CONCERTOS GENERATES SOBRE EL LISOZIMA Entre los

EL LISOZIMA EN EL TRACTO DIGESTIVO DEL RECIEN NACIDO
Y LACTANTE
Prof. H, VACCARO, Dres. J. CABEZAS y D. COPAJA
Catedra de Ba-cteriologia e Inmunologia de U Univ^rsidad de Chile.
CONCERTOS GENERATES SOBRE EL LISOZIMA
Entre los factores inespecificos 'de defensa mas amplia. mente distribuidos, merece consideracion especial el principio
mhibidor y litico que fue descrito por primera vez por Alexander Fleming.
Este autor, partiendo de las investigaciones de Laschtschenko ( 1 9 0 9 ) y de Rettger y Sperry (19-12), logro, continuandolas, verificaciones reveladoras, las que publico, en
1922, en un trabajo acerca del poder bactericida de la clara
de huevo. (24)
Un anc mas tarde amplia sus estudios en colaboracion
con Allison (25), llegando Ic^s dos autores a identificar un
principio bactericida de naturaleza- enzimatica, al cual denominnn "Lisozima", Demostraron que dicbo principio inhibidor y litico se hallaba presence en la casi tctalidad de los
humores y tejidos del organismo humano y animal. Del mis-"
mo mode comprobaron su ,presencia en algunos tejidos vegetales.
Este principio producia la inhibicion o la lisis de nurrrerosas especies bacterianas, saprofitas y patogehas.
El Lisozima contenidc en la clara de huevo, fue el que
sirvio a F'eming y Allison para estudiar su poder bactericida. Una dilucion de clara de huevo al 1 (/'( , mezc'iada, en
partes iguales, con una emulsion microbiana concentrada de
Mk'rococcu? lyfodeikticus, y colocada a una temperatura cercana a los 50 grades, prcdujo la lisis total de la emulsion bacterica antes de medio minuto, como se demostro ntediante los
598
RHVISTA CHILENA DE PEMATRIA
examenes directos y los cultivos .practicados, quc fueren, persistentemente negatives. La adkipn de uaa gota de clara dc
huevo a un cultiyo de 24 horis de #quella misma especie
tiacterdana, sembrada en placa de Petri, produjo el aclara'miento complete del medio en 1 minuto a la temperatura de
37 grades.
El Micrccoccus lysodeikticus demostro ser tan altamente
sensible, que diluciones de clara de huevo del 1 por cincuenta
millcnes. produjeron su lisis total despues de 24 horas a la
temperatura de 37 grades.
Estos investigadores demostraron la presenda de este
principle litico, en la casi totalidad de las secreciones y excreciones del organismo humane, come ser: lagrimas, mucus
nasal, saliva, liquidq pleura'l, liquido ascitico y de hidrocele,
semen, suero sanguineo, secreckmes viaginales, lequios, etc.
Asi mismc, lo contenian algunes productos patologices: pus,
orina albuminurica o purulenta,'liquidos de quistes, etc.
Tambien los tejidos humanos demostraron contenerlo y
entre estos se distinguieron per un alto contenido lisozimico,
la fibrina y una muestra de cartilage articular de la rotu]_a.
El tejido cerebral lo contenia en proporciones inferiores
a las meningeas.
Los huevojs de distintas especies de peces y sobre todo
les huevos de spile, contendrian en alfa proportion el principle litico de Fleming.
Fleming y Allison hicieron un estudio comparative del
Lisozima contenido en la clara de huevo de distintas especies
de aves: gallinas, patas, tordos y nevatillas y compruebau
que la clara de huevo de gallina es la que comtiene la mas alta
concentracion lisozimica, siguiendo en impcrtancia, la clar:
de huevo de pata.
Norman J. Miller y Francis Me Donald (26) en 1933,
investigan el Lisozima en las leches de: mujer, mona, perra,
gata, ratona y Hama, 'coniprobando su presencia en todas
cllas y encontrando una concentracion casi identica.
La leche de vaca, segiin J. y M. Bordet (27), careceria
de este principle; Blatt y Kessler, en 1937, llegan a la misma
conclusion.
Prickett y colaboradores, en 1933, demuestran, por el
contrario, que la leche de vaca contiene Lisozima.
Nuestres trabajos concordantes con lo verificado per Rosenthal y Lieberman (28) en 1931, nos han demostrado pprsistentemente It ausencia de Lisozima en la leche de vaca.
BL LISGZIMA EN EL TRACTO DIGESTIVO
599
Las leches de: coneja, ca-bra, oveja, cuyes, contendrian
muy escasa cantidad dc este principle, llegando en determinadas ocasicnes a carecer totalmente de el.
No centendrian Lisozirna, segiin Fleming y AQlison, el
liquido cefalo raquideo, el sudor, la orina y deposicipnes
normales.
Segun Goevaerts, el liquido amniotico carece de Lisozima.
Bordet, en 1928, demostro que el sudor humano es capaz de producir 'la lisis de las bacterias senstbles al Lisoiima.
Nuestros trabajos en curso, coinciden con la opinion
de Bordet. La sarcina test, especie micrcbiana altamente sensible al Lisozima, que nosotros hemos empleado en todos
nuestros trabajos acerca del contenido lisozimico en Ics cliscintos humores y secreciones, ha sido lizada con facilidad por'
el sudor humano. Algun.as especies patogenas, tales come:
Escherichia coli, Staphylococcus, Streptococcus viridans y
haemolyticus han sido, en mayor o menor- grado, inhibidas
en su desarrollo.
Wolff (29), en 1927; Meyer y colaboradores (30) , en
1936; Roberts (61), en 1937,- y Abraham (32), en 1932,
son Ics investigadores que en forma mas completa se han preacupado del problema de la naturaleza quimica del Lisozima.
Abraham obtuvo este principio a partir de la clara de
huevo, en forma de un polvo bianco desecado en acetona y
eter, con una actividad de alrededor de dos mil unidades por
miligramo y un pesp molecular de aproxirnadamente 18,000,
que cont^nia N 16,4 %, S 3,2 %, calculado sobre una base
de cenizas 'libres. (^btuvo un producto amorfo, y otfo cristalizado, con semejante grado de actividad.
El anaflasis cuantitativo verificado de la substancia amorfa, demostro qufe esta contenia los siguientes amino-acidos;
Arginina 11,6 %,. Cistiina 7 •%, Lisina 5/8 %t Tirosina
4,4 % e Histidina 2,6 %.
El Lisozima obtenido y purificado por Meyer y cobboradores, en 1936, que se cqfnsidera como una de las pre/
paraciones de mas alta pureza, es un cuerpo de naturakza
basica , soluble en medio acuoso, acidificado e insoluble en los
disolventes organicos puros en las medios alca'linos.
600
REVISTA CHILENA DE PEDIATRIA
Su analisis centesimal, demostro lo siguiente:
C: 49,65 %-, N: 15,33
'% ; H: 6,44 %4 P: 0'.25' % ;
S: 0,64 % ; Cenizas: 3,3 f /e.
Su peso molecular aproximado fue de 25,000. Las
reacciones de Biuret, acido glioxilico, fenol Greenberg y nitroprusiato de scdio, fueron positivas. La reaccion de Moelisch fue siempre negativa. El acido tricloroatetico y el sulfosaliciHco, no precipitaban sus diluciones, el acido tungstico lo hizo incompletamentei. El acido perclorico y las sales de
o'ro y plata, junto con precipitarlo, mactivaban el Lisczima.
El Lisozima se demostro como muy estable al calor v al
acido; asi el acido acetico al 2 /v a 100 grades C-, no afecto
el poder litico de este principle, despues de 45 minutos de
contacto.
'
En medio alcalinc, a la temperatura ambiente, se dismiimia notablemente la actividad litica del Lisozima' antes de
los 10 minutos. De acuerdo con la totalidad de Ics invesfigadores, consideramos que en un medio neutro, se evidencia el
optimo de la activrdad lisozimica.
En pH acido, la solucion lisozimica atraviesa ocn facilidad la bujia Berkefeld 5, mientras que a pH neutro lo bace
con £irma dificultad. Los filtros de porcelana, algodon y
papel retienen el Lisozima, mientras no ban sido saturados,
despues de lo cual el elemenlo los atraviesa con facilidad. No
dia'liza. Se comporta como un coloide electro positive^.
Es absorbido por el carbon vegetal, caolin, celulosa,
perc no PGT el bidroxido de aluminio' coloidal, bidroxido de
hierro coloidal y fosfato tricalcico. Su tamano molecular seria
inferior a 30 milimicrones. Es destruido por la luz ultravioleta.
Respectc de su estabrlidad, las soluciones de Lisozima,
conservan su actividad, ya< a la temperatura de la estufa odel frigidaire, por un tiempo mas o mencs largo. El yodo y
el cxido cuproso, lo inactivan, fenomenos que son parcialrnente reversibles,
Lcs fermentos proteolitictxs digestives no disminuyen el
poder bacteriolitko del Lisozima contenido en la clara.de
huevo. Los drstintos ,antisepticcs se comportan.i de inodo
variable. Mientras que algunos, como el fenol a l 1 %, sublimado oxicianuro de mercurio al L por mil y el m^ntol al
1 por 10 mil, no modifican en absoluto el ,poder litico del
Lisozima, la tintura de yodo a concentraciones que no determinan la precipitacion de este producto, inbibei totalmfntesu activida>d inhibidortlinca. Los compuestos . su'lfamidadoe.
EL LISOZIMA EN EL TRACTO DIGESTIVG
601
asociados al Lisozima, parecen reforzar su accion cuando liegan a contacto con especies microbianas sensibles.
MECANISMO DE ACCION D'BL LISOZIMA
Fleming y Allison consideraron el Lisozima como una
diastasa, sin llegar a demostrar Su'calidad enzimatka ni el
^ubstrato sobre el cual ejerce su accion.
Hallauer ( 3 3 ) creyo que dicha accion se ejercia 'Sobre la
fraccion mucoide de la membrana microbiana, ya que el fcnomeno litico va asociado con un aumento del N no proteico, de P inorganico y de substancias reductoras de otigen
proroplasmatica que ban sido puestas en libertad gracias a la
desintegracion de dicha membrana.
K. Meyer, J. W. Palmer y R. Thompson (30) apoyan
la teoria fisico-quimica del mecanismo de accion del Lisozima,
considerandold como capaz de prqducir el. descenso de la
tension superficial,' opinion que ha quedado totalmente desvirtuada gracias a multiples investigaciones en las cuales se
ha probado que las substancias que disminuyen la tension
superficial en forma manifiesta —como el alcohol capriHco
que la hace descender en un 60 % en relacion con la del
agua destilada—, no se comportan en absoluto como agentes liticos.
.
Wolff y Kiwasawa, en 1927,' comprobaron que el Lisozima altamente purificado, disuelto en agua o en suero fisiologico, no hacia descender la tension superficia'l,
K. Meyer y colaboradores, siguiendo los trabajos de
Fleming y Allison y especialmente los cle Hallauer, que considtran la accion del Lisozima como un fenomeno diasta^ico
que se verifica sobre .la fraccion rnucoide de la membrana microbiana, lagraron Ipcalizar en determinados eslabones azucarados el sitio en que la desintegracioh se ejercia.
Estos autores, colocando al Lisozima purificado frente
a determinados substratos, no lograron comprobar de su
parte la calidad.de proteasa, quin'aga, amilasa, lipasa ni fosfatasa.
.
L. A. Epstein ^ E. Chain' (34), en. 1940, aceptan que
el Lisozima actua como una diastasa capaz de hidrolizar
determinados poUsacaridos contenidos en el cuerpoi de las especies microbianas sensibles, rxtlisacarido insoluble en el agua,
responsable del mantenirniento de lai estructura nxorfologica
de las bacterias.
802
,
KEVKTA CHILENA DE PEDIATRIA
En los casos en que este polisacarido es el unico eleinento mantenedor de dicha estructura, las especies microbianas sensibles al Lisozima, puestas a su contacto, son desintegradas hasCa su completa lisis. Pero, cuando estan presences tambien otras estructuras, el Lisozima tendria sobre las
especies sensibles solo un pcder bacteriostatico, o bien bacrcricida, ya.que dicbo polisacarido desempenaria, aparte de intervenir en la mantendon de la estructura morfologica, un rol
de vital importanda para la bacteria.
Segun lo establecen Epstein y Chain, el pcjisacarido que
lograron aislar de cuerpos secos de Micrococcus lysodeikricus
y que demostro tener un alto peso molecular, puesto a contacto coji ed Lisozima purificado de la clara de huevo o de
otras fueares que lo contienen, -perinitio ubicar a esta sub?tancia-en el grupo de las carbohidrasas.
La hidrolisis obtenida en un pH entre 2 y 9, daria
origen, entre ctras substancias, a una N-aminoexosa acetilada
y una queto exosa, no cqnsiguiendose demcstrar la presenda
de otros hidratps de carbono. s
En resumenr los estudios realizados acerca del mecanismc de accion del Lisozima frente a las 'especies microbianas
sensibles, saprofitas y patogenas, a pesar de no haber resuelto
el problema en forma definitiva. permiten, gracias a las recientes verificaciones de Meyer y colaboradores, considerar a
esta 'substancia como una diastasa.
NUESTRAS INVESTIGACIONES
El presente trabajo se basa en el estudio dinico-experimental que publicaran Rosenthal y Lieberman en el ario
1931 (28) -sobre el papel que desempena el Lisozima en el
desarrollo de la flora intestinal del recien nacido y lactanfe.
Ellos observaron que el tracto intestinal del recien nacido, esteril en el momento del nacimiento, es invadidc, dcntro
de un corto "periodo de tiempo, por los microorganismos del
medio ambiente. Esta flora- intestinal inicial desaparece al
tercero o cuarto dia en los lactantes alimentados en forma .natural y es reemplazada por una flora, en la cual predomina ei
Lactobacillus bifidus. En los ninos alimentadcis en forma
artificial! no sncede lo mismo, desarroll'andose una flora microbiana intestinal muy variada y sin predominio de ninguria especie determinada.
,
;
Tratando de investigar la causa de la modificadon.
que ex-perimenta la-flora microblana inicial en 'los ninos all-
EL LISOZIMA EN EL TRACTO DIGESTIVO
603
mentados en forma natural, Rosenthal y' Lieberman fijaron
su atencion en las deposiciones y trataron de buscar en ellas
la existencia de algun factor capaz de destruir a los germenes
invasores. Para ello prepararon un extracto de deppsiciones
y lo pusieron en contacto con una cepa de Sarcinas, germen
saprofito del aire, que tiene los caracteres de coco gram
positivo, se dispone en tetradas y cuyas colonias en agar
placa son muy tipicas y facilmente diferenciables.
.
La tecnka empleada por estos investigadores en sus experiencias, fue la siguiente: "el extracto se prepare mezclando deposicicnes de un lactante de una semana de edad,
con cantidad suficiente de suero fi-siologico, basta formar
una pasta espesa. Esta se centrifugo a una gran velocidad,
por espacio de 20 minutos, y se decanto el sedimento. Como
un representante de las bacterias deJi aire, seleccionamos una
cepa de Sarcina, que habiamos aislado del aire por exposicion de placas de agar descubiertas. Se eligio este germe-fl,
porque su aspecto tipico al microscopic permite reconocerlo
facilmente. Se obtuvo una suspension sCarfdard de Sarcinas,,
en 5 cc. de suero fisiologico; 0,5 cc. de esta suspension, con
2 cc. de extracto de deposiciones, se tncubo a 45 grados. Un
e&tudio microscopico en fresco de gotas sucesivas de esta mezcla,. tcmada5 a intervalos de media hora, revelo la destruccion com pi eta y lisis de'las Sarcinas en una a dos horas".
Estudiando los caracteres fisico-quimicc~s del principio
Ktico revelado en las deposiciones, estos autores comprueban
su notable resistencia a los agentes fisicos y quimicos, demostfando que no es afectado per temperaturas de 569 y que
es inactivado solo despues de una hora y media a 65t? o des1
pues de 3 minutos a 100V Su poder bacteriolitko no es alterado por el eter hi cloroformo. La filtracion a traves de
papel filtro, cambia el principio acttvo del extracto probablemente por absorcion.
Rosenthal y Lieberman, por todas estas fazones> identifican el principio litico encontrado por ellos en las deposiciones, con el Lisozima.
A continuacion invesdgan la presencia de LisQzima en
las deposiciones de ninos alimentados en forma natural y
artificial, para lo cual examinan un total de 81 muestras,
conduyendo de sus investigaciones que el Lisozima se encuentra presente solo en las deposiciones de nincxs alimentados al pecho, y no en los alimentados con formulas de Teche
de vaca, de lo que deducen que tal principio se encuentra
contemdo en la leche humana y que atravtesa» el tracto intes-
6C4
tmal, apareciendo en las deposiciones, sin ser destruido por
el jugo gastrico ni por las secreciones intestinales.
Basandonos en las experiencias de Rosenthal y Lieberman, las que hemos modificado en ,parte y .ampliado, verificamos en la Catedra el presente trabajo de orden experimental.
MATERIAL Y TECN1CA USA-DOS EN NUESTRAS EXPERIENCIAS
Germen de prueba.
- Hcmos utilizado la mism.3 cepa de Sarcina test, cm pi* ad a en toda.s las
invcstigacton€s efectuadas -zn la Caredra. sabre el Lisozima.
D;-cha Sarcina fue aislada del aire en 1930 por L, 'RosoiUhal, del Laboratorio del United Israel Zion Hospital. ' E!la ha sido utilizada ;por Paul S1.
Pricket*, del Laboratorio de Mead. Johnson and Company, EvansvUI's, India- 1
na, en.stis trabajos sobrc Lisozima. y fue el quien. nos envio dioha cepia par>3'
nu-estras investigacioncs.
El tstudio de sus caracieristkas morfo-ogicas, ' culturaUs y fisiologicas,
ya fiij realixado *n la Catedra en 1942. por lo cual no iasistiremos mayormente y solo dir^mos qu« se trata de un gfrmtn de fofma -esferica, disput&to
en tt-tradas. rio csporu'lado, inmovil, Gram positive. E« agat cstria- tiene
d'^sa-trollo ,-bundante en for,ma.- invasor, piano, lig-eramente lewntadd, opaco,
de snperficie lisa y hiimeda, color-amarillo limon, sin olor, de conaist«ncia
viscosa; no altera el medio, pnede cmLllsioIlars^ faci'lm'Snte, d^ndo una cmu!s'6n homogenej. Las colonias -en agar placa son pequ>enas, redondeadas, de
snperficie humiida, de color amarillo cremoso.
Deposlciofles,
En nuestris experi-encias hemos utilizado 'muestras de tneconio y deposiciones d-e nines recien nacidos de la Maternidad del Hospital Bartos Lu<o /
de Lcctantcs del Hospital Luis Calvo Mackenn'a. Estos ultimos nirios, en las
cajos en que fueron alim':ntados en forma natural, tomafoan" leche human a
ordenada. Es del caso h-aner notar que, en1 su mayoria, se trataba de ninos
distroficos, contrariamente a los primtros, que fueron. en su. totalidad, catalogados como clinicam^nte sanos.
Preparaci6n del extracto de deposictones.
1, A uru cantidad indet-erminada de deposicionts (retogidas gen«raN
mente de la primera m u d a ) . agregamo?' 10 cc. de suero fi&ioJolgko, agitando
hasta format una ma^a semi liquids.
EL LISOZIMA EN EL TRACTO DIGESTIVO
,
60>
2. Centrifuganjos dicha mez<la a razon de 5,000 revoludones por
minuto, por espacio de 20 minu!os.
3, Ocean-tamos el scdimentu, obteniendo el "sbbrenadante como extracto de
deposiciones. Este extracto, asi obtenido, io mezclamos con un volumen igual
de etcr sulfurico, llevando en seguida esta mezcla al barlomaria a 50 grado^,
hasta la complete evaporation del eter, la que se conseguia despues de faora y
midia de calentamiento. En esta forma obtuvi*nos '^1 extracto de deposkionea
libre ds impurezia, ya que la esterilizacion con eter y el calentamiento a 5.0
grades, no afectan al Lisozima qu; pudieran contentr, en tanto qLie exicluyen
la interv«ncion di; las bacterias del giupo Mcstnterkus-subtilis, ,que puedcn
tr.contrarse en las deposicion^.-; -y que, tal como lo ban demostrado 'Nicolle y<
Rosen thai, son capaccs d; produtir n n . f e r m e n t o litico active.
Preparation de la emulsi6n de sarcinas.
1. A un cukivo de 24 boras en agar Undido dz Sarcina test, agregamos 10 cc. de suero fisiologico. agitamos.
2. 0.1 cc. dc esta mezcla agrcgamos a un tubo de agar fan-dido y eafriado a. 45 grades.
3. Vaciamos a pla-cas .de Petri, e . i n c u b a m o g a 7 7 -grado-s por e-spa'cio
d? 24 horas, a-1 cabo de-las cuales Icemos los ^-sulta-cfas1 obtenidos.
4. Usamos dos tubos <3e control: uno de ellos en el que reemplazabanios
el exrfacto de d^posiciones por suero fisiologico. y otro en el que solo teniamas extracto de depositions. Este. ultimo lo usa*bamo9 con el fin Je tener \A
scguridad de que mediante la esKri'lizacion previa habiamos deg!"rui<io la flora'
microbrana intestinal normal.
En esta forma, investigabamos el poder liti-co inhibitor del extracto de
deposiciones. frente a la Sarcina t.'st. en forma instantanea.
A fin de facilitar la lectuta de los resultados obtenidos
tn todas nuestras experiencias, hemos adoptado la siguiente
pauta para !su interpretacion:
Lisis total, no hay <&sarroUo microbiano.
Hay disminucion en un 7 5 % en el niimero -de colonias,
comparativament-e a la p"laca control.
'La reduction ckl num«ro -de colonies alcanza a un 50%
con raspecto al control.
Hay drsminncion <jkl numero de colonias en un 25 %.
El iramero de colonias es sensibfcmente igual al Je la pTaca
control.
606
PROTOCOLO DE NUBSTRAS INVESTLGACiONES
Primera serie de experiencias.
Efec'tuamos la investigation del Lisozima en cl .m-econio y d-posicioflcs
dc los reden nacidos alimenudos con leche raaterna.
Estudio verificado ien 75 ninos, protocolizados «n la Maternidad del' Hospital Barros Lnco, y cuyas edades fluctnaban entre 1 dia y 12 dias.
Los resultados obtenidos los resumimos en cl cuadro- siguientei
.CUADRO N.' 1.
Investigacion del poder liti-co-iahibidor del meconio y deposiciones de
los recien nacidos alimentados con lech? niJterna, frente a 1'a Sarcina test.
.^cci6n instantan-ea.
Nombrc
Protocolo
9944 .. .. ..
11469 .. .. ..
9938 ,.
11470 ..
11471 ..
9946 ..
9961 ..
9939 ..
11476 .
11472 ..
11464 ..
11465 ..
11466 ..
11467 ..
11474 ..
11432 ..
1 1438 ..
11441 -.:
11475 ..
11433 ..
11424 ..
11435 ..
11477 ..
11478 .. 11479. ..
11480 ..
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9965 ..
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12139 ..
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Edad
• 1
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Proced,
N.9 Alimentation
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60315
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60167
59936
32837'
60246
59951
51730
60245
59492
59890
31042
59758
56187
59770
59784
13531
.6045-3
7236
60051
59818
60170
44480
20718
45281
41152
59977
60109
49851
60325
28109
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EL LISOZIMA EN EL TRACTO DIGESTIV<3
Nonibie
Protocolo
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9964 .. . .
11468 .. . .
12141 .. . .
12142 .. . .
12143 ., .
12144 .. . .
12746 .. . .
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12748 .. . .
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Edad
f
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12753
12754
11436
11437
11439
11440
11481
11482
11483
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12758
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12761
12762
U485
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11489
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Concl'Jsicnes de la primcra c^ ie dc cxp:riencias.
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L 9 Demuestrase en la totalidad de los casos investigados, que el meconio catece de Lisozima.
2. Q Las depcsiciones de recien nacidos alimentados <;on
leche materna demostraron, en todos los casos analiz-ados, un
"ran contenido lisozimico.
«oa
REVISTA CHILENA DE PEDIATRIA
3.9 La aparicion de Lisozima en" las deposiciones coin-/
cidio constantemente con la iniciacion del amarnantamiento.
4.'-' Los controles verificados en forma continuada, a
partir del l.er dia del amamantamiento hasta el 12.Q dia, demostraron un contenido lisozimico cOnstante.
Segunda serie de experiencias.
Se investigo el pod-^r inhibidor litico -de las -depositions de 79 lactantes,
cuyas cdlades 'fluctuabarv «ntre 15 dias y 22 meses, alimentados en forma aa-.
tufal (leche h n m a n a ordenada), mixta y artificial.
Estos caso.s. fueron proto-coliz.ados en el Hospital Luis Calvo Mack-cnna,
• Los resultados obtcnidos estan rcsumidos en el cuadro siguiente:
CUADRO K.'! 2
Investigation del poder inhibidor litico de las deposicioncs de lactanf^s,
frente a la Sarcina test. Accion instantanea.
Profocolo
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610
REVISTA CH1LBNA DG PEDIATTUA
Conclusions de la segunda serie de experteocias.
1. Las deposiciones de lactantes alimentados con lecbc
hurr.ana ordenada, contienen Lisozima.
2. El contenido lisozimico que poseen ias deposiciones
de estos ninos, es tan elevado como el de los ninos alimentadcs con lecbe materna.
3. La actividad lisozimica fue siempre constante e independiente de la edad del lactante.
4. Los lactantes alimentados en forma mixta, demos~
traron contener Lisozima en sus deposiciones.
5. Las deposiciones de estcs ninos presentaron un
contenido lisczimico inferior al de los ninos alimentados en
forma natural, variando su concentracion en forma proporcionalmente directa a 'la cantidad de leche humana que recibian.
6. Los lactantes que recibian alimentacion artificial no
prerentaron, en ningun caso, Lisozima en sus
ACCION DEL LISOZIMA CONTENIDO EN LAS DEPOSICIONES
DE RECIEN NACIDOS, FRENTE A ALGUNAS ESPECIES
M1CROBIANAS S.APROFITAS Y PATOGEJSAS
c creidc de interes investigar la accion del Lisozima fecal de los recien nacidos, frente a algunos germeines patogenos del tracto digestive.
Procedimos a estas investigaciones despues de haber
comprobado, utilizando la Sarcina test como especie microbiana sensible, el alto poder lisozimico de las deposiciones a
examinar.
Verificamcis este estudio en 52 muestras de deposiciones
obtenidas de recien nacidos, cuyas edades fluctuaban entre 4
y 8 dias.
Em^'.eamos 'las slguientes especies micro bianas: Escberichia coli: Eberthella typhoira, Salmonella tP^ratypbi A., Streptococcus faecalis (enterococo) , Proteus morga>nilf Sbigella p^radysenceriae (Bacilo Flexner) .
En cuanto a. la tecnica seguida, ella ba sido analcga-a
la ya descrita para las experiencias con Sarcina test.
Hemos variado la dilucion d^i extracto " de deposiciones desde 1/10, que corresponde a la dilucion empkada en
las exoeriencias verifioadas con la Sarcina test, hasta 1/200.
EL LISOZIMA EN EL TKACTO DIGE'STIVO
Asi mismo, hemos variado el tiempo de comtacto entre la
emulsion microbiana y -el extracto de deposiciones, desde las
24 horas hasta la fluracion de la accion instantanea, que en
.las experiencias con Sarcina test file el tiempo optimo de
accion.
Los protocclos de las experiencias y los resdltados obtenidos, frente a cada una de estas especies mkrobianas, estan
resumidos en 'la serie de cuadros siguientes:
CUA^RO N.9 3
Accion -dtl Lisozima, contenido en Las deposicroni2s del recien nacido sobre
la Escherichia coli.
Muestra Extr. Deposit.
Tiempo
contacto en. horas e interpretacion
<k lew resaltados.
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Conchisiones.
De esta serie de experiendas, pueden deducirse las siguientes conclusiones:
1. Las deposiciones de recien nacidos, contieaen Lisozima active para la Erx:herichia coli.
2. El grado de actividad es direct a meat e proporcional
a la concentracion y al tiempo de contacto,
3. Al 1/10 se produce lisis parcial en forma instantanea, la que se hace total despues de 6 horas de contacto.
4. Al 1/20 la lisis es apenas perceptiW e hasta. las 3
horas; se va haciendo mas evidente a medida que aumenta
fl tiempo de contacto, sin llegar en ningun caso a- la pfoduccion de lisis total,
•
EL LISOZTMA EN EL TRACTO DLGESTLVO
5. AI 1/50 hubo. ligera accion despues de 24 hpra» dc
contacto, en dos del total de las muestras exaniinadasl
6. AI " 1/200, el extracto de deposiciones no cjerce
ninguna accion frente a la Escherkbia coli.
CUADRO N.' 4
Accion del Lisozima cont«nido cc las deposiciones del recten niacido, sobre
la Ebcrthella typhosa.
Muestra Extr Deposic.
N.*
12137
12138
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1/10
1/20
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1/100
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1/10
1/20
1/50
1/100
1/200
1/10
1/20
1/50
1/100
1/200
Conclttsiones,
E>e esta serie de experimentos se deducen las siguientes
conclusiones:
*
• 1. B^ Lisozima contenido en las 'depcsiciones del recien nacido, tiene accion inhibidor litica evidente sobre la
Ebcrthella typfoosa.
2. El grado de actividad es directamente proporctonal a la concentracion y al tiempo de contacto.
3. Al 1/10 se produce lisis parcial a las -3 horas, la
que se hace total a las 24 horas de contacto.
4. Al 1/20, su accion empieza a ejercerse a las 12
horas de contacto y no llega a ser completa aun despues de
24 horas.
5. A mayores diluciones, el extracto de deposiciones
no dernostro ningtin efecto sobre ia Eberthella typho&a, aun
despues de 24 horas de contacto.
EL LtSOZIMA EN EL TRACTO 'DKiESTIVO
CUADRO N.o 5
Accion del Lisozimla contenido en las deposiciones cjel recitn nacido sobre
.h Salmonella paratyphi A.
Tiempo de contacto en horis e interpretacion
de los resultadtos
Muestra Extr. Deposic.
Instant.
N->
12746
1/10
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1/20
12747
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12753
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1/20
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—
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616
,
KEVISTA CHILENA DE PEDTATRlA
Conclusiones.
De esta serie de experiencias, se deducen las siguientes
conclusiones:
1. El Lisezima contenido en las deposiciones del recien
nacido, tiene accion litica evidente sobre la Salmonella^ paratypbi A.
2. El grado de actividad es directamente proporcional
a la concentration y al tiempo de contacto,
3. Al 1/10 se produce Usis parcial en forma instantanea, la que se hace total despues de 6 horas de contacto.
4. Al 1/20 su accion empieza a ejercerse a las 3 bora's
y no llega a ser completa aun despues de 24 horas;
5. A mayores diluciones, el extracto de deposiciones no
demostro ningun efecto sobre la Salmonella; paratyphi A.
.
:
CUADRO N.' 6
Accion d«l Lisozima contenido en las deposiciones del r-ecien fucido sobre
el Streptococcus faecalis.
Muestra Extr. peposic.
Tiempo de contacto en boras e mterpretaci6n
de los resultados
Instant.
12137
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Conclusion's.
En esta serie de experiences, nos hemos entontrado con
dificultades tecnicas, practicamente insalvables, por lo qne
nuestras conclusiones serin solo transitorias, quedando supeditadas a estudios posteriores. Las dificultades se refieren es~
pecialmeirte al hecho de que los cultivos en placas de esta
especie microbiana, dan colonias pequefiisimas y de aspecto
transparente, muy dificiles de apreciar aun con ayuda de
5upa. En todo caso, como se desprende del cuadro, parece que
el Lisozima tiene una accion muy debil scbre esta germen.
CUADRO N.' 7
Accion del Lisozima contenido en las depasiciones del recicn nactdo sabre
el Proteus morganii.
Mucstra Extr E*eposic.
Tiempo de contacto en horas e int-ejrp-retacion
de los tesoltados
N.?
lastant.
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REVISTA CHILENA DE PEDIATRIA
Muestra Extr. Deposit.
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12757
12758
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Tiempo cte contacto en boras e interpretation
de los resuludos
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Conclusiones.
E>e esta serie de experiencias, se deducen las siguientes
condhisiones:
1. El Lisozima cojntenido en las deposiciones de1!
recien nacido, tiene a'ccion inhibidcir litica evidente sobre el
Proteus morganii.
2. El grado de actividad es directamente proporcional
a la concentration y al tiempo de contacto.
3. Al 1/10 se produce lisis parcial en forma Instantanea, la que se hace total despues de 3 horas de contacto.
4. Al 1/20 su accion tambien se ejerce en forma instantanea, hadendose la 'lisis total a las 24 horas de contacto.
5. Al 1/50 se 'produce lisis parcial en forma instantanea, la que no llega a hacerse completa aun despues de 24
horas de contacto.
6 , - Al 1/100 se manifiesta una pequena accion liticoinhibidora, despues de 24 horas de contacto.
EL LISOZIMA EN EL, TRACTO DJGE6TIVO
CUADRO N,p 8
Accion del Lisozima conttnido en las depoii clones del recien. 'nacido
h Sbigeth paiadysaitecia*.
Muwtra Extr. Deposit.
Tiem-po de contacto «n haras e interpret a cion
de los reSultados
I-iwtant.
12755
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Conclusiones
.
—
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—
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—
—
• —
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—
—
—
•—
—
—
12
—
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.
Del analisis del cuadrc precedence, se desprende que la
Shigelh paradyEenteriae es altamente resistente a la accion del
Lisozima fecal.
CONSIDERACIONES GENERALES
Del presente trabajo experimental se desprende que el
Lisozima se pncuentra solamente en las deposiciones de recien
nacidos y lactantes que son alimentados con leche humana,
ya sea en forma exclusiva o mixta.
.
•
.. ; , Si consideramos ahora Ics dos hechos, ya demostrados
por Rosenthal y Lieberman en 1931 (28) y cortfirmados
por nuestras recientes investigaciones, que ni el meconio de
:
I20
los recien nacidos, ni las deposiciones de Ics lactantes de cual. quiera edad -alimentados- en forma artificial, contienen Lisozima, podemos deducir que este eleroento presente en las-tleposiciones de los* ninos que reciben leche humana, provenga
exclusivamente de esta substancia alimenticia.
M. y J. Border ccmprobaron en 1828 (27) que, mientras el caloptro y la leche humana contienen el Lisozima en
alta proporcion, la leche de vaca • carece de este (principio.
Blatt y Kessler (34-) llegaron en 1937 >a la misma conclusion. Prickett, Miller y Me Donald (26), en 1933, sin embargo, concluyen de sus trabajos que la leche de vaca contiene Lisozima, pero, comparativamente con la leche humana,
en cantidades muy reducidas. Nuestras investigaciones realizadas en la Catedra, nos permiten confirmar los resultados
obtenidos por Bo'rdet.
•
•
Puesto que los jugos digestives no mpdifican ni disminuyen el poder de este principio inhibidor-liticof hecho comprohado per Fleming y Allison (25) en 1924, el Lisozima
ejerceria su accion antimicrobiana en forma eficaz, a lo
largo de todo. el tracto digestive del lactante.
En cuanto a los microorganismos mas frecuentemente
raisladcjs del intestine y de las deposiciones de recien nacidos y
lactantes" norm-ales, los diferentes investigadores oqncuerdan
en considerar al Lactobacillus bjfidus como una de las espe-.
cies de mayor resistencia frente al Lisozima, lo que explicaria la frecuencia con que este germen es aislado de las deposiciones de los ninos alimentados con leche humana y, al mismo tiempo, la escasez o ausenda de otra flora microbiana en
estos terrenos.
.
Teniendo pfesentes las anteriores consideraciones, podemos deducir que, gracias a los recientes ^trabajos de Meyer,
Palmer y Thompson (30), que ban logrado obtener el Lisozima al estado de maxima pureza y aun en forma cristalizada, ccntamos ahora 'con una substancia mas pata combatir
eficazmente ciertos procesos rnorbidos digestives del nino de
naturaleza toxi-infecciosa.
CONOLUSIONES GENERATES
De nuestro estudio sobre la presencia de Lisozima en el
meconio y en las deposicicmes de recien nacidos y lactantes y
de su accion inhibidora y litica frente a algunas especies microbianas saprofitas y patogenas del tracto digestive, se desprenden las siguientes conclusiones:
EL 'LISOZIMA-EN EL TTRACTO DIOESTIVO
621
1) En la totalidad de llos casos investigados.se demostro la ausencia de Lisozima en el meconio.
2) Por el contrario, se evidencio su presencia en todas
las deposicioyies de los recien" nacidos alimentados con leche
matcrna.
3) La aparicion del lisozima tuvo lugar, en todos los
cases controlados, en el tercer dia, coincidiendo con la iniciacion de1 amamantamientc.
• .
4) Los lactantes alimentados con leche humana. ordefiada, demostraron contener en sus deposiciones un alto titulo lisozimico, semejante al que se comprobo en los niiios
alimentados con leche materna.
5) La edad del nino alimentado con leche humana no
tiene, evidentemente, ninguna relacion con el contenido lisozimico de las deposiciones.
6) La tasa lisozlmica de las deposiciones de lactantes
alimentados en forma mixta, guarda relacion directa con la
cantidad de leche humana ingerida.
7) En los lactantes alimentados en forma artificial,
no pudo demostrarse, en ningun case, la presencia de lisozima
en sus deposicicnes.
8) En cuanto al poder lisozimico de las deposiciones
frente a diversos germenes patogenos y saorofitos 'del tubo
digestivo, se com,probo que la intensidad de su accion varia
segun la especie microbiana:
a) .La Escherichia coli fue inhibida en su desarrollo
en forma total por concentraciones del 1 x 10 y despues de
6 horas de contacto. A concentraciones de 1 x 50 se demostro
una acci6n muy leve despues de 24 boras.
b) La Eberthella typbosa sufrio la. inhibicion total a
concentraciones de 1 x 10 y despues de 24 horas de. contacto.
A concentraciones de 1 x 20 se demostro, en el mismo tiempo, una accion inhibidor-litica incompleta.
c) El Streptococcus faecalis (enterococo) probo ser
una especie muy resistente a la accion del lisozima fecal.
d) La Salmonella paratyphi A fue inhibida en su desarrollo en forma total por concentraciones de 1 x 10 despues
de 6 horas de contacto. Al 1 x 20, el efecto mhibidor fue
solo parcial, aun despues de 24 horas.
e) El Prcteus morganiii se revelo, de las especies microbianas estudiadas cojno la mas sensible al lisozima fecal.
A concentraciones de 1 x 10 y a las 3 horas de contacto, se
comprobo la inbibicion total de su desarrollo. Un efecto par-
522
REVISFA CHILENA DE PEDIATRIA
cial pudo observarse aiin a concentraciones de 1 x 100 despues
de 24 horas.
f) La SbigcIIa paradysenteriae (Bacilo de Flexner) se
mostro altamente resistente a la accion del lisozima fecal de
'los recien naddos. Concentraciones de 1 x 10 .produjeron,
despues de 24 horas de contacto, solo en alguncs de los casos
investigados, una inhibicion parcial de su desarrallo.
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