350µl de solución de lavado (ver Sección de Preparación de los
reactivos), decante (tape y de un golpecito) o aspire. Repita cuatro (4) veces para
un total de cinco (5) lavados. Un lavador automático o manual de platos puede
ser usado. Siguiendo las instrucción del fabricante para su uso apropiado. Si
emplea una botella de apretón, llene cada pozo por depresión del contenedor
(deseche las burbujas de aire) para dispensar el lavado. Decante el lavador y
repita cuatro (4) veces adicionales.
8. Añada 0.100 ml (100µl) de la solución del reactivo de señal de trabajo a todos
los pozos (ver Sección de preparación de Reactivos). Siempre añada reactivos
en el mismo orden para minimizar el tiempo de reacción entre los pozos.
9. incube a temperatura ambiente por cinco (5) minutos en la oscuridad.
10. Lea las unidades de luz relativa en cada pozos, para 0.2 – 1.0 segundos/pozos,
usando un luminómetro de micro platos. Los resultados pueden ser leídos
dentro de los treinta (30) minutos de añadida la solución de sustrato.
Los datos presentados en el ejemplo 1 y el cuadro 1 son ilustrativos solamente y
no se deben utilizar en lugar de una curva de la reacción a cierta preparación de
cada ensayo. En adición, los RLU’s de los calibradores han sido normalizados a
100,000 RLU’s para el calibrador F (la mayor salida de luz). Esta conversión
minimiza las diferencias causadas por la eficiencia de varios instrumentos que
pueden ser usados para medir la salida de luz.
CONTROL DE CALIDAD.
Cada laboratorio debe probar controles en niveles bajo, mediano y alto rango para
monitorear el funcionamiento de la prueba. Estos controles se deben tratar como
desconocidos y valores determinados en cada método de prueba realizado. Las
cartas del control de calidad se deben mantener para seguir el funcionamiento de
los reactivos provistos. Los métodos estadísticos pertinentes se deben emplear
para comprobar tendencias. El laboratorio individual debe determinar los límites
aceptables para el funcionamiento de la prueba. La desviación significativa del
funcionamiento establecido puede indicar el cambio inadvertido en condiciones o la
degradación experimentales de los reactivo del kit. Los reactivos frescos se deben
utilizar para determinar la razón de las variaciones.
PARAMETROS DEL CONTROL DE CALIDAD
En orden para que los resultados del análisis sean considerados válidos los
siguientes criterios deben ser resueltos: 1. La Curva de Respuesta la dosis debe
estar dentro de los parámetros establecidos. 2. Cuatro fuera de 6 pools de control
de calidad deben estar dentro de los rangos establecidos.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
A. FUNCIONAMIENTO DEL ANÁLISIS.
1. Es importante que el tiempo de reacción en cada pozo sea llevada a cabo
constante para resultados reproductivos.
2. El medir con una pipeta de muestras no debe extender más allá de diez (10)
minutos para evitar la deriva del análisis.
3. Si se utiliza más de una (1) placa, se recomienda para repetir la curva de la
reacción a cierta dosis.
4. La falla de remover la solución adherida adecuadamente en los pasos de lavado
por aspiración o decantación puede resultar en replicación pobre y resultados
falsos.
5. Use los componentes del mismo lote. No mezcle los reactivos de diferentes
lotes.
6. Se recomiendan pipetas multicanales para la adición de los reactivos.
7. Muestras que se contaminan microbiológico, no se deben utilizar en el análisis.
La lipemia alta de especimenes hemolizados no debe ser utilizada.
B. INTERPRETACIÓN
1. Si la reducción de datos controlados de la computadora se utiliza para interpretar
los resultados de la prueba, es imperativo que los valores predichos para los
calibradores bajen dentro del 10% de las concentraciones asignadas.
2. El PSA se eleva en la hipertrofia prostática benigna (BPH). Clínicamente un solo
valor elevado de PSA no es valor de diagnóstico como prueba específica para
el cáncer y se debe utilizar solamente conjuntamente con otras manifestaciones
clínicas (observaciones) y procedimientos de diagnóstico (biopsia de la próstata) y
DRE (Examinación Digital Rectal). Las determinaciones libres de PSA pueden ser
provechosas en vista de los diferentes diagnósticos de BPH y condiciones
prostáticas de cáncer (5).
3. Debido a las variaciones en la calibración usada en las pruebas de PSA/fPSA y
las diferencias en reconocimiento del epítome de diferentes anticuerpos se
recomienda que siempre que las muestras del paciente deben ser analizadas con
pruebas de PSA/fPSA hechas por el mismo fabricante.
RANGOS ESPERADOS Y VALORES
Se espera que los varones sanos tengan valores debajo de 4 ng/ml. (4).
TABLA 1
Valores Esperados para la prueba CLIA de PSA
Varones Sanos
<4ng/ml
Es muy importante tener en consideración que los rangos establecidos de los
valores que se esperan pueden ser encontrados por un método dado por la
población “normal” de personas es dependiente de múltiples factores: la
especificidad del método, la población analizada y la precisión del método en las
manos de los analistas. Por estas razones cada laboratorio debe determinarse por
los analistas usando el método con una población indígena del área en que cada
laboratorio esta localizada.
CARACTERISTICAS DE ACTUACION
La precisión en y entre el análisis del procedimiento de PSA CLIA fue determinada
por análisis en tres diversos niveles de control de suero. El número, el valor medio,
la desviación de estándar y el coeficiente de variación para cada uno de estos
controles de suero se presentan en la tabla 3 y la tabla 4.
B. Sensibilidad
La sensibilidad del procedimiento de PSA por CLIA está definida como el valor
singular mas pequeño que puede ser distinguido a 2 S.D. del significado de 10
replicas de calibrador “0”. Este método tiene una sensibilidad de 0.25 ng/ml.
C. Exactitud
El procedimiento del método de PSA CLIA fue comparado con una referencia del
ELISA. Fueron analizados los especimenes biológicos de bajo, normal y
concentraciones elevadas. El número total fue de 180. La ecuación de regresión
del último cuadro y el coeficiente de correlación fue computada por el PSA CIA en
comparación con el método de referencia. La información obtenida esta expuesta
en la tabla 4.
TABLA 4
Ultimo recuadro
Regresión
Correlación
Método
Resultado
Análisis
Coeficiente
Este Método (X) 5.62
y =-0.0598+0.98(X)
0.987
Referencia (Y)
5.57
REFERENCIAS
1. Christensson A, Laurell CB, Lilja H., Eur J Biochem , 194, 755-A. 63 (1990).
2. Watt KW, et. al., Proc Nat Acad Sci USA, 83, 3166-70 (1986).
3. Chen Z, Prestiglacomo A, Stamey T., Clin Chem,, 41, 1273-82 (1995).
4. Wild D, The Immunoassay Handbook., Stockton Press (1994) p452.
5. Junker R, Brandt B, Zechel C, Assmann G, Clin Chem, 43, 1588- 94 (1997).
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8. Chen Z, Prestigiacomo A, Stamey T, ‘Purification and characterization of
Prostate Specific Antigen (PSA) Complexed to a1- Anticymotrypsin:Potential
reference Material for International Standardization of PSA Immunoassays.’ Clin
Chem. 1995;41/9:1273-1282.
9. Horton GL, Bahnson RR, Datt M, Cfhan KM, Catalona WJ and Landenson
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form of prostate specific antigen in serum of patients with prostate cancer:assay of
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