ANÁLISIS Y EVALUACIÓN DE LOS PROCESOS DE LIMPIEZA
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ANÁLISIS Y EVALUACIÓN DE LOS PROCESOS DE LIMPIEZA MANUAL DE EQUIPOS DE MANUFACTURA EN UNA INDUSTRIA NUTRACÉUTICA. Rafael Alberto Forero Vargas Diana Carolina Piedrahita Navarrete TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al Titulo de MICROBIOLOGO(A) INDUSTRIAL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL FACULTAD DE CIENCIAS Fort Laurderdale, Florida - Estados Unidos de América Julio de 2008 NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N°13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velara por qué no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia” ANÁLISIS Y EVALUACIÓN DE LOS PROCESOS DE LIMPIEZA MANUAL DE EQUIPOS DE MANUFACTURA EN UNA INDUSTRIA NUTRACÉUTICA. Rafael Alberto Forero Vargas Diana Carolina Piedrahita Navarrete APROBADO _____________________ Diego F. Congote Microbiólogo Industrial Director ______________________ Janeth Arias Bacterióloga M. Sc Co Director _____________________ Luz Ángela Montaño Microbióloga Industrial Candidata a CIH Jurado _______________________ María Cristina Peña Microbióloga Industrial Jurado ANÁLISIS Y EVALUACIÓN DE LOS PROCESOS DE LIMPIEZA MANUAL DE EQUIPOS DE MANUFACTURA EN UNA INDUSTRIA NUTRACÉUTICA. Rafael Alberto Forero Vargas Diana Carolina Piedrahita Navarrete APROBADO ______________________ Ingrid Schuler Ph.D Decana Académica Facultad de Ciencias ______________________ Janeth Arias P. M.Sc Bacterióloga Directora de Carrera RESUMEN La evaluación de la limpieza de equipos e instalaciones en una Industria Nutracéutica es uno de los factores fundamentales para garantizar y asegurar que un producto (suplemento nutricional) es apto para el consumo. En este trabajo se evaluó la eficacia los agentes limpiadores Alconox (detergente aniónico) y alcohol isopropílico (desinfectante) utilizados durante la limpieza manual de equipos; se llevaron a cabo pruebas in vitro de suspensión y superficies aprobadas por la FDA y validadas por la AOAC (Association of Official Analytical Chemist) e in vivo en donde se tomaron muestras de las superficies de los equipos del área de manufactura una vez finalizados los procesos de limpieza. Finalmente, se utilizó el criterio del caso o condición extrema (worst case) para la evaluación en el área de manufactura. Los microorganismos que se utilizaron para las pruebas fueron: Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans. La concentración recomendada de alcohol isopropílico (70%v/v) resulto ser adecuada para el uso establecido, debido a que mediante las pruebas realizadas se demostró la inhibición del crecimiento de todos los microorganismos en suspensión con un tiempo mínimo de un minuto. En la evaluación de superficies para el alcohol isopropílico se observó que el desinfectante es sensible a diferentes concentraciones de materia orgánica (suero bovino 0.01g/mL, 0.125g/mL y 0.25g/mL) permitiendo el crecimiento de microorganismos. Alconox evidenció acción bactericida frente a Staphylococcus aureus a una concentración del 2% p/v en un tiempo de exposición mínimo de 5 minutos. Además, según el tipo de residuo este debe ser utilizado a diferentes concentraciones entre 1%p/v y 2%p/v. La inmersión de las partes pequeñas removibles de la maquina en Alcohol isopropílico al 70%v/v, el uso periódico de agentes esporocidas, y la rotación del desinfectante, son algunas de las implementaciones sugeridas mediante la realización de este trabajo. ABSTRACT Facilities and equipment cleaning evaluation in the Nutraceutical Industry is an important aspect to guarantee and assure that dietary supplements are suitable for human consumption. The effectiveness of an anionic detergent (Alconox) and a disinfectant (Isopropyl alcohol) utilized during the manual cleaning of manufacturing equipment were evaluated in this study. In vitro tests were separated in two parts; suspension tests and carrier test. Suspension test were the Phenol Coefficient (AOAC 955.11) and the Kirby-Bauer disk diffusion method, while carrier test was the Use dilution method (AOAC 955.15). These methods are approved by the FDA and EPA for disinfectant evaluation. In vivo test was carried out by taking swab samples of the equipment’s surfaces before and after the cleaning process in order to identify the residues and microorganisms left behind the cleaning process. Specific analytical methods were used to identify minimal concentration of residue. The process was then evaluated by the worst case scenario. The microorganisms used were Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans. The recommended dilution of Isopropyl Alcohol (70% v/v) was suitable for the inhibiting of bacterial growth even, at on (1) minute of exposure. Meanwhile, surface test done with isopropyl alcohol showed that the disinfectant is inactivated by organic matter (Bovine serum at 0.01 g/mL, 0.125 g/mL and 0.25 g/mL) allowing the growth of microorganisms. Alconox showed bactericidal action against Staphylococcus aureus at 2% w/v after 5 minutes of exposure. Even though, the concentration of alconox (1% w/v or 2% w/v) depends on the nature of the residue. Immersion of the removable small pieces of equipment in 70% v/v isopropyl alcohol solution as well as the periodic intervals of disinfectant solutions were some of the feedback given once the study was over. AGRADECIMIMIENTOS A la Pontificia Universidad Javeriana por sus enseñanzas a lo largo de nuestra carrera. A Arnet Pharmaceutical Corp. por brindarnos la oportunidad de tener esta gran experiencia profesional. A la familia Tabacinic por aceptarnos dentro de su compañía y acogernos durante todo el tiempo del estudio. A la familia Congote Montaño por la gran oportunidad de estar aquí, su amistad, acogimiento y sus sabios consejos. A Diego Congote por guiarnos a lo largo de todo este estudio, por brindarnos su amistad, su afecto y su paciencia. A Janeth Arias por creer en nosotros y apoyarnos. Al equipo del laboratorio, manufactura y empaque por ser nuestros amigos, hacernos reír y colaborarnos para llevar en buen término este trabajo. A nuestra familia por su amor, comprensión y constante apoyo. A nuestros amigos por su constante apoyo. Y a todos gracias…!!! Dedicatoria A Dios por bendecirme, A mis padres por su amor, su confianza, su apoyo, su constancia y sus sabios consejos “Los amo”. A mi familia por su voz de aliento a pesar de la distancia, A Janeth Arias por su apoyo incondicional, A Diego por su apoyo, su paciencia, su alegría, su amistad y por ser un gran maestro, A Rafa por su paciencia y constante alegría, A David por ser mi ángel, A Viviana, Diana, Karem, Laura y Sandra que desde cada uno de los rincones del mundo en que se encuentran dieron el apoyo y la energía necesaria para salir adelante. Y a todas aquellas personas que colaboraron a que este proyecto sea un sueño hecho realidad!! Diana C. Piedrahita Dedico mi trabajo y mi esfuerzo a Dios….gracias por escucharme y apoyarme, A mis papitos por ser todo en mi vida y darme todo el ánimo, amor y compresión que necesite siempre para salir adelante. Los amo y siempre los llevo en mi corazón!, A mis hermanitos Germán y Juan Sebastián por estar siempre conmigo y hacerme la vida más feliz, A mi familia por su constante apoyo y ánimo. Los amo! A mi bibe divina por su apoyo y todo su amor. Te amo mucho bibec!!, A “The Boss” por brindarme el conocimiento, la instrucción, su afecto e incondicional amistad durante todo este tiempo. Te quiero The Boss, A Carito por ser mi compañera a lo largo de todo este tiempo, parce lo logramos! A Janeth Arias por su constante apoyo y ánimo, A todos mis amigos con lo que crecí y a todas las personas bonitas que me brindaron su amistad y apoyo durante todo este tiempo, gracias. RAFAEL FORERO V. TABLA DE CONTENIDO RESUMEN ABSTRACT 1. INTRODUCCION ................................................................................................. 1 2. MARCO TEORICO .................................................................................................. 3 2.1 Antecedentes en la Industria Nutracéutica .............................................................. 3 2.1 Suplementos nutricionales ..................................................................................... 4 2.1.1 2.1.1.1 Que es un suplemento nutricional?................................................................. 4 Alergias a los Alimentos - Alimentos Alergénicos ................................... 5 2.2.2 Diagrama de flujo para la fabricación de un suplemento ................................... 7 2.2.3 Descripción de los equipos utilizados en la elaboración de suplementos ............ 7 2.2.3.1 Mezcladores o Blenders .................................................................................... 7 2.2.3.2 Encapsuladoras.................................................................................................. 8 2.2.3.3 Tableteadoras .................................................................................................. 10 2.2.3.4 Recubrimientos y pinturas............................................................................... 11 2.2.3.5 Equipos y Utensilios complementarios ........................................................... 13 2.3 Regulaciones para la manufactura de suplementos.............................................. 14 2.3.1 Buenas Prácticas de Manufactura (BPM’s) – Código de Regulación Federal, Capitulo 21 parte 111 .................................................................................................. 14 2.4 Control de calidad de los suplementos Nutricionales .......................................... 14 2.5 Establecimiento de Límites para la Industria Nutracéutica ................................. 15 2.5.1 Toma de muestras ......................................................................................... 16 2.5.1.1 Métodos Analíticos ................................................................................... 16 2.5.1.2 Criterios de Límites de Aceptación. ......................................................... 18 2.6 Agentes Antimicrobianos ..................................................................................... 20 2.6.1 Factores que influyen en la actividad de los antimicrobianos ...................... 33 2.7 Mecanismos de evaluación de los desinfectantes. ............................................... 33 2.7.1 2.7.1.1 Pruebas en suspensión .................................................................................. 34 Dilución en tubo ....................................................................................... 35 173 VII 2.7.1.2 Sensibilidad antimicrobiana (Kirby-Bauer) .............................................. 36 2.7.1.3 Coeficiente Fenólico ................................................................................. 36 2.7.2 2.7.2.1 2.7.3 Pruebas Carrier ............................................................................................ 37 Método de la Dilución de Uso .................................................................. 37 Pruebas en superficie – In Vivo .................................................................... 38 2.8 Limpieza............................................................................................................... 38 2.8.1 Limpieza manual de equipos ........................................................................ 39 2.8.2 Limpieza Automatizada de equipos ............................................................. 40 2.8.2.1 COP (Clean-Out-of- Place)....................................................................... 40 2.8.2.2 CIP (Clean-In-Place) ................................................................................ 41 2.9 Descripción del proceso de limpieza manual ....................................................... 42 2.10 Mecanismos de resistencia de los microorganismos............................................ 42 2.10.1 Intrínseca ...................................................................................................... 43 2.10.1.1 Bacterias ................................................................................................... 43 2.10.1.2 Mohos y levaduras .................................................................................... 45 2.10.2 Adquiridas .................................................................................................... 46 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ................................................................. 47 3.1 Problema .............................................................................................................. 47 3.2 Justificación.......................................................................................................... 47 4. OBJETIVOS ........................................................................................................ 49 4.1 General ................................................................................................................. 49 4.2 Específicos ........................................................................................................... 49 5. HIPOTESIS.......................................................................................................... 50 6. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 51 6.1 Identificación de los microorganismos prueba. ................................................... 51 6.2 Agentes de limpieza. ............................................................................................ 53 6.2.1. Evaluación de la efectividad antimicrobiana “Desinfectante y Detergente” .... 53 6.2.1.1 Pruebas en suspensión. ................................................................................... 53 6.2.1.1.1 Dilución en tubo y sensibilidad antimicrobiana (Kirby - Bauer) “Desinfectante y Detergente” ...................................................................................... 53 VIII 174 6.2.1.1.2 Método del Coeficiente Fenólico para el Alcohol isopropílico USP según la AOAC 955.11. ........................................................................................................ 55 6.2.1.2 Prueba en soporte “Carrier”. ................................................................... 57 6.2.1.2.1 Método de la dilución de uso - AOAC 955.15. ........................................ 57 6.2.2 Evaluación de la efectividad del detergente para la remoción del material orgánico. ...................................................................................................................... 64 6.3 Proceso de limpieza manual ................................................................................. 65 6.3.1 Evaluación del proceso de limpieza según “limites físico, químicos y microbiológicos”. ........................................................................................................ 65 6.3.1.1 Condiciones Normales. ............................................................................. 65 6.3.1.2 Condición crítica ....................................................................................... 67 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS. ....................................... 71 7.1 Agentes de Limpieza ............................................................................................ 73 7.1.1 Evaluación de la efectividad antimicrobiana de los agentes de limpieza 7.1.1.1 Pruebas en suspensión ................................................................................................. 73 7.1.1.1.2 Método del Coeficiente fenólico para el alcohol isopropílico USP “AOAC 955.11” .................................................................................................................. 81 7.1.1.2 Pruebas soporte “Carrier”. ....................................................................... 87 7.1.1.2.1 Método de la dilución de uso “AOAC 955.15”. ....................................... 87 7.1.2 Evaluación de la efectividad del detergente para la remoción de material orgánico. ...................................................................................................................... 91 7.2 Proceso de limpieza manual................................................................................. 93 7.2.1 Evaluación del proceso de limpieza según “limite físico, químico y microbiológico”. ......................................................................................................... 93 7.2.1.1. Condiciones normales. ................................................................................... 93 7.2.1.2 Condiciones críticas ..................................................................................... 100 8. CONCLUSIONES ............................................................................................. 106 9. RECOMENDACIONES .................................................................................... 109 10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS............................................................... 111 11. ANEXOS ............................................................................................................ 121 Anexo A Cronología de la regulación para suplementos nutricionales ................... 121 175 IX Anexo B Diagrama de flujo para la obtención de un suplemento nutricional. ........ 122 ANEXO C DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO GENERAL DE UN MEZCLADOR (BLENDER). ................................................................................... 123 ANEXO D DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO GENERAL DE UNA ENCAPSULADORA ................................................................................................ 124 ANEXO E. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO GENERAL DE UNA TABLETEADORA ................................................................................................... 126 ANEXO F DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO GENERAL DE UNA MAQUINA DE RECUBRIMIENTOS Y PINTURAS. ........................................... 127 ANEXO G. Buenas Prácticas de Manufactura (BPM’s) para suplementos nutricionales – Código de Regulación Federal, Capitulo 21 parte 111..................... 128 ANEXO H Ventajas y Desventajas de algunos desinfectantes ................................. 145 ANEXO I FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD DE LOS ANTIMICROBIANOS ............................................................................................. 146 ANEXO J Descripción de limpieza manual de equipos. ......................................... 145 ANEXO K Diagrama general pruebas In Vivo e In vitro........................................ 147 ANEXO L Susceptibilidad antimicrobiana (KIRBY-BAUER) ............................... 148 ANEXO M DIAGRAMA DE FLUJO TÉCNICA DEL COEFICIENTE FENÓLICO ............................................................................................................................ 150 ANEXO N DIAGRAMA DE FLUJO – PRUEBA EN SOPORTE “Carrier”. ...... 152 ANEXO O Evaluación de la efectividad de la remoción de material orgánico por parte del detergente ................................................................................................... 158 ANEXO P PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO .................................... 160 ANEXO Q FORMATO DE TABLA DE RESULTADOS ...................................... 167 ANEXO R ANÁLISIS DE VARIANZA DE LAS PRUEBAS IN VITRO ............. 172 176 X INDICE DE FIGURAS Figura 1. Blender en forma de “V” ............................................................................... 8 Figura 2. Encapsuladora Bosch GFK 2500 ................................................................... 9 Figura 3 - 3a. JCMCO modelo JC – SH31D; 3b. Compresores y ponches ............... 10 Figura 4 Vector Hi – Coater. Modelo VHC - 5811..................................................... 13 Figura 5. A. Alquil éter sulfato; B. Alquil sulfato Linear; C. Ácidos grasos y jabones. ....................................................................................................................... 31 Figura 7 Eficacia de los agentes de limpieza (concentración microbiana vs tiempo de exposición) .................................................................................................................. 32 Figura 6 Surfactantes catiónicos: A. Esquerato; B. Amonio cuaternario; C. Surfactante no iónico: ................................................................................................. 32 Figura 8 Clean Out of Place ....................................................................................... 40 Figura 9 Clean in Place .............................................................................................. 42 Figura 10 Resistencia de los microorganismos a los desinfectantes. .......................... 43 Figura 11 Estructuras de resistencia de las esporas bacterianas. ............................... 45 Figura 12. Lyfocults (Fuente: MSL Microbiologicals) ............................................... 51 Figura 13 Oxi –Ferm tube II ....................................................................................... 52 Figura 14 Metodología general para la prueba #1 del método de superficies. ......... 61 Figura 15 Metodología para la prueba #3 del método de superficies ....................... 62 Figura 16 Metodología para la prueba #4 del método de superficies. ...................... 62 Figura 17 Escherichia coli en agar EMB.................................................................... 71 Figura 18 Pseudomonas aeruginosa en agar Cetrimide ............................................. 72 Figura 19 Salmonella enterica en agar Hecktoen ....................................................... 72 Figura 20 Staphylococcus aureus en agar Vogel Johnson .......................................... 72 Figura 21 Evaluación de la efectividad antimicrobiana de Alconox frente a Staphylococcus aureus. ............................................................................................... 74 Figura 22 Evaluación de la efectividad antimicrobiana de Alconox frente a Escherichia coli........................................................................................................... 75 XI 177 Figura 23 Evaluación de la efectividad antimicrobiana del alcohol isopropílico y Alconox frente a Escherichia coli. .............................................................................. 76 Figura 24 Evaluación de la efectividad antimicrobiana del alcohol isopropílico y Alconox frente a Pseudomonas aeruginosa................................................................ 77 Figura 25 Evaluación de la efectividad antimicrobiana del alcohol isopropílico y Alconox frente a Salmonella enterica. ........................................................................ 78 Figura 26 Evaluación de la efectividad antimicrobiana del alcohol isopropílico y Alconox frente a Staphylococcus aureus. ................................................................... 78 Figura 27 Evaluación de la efectividad antimicrobiana del alcohol isopropílico y Alconox frente a Candida albicans. ........................................................................... 79 Figura 28 Método del coeficiente fenólico para Escherichia coli .............................. 81 Figura 29 Método del coeficiente fenólico para Salmonella enterica. ....................... 82 Figura 30 Método del coeficiente fenólico para Pseudomonas aeruginosa. .............. 83 Figura 31 Método del coeficiente fenólico para Staphylococcus aureus.................... 84 Figura 32. Método del coeficiente fenólico para Candida albicans. .......................... 85 Figura 33 Selección de la concentración de materia orgánica. “evaluación de superficies”.................................................................................................................. 87 Figura 34. Resultados de la evaluación de superficie. ............................................... 88 Figura 35. Evaluación de superficies (In Vivo) – Alcohol isopropílico área de manufactura. ................................................................................................................ 90 Figura 36. Efectividad de la limpieza con Alconox. ................................................... 92 Figura 37. Control Microbiológico - Bacterias ........................................................... 94 Figura 38. Control microbiológico – Mohos y Levaduras ......................................... 95 Figura 39. Gráfica de Control Microbiológico – Bacterias, Mohos y Levaduras. ...... 96 Figura 40 Gráfica de control microbiológico en condiciones críticas (bacterias, mohos y levaduras). .................................................................................................. 103 XII 178 INDICE DE TABLAS Tabla 1. Niveles de actividad de los desinfectantes .................................................... 25 Tabla 2 Características de los Desinfectantes ............................................................ 26 Tabla 3 Mecanismos de resistencia intrínsecas de las bacterias a los desinfectantes.44 Tabla 4 Mecanismos de resistencia - Levaduras y Mohos......................................... 46 Tabla 5 Agares Selectivos .......................................................................................... 52 Tabla 6 Concentraciones de Alcohol isopropílico y fenol (empleadas) .................... 56 Tabla 7 Parámetros a evaluar en la evaluación de superficies. .................................. 60 Tabla 8. Distribución del material “Evaluación de superficies” ................................ 60 Tabla 9. Interpretación de resultados. “Evaluación de Superficies”. .......................... 63 Tabla 10 Identificación Microscópica – Coloración de Gram .................................... 71 Tabla 11 Resultados Oxi/Ferm Tube II...................................................................... 73 Tabla 12. Número del coeficiente fenólico ................................................................. 86 Tabla 13. Límite Químico en base al producto anterior.............................................. 98 Tabla 14. Cuantificación del fósforo. Alconox ........................................................... 99 Tabla 15 Resultados Recuento de Bacterias, Mohos y Levaduras – Límite microbiológico. ......................................................................................................... 102 Tabla 16 Recuento de Lactobacillus sp. – Límite microbiológico en condiciones críticas. ...................................................................................................................... 104 179 XIII INDICE DE ECUACIONES Ecuación 1. Número del Coeficiente fenólico ............................................................ 37 Ecuación 2 Número del coeficiente fenólico .............................................................. 57 Ecuación 3 Evaluación de la efectividad de Alconox – Porcentaje de Residuo ......... 65 XIV 180 1. INTRODUCCION Los suplementos nutricionales son definidos como productos naturales compuestos de sustancias bioactivas y que al ser consumidos en una dosis superior a la existente comúnmente en los alimentos, tienen un efecto favorable sobre la salud; estos se encuentran en el mercado en varias presentaciones como cápsulas, tabletas o polvos. En la antigüedad, la humanidad utilizaba partes de animales o plantas para la elaboración de preparados terapéuticos o remedios en búsqueda del alivio a las enfermedades. En América, las culturas indígenas desarrollaron remedios contra enfermedades a lo largo de los siglos; por ejemplo en Perú se utilizó la quina o quinina (alcaloide) para el tratamiento de la malaria. En el siglo XVI, Paracelso, médico naturista suizo, fue el primero en expresar que “la doctrina de los procesos vitales” es química, ya que en durante su estudio puede hallarse la curación de las enfermedades. El sector de la industria nutracéutica es unos de los segmentos de la economía que en la actualidad ha tenido un crecimiento significativo que ha sobrepasado el de la industria farmacéutica y alimenticia, posicionándose como una de las grandes industrias del futuro. Los recientes estudios de mercadeo en los Estados Unidos han demostrado que la industria nutracéutica ha tenido ventas por más de 18 mil billones de dólares en el año 2000, es por esto que las entidades federales de regulación de los Estados Unidos tales como la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), la Agencia de Protección Ambiental (EPA), y la Comisión Federal de Comercio (FTC) se encuentren vigilándola con mayor atención. Por tales motivos es necesario mantener y acogerse a las medidas exigidas por cada de una de ellas; dentro de las cuales se encuentra la implementación de las Buenas Prácticas de Manufactura para Suplementos Alimenticios (Código de Regulación Federal, Capitulo 21 parte 111), en donde uno de sus numerales (subparte G) exige el 1 constante control en cada una de las áreas, superficies, equipos y utensilios que entran en contacto directo con el producto. La evaluación o validación de la limpieza surge de la necesidad de documentar, garantizar y verificar que los procedimientos implementados en la actualidad están cumpliendo con su objetivo específico de reducir de manera constante la suciedad sobre la superficie del equipo, zonas comunes, así como los residuos entre los diferentes productos a un nivel aceptable preestablecido, el cual asegura no ser ningún peligro para el consumidor final (sustancias alergénicas). 2 2. MARCO TEORICO 2.1 Antecedentes en la Industria Nutracéutica Durante años los suplementos nutricionales han sido considerados como alimentos y su industria era diferente a la actualmente conocida. Los procesos y la producción no estaban estandarizados, el saneamiento era inseguro y su distribución era desordenada (Hollenstein, 2007). Por décadas, FDA reguló a los suplementos nutricionales como alimentos en muchas circunstancias, con el fin de asegurar la calidad del producto. En el año 1994 se firmó el Acta de Salud y Educación (DSHEA) en donde los suplementos nutricionales tuvieron sus primeras reglamentaciones las cuales difieren de las de alimentos y medicamentos (Ver Anexo A). Según establece DSHEA, las industrias nutracéuticas son responsables de garantizar que un suplemento nutricional es seguro antes de su comercialización. El acta comisiona a FDA para que sea el organismo regulador de la fabricación de los suplementos nutricionales; FDA solamente es responsable de tomar acciones contra cualquier suplemento que no sea seguro después de que este en el mercado (FDA, 2006). El término de suplemento nutricional o dietético fue definido por el congreso de los Estados Unidos en DSHEA como productos (sin incluir el tabaco) administrados oralmente que contienen un ingrediente nutricional o dietético a fin de complementar la dieta (DHSEA, 1994). En el año 2006 FDA estimó que los ciudadanos americanos gastan más de $8.5 billones de dólares al año en suplementos nutricionales y el mercado mundial está estimado en $60 billones de dólares; la mayoría de los consumidores (74%) concuerdan en que el gobierno debería prestar una mayor atención al control de los suplementos para garantizar su seguridad y eficacia (Crowley et al, 2006). Los productores de suplementos nutricionales no requieren registrar sus productos ante la FDA así como tampoco necesitan su aprobación antes de ser producidos o vendidos. 3 En Junio del año 2007, FDA publicó las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM’s) para suplementos alimenticios - Código de Regulación Federal (CFR), Capitulo 21 parte 111. Estas regulaciones están enfocadas hacia la manufactura, empaque, etiquetado, almacenaje y distribución de los suplementos nutricionales. (FDA/CFSAN, 2008). 2.1 Suplementos nutricionales 2.1.1 Que es un suplemento nutricional? FDA tradicionalmente considera a los suplementos nutricionales o alimenticios (como también se conocen en el mercado), como un producto compuesto por vitaminas, minerales o proteínas con el fin de proveer nutrientes que pueden encontrarse en bajos niveles debido a los malos hábitos alimenticios. La ley de educación y etiquetado para los alimentos (NLEA, por sus siglas en inglés) de 1990 adiciona al término de suplemento alimenticio a las hierbas o sustancias nutricionales similares a estas como el Ginseng (planta aromática China), ajo, aceite de pescado, enzimas, semillas de Physillum, gránulos y mezclas de estos (FDA/CFSAN, 2008). Finalmente, DSHEA establece que un suplemento alimenticio: − Es un producto (además del tabaco) que contiene uno o más de los siguientes ingredientes: vitaminas, minerales, hierbas y otros compuestos botánicos, aminoácidos o concentrados, metabolitos, tejidos de órganos, tejidos de glándulas, constituyentes, extractos o combinaciones de estos ingredientes. − Esta designado para su ingestión en tableta, cápsula, cápsula líquida, gelcaps, forma líquida o en polvo. Pueden también presentarse en forma de barra pero en este caso se debe aclarar en la etiqueta que no representa una comida ni es un reemplazo de esta. − Esta etiquetado como “Suplemento Nutricional – Dietary Supplement”. 4 − No está fabricado para ser utilizado como medicamento. − En la etiqueta se debe aclarar que no es un producto fabricado como reemplazo de una comida. 2.1.1.1 Alergias a los Alimentos - Alimentos Alergénicos La alergia alimenticia es una reacción que presenta el sistema inmunológico, ante el consumo de un alimento o el componente de un alimento (usualmente una proteína) que es reconocido como extraño en el cuerpo. (Alimentación Sana, 2006). Los síntomas de una reacción alergénica no siempre son iguales, y varían dependiendo del mecanismo implicado en la reacción inmune causada por la alergia. Así, existen reacciones inmediatas que se producen al cabo de pocos minutos (mediadas por la Inmunoglobulina E - IgE); síntomas comunes de este tipo de reacciones son: Urticaria, Angioedema (edema localizado en la cara, con hinchazón de párpados, labios, lengua y cierta dificultad para tragar), vómito, tos, asma, anafilaxia (choque alérgico), reacciones diferidas (no mediadas por IgE) que comienzan al menos después de 2 horas de la ingestión del alimento y en ocasiones pueden aparecer al cabo de 24 a 48 horas; este tipo de reacciones únicamente producen síntomas digestivos (diarrea), y tardías que aparecen varios días después de la ingestión del alimento, el síntoma más frecuente en este caso es la dermatitis. (Alimentación sana, 2008) El efecto de las reacciones alergénicas dependen de la fisiología de las personas y de la concentración del o los alergénicos consumidos; algunos pueden causar solamente algún síntoma, otras por el contrario pueden causar hasta la muerte. La concentración de alimento o ingrediente con proteína alergénica es mínima y en general oscila entre los 5 a los 100mg de alergénico consumido (FDA – Food Facts, 2007). Una reacción alérgica a los alimentos incluye tres componentes principales: (Alimentación sana, 2008) 5 1. Contacto con los alérgenos (sustancia que provoca la reacción, casi siempre se trata de una proteína) 2. Inmunoglobulina E (IgE – un anticuerpo del sistema inmunológico que reacciona frente a los alérgenos). 3. Mastocitos (células del tejido) y basófilos (células sanguíneas), que cuando se conectan con los anticuerpos IgE liberan histamina u otras sustancias que causan los síntomas alérgicos. (Alimentación sana, 2008). Aproximadamente el 2% de adultos y cerca del 5% de niños y jóvenes en los Estados Unidos sufren de alergias alimentarias y cada año aproximadamente 30,000 personas acuden al hospital y 150 personas mueren a causa de las reacciones alérgicas. (FDA Food Facts, 2007). En el año 2004 el Congreso de los Estados Unidos aprobó la Ley de Etiquetado de Alérgenos Alimentarios y Protección del Consumidor (FALCPA, con sus siglas en inglés). Con la nueva ley a partir del 1˚ de Enero de 2006, las etiquetas de los alimentos (incluyendo los suplementos nutricionales) deben identificar claramente el origen de todos los ingredientes que sean o se deriven de los alérgenos alimentarios más comunes. (FDA – Food Facts, 2007). Hasta el momento existen más de 160 alimentos que pueden provocar reacciones alérgicas, la nueva ley identifica los ocho alimentos alergénicos más comunes. Estos alimentos ocasionan el 90% de las reacciones alergénicas alimentarias y son las fuentes de las que se derivan otros ingredientes. (FDA – Food Facts, 2007). Los ocho alimentos identificados por la ley son: Leche, Huevos, Pescado, Crustáceos, Frutos secos (Almendras, nueces, pecanas), Maní, Trigo y Soya; estos ocho alimentos y cualquier ingrediente que contenga proteínas derivadas de uno o más de ellos, fueron designados por la ley como “los principales alergénicos alimentarios”. (FDA – Food Facts, 2007). 6 2.2.2 Diagrama de flujo para la fabricación de un suplemento Ver ANEXO B. 2.2.3 Descripción de los equipos utilizados en la elaboración de suplementos 2.2.3.1 Mezcladores o Blenders La función de estas máquinas, como su nombre lo indica, es mezclar las materias primas (secas) para que tengan uniformidad en el producto final; la mezcla se realiza a través de procesos de rotación de la tolva y de un tornillo rotatorio dentro de esta el cual realiza el movimiento de rotación opuesto. Es importante tener en cuenta el tiempo y la velocidad de rotación de la tolva del mezclador así como la fuerza del movimiento rotatorio del tornillo. La velocidad, fuerza y tiempo de homogenización dependen de los ingredientes a mezclar y de cada una de sus propiedades (Keith Machinery Corp., 2008). El diagrama de flujo del Anexo C permite entender el proceso que se realiza en un mezclador. Los mezcladores o “blenders” como son conocidos varían en su tamaño (de 1 a 100 – pies cúbicos) y forma dependiendo del producto que se va a manufacturar. Estos pueden ser: - Blenders en forma de “V” (Figura 1) - Blenders en forma de Cono - Blenders en forma de Trapecio - Blenders Horizontales 7 Tornillo Puerta de entrada e Tolva Puertaa de descargue Figura 1. Blender en n forma de “V”” P Partes Princcipales: (Keith Machineery Corp., 20008) ‐ Motor M ‐ Tolva T o Blennder ‐ Tornillo T rotattorio ‐ Puerta P de enttrada del prooducto ‐ Puerta P de desscargue M Materiales: Acero inoxiidable tipo 304 y Siliconna (Tubo de la l aspiradoraa y sellantes) 2 2.2.3.2 Enca apsuladorass M Máquinas empleadas e p para el llenaado, selladoo y expulsióón de cápsuulas (gelatinna, c celulosa o almidón) de d diferentees tamañoss. Estas mááquinas sonn capaces de s seleccionar, extraer y deesechar automáticamentee las cápsulaas que no cuumplen con las l e especificacio ones. Princippalmente lass encapsuladdoras difierenn entre si poor: la velociddad d llenado, cantidad dee capsulas manufactura de m adas por hoora y tipos de tamaño de c cápsulas. Laa selección de d estas máquuinas dependden de: el tam maño de la compañía, c tiipo d capsulas manufacturaadas y cantiddades promeedio de cápssulas manufaacturada. Enn la de 8 figura 2 se observa una encapsuladora marca Bosch modelo GKF 2500 (NJM/CLI, 2008). Tanque de cápsulas vacías Tanque del producto en polvo Figura 2. Encapsuladora Bosch GFK 2500 Partes Principales: La mayoría de las encapsuladoras modernas se encuentran divididas en cuatro o más partes principales, las cuales cumplen funciones específicas en el proceso de llenado de las cápsulas; estas partes son: 1. Tanques de almacenamiento para las cápsulas vacías y recepción del producto en polvo procedente del blender. 2. Torre o Turret con segmentos para la recepción de cápsulas vacías. 3. El proceso de llenado (estación de estructura) se encuentra subdividido en: • Estación de limpieza de los segmentos de recepción. • Apertura de las cápsulas vacías con aire comprimido • Llenado – Según el peso establecido para cada cápsula • Cierre • Verificación (las cápsulas defectuosas en este proceso son descartadas por la máquina). 9 • Expulsión de cápsulas. 4. Selección de las cápsulas por peso promedio (deduster) En el anexo D se observa el diagrama de flujo para la obtención de una cápsula (Suplemento alimenticio) en las máquinas Bosch y Zanasi 40F. Material: Acero inoxidable tipo 304, silicona y aluminio. 2.2.3.3 Tableteadoras Estas máquinas son utilizadas para fabricar tabletas de distintas formas y tamaños dependiendo del molde y los ponches que se instalen; el procedimiento se realiza mediante la pre-compresión y compresión de la mezcla proveniente del blender, que resulta en la formación de una tableta compacta la cual debe cumplir estrictas características físicas como: dureza, tiempo de desintegración, friabilidad y peso promedio. Es importante establecer previamente el peso de cada tableta así como la fuerza de pre-compresión y compresión. La selección de estas máquinas se debe realizar basados en las mismas características de las encapsuladoras. En las figuras 3a y 3b se observa una tableteadora marca JCMCO modelo JC-SH 31D (JCMCO, 2008). Contenedor de entrada del polvo Ponches Compresores 3a 3b Figura 3 - 3a. JCMCO modelo JC – SH31D; 3b. Compresores y ponches 10 Partes Principales: ‐ Ponches ‐ Moldes ‐ Plataforma bascula ‐ Torre ‐ Contenedor de polvo (Hopper) ‐ Feed Frame (Dispensador de producto en polvo a la torre). Material: Acero inoxidable tipo 304. 2.2.3.4 Recubrimientos y pinturas Estas máquinas son el paso final de las tabletas antes de ser llevadas a la presentación final al consumidor. El material de recubrimiento debe presentar ciertas características: (Universidad de Antioquia, 2008) ‐ Debe ser estable durante el almacenamiento. ‐ Debe producir un recubrimiento uniforme. ‐ No debe ser tóxico. ‐ No debe ser reactivo. A su vez las tabletas deben tener unas condiciones específicas: ‐ Baja friabilidad. ‐ Velocidad de disolución rápida. ‐ No deben ser porosas. ‐ Deben poseer una dureza que permita su manipulación. ‐ Deben ser los suficientemente impermeables para que no absorba los solventes utilizados en el recubrimiento. 11 Los recubrimientos de las tabletas se clasifican en dos categorías: recubrimiento por azúcar, y recubrimiento por película (entérica y no entérica). El recubrimiento azucarado consiste en cubrir las tabletas en numerosas capas de azúcar, generalmente sacarosa y resinas como: zeína, bálsamo, talato-acetato-celulosa y Shellac (laca purificada – secreción roja del insecto Laccifer lacca kerr). Alguno de los componentes son utilizados para: liberación controlada del principio activo, mejoramiento de la apariencia, enmascaramiento de sabores y olores desagradables, protección para el suplemento de la descomposición producida por el oxígeno o la humedad. (Universidad de Antioquia, 2008) El recubrimiento por película tiene las mismas funciones que el recubrimiento azucarado, además también se usa para evitar la destrucción del suplemento a pH acido o por enzimas estomacales y para la liberación continua del suplemento. Este recubrimiento se realiza cubriendo las tabletas con una o más sustancias naturales o sintéticas como diluyentes, azúcares, plastificantes, resinas, gomas, alcoholes polihídricos, ceras y agentes saborizantes. Actualmente, se utilizan polímeros hidrosolubles (CMC, HEC, PE) y otros como dietilaminocelulosa y poliésteres sustituidos; los recubrimientos difieren con respecto al tiempo necesario para la liberación del producto. (Universidad de Antioquia, 2008) Para realizar un buen proceso de recubrimiento es necesario tener en cuenta la mezcla de pinturas para obtener el color deseado así como la reacción que esta mezcla pueda tener frente a los ingredientes de las tabletas. Por esto, siempre se recomienda realizar lotes piloto y pruebas de estabilidad. El proceso de recubrimiento de las tabletas se observa en el diagrama de flujo en el anexo F; a continuación la figura # 4 se observa un equipo de recubrimiento marca Vector modelo VHC-5811 (Freund Vector, 2008). 12 Figura 4 Vector Hi – Coater. Modelo VHC - 5811 Partes Principales: - Contenedor principal - Aspersores - Entrada y salida de Aire Materiales: Acero inoxidable tipo 306 en el contenedor principal, el resto de material es acero inoxidable tipo 304 y silicona. 2.2.3.5 Equipos y Utensilios complementarios Además de los equipos anteriormente mencionados, existen otro tipo de máquinas que directamente se encuentran relacionadas con la fabricación del producto. Son utilizadas cuando el polvo pre mezclado o alguna materia prima no cumplen con las características físicas requeridas para su producción, por ejemplo los molinos, que son utilizados cuando un producto posee partículas de gran tamaño que dificultan la fabricación, la máquina disminuye el tamaño de las partículas haciendo que estas se transformen en partículas más finas en un proceso conocido como pulverización o molienda el cual mejorar la homogenización, mejorar el flujo del polvo en la máquina (tableteadora o encapsuladora) y ajustar el color (Quiminet, 2003). 13 Igualmente, existen procesos que se encargan de realizar la acción contraria a la pulverización, como la granulación por vía húmeda que consiste en la adición de alcohol (50 - 80%) al producto en polvo para la formación de gránulos (compactación del material) y el eslogado o granulación por compresión que consiste en comprimir el polvo y molerlo para la elaboración de partículas de mayor tamaño. (Quiminet, 2003) Asimismo se deben tener en cuenta las herramientas manuales (palas de acero inoxidable) utilizadas por los operarios para la adición de producto a las máquinas o para el peso de cada uno de las materias primas que van a formar el producto (Groover, 1997). 2.3 2.3.1 Regulaciones para la manufactura de suplementos. Buenas Prácticas de Manufactura (BPM’s) – Código de Regulación Federal, Capitulo 21 parte 111 Ver Anexo G 2.4 Control de calidad de los suplementos Nutricionales El control de calidad de los suplementos nutricionales se encarga de garantizar que los productos manufacturados cumplan con las especificaciones con respecto a su identidad, pureza, calidad, potencia y composición (Crowley, 2006). El grupo de control de calidad también está encargado de la toma y recolección de muestras, todas las medidas tomadas por el departamento de calidad deben estar debidamente documentadas. El departamento de calidad y el laboratorio deben trabajar juntos en un solo equipo para garantizar que el producto cumple con las especificaciones físicas, químicas y microbiológicas requeridas. Las siguientes son 14 las características que el equipo de calidad junto con el laboratorio deben tener en cuenta según las BPM’s para garantizar la calidad de los suplementos nutricionales: (Crowley, 2006). a. Olor b. Sabor (si aplica) c. Potencia d. Identidad e. Microbiología f. Tiempo de desintegración g. Variación en el color h. Tamaño de la tableta i. Empacado y/o etiquetado erróneo. Lo más importante que se debe tener en cuenta para mantener un eficiente control microbiológico es: (Wirtanen, 2003) − Minimizar la carga microbiana que puede llegar por fuentes externas. − Control eficiente del crecimiento microbiano en zonas vulnerables (Puntos Críticos) − Limpieza y desinfección adecuada de los materiales utilizados durante el proceso. 2.5 Establecimiento de Límites para la Industria Nutracéutica Para el establecimiento de límites de aceptación se pueden tomar como guía los parámetros que se siguen regularmente en la Industria Farmacéutica. Estos parámetros son: (Fourman et al, 1993). − Realizar una lista de todos los productos que son manufacturados en la compañía − Por cada producto identificar: 15 − Tamaño de Lote − Número de unidades por lote (miles de tabletas o capsulas por ejemplo). − Menor tamaño manufacturado − Máxima dosis diaria − Área de contacto del producto sobre la superficie del equipo. En el caso de una industria nutracéutica donde los controles no son tan rigurosos y se manufacturan numerosos tipos de suplementos, es conveniente usar un solo limite o agrupar los productos según la similitud que presenten sus ingredientes y continuar con los parámetros mencionados, generalizando en todos los aspectos como si se tratara de un solo producto (Agalloco, 1992). 2.5.1 Toma de muestras Saber cómo y de donde se deben tomar las muestras para verificar los límites de aceptación es un parámetro fundamental en la validación de un proceso de limpieza, algunos de los métodos de toma de muestra son: (Agalloco, 1992). − Muestro con escobillón en aéreas abiertas − Muestreo con escobillón en aéreas cerradas − Producto Placebo − Examinación Visual − Extracción de solvente 2.5.1.1 Métodos Analíticos Los métodos analíticos son desarrollados para asegurar que los ingredientes y suplementos cumplan las especificaciones a lo largo de los procesos de manufactura y 16 distribución, para de esta manera confirmar que las cantidades señaladas en las etiquetas de los suplementos nutricionales son reales (Crowley, 2006). Las muestras deben poder ser cuantificadas por métodos analíticos validados, ya sean cualitativos o cuantitativos. El uso de más de un método analítico es útil para la confirmación de los resultados. Los métodos más utilizados son: (Agalloco, 1992). − Métodos específicos (Por cada ingrediente del producto): Utilizando adaptaciones del método de identificación rutinario del producto se selecciona la técnica más sensible con el nivel de detección más específico para verificar concentraciones que se que se pueden presentar después de un proceso de limpieza. Estos métodos deben estar validados. Algunos de los métodos analíticos específicos son: (FDA, 2005) − HPLC − Absorción atómica − Fotometría de Flama − Detección enzimática − Titulación − Métodos inespecíficos: cuantificación de Carbono Orgánico Total (TOC): Este método solamente identifica los carbonos orgánicos, no identifica residuos específicos por lo que se hace difícil la cuantificación. Es conveniente complementar esta técnica con un método específico para un determinado ingrediente del producto. Otros métodos inespecíficos son: − pH − Conductividad. − Métodos sensoriales, organolépticos. 17 La FDA recomienda los métodos específicos para la cuantificación de residuos (FDA, 2005). 2.5.1.2 Criterios de Límites de Aceptación. Límite Físico También se conoce como “Criterio de limpieza Visual” o “Visualmente Limpio” Generalmente se utiliza como revisión preliminar del equipo una vez se realiza el proceso de limpieza. No debe existir ninguna cantidad visible de residuos después de la limpieza. En el caso de identificarse algún residuo se debe tomar una muestra para su posterior análisis (Fourman et al, 1993). Límite Químico Una vez cuantificados los residuos por los métodos anteriormente mencionados, se debe establecer el criterio por el cual van a ser evaluados, entre los criterios más utilizados se encuentran: (Agalloco, 1992). − Menor porcentaje de la dosis terapéutica (Lowest Therapeutic Dose - LTD): entre 0.01 a 10% de ingrediente activo puede ser identificado tras un análisis con un método analítico. − Porcentaje de dosis tóxica: Es utilizado para sustancias no activas pero tóxicas como los detergentes, sanitizadores, desinfectantes etc. Son generalmente más amplios que los límites LTD, y se deben establecer con base en los análisis de toxicidad como LD50. − Partes por millón y partes por billón: Algunos métodos analíticos proveen resultados en estas unidades. Para saber la cantidad real es necesario relacionar estos datos con la dosis terapéutica o la dosis toxica. Un límite bien conocido y 18 aceptado por la FDA es el de “no más de 10 ppm” después del proceso de limpieza (LeBlanc, 1998). − Aunque se pueden utilizar uno o más de los criterios mencionados, para el caso de los suplementos nutricionales se recomiendan dos criterios de aceptación: El primero es con respecto a los productos que no presentan ningún riesgo (inocuos) es de 1/100 y el segundo es para los productos que poseen ingredientes tóxicos y/o alergénicos de 1/10000 (Frey, 2006). Límite Microbiológico El límite microbiológico es establecido bajo el criterio de una reducción: logarítmica en la concentración de UFC. En el caso de los microorganismos que se encuentran en una suspensión el límite es de una reducción mínima de cinco unidades logarítmicas. Si se encuentran adheridos a una superficie el límite será la reducción de mínimo tres unidades logarítmicas. Es por esto que las muestras para evidenciar los límites microbiológicos deben tomarse antes y después de realizado el proceso de limpieza (Wirtanen, 2003). − Finalmente la ausencia de los microorganismos patógenos: Escherichia coli Salmonella sp, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa (FDA – The “bad bug” book, 2008). Seis pasos simples son sugeridos por FDA para realizar un control de calidad después de la limpieza de los equipos, estos pasos consisten en: (FDA, 1993). − Aplicar el concepto de visualmente limpio “Visualmente limpio” − Tomar muestras si se observan residuos después de la limpieza utilizando alguno de los métodos anteriormente mencionados. − Tomar muestras para el recuento microbiológico y la cuantificación residual. − Cuantificación de muestras por métodos analíticos. 19 − Recuento de microorganismos – Ausencia de patógenos − Comparar los resultados con los límites de aceptación. 2.6 Agentes Antimicrobianos Según EPA, son sustancias o mezclas de sustancias utilizadas para inhibir o eliminar el crecimiento de cualquier tipo de microorganismo incluyendo esporas bacterianas. Los principales usos de los agentes antimicrobianos son: (EPA, 2008) − Desinfectar, sanitizar, reducir o mitigar el crecimiento y desarrollo de microorganismos. − Proteger los objetos inanimados, procesos o sistemas industriales, superficies, agua u otras sustancias químicas de contaminación, suciedad, desgaste y deterioro causado por bacterias, virus, mohos, protozoos, algas o biofilms. En la actualidad existen dos grupos de productos Antimicrobianos: (EPA, 2008) − Productos que no son de salud pública son utilizados especialmente para inhibir el crecimiento de: a. Algas. b. Bacterias que causan el mal olor. c. Microorganismos que deterioran, degastan y destruyen los materiales d. Microorganismos patógenos para humanos. Estos productos son utilizados en: Pintura, tratamientos textiles, torres de enfriamiento. − Productos de salud pública son utilizados para controlar los microorganismos infecciosos en cualquier ambiente. Los productos comúnmente utilizados se pueden clasificar de la siguiente manera (EPA, 2008). 20 − Esterilizantes Son utilizados para destruir y eliminar todas las formas de vida microbiológica, incluyendo: mohos, virus, todas las formas de bacterias vegetativas y sus esporas. La esterilización es importante para prevenir la aparición de infecciones; es ampliamente utilizada con los instrumentos médicos y quirúrgicos de los hospitales, así como en las industrias alimentarias. La esterilización se puede realizar por métodos físicos o químicos (EPA, 2008). Los métodos físicos no son utilizados en la industria nutracéutica debido que estos pueden alterar las propiedades del producto final, sin embargo en algunos casos es usada la radiación ionizante (rayos gamma) sobre los productos terminados que presenten algún tipo de contaminación microbiológica. Dentro de los métodos físicos se incluyen: (USP/NF, 2007). − Vapor bajo presión (Autoclave) − Calor Seco y Húmedo − Bajar temperaturas − Presión osmótica − pH Los métodos químicos incluyen sustancias altamente tóxicas para los microorganismos (incluyendo esporas bacterianas) estos esterilizantes son: (USP/NF, 2007). − Glutaraldehídos - en una solución acuosa al 2% v/v − Oxido de Etileno – Inactiva enzimas y otras proteínas que poseen grupos sulfhidrilos, mediante la reacción llamada alquilación. 21 − Desinfectantes y Sanitizantes – Agentes de limpieza. Según FDA un sanitizante es un agente químico o físico el cual reduce los niveles de contaminación microbiana en una superficie inanimada, EPA señala que los sanitizantes también son utilizados para reducir, pero no necesariamente eliminar microorganismos de áreas inanimadas a niveles que se consideren seguros por los códigos o regulaciones de salud pública (Luppens, et al. 2002; Springthorpe, et al. 2005) Por otra parte, FDA considera que un desinfectante es un agente químico que elimina microorganismos indeseables de superficies inanimadas, EPA completa esta definición especificando que un desinfectante es un agente químico utilizado en superficies inanimadas cuyo objetivo es destruir o inactivar de forma irreversible mohos y bacterias, pero no necesariamente sus esporas (Luppens, et al. 2002; Springthorpe, et al. 2005). El titulo 7 del Código de los Estados Unidos (acta federal de insecticidas, fungicidas, y rondenticidas FIFRA por sus siglas en ingles) ordena que los desinfectantes deben estar registrados con EPA para su venta y distribución (Martínez, 2006). Un desinfectante debe eliminar por lo menos un 99.999% (5 unidades logarítmicas) de patógenos bacterianos en un tiempo de 5 a 10 minutos, no necesariamente destruye bacterias esporo formadoras o virus. Las características que un desinfectante debe tener son: (Reynols, 2002; Fraise, 1999) − Amplio espectro de acción frente a los microorganismos − Baja toxicidad − Alta penetrabilidad − Estabilidad (Tiempo de almacenamiento) − Solubilidad (agua) − Compatibilidad con detergentes (Sinergismo) 22 − Inoloro − No corrosivo. − No debe desteñir. − Rápida acción En la actualidad existen varios tipos de desinfectantes los cuales difieren en su composición y propiedades. Los tipos de desinfectantes pueden ser orgánicos o inorgánicos. − Desinfectantes Inorgánicos. Los desinfectantes inorgánicos son: (Mac Donell, 1999) − Metales: Dentro de los cuales se destacan mercurio, plata, bronce y zinc al desactivar las proteínas mezclándose con ellas, también alteran los grupos funcionales de los ácidos nucléicos, componentes de la pared y membrana. − Ácidos y Álcalis: Se destacan el acido sulfúrico, el acido nítrico, el hidróxido de sodio y hidróxido potásico. Tienen como función alterar la permeabilidad de la membrana y la coagulación de proteínas. Son bactericidas, fungicidas, virucidas y esporocidas. Son corrosivos. − Compuestos inorgánicos oxidantes: Poseen acción bactericida, fungicida, micobactericida y virucida, algunos son corrosivos como el acido per-acético. Sus mecanismos de acción incluyen la inactivación de proteínas enzimáticas y de membrana; los compuestos de mayor tamaño pueden alterar los radicales amino, el grupo indol y la tirosina. Algunos de los compuestos inorgánicos oxidantes más importantes son: a. Agua oxigenada: Como el agua oxigenada al 6% v/v, funcionan oxidando los componentes de la membrana y las enzimas b. Halógenos: Son compuestos altamente oxidantes, reactivos y destructivos con los componentes vitales de los microorganismos. Algunos de estos 23 compuestos son el cloro y el iodo funcionan oxidando las proteínas, membranas y enzimas de los microorganismos. − Aldehídos: Su actividad se debe a la alquilación de sulfhídrilos y otros grupos funcionales que causan alteración a proteínas y ácidos nucleídos, poseen acción bactericida, fungicida, micobactericida, virucida y esporocida. Son cancerígenos y están clasificados como químicos esterilizantes (Fraise, 1999). − Desinfectantes Orgánicos Los desinfectantes orgánicos son: (MacDonell, 1999) − Alcoholes: Los alcoholes solubilizan la membrana celular y desnaturalizan las proteínas, tienen actividad bactericida, no son corrosivos pero si inflamables; tienen una actividad residual limitada debido a su tasa de evaporación y proveen una actividad limitada en presencia de materia orgánica; además, no se consideran efectivos frente a esporas de mohos y bacterias. (Chemical disinfectant, 2008) La acción bactericida mejora a medida que la longitud de la cadena carbonatada aumenta incluso aquellos con ocho y diez átomos de carbono (C8 –C10); los alcoholes de cadenas más largas de C10 disminuyen la solubilidad en el agua lo que conlleva a la perdida de la acción. (Chemical disinfectant, 2008) El Alcohol isopropílico (60 – 90% v/v) está registrado en EPA con el código CAS# 67-63-0 y se conoce también como: 2-Propanol, Isopropanol, Dimetil Carbinol o Sec-propil Alcohol. Su temperatura de ebullición es de 87°C y su punto de ignición es de 25°C. Debe evitar utilizarse en zonas donde exista riesgos de chispas; de igual forma no se debe utilizar a elevadas temperaturas ni se debe exponer a una llama abierta (EPA, 1999). Es un desinfectante excelente por su rápida acción y por no dejar residuos químicos sobre las superficies, sin embargo 24 la acción de este desinfectante disminuye cuando es diluido por debajo de un 50% v/v en una solución con agua; no es considerado como un desinfectante de alto nivel debido a que no inactiva esporas de bacterias ni algunos virus, sin embargo son efectivos frente a VIH. Para su almacenamiento es necesaria un área fría y ventilada debido a que es inflamable. (Chemical disinfectant, 2008). Sus ventajas son: Rápida acción bactericida, no es corrosivo con el metal, económico, no deja residuos químicos que requieran un enjuague posterior. Sus desventajas son: Rápida evaporación Inactivación en presencia de materia orgánica que se puede dar por la adsorción del desinfectante a coloides de proteínas, formación de complejos inertes o poco activos y unión de grupos activos del desinfectante a proteínas extrañas (Chemical disinfectant, 2008). A continuación (tabla 1) se observan los niveles de actividad de los desinfectantes en donde se clasifica a los alcoholes en un nivel intermedio (Russell, 1998). Tabla 1. Niveles de actividad de los desinfectantes − Fenol y compuestos fenólicos: El fenol (acido carboxílico) fue el primer desinfectante usado por Joseph Lister en 1867, en la actualidad no es utilizado 25 como desinfectante debido a su toxicidad, debido a esto es reemplazado por compuestos fenólicos que son sustancias derivadas del fenol menos toxicas y con mayor actividad frente a los microorganismos. Se caracteriza por ser bactericida, fungicida y micobactericida; el fenol y los compuestos fenólicos alteran la permeabilidad de la membrana citoplasmática, desnaturalizan las proteínas de los microorganismos (forma vegetativa) e inactivan las oxigenasas y deshidrogenasas de la membrana. (Fraise, 1999) − Amonios Cuaternarios: Son utilizados como desinfectantes y antisépticos, son tensoactivos (sirven como detergentes), efectivos para inhibir el crecimiento de bacterias Gram positivas y Gram Negativas, aunque estas últimas en menor proporción. Son bactericidas, fungicidas y virucidas; la actividad se desarrolla tanto sobre medio ácido como alcalino, aunque en éste último tiene mejor acción. Se inactivan fácilmente en presencia de materia orgánica (Quiminet, 2006) Actúan extracelularmente incrementando la permeabilidad de la bicapa lipídica, con la consecuente pérdida de los componentes citoplasmáticos. Además, atraviesa la pared celular cargada negativamente reduciendo la perdida de potasio y provocando la desnaturalización de proteínas. (Fraise, 1999). La tabla # 2 muestra el efecto de los desinfectantes más conocidos sobre la mayoría de los microorganismos y en el anexo H se nombran las ventajas y desventajas de algunos desinfectantes (Wirtanen, 2003). Tabla 2 Características de los Desinfectantes Agente Químico Acción Etanol (50-70%) Denatura proteínas solubiliza lípidos y Antiséptico utilizado en la piel o en superficies Isopropanol (50-70%) Denatura proteínas solubiliza lípidos y Antiséptico utilizado en la piel o en superficies Usos 26 Agente Químico Acción Usos Tintura de Yodo (2% I2 en Inactiva proteínas 70% alcohol) Antiséptico utilizado en la piel Nitrato de plata (AgNO3) Antiséptico general y utilizado en los ojos de recién nacidos Cloruro (HgCl) de Precipita proteínas mercurio Inactiva proteínas por Desinfectante. En reacción con los grupos ocasiones utilizado como sulfuro componente en antisépticos para la piel. Detergentes Ruptura de celulares Compuestos fenólicos Denatura proteínas y Antisépticos a rompen las membranas concentraciones, celulares desinfectantes en concentraciones Oxido de etileno membranas Leve efecto desinfectante y antiséptico para la piel. Agente alquilante bajas altas Desinfectante utilizado para la esterilización de objetos sensibles al calor como goma y plásticos. − Detergentes Se conocen con el nombre de Detergentes o Agentes tensoactivos a las sustancias que disminuyen la tensión superficial y de superficies límites del agua, actuando así como agentes humectantes, emulsionantes, dispersantes y adsorbentes. Pueden ser desde agua pura hasta soluciones con detergentes y otras sustancias llamadas aditivos que ayudan a la remoción del sustrato. Los limpiadores acuosos están disponibles en polvo o en líquidos concentrados. Este tipo de limpiadores es el que se usa para la limpieza de metales, ya que estos son capaces de eliminar residuos orgánicos e 27 inorgánicos de las superficies sólidas, así como: partículas, películas, aceites ligeros, disolventes y otros tipos de limpiadores resultantes del proceso de fabricación. Los agentes limpiadores usan una combinación de propiedades físicas y químicas para eliminar contaminantes de sustrato (Procter & Gamble, 2005). Los agentes limpiadores acuosos ofrecen una variabilidad en su aplicación, ya que su rendimiento depende de la medida de su formulación, dilución y temperatura. Los limpiadores acuosos ácidos o alcalinos pueden tener ciertas desventajas como el hecho de atacar las superficies metálicas. Por eso con frecuencia se añaden aditivos a estos agentes con el fin de minimizar los efectos adversos, otra desventaja es que su consumo de agua es mayor y el proceso de secado puede prolongarse por más tiempo (Procter & Gamble, 2005). Las propiedades que los agentes limpiadores poseen son: (Procter & Gamble, 2005). 9 Humectación: Se entiende como la capacidad de mojar más, es decir una misma gota de agua es capaz de abarcar una mayor superficie de contacto. 9 Penetración: Como la palabra lo indica, es la capacidad de penetrar o introducirse en las superficies porosas sucias o en la suciedad. 9 Emulsión: Es la dispersión o suspensión de finas partículas de uno o más líquidos en otro líquido. Por ejemplo el aceite o grasa en agua. 9 Suspensión: Consiste en dejar la suciedad o partículas de suciedad en solución, evitando que estas se vuelvan a re depositar. Los ingredientes que pueden incluir los agentes limpiadores son: a. Detergentes alcalinos Estos se caracterizan por poseer ingredientes altamente alcalinos como el hidróxido de sodio (soda caustica) o el hidróxido de potasio (potasio caustico). Una de las grandes ventajas que brindan este tipo de detergentes es la emulsificación de las grasas y alteración en los enlaces de las proteínas. 28 Para inhibir la corrosión por el detergente se agrega a la formula silicatos que son sales que impiden el desgaste del metal. Estos detergentes solo son utilizados en las industrias de alimentos (Chemestry and New Zealand, 2007). b. Detergentes ácidos Estos pueden ser tanto orgánicos como inorgánicos; los ácidos inorgánicos más utilizados son: fosfórico, nítrico, sulfámico, sulfato ácido de sodio y el clorhídrico y entre los ácidos orgánicos están el ácido hidroxiacético, cítrico y glucónico. El mecanismo de acción de estos detergentes, es por reacción química de los ácidos sobre la superficie disolviendo las partículas adheridas a ella. c. Solventes Se usan para darle volumen y diluir las formas peligrosas de detergentes. Por ejemplo los álcalis fuertes suelen diluirse con rellenos con el fin de hacer más fácil su manipulación. El agua es utilizada como principal relleno y para soluciones en polvo se usa el cloruro y/o sulfato sódico (Chemestry and New Zealand, 2007). d. Acondicionadores acuosos Previenen la acumulación de diversos minerales que pueden inactivar la acción del agente limpiador. Estos iones son los mismos que le confieren la dureza al agua (Calcio y Magnesio), la función entonces de los acondicionadores acuosos es la de formar complejos solubles con estos iones para permitir la acción normal del agente limpiador. Algunos de estos acondicionadores son: gluconato sódico y el acido etildiaminotetraacetico. (Chemestry and New Zealand, 2007). e. Surfactantes Los surfactantes son el grupo más importante dentro de la composición de un detergente. Un surfactante reduce la tensión superficial del agua cuando es utilizado en bajas concentraciones. Un surfactante consta de dos partes moleculares: parte soluble (hidrofílica) e insoluble (hidrofóbica). (Chemestry and New Zealand, 2007). 29 La parte hidrofóbica es una cadena carbonada de 8 a 18 carbonos, que puede ser alifática, aromática o ambas, esto confiere la hidrofobicidad a la molécula; las cadenas suelen ser grasas naturales, aceites, fracciones de petróleo, polímeros sintéticos pequeños o alcoholes sintéticos de peso molecular considerable. La parte hidrofílica es la que clasifica al surfactante, entre: aniónicos, catiónicos y no iónicos. Los aniónicos son los surfactantes carboxilados, sulfatados o fosfatados; los catiónicos son producto de las aminas. Finalmente, los no iónicos se asocian al agua que está enlazada por enlaces éter a una cadena de poli etilenglicol, en este caso la parte hidrofílica terminal de la molécula se enlaza mejor y más fuerte con la molécula de agua. (Chemestry and New Zealand, 2007). − Surfactantes aniónicos En una solución con agua, la parte hidrofílica de un surfactante tiene una carga negativa; estos detergentes son efectivos en cuanto a la remoción de aceites en superficies, debido a que pueden reaccionar con la carga positiva de los iones del agua, por lo tanto cualquier ion puede afectar la efectividad del surfactante; entre mayor sea la dureza del agua, es decir, mas iones de calcio o magnesio allá en la solución, el surfactante aniónico puede ser desactivado. Para prevenir la pérdida del efecto del surfactante dentro del detergente existen otras sustancias, las cuales capturan los iones de magnesio y calcio presentes dentro de la solución. Los detergentes aniónicos más comunes son los alquil sulfonatos, alquil etoxilatos y jabones; son utilizados para la limpieza en las industrias farmacéuticas, alimenticias y nutracéuticas (Procter & Gamble, 2005). Las figuras 5a, 5b y 5c muestran los diferentes tipos de Surfactantes aniónicos. 30 Figura 5. A. Alquil éter sulfato; B. Alquil sulfato Linear; C. Ácidos grasos y jabones. ‐ Surfactantes catiónicos En soluciones acuosas la parte hidrofílica está cargada positivamente. Existen 3 posibles usos de surfactantes catiónicos: ‐ En los suavizantes y los detergentes que tienen suavizantes usan surfactantes catiónicos. ‐ En los detergentes de lavadora los surfactantes catiónicos mejoran la capacidad de los surfactantes aniónicos de encapsular partículas de suciedad, ya que reduce la tensión interfacial entre el agua y la suciedad. ‐ Poseen propiedades desinfectantes y sanitizadores, por lo que son utilizados en las sustancias limpia baños (Procter & Gamble, 2005). Las figuras 6a y 6b son algunos ejemplos de surfactantes catiónicos: 31 Figura 6 Surfactantes catiónicos: A. Esquerato; B. Amonio cuaternario; C. Surfactante no iónico: − Surfactantes no-iónicos (Figura 6c) No poseen carga y esto hace que la dureza del agua no afecte al detergente, son excelente removedores de grasa. La mayoría de los detergentes contienen tanto surfactantes aniónicos como no-iónicos, los surfactantes no-iónicos más comunes son los éteres de los alcoholes grasos (Procter & Gamble, 2005). Finalmente, en la figura # 7 se observa la eficacia de algunos agentes de limpieza sobre una determinada población microbiana. Figura 7 Eficacia de los agentes de limpieza (concentración microbiana vs tiempo de exposición) 32 2.6.1 Factores que influyen en la actividad de los antimicrobianos Ver ANEXO I. 2.7 Mecanismos de evaluación de los desinfectantes. Con el fin de obtener el registro ante la EPA, en el acta FIFRA se encuentran las guías para la evaluación de los desinfectantes (considerados como pesticidas), las cuales establecen que se deben realizar pruebas de efectividad del desinfectante mediante métodos utilizados por la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (AOAC) para poder obtener el registro. Las pruebas que se reportan son: Pruebas soporte (Carrier test), y de dilución de uso (Use-Dilution) para evidenciar la actividad bactericida, micobactericida, y esporocida; estas pruebas se conocen como “Pruebas de efectividad de los desinfectantes” o DET's por sus siglas en ingles (Martínez, 2006). En resumen si se utiliza un desinfectante que este registrado con EPA, este ya se encuentra evaluado. La concentración recomendada, espectro de acción, condiciones y tiempo de exposición ya han sido establecidos. Cuando el desinfectante es preparado in situ es necesaria una calificación la cual es equivalente a las pruebas realizadas para el registro ante la EPA. Recientemente en el año 2007, la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) expidió la sección <1072> “Antisépticos y Desinfectantes” en la cual se detalla la metodología que puede desarrollarse para realizar la evaluación de la efectividad de los desinfectantes; las pruebas que la farmacopea sugiere son el coeficiente fenólico 33 (pruebas en suspensión) y la dilución de uso (pruebas carrier), las cuales están incluidas dentro de los DET’s (Martínez, 2006). Sin embargo, estas no son las únicas pruebas que se deben realizar a los desinfectantes. Los DET’s no representan las condiciones de uso real, además existen grandes dificultades para DET’s en cuanto a su repetibilidad y a su reproducibilidad de resultados (Reyboruck, 1998). En estas no se toma en cuenta el proceso de limpieza completo; es por esto que la toma de muestras después de un proceso de limpieza y desinfección in vivo asegura tanto la efectividad real del desinfectante como del mismo proceso de limpieza (Martínez, 2006). Los DET’s se dividen en tres: pruebas en suspensión, pruebas soporte “Carrier” y desinfección de superficies. Para brindar seguridad en cuanto a la eficacia de un desinfectante es conveniente realizarle los 3 tipos de estudios (Reyboruck, 1998). 2.7.1 Pruebas en suspensión Existen diferentes tipos de pruebas en suspensión: Las pruebas en suspensión cualitativas, el método del coeficiente fenólico y las pruebas en suspensión cuantitativas. Todas tienen en común el siguiente procedimiento: un volumen apropiado de suspensión bacteriana es adicionado a una concentración determinada de una solución de desinfectante. Después de un tiempo prudente de exposición la muestra es examinada para evidenciar si la suspensión bacteriana fue inhibida o no. Los resultados cualitativos se dan como crecimiento o no crecimiento. Mientras que para las pruebas en suspensión cuantitativas se procede a realizar recuentos para identificar el efecto microbiocida (Microbiocidal Effect, ME), para que un desinfectante apruebe un test de suspensión cuantitativa de haber inhibido por lo menos al 99.999% de los microorganismos lo que equivale a la reducción de 5 unidades logarítmicas (Reybrouck, 1998). 34 2.7.1.1 Dilución en tubo Se realizan diferentes soluciones del desinfectante. El mismo volumen de cada dilución se adiciona en tubos estériles, a cada tubo se le añade la misma cantidad de una suspensión del microorganismo utilizado como prueba. A determinados intervalos de tiempo se transfiere un alícuota de cada tubo a otro que contenga medio de cultivo. Estos tubos inoculados se incuban a la temperatura y crecimiento óptimo de crecimiento según el microorganismo. Al cabo de este tiempo se examina el crecimiento del microorganismo mediante la aparición o ausencia de turbidez en el tubo (crecimiento positivo o negativo). Aquellos tubos que presentan crecimiento negativo indican la dilución a la cual ese agente químico inhibe al microorganismo prueba. El control de la prueba se realiza con agua estéril siguiendo el mismo procedimiento (Rojas, 2001). Una complementación de esta técnica es el aislamiento e identificación de una muestra representativa de los tubos positivos con el fin de confirmar que el crecimiento pertenece al microorganismo estudiado y descartar una posible contaminación que altere los resultados promoviendo la aparición de resultados falsos negativos respecto a la presencia de turbidez (Reybrouck, 1998) Por otra parte también es importante tener en cuenta las propiedades del o de los desinfectantes en el momento de realizar la transferencia al tubo con medio de cultivo ya que la acción bactericida de algunos desinfectantes puede continuar aun después de haber realizado la transferencia al tubo a incubar lo que prolongaría el tiempo de exposición; si el desinfectante se inactiva por dilución (como el alcohol ) el procedimiento y los resultados pueden ser confiables, pero si por el contrario no se inactiva por dilución (que es lo que se realiza al momento de la transferencia), se debe realizar una pre-transferencia a un medio neutralizante (MN) los cuales tienen compuestos que inactivan la acción bactericida del o los desinfectantes permitiendo 35 de esta forma obtener resultados reales de la prueba evitando los resultados falsos negativos (Sutton, et al, 2002). 2.7.1.2 Sensibilidad antimicrobiana (Kirby-Bauer) La sensibilidad antimicrobiana también se puede evaluar de forma semi-cuantitativa observando los halos de inhibición de un agente antimicrobiano bien sea antibiótico o desinfectante. La técnica consiste en preparar una suspensión con una concentración conocida de microorganismo del orden de 108-7ufc/mL. La suspensión es inoculada y sembrada masivamente en una placa de agar Mueller Hinton, el cual permite una mayor difusión del agente antimicrobiano; para que el medio permita la difusión de debe cumplir con ciertas características: profundidad de medio de 4 a 5 mm y el pH debe ser de 7.4 +/-0.2. A su vez depende de ciertos factores como la concentración de microorganismo sembrado y la concentración de cationes divalentes que hay en el medio (Murray, et al. 1983). Discos de papel filtro son sumergidos en una concentración determinada del desinfectante y colocados sobre la placa de agar con el microorganismo, el control de la técnica son discos impregnados con agua estéril. La lectura se realiza según el tiempo de incubación de los microorganismos. Se deben observar halos que indican la inhibición del crecimiento, estos deben ser medidos; a mayor diámetro de halo mayor es la efectividad del desinfectante (Olson, 2007). 2.7.1.3 Coeficiente Fenólico Es la técnica más conocida para la evaluación de los desinfectantes en suspensión, esta validada por la AOAC (Phenol Coefficient Method 955.11); en esta se compara la acción bactericida de un determinado desinfectante frente a la del Fenol; se prepara una suspensión conocida del microorganismo, concentraciones de los desinfectante de prueba en tubos (dilución recomendada, una mayor y una menor a esta con un volumen final de 5mL). De igual forma se preparan tres concentraciones de fenol según el microorganismo de estudio generalmente 1/100, 1/90,1/80. Una vez 36 preparado el material se adicionan 0.5 mL o una asada de la suspensión a los tubos con la dilución. El estudio evalúa tres tiempos de exposición (5, 10 y 15 minutos) por cada dilución tanto de desinfectante prueba como de dilución de fenol, cada vez que pase un tiempo de exposición se transfieren 0.5 mL o una asada (4 mm) del tubo la dilución y microorganismo a un caldo nutritivo y este se deja incubar según el tipo de microorganismo en estudio. Los resultados son expresados cualitativamente (crecimiento o inhibición del crecimiento) a cada uno de los tiempos de exposición, teniendo en cuenta la dilución del desinfectante y fenol que no inhiba a los microorganismos a los cinco pero si a los diez y quince minutos con respecto a cada uno de los microorganismos, para obtener el numero del coeficiente fenólico, el cual expresa cuantas veces es mejor el desinfectante de prueba que el fenol, se aplica la ecuación # 1; si el número es menor a 1 no se recomienda la utilización del desinfectante por lo menos a esa concentración. (AOAC, 2005) . Ecuación 1. Número del Coeficiente fenólico 2.7.2 2.7.2.1 Pruebas Carrier Método de la Dilución de Uso Este método validado por la AOAC (Use-Dilution Method 955.15) se utiliza para verificar la acción de un desinfectante frente a un microorganismo el cual esta adherido a una superficie inerte. El método consiste en contaminar el soporte carrier (material característico de la industria como: acero inoxidable, polietileno, PVC, etc.) sumergiéndolos con una suspensión del microorganismo en una concentración conocida por 30 minutos; después del tiempo de exposición, el soporte es extraído de la suspensión y se deja secar a temperatura ambiente. Luego, el soporte es sumergido en una dilución conocida de desinfectante por 10 minutos (tiempo estandarizado) y finalizado el tiempo de exposición el soporte es extraído y 37 depositado en un Medio Neutralizante por 30 minutos para finalmente ser adicionado a un caldo de crecimiento. La lectura se realiza de forma cualitativa observando la turbidez de tubo, esta prueba se debe realizar simultáneamente con mínimo 10 soportes para mayor confiabilidad. Una modificación a esta técnica que esta validada por la AOAC es la adición de materia orgánica como interferente, con el fin de evidenciar inactivación de la acción bactericida del desinfectante. Con el objetivo de confirmar la inactivación del desinfectante frente al microorganismo prueba sobre la superficie la prueba se acompaña de controles de: viabilidad del microorganismo, pureza de la materia orgánica (si es el caso) y un procedimiento paralelo en el que se reemplaza el desinfectante por agua destilada estéril (AOAC, 2006). 2.7.3 Pruebas en superficie – In Vivo Este tipo de prueba se maneja en condiciones reales, tiene como objetivo verificar la dilución de uso del desinfectante bajo condiciones reales en la industria. La prueba consiste en contaminar la superficie (segmento de acero inoxidable) con un inóculo del microorganismo (concentración conocida), después del tiempo de exposición al desinfectante se de determina el numero de microorganismos sobrevivientes por contacto directo con agar nutritivo (caja de petri) o por la técnica de lavado, en la cual la parte es lavada con un diluyente y el número de bacterias es determinado en solución residual. La técnica puede ser reemplazada directamente por la toma de muestras del proceso de limpieza realizado en la industria (Reybrouck, 1998). 2.8 Limpieza Se entiende por limpieza como el proceso de empleo correcto de productos químicos (antimicrobianos) en una secuencia dada para disminuir la suciedad y los agentes 38 contaminantes de forma que no se afecte la calidad del producto; teniendo en cuenta los factores que influyen directamente como la concentración, temperatura, tiempo de exposición y utilización de herramientas. Para realizar la limpieza se utilizan los agentes químicos anteriormente mencionados que disminuyen la carga residual y microbiana a límites aceptables. Esta última puede ser neutralizada inhibiendo el crecimiento bacteriano con agentes bacteriostáticos o eliminándolos con los agentes bactericidas (Gerhard, 2000). Con el fin de realizar un buen proceso de limpieza se deben seguir cierto orden básico citado a continuación: (Office of Environmental Health, 2004; Schimdt, 2008) − Lavado − Limpiado − Relavado − Sanitización/ desinfección 2.8.1 Limpieza manual de equipos Es la limpieza que realizan los operarios en la cual se emplea un esfuerzo físico, utilizando cepillos, trapos y esponjas (acción mecánica). El personal debe tener la capacitación adecuada para realizar este tipo de procedimientos y de igual manera se debe brindar una supervisión al proceso manual de limpieza; este tipo de limpieza es considerada como la de mayor riesgo debido a que los equipos o partes de los equipos entran en contacto directo con el operario, además que requiere el desarme total de la máquina lo que conlleva a un mayor tiempo muerto (desarmado, lavado y ensamblado) de la máquina, lo que se ve reflejado en costos de producción. (Código de Regulación Federal, Capitulo 21 parte 111). Debido a las variaciones que el o los operarios puedan tener durante el desarrollo del proceso de limpieza, no se puede llevar a cabo la validación de este, debido a que 39 una de las principales características de una validación es la repetibilidad que debe tener el proceso; es por esto que solo es conveniente evaluar el proceso. En algunos casos estos son considerados como el caso o condición crítica de una industria (Agalloco, 1992; Morales, 2006). 2.8.2 Limpieza Automatizada de equipos 2.8.2.1 COP (Clean-Out-of- Place) Sistema automático o semi-automático de limpieza que requiere un desarme parcial de los componentes mayores de los equipo, estas son llevadas a cuartos de lavado en donde un tanque lava las partes por ciclos, utilizando diferentes agentes de limpieza (detergentes y desinfectantes) a presión y a una temperatura determinada. Actualmente es utilizado principalmente en industrias farmacéuticas, nutracéuticas y de alimentos. Este tipo de limpieza minimiza los riesgos de contaminación debido a que no hay contacto directo con el operario durante el proceso. Por la robustez que el proceso confiere a la limpieza COP puede ser evaluado y validado environmental Health, 2004). Fuente: Sanimatic, 2008 Figura 8 Clean Out of Place 40 (Office of 2.8.2.2 CIP (Clean-In-Place) El sistema Clean In Place (Limpieza in situ) es un procedimiento automático, reproducible, con un lavado y enjuague confiable de las soluciones de limpieza a través de los equipos y tuberías del área de manufactura; hasta el momento ha demostrado que mejora tanto la calidad del producto como la limpieza de los equipos y la planta. (A&B Process Systems, 2008) Además, este sistema tiene la capacidad de limpiar sin necesidad de desmontar la totalidad de las partes de un equipo, es un sistema integrado de: tanque, válvulas, filtros, unidades de intercambio de calor, tuberías, entre otros. Consiste básicamente en ciclos consecutivos de lavados utilizando: limpiadores (alcalinos, ácidos e intermedios), desinfectantes, seguido de un lavado con agua purificada. Este sistema reduce la mano de obra (limpieza manual) y tiempo; además, garantiza el mejoramiento de la limpieza y desinfección con respecto a la limpieza manual (Bremer, et al. 2005; Anderson, 2007). Tipos de sistemas CIP: (Bremer, et al. 2005; Anderson, 2007) ‐ Sistema simple: la solución de limpieza es introducida en al sistema, terminado el proceso se descarga y por último se enjuaga. ‐ Sistema de recirculación: este sistema de limpieza implica la preparación de la solución de limpieza en un tanque externo, debido a que la solución se re circula hasta el punto que los ciclos de limpieza hayan finalizado. Este tipo de sistemas de limpieza son empleados por industrias farmacéuticas, nutracéuticas, alimentarias, bebidas y biotecnológicas. 41 Fuente: Anderson, 2007 Figura 9 Clean in Place 2.9 Descripción del proceso de limpieza manual Ver ANEXO J. 2.10 Mecanismos de resistencia de los microorganismos Los microorganismos tienen variabilidad en la resistencia a los desinfectantes, a continuación (figura # 10) se encuentran en forma decente, de los más resistentes a 42 los de menor resistencia: (Russell, 1998) + R e s i s t e n c i a - Fuente: Russel, 1998 Figura 10 Resistencia de los microorganismos a los desinfectantes. 2.10.1 Intrínseca 2.10.1.1 Bacterias La composición en la pared celular de las células bacterianas varía entre un grupo y otro, lo que explica en parte la diferente actividad de un biocida frente a los distintos 43 microorganismos. (Russell, 1997). A continuación en la tabla 3 se observan los mecanismos de resistencia de las bacterias a diferentes desinfectantes Tabla 3 Mecanismos de resistencia intrínsecas de las bacterias a los desinfectantes. Tipo de resistencia Ejemplo(s) Mecanismos de resistencia Impermeabilidad Bacterias gram-negativas QACs, triclosan, diaminas Barrera presentada por la membrana externa que puede prevenir la toma de antisépticos o desinfectantes; el glicocalix puede estar involucrado Micobacterias Clorhexidina, QACs Cera de la pared celular previene adecuadamente la entrada del biocida Razón para la resistencia de algunas especies de Glutaraldehido Esporas bacteriales Bacterias gram-positivas M. chelonae Clorhexidina, La cubierta de las esporas y corteza presenta una QACs, fenólicios barrera a los antisépticos y desinfectantes Clorhexidina El glicocalix/mucoexopolisacarido presenta una barrera asociada con la reducción de la difusión del antiséptico Inactivación Clorhexidina El rompimiento de la molécula de clorhexidina (mediada cromosomalmente) puede ser responsable de la resistencia Fuente: Mac Donell, 1999. Las esporas bacterianas son el estado de latencia de las bacterias vegetativas, no hay síntesis de macromoléculas, su contenido de agua es bajo (10-15%), el pH es una unidad menor que el de las bacterias vegetativas, no poseen metabolismo. Tienen estructuras de resistencia (intrínsecas) diferentes a los demás microorganismos que les confieren resistencia a altas temperaturas, radiación y agentes químicos como el 44 Alcohol isopropílico, el cual pierde su efecto frente a estas debido a que poseen una serie de capas impermeables protectoras que impiden el paso de las moléculas de Alcohol isopropílico. Estas capas están conformadas por una membrana interna igual a la de las células vegetativas, una pared celular con un peptidoglicano deshidratado (esporo específico) llamado cortex, una membrana exterior también llamada capa cortical formada por proteínas ricas en cisteína y finalmente un recubrimiento delgado formado por queratina llamado exosporio (Russell, 1998). En la figura 11 se observan las principales estructuras de resistencia de una espora bacteriana. Fuente: Wampler, 2005 Figura 11 Estructuras de resistencia de las esporas bacterianas. 2.10.1.2 Mohos y levaduras Las paredes celulares representan una barrera natural para reducir y excluir la entrada de un desinfectante. Uno de los grandes factores que afecta la resistencia intrínseca de los mohos y levaduras es la edad del cultivo ya que a mayor edad las capas externas adquieren un mayor grosor aumentando la probabilidad de resistencia a agentes antimicrobianos. A continuación (tabla 4) se muestran los posibles mecanismos de 45 resistencia intrínseca que tienen los mohos y levaduras (Russell, 1998; Mac Donell, 1999). Tabla 4 Mecanismos de resistencia - Levaduras y Mohos Tipo de resistencia Intrínseca Adquirida Posible mecanismo Ejemplos Exclusión Clorhexidina Inactivación enzimática Formaldehído Modulación fenotípica Etanol Mutación Algunos preservativos Respuesta plásmidos mediada por los No demostrado a la fecha Fuente: Mac Donell, 1999. 2.10.2 Adquiridas Son las resistencias que se dan por mutaciones genéticas, plásmidos y transposones que les confieren características únicas de resistencia a algunos microorganismos, la mayoría se observan en los biofilms (Russell, 1998). 46 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 3.1 Problema La evaluación de un proceso de limpieza manual de equipos es realizado con el fin de garantizar la identidad, potencia y pureza de los suplementos nutricionales a través de los procesos de manufactura y empaque. La evaluación de este proceso optimizaría otros que dependen o están interrelacionados. La limpieza de equipos es un proceso que busca disminuir la concentración microbiana y residual a límites aceptación establecidos por la compañía y por organismos reguladores en cada país que garantizan la seguridad al consumidor final. ¿Es necesario evaluar el proceso de limpieza manual de una industria nutracéutica para asegurar y certificar que sus productos cumplen con la regulación establecida y son aptos para el beneficio del consumidor final? 3.2 Justificación Durante la manufactura, empaque, etiquetado y sellado de un suplemento nutricional se utiliza una gran variedad de equipos y utensilios que facilitan estos procesos. Los equipos de mayor importancia son los utilizados en el área de manufactura debido a que es aquí donde se: pesan y mezclan las materias primas y donde se fabrican las tabletas, capsulas o softgels que van a salir al mercado. A su vez es el área donde el producto tiene el mayor tiempo de exposición a las condiciones ambientales de fabricación incluyendo el contacto directo con las superficies de los equipos y los operarios. 47 La limpieza adecuada de los equipos del área de manufactura es uno de los factores que ayudan a evitar la contaminación por microorganismos y el paso de residuos de un producto a otro. El origen natural de los suplementos nutricionales implica la ausencia de preservantes o sustancias artificiales para el control de la contaminación. En consecuencia, se deben realizar controles, evaluaciones y análisis del o los procesos de limpieza, siendo estos más continuos y rigurosos en el caso de un proceso de limpieza manual, debido a que este tipo de procesos no pueden ser validados. Al mantener el proceso de limpieza manual y sus componentes evaluados periódicamente se garantiza la seguridad del producto en cuanto a su identidad, pureza y composición, cumpliendo de esta manera con las normas de las Buenas Prácticas de Manufactura para los suplementos nutricionales y con las especificaciones de calidad expuestas por la FDA. 48 4. OBJETIVOS 4.1 General Evaluar el proceso de limpieza manual utilizado en la fabricación de suplementos nutricionales cumpliendo con los requerimientos establecidos para la limpieza de equipos en el área de manufactura según la CFR 21 parte 111. 4.2 Específicos ‐ Evaluar la efectividad antimicrobiana del desinfectante y detergente empleado en la compañía ‐ Evaluar la efectividad de la remoción de material orgánico por parte del detergente. ‐ Evaluar la actividad antimicrobiana de la concentración del desinfectante empleado en la compañía en presencia de microorganismos patógenos. ‐ Evaluar la actividad antimicrobiana del desinfectante en presencia de materia orgánica. ‐ Evaluar la afinidad del desinfectante sobre la superficie de trabajo (acero inoxidable tipo 304). ‐ Establecer los límites de aceptación físicos, químicos y microbiológicos “parámetros de evaluación”. ‐ Emplear los parámetros para la evaluación de la limpieza manual en los equipos de manufactura. ‐ Evaluar el proceso de limpieza manual en condiciones críticas (Worst Case). 49 5. HIPOTESIS La hipótesis manejada en el trabajo de grado solo hizo referencia a una concentración específica de desinfectante (70% v/v), debido a que esta es la solución utilizada en la compañía para la inhibición del crecimiento microbiano en los equipos de manufactura. Hi: La solución de alcohol isopropílico al 70% v/v es efectiva para la desinfección de equipos del área de manufactura. Ho: La solución de alcohol isopropílico al 70% v/v no es efectiva para la desinfección de equipos del área de manufactura. 50 6. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1 Identificación de los microorganismos prueba. Los microorganismos empleados en cada una de las técnicas provienen de cultivos liofilizados (Lyfocults) reconocidos por las colecciones de la American Type Culture Collection (ATCC) organización privada sin ánimo de lucro dedicada a la recolección, conservación y distribución de los cultivos auténticos de microorganismos existentes, virus, DNA, plantas, células de animales y el hombre. Figura 12. Lyfocults (Fuente: MSL Microbiologicals) Los cultivos fueron almacenados a una temperatura (Nevera VWR # R414GA14) de 2 a 8ºc como lo sugieren las especificaciones de uso, teniendo en cuenta que no se pueden congelar para ser utilizados nuevamente; estos se encuentran conformados por: Terminal con asa estéril, asa de inoculación, fluido para rehidratar, cultivo liofilizado del microorganismo. Una vez reconstituidas las cepas liofilizadas fueron transferidas a cajas de petri (Spectrum, Cat # 960-35563) con agar nutritivo para ser preservadas. La conservación consistía en repiques mensuales a un agar nutritivo (Agar tripticasa de soya – TSA, BD # 221283) teniendo en cuenta que cada nuevo pase se incubó (Incubadora – Boekel N˚132000) por 48 horas (bacterias) y 72 horas (levadura) a una 51 t temperatura de 35ºC +/- 2˚C . El contrrol de calidaad de las ceppas se realizzó mediante la c coloración de d Gram (Kitt Gram, BD # 212539) en e cada uno de d los repiquues realizadoos. L identidad La d de los miccroorganism mos se confirrmó mediannte coloracióón de Gram,, y s siembra en agares seleectivos – Bacterias. B Laa Tabla 5 da a conoccer los agarres u utilizados. T Tabla 5 Agarres Selectivos Microo organismo Medio de cu ultivo Mac Coonkey (EMD D # 1.05465) Escherrichia coli Xilosa Lisina L Desoxxicolato – XLD X (EMD # 1.05405) Hecktoeen (EMD #1.05287) Eosina Azul A de Mettileno - EMB B (EMD # 1.01342) D # 1.05465) Mac Coonkey (EMD Salmoneella enterica Xilosa Lisina L Desoxxicolato – XLD X (EMD # 1.05405) Hecktoeen (EMD #1.05287) Eosina Azul A de Mettileno - EMB B (EMD # 1.01342) Pseudomon nas aeruginoosa Cetrimiide (BD #1.005284) Staphyloco occus aureus Vogel Johnson J (EM MD # 1.052844) P Posteriormen nte se realizzó identificaación de baccterias Gram m negativas por p el sistem ma O Oxi/ferm tub be II* (BD, Cat # 900000-496), prueeba de la coaagulasa (BD, Cat # 900003152) en el caso c de Staphylococcus aureus y sieembra en aggar nutritivo (TSA) para la l levadura (C Candida albiccans) con una u posteriorr prueba de fermentacióón de azúcarres ( (Dextrosa, Manitol, M Lactosa, Sacaroosa). Figuraa 13 Oxi –Ferm m tube II 52 *Oxi/Ferm tube II es un tubo plástico con divisiones, conformado por doce medios de cultivo diferentes, que permiten la determinación de un total de quince reacciones bioquímicas. Está creado para la inoculación simultánea de los doce medios de cultivo con una sola colonia, utilizando la aguja de inoculación dispuesta en el centro; la combinación de las reacciones junto con la guía de interpretación de resultados permite la identificación del microorganismo. (BBL # 90000-496) Las pruebas realizadas se dividieron tanto en pruebas in vivo e in vitro una explicación general de los pruebas se encuentra en el anexo K. 6.2 Agentes de limpieza. 6.2.1. Evaluación de la efectividad antimicrobiana “Desinfectante y Detergente” 6.2.1.1 Pruebas en suspensión. 6.2.1.1.1 Dilución en tubo y sensibilidad antimicrobiana (Kirby - Bauer) “Desinfectante y Detergente”. (Diagrama de flujo – Ver Anexo L) En primer lugar se aislaron cada uno de los microorganismos en agar nutritivo (TSA) con un tiempo de incubación de 24 horas en el caso de las bacterias y 72 horas como mínimo para la levadura a una temperatura de 35˚C +/- 2˚C. Una vez terminado el tiempo de incubación se prepararon 5 mL de suspensión de cada uno de los microorganismos en agua destilada (Zephyrhills) estéril, teniendo en cuenta que se mantuvo a una concentración aproximada de 12x108 ufc/mL la cual es equivalente al tubo número cuatro de la escala nefelométrica de Mac Farland. La confirmación de la concentración se realizó mediante recuento en placa en agar Plate Count (EMD, Cat #1.05463). Para la preparación de las concentraciones de los agentes de limpieza únicamente se llevó a esterilizar (Electric Pressure Steam, model 25x) el agua necesaria para la preparación de cada una de las concentraciones (Volumen final: 4.5 mL); debido a que el Alcohol isopropílico y el Alconox no se pueden esterilizar (perdida de propiedades). Una vez esterilizado el material se procedió a preparar las 53 concentraciones de cada agente de limpieza: Desinfectante - Alcohol isopropílico anhídrido al 50,70 y 80%v/v (USP 99.9%) y Detergente Alconox al 0,5%; 1%; 2% p/v (Alconox Cat # 1101) dentro de la cabina de flujo laminar, una vez listo el material se tomó un solo tubo por cada concentración. En la técnica de sensibilidad antimicrobiana, la siembra de los microorganismos se realizó masivamente en las placas de agar Mueller Hinton (BD # 221177) por duplicado, una vez que se obtuvieron listas el total de placas del ensayo se colocaron tres pozos estériles (longitud 0,5 cm aproximadamente) en cada una de las cajas; con la ayuda de una micropipeta (VWR-100µL, Cat # 40000-208) se adicionaron 100 µL del agente de limpieza (Alcohol isopropílico o Alconox) a cada uno de los pozos, finalizado el procedimiento se incubó a una temperatura de 35˚C +/- 2˚C. El empleo de los pozos se descartó debido a que la rápida evaporación del alcohol isopropílico no permitió observar mediante la presencia de los halos de inhibición la acción biocida por parte del agente químico sobre cada uno de los microorganismos. El empleo de los pozos fue remplazado por sensidiscos estériles (Whatman Filtro #1; Cat # 100125), cada uno de ellos se humedecieron con la solución del agente de limpieza correspondiente seguido de su colocación sobre la superficie del agar con la ayuda de unas pinzas estériles. Esto se realizó por duplicado en la misma caja con su correspondiente control (Agua destilada Estéril), teniendo en cuenta que por cada caja se evaluó una sola concentración. Terminado el montaje, se llevaron a incubar una temperatura de 35˚C +/- 2˚C por 24 horas para bacterias y 72 horas para levadura. La técnica de dilución en tubo es una modificación de la técnica original, en la cual se evaluó el efecto de los agentes de limpieza con respecto a los microorganismos a tres tiempos de exposición (1, 5,15 minutos). Durante esta técnica se utilizaron diecinueve tubos con Caldo BHI (Difco, Cat # 211057), 500 mL de agar TSA, cuarenta cajas de Petri (VWR, Cat # 960-35563), un paquete con veinte pipetas estériles (VWR, Cat # 14670-201), un cronómetro (VWR) 54 y una gradilla. Teniendo en cuenta que el material anterior era por cada microorganismo a evaluar. Los tubos con la concentración del agente de limpieza (Alcohol isopropílico o Alconox) fueron inoculados con el microorganismo de prueba con la ayuda de la micropipeta (0.5 mL), cada vez que se cumplía uno de los tiempos de contacto se tomaban 3 mL con la ayuda de una pipeta estéril; 1mL para adicionarlo en el tubo de BHI y los 2 mL restantes se adicionaban en cajas de petri para realizar siembra en profundidad. El control de los microorganismos se realizó sembrando 1mL de la suspensión patrón en una caja de petri seguido de la adición del agar nutritivo. Terminado el ensayo se incubaron las cajas de petri a una temperatura de 35˚C +/- 2˚C por 24 horas para bacterias y 72 horas para la levadura. La lectura de los resultados se llevó a cabo cualitativamente en ambas técnicas, teniendo en cuenta que para la técnica de sensibilidad antimicrobiana se evaluó la presencia o ausencia de halos indicando de esta manera la sensibilidad o resistencia del microorganismo. Por otra parte, la técnica de dilución en tubo se evaluó por la presencia de turbidez en los caldos de BHI o el crecimiento en las cajas de petri con respecto a la caja control del microorganismo, teniendo en cuenta que cada resultado positivo (presencia de turbidez) se confirmó mediante coloración de Gram y siembra en agares selectivos. 6.2.1.1.2 Método del Coeficiente Fenólico para el Alcohol isopropílico USP según la AOAC 955.11. (Diagrama de flujo – Ver Anexo M) La metodología descrita a continuación es una modificación del método de la AOAC 955.11. 55 Al igual que en la técnica de dilución en tubo únicamente se llevó a esterilizar el agua necesaria para la preparación de las diluciones de Alcohol isopropílico y Fenol (Labchem, Cat # LC 18195-2) teniendo en cuenta un volumen final de 5 mL. Las concentraciones de los desinfectantes (Alcohol isopropílico: 20% a 80% v/v y Fenol: 1/60 a 1/100) se prepararon en la cabina de flujo con las precauciones necesarias (uso de máscara – North 7700-30L). Es necesario tener en cuenta para el almacenamiento de las soluciones oscuridad, ventilación y una temperatura aproximada de 18˚C aproximadamente. Para esta metodología se utilizaron los siguientes materiales: Suspensión del microorganismo con 24 horas de incubación para el caso de las bacterias y 72 horas para la levadura, dieciséis tubos con caldo BHI, un tubo por cada concentración de Alcohol isopropílico y fenol, un paquete de asas plásticas estériles (VWR, Cat # 12000-810), cronómetro y gradilla. Las concentraciones de Alcohol isopropílico y fenol se distribuyeron de la siguiente forma: Tabla 6 Concentraciones de Alcohol isopropílico y fenol (empleadas) Concentración (v/v) Microorganismo Fenol Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa 1/80,1/90,1/100 Salmonella Typhi Staphylococcus aureus 1/60,1/70, 1/90, 1/100 Candida albicans 1/70, 1/80, 1/90, 1/100 56 Alcohol 20%,30%,50%,60%,70%, 80% 20%,30%,50%,70%, 80% 30%,50%,60%,70%, 80% Cada uno de los microorganismos fue evaluado mediante un set que contenía dos diluciones del fenol, tres del alcohol isopropílico y dieciséis tubos de caldo BHI. A los tubos con las diluciones del fenol y alcohol isopropílico se le adicionó 0.5 mL (500µL) del microorganismo de prueba. Una vez fue adicionado el microorganismo se agitó manualmente. El contacto entre el microorganismo y el desinfectante se evaluó a los 5, 10 y 15 minutos, terminado el tiempo de contacto se inoculó a partir de la solución (Fenol o alcohol isopropílico y microorganismo) al caldo nutritivo BHI (agitar los tubos suavemente) con la ayuda de una asa estéril, finalizado el procedimiento se llevaron a incubar los tubos (VWR, Model 1510E) a una temperatura de 35˚C +/- 2˚C. La lectura de los tubos se realizó cualitativamente por la presencia (Positivo: crecimiento) o ausencia (Negativo: inhibición del crecimiento) de turbidez, los tubos positivos se identificaron y confirmaron por las pruebas nombradas anteriormente. La metodología se realizó por triplicado para la verificación de resultados. Obtenidos los resultados se procedió a calcular el número del coeficiente de la siguiente manera: Numero Coeficiente Fenólico = Mayor dilución del desinfectante que inhiba al microorganismo en 10 min pero no en 5min Mayor dilución del fenol que inhiba al microorganismo en 10 min pero no en 5min Ecuación 2 Número del coeficiente fenólico 6.2.1.2 Prueba en soporte “Carrier”. 6.2.1.2.1 Método de la dilución de uso - AOAC 955.15. (Diagrama de flujo ver Anexo N) El método a continuación es una modificación del Use Dilution Method de la AOAC 955.15. 57 Para la evaluación de superficies fueron necesarios dos frascos de vidrio con su tapa respectiva, veintiún soportes de acero inoxidable tipo 304 que fueron cortados a partir de un tubo de 30 cm de largo y un diámetro de 5 mm dejando cada uno de ellos con una longitud de 5 mm de ancho por 5 mm de largo aproximadamente; posteriormente los soportes fueron limados utilizando un esmeril (Dayton # 4Z123H), gancho estéril, 30 mL de materia orgánica (Suero Bovino) al 0.01g/mL (1%p/v), 0.125g/mL (12.5%p/v) únicamente para Escherichia coli y 0.25 g/mL (25%p/v) para ambos microorganismos; 60 mL de suspensión de Escherichia coli y Staphylococcus aureus con 54,48 y 24 horas de incubación, tubos de plástico con tapa estériles, 20 tubos con la solución de Alcohol isopropílico al 70%, 11 tubos con 2,5 mL de agua destilada estéril, 3 contenedores plásticos estériles de 100mL (VWR # 15004-012), Solución de NaOH 1N, Veintiún tubos de 5 mL con Caldo Letheen modificado (AOAC 955.11), veintitrés tubos de 5 mL con Caldo BHI, dos cajas de petri con papel filtro, micropipeta, puntas estériles (VWR # 83007-380), pipetas estériles, cronómetro, gradillas. La metodología para la evaluación de superficies se dividió en cinco segmentos, en los cuales se evaluó la interferencia de la materia orgánica en la acción bactericida del alcohol isopropílico al 70% A. Preparación de los soportes: Para dar inicio al método fue necesario contar con al menos veintiún cilindros por microorganismo. Los soportes fueron sumergidos en una solución de 30 mL de NaOH al 1N en un contenedor de 100 mL durante 12 horas a temperatura ambiente. Terminado el tiempo, estos se lavaron con agua destilada estéril; por cada lavado se tomó una muestra de 5 mL del proceso a la cual se le agregaron de dos a tres gotas de fenolftaleína al 1% para la verificación de residuos de NaOH. La presencia de estos residuos se evidencia por el cambio de color que genera la fenolftaleína en el agua 58 (color fucsia). El número de lavadas puede variar hasta que la muestra de agua residual no presente cambio de color en presencia de fenolftaleína (incoloro). Terminado el lavado de los cilindros fueron depositados en dos frascos de vidrio pequeños; diez cilindros en uno (frasco #1) y once en el otro (frasco #2). Se adiciono agua destilada a los frascos hasta cubrir completamente. Los cilindros se llevaron autoclavar durante 15 minutos a 15 libras de presión y 121oC. B. Preparación del cultivo prueba: Los microorganismos fueron seleccionados en base a las características morfológicas presentadas por las bacterias, Escherichia coli (bacteria Gram Negativa) y Staphylococcus aureus (bacteria Gram positiva). Para la preparación del cultivo prueba fueron necesarios: Cajas con cultivo estándar, quince tubos de BHI con 5 mL por cada microorganismo teniendo en cuenta que se necesitaban cultivos estándar con 24,48 y 54 horas de incubación. Cada uno de los microorganismos estándar que se evaluaron estaban conservados en cajas de petri, a partir de cada una de las cajas se realizaron repiques a caldo BHI teniendo en cuenta los tiempos de incubación. Por cada uno de los periodos de incubación se realizaron pases del cultivo a cinco tubos con 5 mL de caldo BHI. Un total de 25 mL de caldo BHI por cada tiempo de incubación. La primera serie se llevo a incubar durante 54 horas, la segunda serie durante 48 horas y la tercera durante 24 horas; los tiempos fueron estimados de acuerdo con la hora destinada para la realización del test. Terminado el tiempo de incubación se realizó una mezcla de los quince tubos de cada microorganismo formando una solución stock con un volumen final de 75 mL de suspensión microbiana. (30 mL para el test, 45 mL para controles positivos y negativos.) 59 Los materiales se asignaron teniendo en cuenta que en se realizaron cinco pruebas, en las cuales fueron evaluados los siguientes parámetros: Tabla 7 Parámetros a evaluar en la evaluación de superficies. Microorganismo Materia Orgánica Solución de Alcohol isopropílico 70% Soporte Prueba 1 X X X X Prueba2 X X X Prueba 3 X X X Prueba 4 X Prueba 5 En cada una de las pruebas los materiales se asignaron de la siguiente manera: Tabla 8. Distribución del material “Evaluación de superficies” Solución de Caldo BHI Caldo Letheen Soportes estériles Prueba #1 10 10 10 10 10 Prueba #2 10 10 10 10 10 Prueba #3 1 1 - - 1 Prueba #4 1 - - - - Prueba #5 1 - 1 - - Alcohol al 70% Tubos estériles C. Desarrollo del método: Prueba #1 a. De la mezcla de microorganismos se tomaron 30 mL y se adicionaron a los 30 mL de la solución de materia orgánica, se mezclaron cuidadosamente y se incubaron 1 hora a 35˚C +/- 2˚C. b. Terminado el periodo de incubación se adicionaron 5 mL de la mezcla a cada uno de los diez tubos (estériles) requeridos para esta prueba. 60 c. Se extrajeron los cilindros del frasco #1 con un gancho estéril y se depositaron con cuidado en la solución de microorganismo y materia orgánica para formar la solución prueba (2). Se incubaron por 30 minutos a 35˚C +/- 2˚C. d. Posteriormente el soporte fue extraído, utilizando el gancho, de la solución para ser colocado en una caja de petri con papel filtro (3), se incubaron a una temperatura de 35˚C +/- 2˚C por 30 minutos (Secado). No más de cinco cilindros por cada caja. e. Terminado el tiempo de secado se colocaron los soportes durante un periodo de 10 minutos en la solución de Alcohol isopropílico al 70% (4). f. Finalizado el tiempo de contacto, el soporte se adicionó durante 30 minutos al caldo Letheen (5) para la neutralización de la solución de Alcohol isopropílico g. Para una completa confirmación del test el soporte se coloco en caldo BHI (6) después del contacto entre el soporte y el caldo Letheen. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. Cilindro estéril. 2. Solución Prueba. 3. Caja de petri con papel filtro. 4. Solución de alcohol isopropílico al 70%v/v. 5. Caldo neutralizador (caldo Letheen). 6. Caldo BHI. Figura 14 Metodología general para la prueba #1 del método de superficies. Tener en cuenta que durante el pase de los cilindros a cada uno de los tubos (Caldo Letheen y BHI) se debe evitar el contacto con las paredes de estos para evitar falsos positivos. En caso que un cilindro entre en contacto con las paredes de los tubos el tubo debe ser marcado. Si más de un cilindro de las pruebas 1 y 2 o el cilindro de la prueba 3 entran en contacto con las paredes del tubo el método se debe repetir. Prueba # 2 (Control negativo) a. De los 45 mL de solución de microorganismo restante se adicionaron 2.5 mL a cada uno de los 10 tubos estériles restantes. (25 mL) 61 b. A cada uno de los tubos con microorganismo se adicionaron 2.5 mL de agua destilada estéril para formar la solución prueba (2). c. Terminado el proceso de preparación de la solución prueba se siguieron los mismos parámetros de la prueba # 1. Prueba # 3 (Viabilidad de los microorganismos prueba) a. La solución de prueba consiste en 5mL de la solución del microorganismo únicamente. b. Se procedió bajo los mismos parámetros de la prueba #1, teniendo en cuenta que en esta no se emplea la solución de Alcohol isopropílico (4). 1. 2. 4. 3. 5. 1. Cilindro estéril. 2. Solución del microorganismo. 3. Caja de petri con papel filtro. 4. Caldo neutralizador (caldo Letheen). 5. Caldo BHI. Figura 15 Metodología para la prueba #3 del método de superficies Prueba # 4 (Control microbiológico de la materia orgánica) a. Se tomó 1 mL de la solución de materia orgánica (1) y se sembró en caldo BHI (2). b. Se incubo a 35°C durante 24 horas. 1. 2. 1. Solución de materia orgánica (Suero Bovino). 2. Caldo BHI. Figura 16 Metodología para la prueba #4 del método de superficies. 62 Prueba # 5 (Control microbiológico de los cilindros) a. Con la ayuda del gancho estéril se transfiere el soporte a caldo BHI. (evaluación microbiológica). D. Lectura de resultados: a. Una vez terminadas las pruebas, se llevaron a incubar los tubos con caldo Letheen y BHI 35˚C +/- 2˚C por 48 horas. b. Las lecturas se realizaron por la aparición de turbidez en cada uno de los caldos. c. Los resultados (Tabla 9 ) se informaron de la siguiente manera: Tabla 9. Interpretación de resultados. “Evaluación de Superficies”. Numero de tubos Interpretación La materia orgánica interfiere > 8 tubos positivos en la acción bactericida del desinfectante sobre la superficie. La actividad del desinfectante se ve afectada, para mayor 5 a 7 tubos positivos seguridad repetir la prueba o aumentar la concentración de materia orgánica. La < 5 tubos positivos materia interfiere en orgánica la actividad bactericida del desinfectante sobre la superficie. no 63 Todos los tubos de la prueba #2 tienen que ser negativos al igual que los controles microbiológicos (pruebas 4 y 5). Por otra parte la Prueba #3 tiene que arrojar resultados positivos confirmando que la viabilidad del microorganismo sobre el acero inoxidable. d. Se realizó un repique en agar TSA para los tubos positivos (turbios) de las pruebas 1 y 3 para la confirmación de los microorganismos. Se incubo a 35°C por 48 horas. e. Teniendo en cuenta el tipo de microorganismo que se evaluaba se realizaron pases a agares selectivos desde el agar TSA. Para el caso de Escherichia coli a agar EMB y Staphylococcus aureus a Vogel Johnson seguido de la prueba de la coagulasa. Se incubo a 35°C por 48 horas. Los resultados de la coagulasa fueron observados 4 horas después de haber sido incubados. 6.2.2 Evaluación de la efectividad del detergente para la remoción del material orgánico. (Diagrama de flujo - ver Anexo O) El propósito del estudio de la efectividad de la limpieza es demostrar que los agentes de limpieza que se utilizan son efectivos en la remoción de residuos después del proceso de manufactura. Típicamente un nivel de residuo remanente menor a un 0.1% p/p es aceptado para el caso de productos con alérgenos alimentarios. (OMS, 2002) a. Se preparó una solución de Alconox al 1% (solución recomendada), lista la solución de 1mg/mL del detergente se procedió a realizar la solución de materia orgánica. b. Para la preparación de la solución de materia orgánica se pesó 1 gramo del producto sea tableta o polvo de la capsula y se adicionó a 10 mL de agua destilada. c. Listos los materiales se pesaron los soportes (Ci) -Cilindros de Acero inoxidable tipo 304, se le adicionó con la micropipeta 0.5 mL (500 µL) de la solución de materia orgánica y se dejó secar a temperatura ambiente. 64 d. Secos los soportes se pesaron nuevamente para obtener lo que conocemos en los datos como cilindro sucio “CS”, luego se procedió a llevar cada uno de los soportes al desintegrador (Vankel 35-1200) aproximadamente por 50 veces dentro de la solución de Alconox. e. Terminado el tiempo de exposición al agente de limpieza se extraen de la solución y se dejaron secar a temperatura ambiente para luego pesarlos nuevamente lo cual se conoce en los datos como cilindro limpio “CL”. f. Obtenidos los datos en el ensayo se remplazaron los valores en la siguiente ecuación: % 100% Ecuación 3 Evaluación de la efectividad de Alconox – Porcentaje de Residuo El residuo restante no deber ser mayor a 0.1% para que el uso del detergente sobre la superficie sea aceptado. 6.3 Proceso de limpieza manual 6.3.1 Evaluación del proceso de limpieza según “limites físico, químicos y microbiológicos”. 6.3.1.1 Condiciones Normales. Durante 4 meses se monitoreo la limpieza manual de los distintos equipos utilizados en las áreas de manufactura y empaque de la compañía, revisando las posibles causas que afectan el proceso de limpieza. Para realizar el monitoreo se tuvieron en cuenta las máquinas que tienen mayor área de contacto con el producto. Dentro de los equipos monitoreados en el área de manufactura se encuentran mezcladores en “V” (V-Blenders), tableteadoras, encapsuladoras, aplicador de recubrimiento y en el área de empaque se encuentran las máquinas de llenado de botellas. 65 En cada una de las máquinas se evaluaron los límites físicos, químicos y microbiológicos previamente establecidos: La evaluación del límite Físico consistió en revisar las máquinas después de haberse realizado la limpieza tipo A (Limpieza total del equipo incluyendo desensamble), para este procedimiento no se requiere material solamente consistió en revisar visualmente el equipo. El límite Químico fue evaluado tomando una muestra lote posterior de producción en bolsas estériles, al cual por métodos químicos como HPLC (PE Nelson Elmer) y Absorción atómica (240 - FS fast sequential atomical, Varian. Inc) se analizó el ingrediente activo del producto anterior y los residuos de detérgete Alconox. Los resultados obtenidos se compararon con los límites establecidos. Por otra parte, el límite Microbiológico se evaluó el recuento en placa de bacterias mesófilas aerobias, mohos y levaduras, teniendo en cuenta que la toma de cada una de las muestras se realizó en los puntos críticos de limpieza que entran en contacto directo con el producto. Para la toma de muestra se emplearon escobillones estériles húmedos con medio de transporte (BBL, Cat # 18740002) los cuales fueron correctamente marcados con el nombre de la máquina (para ser almacenados a una temperatura de 2 a 8˚C), lugar de muestra, nombre del producto retirado, tiempo (antes o después de la limpieza); para la toma de muestra se empleó la técnica de “zig-zag” dentro de un área de 24 cm2 a 30 cm2. Una vez obtenidos los escobillones se procedió a sembrar los escobillones en agar nutritivo PC para bacterias y PDA para mohos y levaduras. Se incubaron a 35˚C +/2˚C por 48 horas para bacterias y 5 días para la levadura a una temperatura de 18˚C +/- 2˚C. 66 Pasado el tiempo de incubación se realizaron los recuentos que presentaban crecimiento. Con ayuda de los escobillones almacenados se les realizaron pases a tubos con caldo BHI y Caldo Lactosa, los cuales se incubaron a 35˚C +/- 2˚C por 48 horas; terminado el tiempo de incubación los tubos que presentaron turbidez se sembraron en agares selectivos con la ayuda de un asa estéril para evidenciar si existía la presencia de microorganismos patógenos (Escherichia coli, Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus). 6.3.1.2 Condición crítica La evaluación de la limpieza manual se realizó durante la producción de un suplemento dietético que tiene como función la remoción de toxinas del cuerpo, este producto contiene como ingrediente activo microorganismos del género Lactobacillus sp en concentraciones de 1 billon de UFC/g capsula, entre otros. Este suplemento dietético fue escogido para la evaluación de la limpieza debido a su ingrediente activo (microorganismo) y el tamaño del lote. “condicionamientos extremos” Los parámetros evaluados durante la evaluación fueron límite físico, químico y microbiológico. Límite físico: La evaluación del límite físico se realizó siguiendo las especificaciones de “visualmente limpio” al igual que durante los controles de la limpieza manual. Límite Químico: Para evidenciar la efectividad del proceso de limpieza se tomo una muestra del siguiente lote en producción al suplemento dietético. El siguiente producto fue identificado como Glucosamina. 67 Límite microbiológico: se tomaron muestras con escobillones estériles en: Blender V-60 (mezclador) y Bosch # 2 (Encapsuladora) Control físico: Inspección visual Control Químico: Las capsulas de Glucosamina se abrieron para adicionar el polvo a un contenedor estéril, se pesaron aproximadamente 8 gramos, una vez pesados se adicionaron 80 mL de agua peptonada al 0.1% (Difco # 218071) - Dilución 1/10, se llevó a incubar durante 30 minutos a 35ºC. Terminado el tiempo de incubación se realizó una dilución 1/10 de la solución del contenedor tomando una alícuota de 1 mL y adicionándola al tubo con agua destilada estéril (Tubo # 1). Se realizó la misma secuencia para realizar una segunda dilución. (Tubo #2). De cada uno de los tubos 1 y 2 se tomó una alícuota (1 mL) para sembrar en las cajas de petri (dos cajas por cada dilución). Finalizado el procedimiento se adicionó agar MRS (BD # 1.10660) a las cajas de petri. Una vez listas las cajas de petri, se colocaron dentro de la cámara de anaerobiosis (BD # 260672) con los respectivos sobres (BD # 260678) e indicadores de oxido reducción (BD # 251051). Se incubó a 35˚C +/- 2˚C por un periodo de 4 días. Concluido el tiempo de incubación se extrajeron las cajas de la cámara y se realizó el recuento de cada una de ellas. Control microbiológico: Se tomaron muestras por “zig-zag” antes y después del proceso de limpieza en las superficies de contacto directo con el producto en cada una de las máquinas empleando escobillones estériles en un área aproximada de 2430 cm2. Una vez obtenidos los escobillones se sembraron (Masivo) en agar nutritivo TSA y PDA. Incubándose a 35ºC +/- 2˚C por 48 horas para bacterias y 18 ˚C +/2˚C por 5 días (Mohos y Levaduras). Finalizado el tiempo de incubación se realizó el recuento de los microorganismos. En el caso de que haya crecimiento en el agar PC se siembra el escobillón en caldos nutritivos Lactosa y BHI para la verificación de patógenos incubándose a 35ºC por 48 horas. 68 En el caso de que se haya evidenciado turbidez en los caldos se realizan pases de la siguiente manera: 1. Caldo Lactosa: Agar McConkey, XLD, Hecktoen y EMB. Identificación de Escherichia coli y/o Salmonella sp. 2. Caldo BHI: Agar Cetrimide y Vogel Johnson. Identificación de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus respectivamente. Si el crecimiento es positivo para Staphylococcus aureus se debe realizar la prueba de la coagulasa. 3. Los escobillones fueron almacenados de 2 a 4ºC para un posterior uso. La lectura de resultados se realizó según los límites microbiológicos establecidos por la compañía. Igualmente, el control de la limpieza también se le realizó recuentos en placa del ingrediente activo (Lactobacillus sp). Los escobillones almacenados fueron cortados a una altura aproximada de 5 cm de longitud para ser insertados en la solución de agua peptonada al 0,1%, terminado el procedimiento se llevaron a incubar por 30 minutos a 350C+/- 2˚C. Finalizado el tiempo de incubación se tomó una alícuota de 1 mL de la solución de agua peptonada y se adicionó al tubo de agua destilada estéril, por cada uno de los tubos se tomaron 2 mL para ser adicionados en las cajas de petri – recuento en profundidad (1mL por cada caja). Luego, se adicionó agar MRS a cada una de las cajas de petri a una temperatura aproximada de 450C aproximadamente, realizándose los movimientos adecuados para una completa mezcla entre la alícuota y el agar nutritivo específico para el género de Lactobacillus. Las cajas se insertaron dentro de la cámara de anaerobiosis, con sus respectivos sobres e indicadores de oxido – reducción, la cámara con las cajas se incubó a una temperatura de 35˚C +/- 2˚C por 4 días, terminado el tiempo de incubación se realizaron los recuentos en cada una de las cajas. 69 Todos los resultados obtenidos durante la metodología fueron escritos en las tablas respectivas para cada caso. (Ver anexo Q). 70 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS. La confirmación de los microorganismos mediante la identificación por coloración de Gram corresponde a las morfologías descritas en el manual de Bergey’s (tabla # 10) Tabla 10 Identificación Microscópica – Coloración de Gram Microorganismo Morfología Escherichia coli Bacilos Gram negativos Salmonella enterica Bacilos Gram negativos Pseudomonas aeruginosa Bacilos Gram negativos Staphylococcus aureus Cocos Gram Positivos Candida albicans Formas Levaduriformes Fuente: Bergey’s Manual (1994) La siembra de los microorganismos en agares selectivos logró identificar a cada uno de ellos por las reacciones bioquímicas generadas a partir de las fuentes de carbono y nitrógeno disponibles. Figura 17 Escherichia coli en agar EMB 71 Figura 18 Pseudomonas aeruginosa en agar Cetrimide Figura 19 Salmonella enterica en agar Hecktoen Figura 20 Staphylococcus aureus en agar Vogel Johnson 72 La prueba sistemática Oxi/ferm tube II de cada uno de los microorganismos Gram negativos (tabla # 11) comparadas con el manual Bergey’s confirman las características bioquímicas y la identidad de estos microorganismos. Tabla 11 Resultados Oxi/Ferm Tube II Oxi / Ferm tube II M icroorganismo Escherichia coli Salmonella Typhi Pseudomonas aeruginosa Gram Bacilos Gram Negat ivos Bacilos Gram Negat ivos Bacilos Gram Negat ivos Cit rat o Urea Fenilalanina M anit ol M alt osa Glucosa/ gas Xylosa Indol - - - + + + - - + + + + - Sacarosa Lact osa/ N2 Lisina Arginina Ana/ Glu + + + + + + - + + + + - - - + + + + + + - - - - + - 7.1 Agentes de Limpieza 7.1.1 Evaluación de la efectividad antimicrobiana de los agentes de limpieza 7.1.1.1 Pruebas en suspensión 7.1.1.1.1 Dilución en tubo y sensibilidad antimicrobiana (Kirby – Bauer) “Desinfectante y Detergente”. La sensibilidad antimicrobiana se evaluó con la utilización de pozos y sensidiscos estériles como medio de transporte para el agente de limpieza, la utilización de este material se abolió para el caso del alcohol isopropílico debido a la evaporación. La evaporación es el cambio de un material de forma líquida a vapor, este cambio se evalúa con la tasa de evaporación que para el alcohol isopropílico al 70% y 99% es de 1.70 con respecto a la del acetato de butiro = 1 (material de referencia) a una temperatura de 20˚ C y 0.05 atmósferas de presión según el documento de seguridad del material (MSDS). Este tipo de medida no posee unidades logarítmicas debido a que depende de variables como la temperatura, presión atmosférica, humedad, velocidad del viento, entre otros. (Riveras, 2003) La tasa de evaporación está relacionada directamente con la temperatura, presión y humedad e inversamente con la concentración y volumen. En ensayos realizados por 73 Oxidasa - + C Cook en el año 2000 see observó unna reducciónn de un 10 % del volum men inicial del d a alcohol isopropílico al 99% 9 por un tiempo t de 488 horas a 23˚˚C. L observaciones de Coook explicann el porqué de Las d los resultaados obteniddos durante los l e ensayos quee a menor volumen v y concentraciónn la tasa dee evaporacióón será alta; al e evaporarse rápidamentee el alcohol isopropílicco no perm mite observaar una acción b biocida de éste frente a los l microorgganismos durrante la prueeba. A evaluar la Al l efectividaad antimicrobbiana del Allconox se obbtuvo como resultado que q e a las co este oncentracionnes evaluadas de 0.5, 1, y 2% dism minuye la carrga microbiaana c como es el caso c de Eschherichia coli (Figura # 222) pero no al a punto de laa inhibición de c crecimiento de los microorganism m mos; únicam mente se evidenció e i inhibición d del c crecimiento de Staphyloococcus aureeus a una cooncentraciónn de 2% conn un tiempo de e exposición de d 1, 5 y 15 minutos (fiigura # 21). Figura 21 Evaluación dee la efectividaad antimicrobiiana de Alconox frente a Staaphylococcus aureus. 74 Figura 22 Evaluación de la efectividad antimicrobiana de Alconox frente a Escherichia coli. La presencia del sulfato dodecilbenceno sulfonato (SDBS) – surfactante aniónico y EDTA (potenciador bactericida) en el Alconox ha demostrado que cada uno de ellos poseen actividad biocida (fluidización de la membrana). Según estudios de Glover en el año 1999, la fluidización de la membrana representa alteraciones graves que están correlacionadas con los cambios en la fluidez de la membrana debido a la acción de los surfactantes con actividad biocida. El poder biocida depende claramente del tipo de microorganismo en evaluación. La alteración en la fluidez de la membrana no es la 75 única responsable del efecto biocida en los microorganismos según el estudio, pero si es la responsable de la pérdida de función. (Glover, 1999). Nicas y Hancock en el año de 1980, exponen que las células bacterianas ofrecen tres sitios para la interacción biocida: la pared celular, la membrana citoplasmática y el citoplasma. El acceso de los agentes biocidas a estos lugares están determinados por el material extracelular, la morfología y la composición química; lo cual explica el porqué de los mecanismos de resistencia (presencia de LPS) en las bacterias Gram negativas al ataque con surfactantes (Alconox) tal y como se observó en la figura # 22. Los resultados obtenidos se presentan a continuación en porcentajes con respecto a los microorganismos, concentraciones y tiempo, teniendo en cuenta la reducción de la concentración inicial de la población microbiana descrita anteriormente. Figura 23 Evaluación de la efectividad antimicrobiana del alcohol isopropílico y Alconox frente a Escherichia coli. 76 Con las concentraciones evaluadas de los agentes de limpieza se observó que Escherichia coli a concentraciones de 50, 70 y 80% de alcohol isopropílico es inhibida durante los tiempos evaluados; por otra parte, la evaluación con el detergente únicamente influyó en la disminución de la concentración inicial. Figura 24 Evaluación de la efectividad antimicrobiana del alcohol isopropílico y Alconox frente a Pseudomonas aeruginosa. La evaluación de la actividad antimicrobiana de los agentes de limpieza con respecto a Pseudomonas aeruginosa fue equivalente al comportamiento de Escherichia coli a las concentraciones de Alconox. Las concentraciones de Alcohol isopropílico por su parte presentaron un 20% de crecimiento al primer minuto de exposición seguido de una reducción a un 10% a los diez minutos de contacto. La presencia de crecimiento a esta concentración por parte de Pseudomonas se deba presuntivamente por sus características morfológicas. (Mac Donell, 1999; Russell, 1998). 77 Figura 25 Evaluación de la efectividad antimicrobiana del alcohol isopropílico y Alconox frente a Salmonella enterica. Por su parte Salmonella enterica presenta un comportamiento similar al obtenido por Escherichia coli, inhibición del crecimiento a las concentraciones del alcohol isopropílico y crecimiento en las concentraciones de Alconox. Figura 26 Evaluación de la efectividad antimicrobiana del alcohol isopropílico y Alconox frente a Staphylococcus aureus. 78 En la evaluación de la efectividad antimicrobiana de los agentes de limpieza para Bacterias Gram positivas como es el claro ejemplo de Staphylococcus aureus, se observó que este microorganismo es sensible a una concentración de 2% de Alconox en un tiempo de exposición de 5 y 15 minutos a diferencia de las bacterias Gram negativas anteriormente mencionadas. Figura 27 Evaluación de la efectividad antimicrobiana del alcohol isopropílico y Alconox frente a Candida albicans. El efecto biocida de los agentes de limpieza sobre Candida albicans es equivalente al comportamiento observado con Escherichia coli en cuanto a la inhibición de crecimiento a concentraciones de 50,70 y 80% de alcohol isopropílico y crecimiento a las concentraciones de Alconox. Al encontrarse la presencia de EDTA en el Alconox hace que este agente limpiador con características biocidas no tenga acción únicamente frente bacterias Gram 79 positivas y levaduras, sino que también sea efectivo frente a bacterias Gram negativas tal y como lo explica Russell y Chopra (1996) en sus ensayos. La integridad de la membrana externa de las bacterias Gram negativas como P. aeruginosa es mantenida por las interacciones hidrofóbicas entre los lipopolisacáridos (LPS) –LPS y LPS y proteína. La presencia de cationes divalentes como Mg+2 es esencial para la estabilidad de las cargas negativas del núcleo de los oligosacáridos presentes en las cadenas de moléculas de los LPS. EDTA une a estos cationes liberando así hasta un 50% de las moléculas de los LPS, y causando fosfolípidos no polares asociados con la membrana interna para ser expuestos en la superficie celular para que moléculas hidrofóbicas puedan entrar a la célula. (Russell y Chopra, 1996). Por otra parte, la acción antimicrobiana del Alcohol isopropílico se evidenció desde el primer minuto de contacto entre el desinfectante y el microorganismo a concentraciones desde el 50% v/v como se observó en cada una de las figuras. Según un estudio de B. van Kingleren de 1995, en el cual se realizó un test de superficie (sin materia orgánica) empleando alcohol isopropílico a concentraciones de 30 a 70% y utilizando Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa como microorganismos de prueba, se logró estimar que la concentración mínima a la cual el alcohol isopropílico actúa eficazmente contra los microorganismos es del 40%; concentraciones menores a esta no inhiben eficazmente a los microorganismos a lo largo del tiempo, presentando en muchos casos crecimiento. Los resultados obtenidos confirman la efectividad y rapidez del alcohol isopropílico para inhibir el crecimiento de bacterias Gram positivas, Gram negativas y levaduras, a partir de la concentración del 50% v/v a un minuto de exposición. Los resultados anteriores confirman los observados en la tabla 1 del estudio realizado por Fraise en 1999, acerca del método de elección de desinfectantes, la cual da a conocer que el tiempo de exposición mínimo para la inhibición del crecimiento de bacterias 80 vegetativas y levaduras es de 1 minuto para una solución de Alcohol isopropílico al 70%. 7.1.1.1.2 Método del Coeficiente fenólico para el alcohol isopropílico USP “AOAC 955.11” En la figura # 28 se observan los resultados obtenidos durante los ensayos a diferentes concentraciones de alcohol isopropílico y fenol durante el tiempo con respecto a la inhibición de crecimiento de Escherichia coli. Figura 28 Método del coeficiente fenólico para Escherichia coli 81 Para el cálculo del número del coeficiente fenólico fue necesario determinar la concentración a la cual el desinfectante de prueba y el fenol inhiben a los microorganismos a los 10 y 15 minutos de exposición. En el caso de Escherichia coli la concentración de un 30% de alcohol isopropílico y 1.25%(1/80) de fenol fueron necesarias. Figura 29 Método del coeficiente fenólico para Salmonella enterica. Una concentración de un 30% de alcohol isopropílico y 1.25% (1/80) de fenol fue necesario para inhibir el crecimiento de Salmonella enterica durante los tiempos de exposición evaluados y con las condiciones para la selección de la concentración. 82 Figura 30 Método del coeficiente fenólico para Pseudomonas aeruginosa. Por otra parte, la concentración de fenol para Pseudomonas no presento ningún cambio con respecto a Escherichia coli y Salmonella enterica. Sin embargo, la concentración de un 50% de alcohol isopropílico fue necesaria para cumplir con los parámetros de selección. 83 Figura 31 Método del coeficiente fenólico para Staphylococcus aureus Las bacterias Gram positivas como es el caso de Staphylococcus aureus presentan una mayor sensibilidad a los agentes químicos (alcoholes y fenoles) de acuerdo a las características morfológicas descritas en el marco teórico. Para la inhibición de crecimiento de S. aureus a 10 y 15 minutos de exposición fue necesaria una concentración de un 30% de alcohol isopropílico y de 1.67% (1/60) de fenol. 84 Figura 32. Método del coeficiente fenólico para Candida albicans. Candida albicans por su parte evidenció que es necesaria una concentración de un 30% de alcohol isopropílico y de 1.42% (1/70) de fenol para la inhibición de crecimiento a los 10 y 15 minutos como tiempo de exposición. 85 El número del coeficiente Fenólico para cada uno de los microorganismos es el que se cita a continuación, siguiendo las normas establecidas por la AOAC para su respectivo cálculo. Tabla 12. Número del coeficiente fenólico Microorganismo Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Salmonella enterica Staphylococcus aureus Candida albicans Alcohol isopropílico Fenol Numero Coeficiente fenólico 30% 1/80 1.25% 24 50% 1/80 1.25% 40 30% 1/80 1.25% 24 30% 1/60 1.67% 17.96 30% 1/70 1.42% 21.11 En la tabla # 12 se observó la efectividad del alcohol isopropílico con respecto a la actividad biocida del fenol. Dando como resultado que el desinfectante es dieciocho veces más efectivo que el fenol con respecto a bacterias Gram positivas para el caso de Staphylococcus aureus, veintiún veces más efectivo para levaduras (Candida albicans), veinticuatro veces más efectivo para Escherichia coli y Salmonella enterica y cuarenta veces más efectivo para Pseudomonas aeruginosa. El orden de los resultados obtenidos coincide directamente con el grado de resistencia que tienen cada uno de los microorganismos estudiados y que fue claramente explicado en el marco teórico. Según el análisis estadístico realizado después de las pruebas in vitro se rechaza la hipótesis nula (Ho), debido a que el alcohol isopropílico demostró tener una rápida actividad bactericida y fungicida a la concentración de 70% v/v. Ningún microorganismo durante todo el estudio in vitro presento crecimiento después de ser expuestos a esta concentración de desinfectante. Las desviaciones estándar y las varianzas mostradas en la tabla (Anexo R) permiten evidenciar que la acción del 86 alcohol isopropílico al 70% v/v es constante. Los únicos microorganismos que presentaron crecimiento fueron E.coli y S. aureus en las pruebas carrier debido a la presencia de materia orgánica. 7.1.1.2 Pruebas soporte “Carrier”. 7.1.1.2.1 Método de la dilución de uso “AOAC 955.15”. En la evaluación de superficies, no se evidenció interferencia de la actividad bactericida del alcohol isopropílico al 70% sobre el acero inoxidable utilizando pequeñas concentraciones de materia orgánica (suero bovino) 0.01g/mL y 0.125g/mL. Esto confirma los resultados obtenidos por Bloomfield en 1993, en donde se analizó el efecto de la albúmina bovina a una concentración de 0.03g/mL como interferente ante la actividad bactericida de una solución al 70% de alcohol isopropílico, sobre láminas de acero inoxidable. Los resultados de ese estudio presentan una disminución en la actividad bactericida del alcohol isopropílico pero, esta se considera aún dentro de los límites de aceptación (reducción de más de 3 unidades logarítmicas de la carga microbiana). La figura # 33 muestra los resultados más detalladamente Figura 33 Selección de la concentración de materia orgánica. “evaluación de superficies”. 87 Varios autores reportaron que el alcohol isopropílico se inactiva o reduce su actividad bactericida cuando se expone frente a moderadas concentraciones de material orgánico. Tanto en el estudio realizado por Bloomfield en 1993 como en el presente trabajo, se debe tener en cuenta que los cilindros fueron sumergidos dentro de las soluciones de alcohol isopropílico. Es posible que la interferencia de materia orgánica en la actividad bactericida del alcohol isopropílico al 70% se vea reducida si se utiliza un mayor volumen de esta solución durante la limpieza, de esta forma se evita la rápida evaporación de la sustancia, se incrementa su potencia y lo más importante su tiempo de exposición a la superficie; algunas bibliografías recomiendan sumergir los materiales que requieren desinfección en soluciones de alcohol isopropílico al 70%( Rutala, 1996). Por otra parte en el ensayo de superficies, utilizando los cilindros de acero inoxidable y una concentración de materia orgánica de 0.25g/mL, se observó crecimiento bacteriano en la mayoría de los diez cilindros dentro de los tubos de caldo BHI. Escherichia coli y Staphylococcus aureus fueron identificados en los tubos positivos de las pruebas siguiendo los procedimientos propuestos. El método se realizó por triplicado a esta concentración con el fin de confirmar los resultados, los resultados se dan a conocer en la figura # 34. Figura 34. Resultados de la evaluación de superficie. 88 A pesar que el tiempo de exposición al desinfectante fue prolongado (10 minutos) el microorganismo creció, esto confirma la necesidad de complementar el proceso de limpieza de los equipos con sistemas de extracción de polvo (aspiradoras) y posteriormente el empleo de algún agente de limpieza (detergente) con el fin de remover la mayor cantidad de materia orgánica acumulada después de haberse manufacturado un producto. Después de este procedimiento el uso de un desinfectante es conveniente ya que se reduce la probabilidad de inactivación de su actividad bactericida al no haber materia orgánica que interfiera con su mecanismo de acción, en este caso denaturación de proteínas (Frey, 2007). Grandes concentraciones de material orgánico sobre una superficie de un área limitada como los cilindros provocará una mayor probabilidad de interferencia frente a la acción bactericida de un desinfectante, promoviendo el crecimiento de los microorganismos y su adherencia a la superficie de estudio, en este caso el acero inoxidable tipo 304. Los mecanismos por los cuales la materia orgánica puede interferir con la actividad de los desinfectantes son la adsorción del desinfectante a coloides de proteína, formación de complejos inertes poco activos y mediante la unión de los grupos activos del desinfectante, en este caso el grupo funcional (-OH) a proteínas extrañas propias del material orgánico. La inactivación del desinfectante y el fomento del crecimiento microbiano debido a la materia orgánica facilitan la formación de biofilms sobre las superficies. (Wirtanen et al, 2001) El método se llevó a cabo satisfactoriamente debido a que en los controles se obtuvieron los resultados esperados. En la prueba # 2 (control negativo) del método de superficies con E. coli y con S. aureus se observó la ausencia de crecimiento en todos los cilindros sumergidos en Caldo BHI, de igual manera, tampoco se evidenció crecimiento en el Caldo Leethen (medio neutralizante para el alcohol isopropílico). Los resultados de este control no se pueden ver por aparte sin tener en cuenta las otras 89 tres pruebas realizadas; La prueba # 3 (viabilidad de los microorganismos) permite comprobar que la presencia de los soportes no interfiere en el crecimiento de los microorganismos pero si funciona como un medio de transporte. Finalmente, las pruebas 4 y 5 de control microbiológico constatan que no hubo ninguna clase de contaminación microbiana (microorganismos ajenos al estudio) por parte de la materia orgánica y el soporte. De igual manera se decidió realizar un test de superficies in vivo con el Alcohol isopropílico preparado por los operarios en el área de manufactura; los resultados que se obtuvieron se observan en la figura # 35 Figura 35. Evaluación de superficies (In Vivo) – Alcohol isopropílico área de manufactura. Al observar el análisis de superficies con el Alcohol isopropílico del área de manufactura se obtuvo un 100% de crecimiento, el cual es causa principalmente de una preparación errónea en la dilución del Alcohol isopropílico e inclusive como se logró constatar en la evaluación con la dilución en tubo está tuvo que estar en una concentración inferior a un 50%, debido a que con los estudios realizados se ha 90 demostrado que esta concentración de Alcohol isopropílico es el límite critico en el cual se presenta crecimiento microbiano y que concentraciones superiores a esta no ha sido evidente hasta el momento presencia de un microorganismo en forma vegetativa. 7.1.2 Evaluación de la efectividad del detergente para la remoción de material orgánico. La figura # 36 de control de monitoreo de la efectividad de Alconox muestra que para ciertos productos la limpieza con el detergente se dificulta haciendo que no se cumpla con los límites establecidos por la compañía. Para que una limpieza sea aceptable no debe quedar más del 0.1% p/p del producto sobre la superficie teniendo en cuenta que este primer parámetro es para productos que contienen en sus componentes productos derivados de proteínas de alimentos considerados como alérgenos alimentarios. Estas sustancias ocasionan reacciones físicas y químicas en el cuerpo humano por lo que su limpieza se convierte en un punto crítico para los procedimientos de limpieza. (Validation Success, 2008) Un estudio realizado por Frey en el 2007 se establece que los residuos de los productos libres de alergénicos deben tener como máximo una concentración de 1/100 (1% p/p) y para los productos con alergénicos debe ser entre 1/1000 (0.1%p/p) y 1/10000 (0.01%p/p) dependiendo del tipo, teniendo en cuenta que el análisis se realiza después de un procedimiento de limpieza adecuado. 91 Figura 36. Efectividad de la limpieza con Alconox. Los productos que mayor resistencia presentaron a la limpieza por el detergente después del procedimiento fueron los productos que poseen extractos botánicos y vitaminas tal y como se observó en la figura anterior. Posiblemente esto se deba a que la densidad de las partículas de extractos botánicos y vitaminas es mayor a la del Alconox impidiendo que el surfactante (dodecil-benceno-sulfonato) realice adecuadamente el procedimiento de remoción. Cuando la materia orgánica es hidratada adquiere una contextura mucilaginosa que se adhiere fácilmente a cualquier superficie, la cual después de seca es difícil de remover, aumentando el tiempo de limpieza de la parte del equipo o material con suciedad. Según Alconox cuando estos casos se presentan es mejor aumentar la concentración del detergente a un 2%p/v y lavar con agua corriente caliente (60 a 70°C) (presión moderada) y no con agua estancada. Los ensayos realizados a esta concentración de trabajo frente a extractos botánicos y vitaminas fueron satisfactorios. 92 7.2 Proceso de limpieza manual. 7.2.1 Evaluación del proceso de limpieza según “limite físico, químico y microbiológico”. 7.2.1.1. Condiciones normales. La evaluación de la limpieza manual de los equipos de la compañía mediante un monitoreo periódico permitió observar la importancia de una limpieza adecuada de los equipos. La FDA aclara en su guía para la inspección de la validación de los procesos de limpieza del 2005, que no es necesario realizar una limpieza minuciosa cuando se manufacturan lotes consecutivos del mismo producto y no es necesaria su validación. Sin embargo, según la guía los procesos mayores de limpieza que requieren el desarme y empleo de agentes de limpieza si deben ser validados. Todas las muestras tomadas fueron de procesos de limpiezas mayores. Las Tableteadoras (JCMCO, Manesty Xpress y Betapress) y las Encapsuladoras (Bosch, Zanazi 40F y Model 10) fueron seleccionadas para realizar este monitoreo debido a que en estas se lleva a cabo uno de los principales pasos para la manufactura de los suplementos nutricionales. En consecuencia, su frecuencia de limpieza es mayor a las demás máquinas utilizadas en la compañía. LÍMITE FISICO Como parámetro principal se observaron las partes de las máquinas que tuvieron contacto directo con el producto. En general no se observaron residuos físicos sobre las superficies de las máquinas limpias a excepción de la Model 10 y Zanazi F40. La FDA no establece una cantidad o concentración específica para este límite. (FDA, 2005) LÍMITE MICROBIOLOGICO Los límites microbiológicos establecidos por la compañía para las superficies fueron seleccionados siguiendo los parámetros de la Federal Standard 209E y de USP NF- 93 2007, los cuales son de 100 ufc/24-30cm2 para bacterias y de 10 ufc/24-30cm2 para mohos y levaduras. En la industria Nutracéutica no es necesario trabajar en áreas estrictamente limpias como las clase 100 de las industrias farmacéuticas, pero si con una población microbiana baja, por eso se toman como límites las clases 10.000 y 100.000 de la Federal Standard 209E para las áreas de producción, adyacentes y de soporte de la industria Nutracéutica (USP-NF, 2007). En la figura # 37 se observa la efectividad del proceso de limpieza en consecuencia a la reducción de la población bacteriana por debajo de los límites de aceptación después de realizado el procedimiento. Figura 37. Control Microbiológico - Bacterias En general se observó una disminución de la carga microbiana sobre las superficies de la máquina después del proceso de limpieza manual. A cada una de las colonias diferentes macroscópicamente se les realizaron tinciones de Gram dando como resultado bacilos Gram negativos y bacilos Gram positivos esporulados. Estos últimos activan su mecanismo de resistencia (formación de esporas) cuando se encuentran en condiciones de estrés, como por ejemplo a la exposición a agentes químicos (alcohol isopropílico). Los mecanismos de resistencia de las esporas bacterianas al alcohol isopropílico y otros desinfectantes de clase intermedia son 94 citados por Russell (1998) donde se explican las características del recubrimiento de las esporas y la resistencia intrínseca que estos recubrimientos confieren a estas estructuras de resistencia. De igual forma los resultados se confirman con el estudio realizado por Fraise (1999), en el cual se dan a conocer las características generales de la actividad bactericida de la solución de alcohol isopropílico al 70% incluyendo su inefectividad frente a esporas bacterianas. Figura 38. Control microbiológico – Mohos y Levaduras Por otra parte en la figura # 38 se observa que hay una leve presencia de estructuras levaduriformes antes del proceso de limpieza sobre las tableteadoras. La eliminación de la levadura después de la limpieza permitió evidenciar nuevamente la efectividad de los agentes de limpieza y de igual manera el buen procedimiento realizado por los operarios a cargo. Los agentes de limpieza empleados durante el proceso son efectivos frente a este tipo de microorganismo, posiblemente debido a que su metabolismo y crecimiento no es tan acelerado como el de las bacterias lo que hace que no se puedan adaptar 95 rápidamente o adquirir resistencia frente al desinfectante. Según McDonnell (1999,) Los mohos y levaduras también poseen mecanismos de defensa intrínsecos que parecen no afectar la rápida acción biocida del alcohol isopropílico. Figura 39. Gráfica de Control Microbiológico – Bacterias, Mohos y Levaduras. 96 En la figura # 39 se observa el monitoreo realizado a las encapsuladoras tanto de bacterias como de mohos y levaduras. A cada una de las colonias diferentes macroscópicamente en las cajas de petri se les realizaron tinciones de Gram. En general se observaron bacilos Gram positivos esporulados y estructuras levaduriformes. En uno de los muestreos programados (Model 10) el cual presento un elevado recuento de microorganismos, se identificaron microscópicamente bacilos Gram positivos esporulados y estructuras levaduriformes. La presencia de una alta carga de microorganismos que supera los límites de aceptación después de un proceso de limpieza manual, puede deberse a los residuos del producto anterior o a un error durante el proceso de limpieza manual. Es por esto que las buenas prácticas de manufactura para suplementos nutricionales considera de vital importancia la capacitación, técnica y compromiso por parte del operario durante el proceso de limpieza. (CFR, Capitulo 21 parte 111) Los factores que pudieron haber influenciado para obtener resultados microbiológicos por encima de los límites de aceptación pueden ser: falla en la preparación de la solución de alcohol isopropílico, higiene personal deficiente, empleo de utensilios sin lavar o instrumentos indebidos para el proceso de limpieza. Los operarios deben estar en capacidad de diferenciar las limpiezas mayores de las menores y cuando cada una de estas debe ser realizada. En la mayoría de las observaciones realizadas la supervisión del proceso de limpieza era inexistente durante la limpieza de las piezas removibles de la máquina en el área de lavado, y poco frecuente cuando se realizaba la desinfección de los equipos. Las BPM’s (2007) ordenan que debe existir una supervisión frecuente a lo largo de todo el proceso de limpieza con el fin de asegurar la calidad de esta; más aún si se trata de un proceso de limpieza manual. 97 Otra de las partes que pueden afectar el proceso de limpieza son el origen y pureza de los ingredientes de los productos manufacturados dentro de la compañía. Para el caso de la Model 10 el suplemento nutricional se caracteriza por tener un extracto botánico dentro de sus ingredientes. Según la USP-NF (2007) las materias primas, excipientes y sustancias activas de los suplementos alimenticios pueden ser la primera fuente de contaminación microbiana teniendo en cuenta que una gran parte de sus productos usan extractos de origen botánico. Estos productos contienen una carga microbiológica natural principalmente formada por mohos y bacilos Gram positivos esporulados que pueden haber ocasionado la contaminación de la superficie de la máquina (USP-NF, 2007). Otro aspecto a tener en cuenta es que el proceso de limpieza de la compañía no está creado para la eliminación de esporas bacterianas. Para eliminar esporas bacterianas es necesario un tratamiento complejo. (Peng et al, 2002) En el estudio realizado por Peng es necesario el empleo de detergentes ácidos, alcalinos y desinfectantes como el hipoclorito de sodio, compuestos de amonio cuaternario a presión para una adecuada eliminación de esporas. Además, este afirma que los microorganismos esporulados y las levaduras aumentan su resistencia cuando logran adherirse a una superficie “Biofilms”. La formación de un biofilm en la máquina podría reducir o anular la actividad del desinfectante, propagando así el crecimiento bacteriano y la consecuente contaminación del producto. LÍMITE QUIMICO La cuantificación del límite químico se llevo a cabo ex situ. Los métodos utilizados para la cuantificación de residuos deben estar validados para dar una completa seguridad a los resultados. Los resultados de la tabla # 13 muestran los resultados obtenidos durante los análisis de cuantificación. 98 Tabla 13. Límite Químico en base al producto anterior Producto (Toma de Producto Elemento Muestra) Anterior analizado Extracto Botánico Multivitamínico para Jóvenes Multivitamínico para Mujeres Vitamina-B6 Multivitamínico para Perros p.p.m./Producto Suplemento Cr ND* Mineral Fe 1,67 Extracto Botánico Ca ND* Cr 0.02 Ácido Fólico 8.55 Piridoxina 29.67 Riboflavina 14.9 Tiamina 38.72 Suplemento Mineral Ácido Fólico + APAB Multivitamínico para niños *ND: No Detectable. Hay que tener en cuenta que las p.p.m obtenidas no son únicamente parte del residuo del producto anterior si no que por el contrario este resultado puede estar alimentado por los componentes del producto en análisis teniendo en cuenta que los elementos cuantificados pertenecen a cada uno de ellos en forma natural. Es por esto que la cuantificación de la mayoría de los residuos obtenidos está por encima del límite de aceptación. Sin embargo, es necesario que para la cuantificación de un elemento se deban tener en cuenta parámetros como la naturaleza del producto en análisis y las del producto anterior para así obtener un resultado específico. La cuantificación de los residuos del detergente se llevó a cabo mediante la cuantificación del fósforo perteneciente a los fosfatos del surfactante. En la tabla # 14 se observan los resultados. 99 Tabla 14. Cuantificación del fósforo. Alconox Producto mg Fosforo/Tab o Cap Extracto botánico 37.43 Multivitamínico/Multimineral 16.26 Complejo Vitamínico 13.63 Glucosamina 0.2995 Complejo vitamína B 7.24 En las pruebas realizadas no se encontraron residuos de fósforo por tableta o capsula analizada; las pequeñas cantidades encontradas pertenecen a las concentraciones que debe tener la tableta normalmente por sus excipientes (fosfato dicalcico). No obstante, en las observaciones que se realizaron durante el proceso de limpieza cabe destacar que no se tienen en cuenta las concentraciones de uso recomendadas por Alconox (2007) para realizar la limpieza de los equipos. Posiblemente la falta de información en cuanto a la preparación por parte de los operarios al realizar el proceso de limpieza hace que no sea preparado el detergente como el suplidor lo indica. Se debe tener en cuenta que estas concentraciones de uso recomendado están direccionadas hacia sistemas automatizados de limpieza CIP y COP como lo indica Bremer et al. (2006) que representó un sistema CIP a escala de laboratorio usando lavados con detergentes ácidos y básicos con similares preparaciones a las de Alconox. 7.2.1.2 Condiciones críticas Este método se aplica para la evaluación in vivo del proceso de limpieza de la compañía. Se escogió como producto un suplemento nutricional basado en la presencia de microorganismos benéficos (Lactobacillus sp.) La máquina en la cual se 100 llevo a cabo todo el proceso de producción fue la BOSCH, la cual tiene capacidad de producir entre 2000 y 2500 cápsulas por minuto. En la evaluación del proceso de limpieza se evaluaron límites físicos, químicos y microbiológicos. Para el límite físico tal y como se estableció, únicamente se utilizó la herramienta de “visualmente limpio”, Límite químico – toma de muestra del siguiente producto en proceso con su respectiva evaluación del ingrediente activo del producto anterior y por último, la evaluación del límite microbiológico. Terminado los procedimientos de limpieza se procedió a evaluar cada uno de los límites. En el límite físico se tuvo en cuenta aquellas partes que entran en contacto directo con el producto como por ejemplo el tanque de almacenamiento de producto en polvo y capsulas vacías, estación de llenado de las cápsulas vacías, y la bandeja de salida del producto. En cada una de las partes evaluadas se encontró después del procedimiento de limpieza residuo del producto en partes como la estación de llenado y el tubo de conexión entre el tanque de almacenamiento del producto y las estaciones de llenado. Esto se debe posiblemente a que aquellas partes no removibles de la máquina únicamente se les retira el producto con el empleo de una aspiradora seguido del empleo del desinfectante. Durante el control del límite químico se tomó una muestra del siguiente producto en producción al evaluado (Glucosamina) para la evaluación de la concentración del ingrediente activo (Lactobacillus sp) del producto anterior. Aunque la evaluación del ingrediente activo se le realice únicamente para sustancias químicas durante este trabajo se realizó la evaluación a la presencia de los microorganismos del género de Lactobacillus en las cápsulas de Glucosamina debido a que este es el ingrediente activo del producto anterior. El recuento que se obtuvo en las capsulas de Glucosamina fue de 1x101 UFC/mL, la presencia de este tipo de de microorganismos aunque no es perjudicial, esta no se encuentra declarada en la etiqueta del producto lo cual va en contra de las leyes establecidas por la FDA. 101 Para el control del límite microbiológico se tuvieron en cuenta la presencia de bacterias, mohos, levaduras y Lactobacillus, específicamente en aquellas partes de contacto directo con el producto. Los resultados que se obtuvieron se observan en la tabla # 15. Tabla 15 Resultados Recuento de Bacterias, Mohos y Levaduras – Límite microbiológico. BOSCH Después Antes Partes PC PDA Patógenos Moldes - Inyectores 0 ufc/25cm2 0 ufc/25cm2 Ausencia Hopper 22 ufc/25cm2 0 ufc/25cm2 Ausencia Tubo de Hopper 4 ufc/25cm2 3 ufc/25cm2 Ausencia Deduster 7 ufc/25cm2 0 ufc/25cm2 Ausencia Moldes - Inyectores 1 ufc/25cm2 0 ufc/25cm2 Ausencia Hopper 6 ufc/25cm2 1 ufc/25cm2 Ausencia Tubo de Hopper 98 ufc/25cm2 25 ufc/25cm2 Ausencia Deduster 34 ufc/25cm2 Ausencia 0 ufc/25cm2 La morfología de las colonias presentes en los recuentos consistían en estructuras levaduriformes, bacilos Gram negativos y bacilos Gram positivos esporulados y no esporulados. Las gráficas que se dan a conocer a continuación son los valores de los recuentos en placa obtenidos a partir de las partes evaluadas. 102 UFC / 25 cm2 Gráfica de control microbio ológico ‐ Worst Case W hos y Levaduras) (Moh 4 40 2 20 10 ufcc/25 cm2 0 Moldes ‐ ores Inyecto Antes Hop pper Tu ubo de D Deduster Ho opper P Partes maquin na Deespues Lim mite de aceptacción UFC / 25 cm2 Gráfica de control microbio ológico ‐ Worst Case W (Bacteriass) 100 uffc/25 cm2 100 1 50 0 des ‐ Mold Inyecttores Antes Ho opper TTubo de Deduster H Hopper P Partes maquin na Deespues Lim mite de Aceptación Figura 40 0 Gráfica de control c microb biológico en condiciones c crííticas (bacteriias, mohos y levaduras).. C respecto Con o a cada unaa de las gráfficas anteriorres se observvó claramennte que aunqque s haya reallizado una liimpieza tipoo A no huboo disminucióón en la carrga microbiaana se c como es el claro c ejemploo del recuennto del tubo de d Hopper. Lo L anterior ratifica r que los l p procedimien ntos durantee la limpiezza no se llevaron a caabo en la forma que se e encuentra esstablecida (eliminación de d producto en polvo). 103 Esto puede ser causa de la manipulación del material en el cuarto de limpieza, el procedimiento de limpieza de la parte, transporte del material limpio, toma y manipulación de la muestra. Cuando un resultado de un recuento sobrepasa los límites de aceptación se realiza un reporte siguiendo los conductos regulares estipulados en la compañía. Los recuentos que se obtuvieron de Lactobacillus antes y después del procedimiento de limpieza son los que se observan en la tabla # 16. Tabla 16 Recuento de Lactobacillus sp. – Límite microbiológico en condiciones críticas. Worst case Potencia Partes Inicio Final Hopper 40 x 102 10x102 Deduster 49x102 15x101 Con respecto a los recuentos la efectividad del desinfectante fue baja, lo cual se observó en la poco o nula reducción logarítmica de los Lactobacillus después del proceso de limpieza manual. Estos resultados no concuerdan con los de Bloomfield y colaboradores (1993) en donde se observó una reducción mayor a cinco unidades logarítmicas en bacterias Gram positivas utilizando una solución de Alcohol isopropílico al 70% v/v. Adicionalmente a esto, es necesario tener en cuenta que la presencia de materia orgánica interfiere con la actividad del desinfectante como se ha mencionado anteriormente. A pesar de que no se detectó una reducción logarítmica significativa, los procesos de limpieza actualmente establecidos y los controles microbiológicos existentes durante todo el proceso de manufactura aseguran un producto seguro para los consumidores, 104 esto se confirma mediante las pruebas de microbiología, potencia, identidad y residuos totales realizados al producto terminado. 105 8. CONCLUSIONES − Se validó el proceso de limpieza manual de la compañía, estandarizando las concentraciones y los tiempos de exposición que deben utilizarse para cada agente de limpieza, así mismo se estableció el proceso de limpieza adecuado para obtener resultados confiables y optimizar la limpieza de equipos realizada en la compañía − La concentración óptima de uso del alcohol isopropílico es de 70% v/v y el tiempo mínimo de exposición el cual garantiza la máxima eficiencia del desinfectante es de 5 minutos sobre la superficie del equipo. − El detergente demostró incrementar su eficacia en cuanto a la remoción de residuos utilizando el doble de la concentración recomendada (2% p/v), de igual manera esta concentración también demostró tener actividad bactericida frente a Staphylococcus aureus. − El proceso de limpieza y desinfección es eficaz siempre que se tengan presentes los procedimientos citados por el Procedimiento Operativo Estándar de la compañía, como se observó durante los monitoreos de control microbiológico. − Para la limpieza manual de equipos se deben tener en cuenta la capacitación y compromiso del operario así como el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Manufactura incluyendo la supervisión del proceso de limpieza. − El Alcohol isopropílico demostró ser un desinfectante eficaz en todas las pruebas realizadas tanto in vitro como in vivo, los análisis realizados permitieron observar que siempre y cuando este se prepare, use y almacene de la forma adecuada el desinfectante será eficiente. 106 − Tanto el Alcohol isopropílico como Alconox cumplen con los límites de aceptación establecidos lo cual significa una reducción en los riesgos de contaminación cruzada de los productos evitando tanto la contaminación microbiana y el paso de ingredientes de producto a producto. − Las concentraciones, temperaturas y tiempos de lavado utilizando Alconox dependen del producto manufacturado. Los suplementos que posean vitaminas y/o extractos botánicos se deben lavar con el doble de concentración recomendada de Alconox (2% p/v) y a una temperatura aproximada de 55 a 65°C según las instrucciones del suplidor. − El monitoreo del control microbiológico de las superficies de los equipos soporta los resultados de eficiencia de los estudios in vitro de los agentes de limpieza. Debido a que durante la mayoría del tiempo del estudio in vivo los límites se mantuvieron por debajo de los límites de aceptación. − Es importante continuar con la cuantificación de residuos después del proceso de limpieza mediante técnicas analíticas específicas validadas para obtener resultados confiables respecto a la seguridad que ofrece el proceso limpieza. − La limpieza manual de equipos es un método que inhabilita a la máquina durante un tiempo prolongado, esto incrementa los costos y entorpece la velocidad que pudieran tener los procesos de manufactura de suplementos nutricionales. − No se recomienda el uso del alcohol isopropílico a concentraciones por debajo del 50% v/v. En el trabajo se demostró la variabilidad y la poca efectividad que poseen concentraciones menores a la mencionada. 107 − Se confirmaron las características que posee el Alcohol isopropílico al 70% v/v, inhibiendo a las bacterias, mohos y levaduras en los monitoreos de control microbiológico (in vivo), y a las bacterias patógenas en los estudios in vitro. − El caso o condición extrema realizado del proceso de limpieza permitió observar la importancia de tener operarios calificados y con conocimientos de en BPM’s debido a que una de las posibles causas del incremento en la carga microbiana que se presento después del proceso de limpieza manual de equipos se deba al contacto del personal con la máquina. 108 9. RECOMENDACIONES − El personal debe estar capacitado de acuerdo a la forma en la cual se debe realizar el proceso de limpieza manual de equipos así como la preparación de los agentes de limpieza. − Se debe realizar una supervisión continua del proceso de limpieza, tanto en el área de lavado de piezas removibles como en el momento de realizar la desinfección. − Es importante determinar el método de limpieza (concentración de los agentes de limpieza, temperatura, tiempo de exposición, uso de utensilios, etc.) para cada grupo de suplementos manufacturados (vitaminas, minerales, extractos botánicos, etc.); en este estudio se demostró que la dificultad de remoción de los productos no es igual en todas las ocasiones. − Es conveniente realizar modificaciones y especificaciones al Procedimiento Operativo Estándar (POE) de la limpieza manual de los equipos. − Continuar con los monitoreos periódicos de las superficies de los equipos, esto colabora a soportar la calidad de la limpieza manual. − El alcohol isopropílico es una solución a la cual se le pueden adicionar sustancias que aumenten su acción bactericida; una mezcla de alcohol al 50% v/v con una solución de hipoclorito de sodio al 5.75% v/v (relación 1:1) potencia la acción bactericida, fungicida y virucida, de igual forma después de 30 minutos de exposición la mezcla puede llegar a tener acción esporocida. Esta solución puede ser utilizada cuando se manufacturen productos que contengan microorganismos esporoformadores. (MacDonell, Russell 1999) 109 − Tener elementos de transporte separados para los materiales que se van a lavar y los materiales que están limpios o en su defecto incluir dentro de la limpieza del equipo, el elemento de transporte utilizado. − El cuarto de lavado requiere de mantenimiento periódico y limpiado constante para evitar la acumulación de residuos de productos los cuales pueden propagar el crecimiento microbiano. 110 10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ‐ AGALLOCO, J. 1992. “Points to Consider” in the Validation of Equipment Cleaning Procedures. Journal of Parenteral Science &Technology. 46: 163168 páginas. ‐ AMIRMOZAFARI N. et al. 2006. Isolation and Identification of Anionic Surfactant Degrading Bacteria from Activated Sludge. Iranian Biomedical Journal. Iran University of Medical Science. Tehran. Iran. 11(2):81-87 páginas. ‐ AOAC Official Method 955.11. 1964. 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Cronología de la regulación para suplementos nutricionales Fuente: FDA, 2006 121 Anexo B. Diagrama de flujo para la obtención de un suplemento nutricional. (Ver archivo adjunto) 122 ANEXO C. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO GENERAL DE UN MEZCLADOR (BLENDER). Recoger y pesar las materias primas Agregar las materias primas como lo establece la fórmula del producto en la tolva del blender. Establecer la velocidad y el tiempo de las partes que realizan la mezcla TOLVA Movimiento circular BARRA ESTABILIZADORA Homogenización dentro de la tolva FIN DE LA HOMOGENIZACION Descargar la mezcla de materias primas en contenedores. Comparar el peso teórico del contenedor con el real (la variación no puede exceder 3%) Si las partículas de la mezcla son grandes se debe MOLER Solo para Tabletas Si las partículas de la mezcla son pequeñas se debe GRANULAR o ESLOGAR FIN 123 ANEXO D. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO GENERAL DE ENCAPSULADORA Las capsulas entran al contenedor de recepción El polvo pre-mezclado entra al contenedor de recepción El polvo pasa al contenedor de la estación de llenado (5). Las capsulas pasan a la estación de orientación y separación (1, 2). El polvo es succionado por inyectores Las capsulas organizadas pasan a segmentos (superior e inferior) que separan las capsulas por presión Las capsulas abiertas pasan a la estación de llenado (3). Las capsulas son llenadas con la cantidad predeterminada de polvo (4) Las capsulas pasan a la estación de selección de capsulas (7). Extrae las capsulas no abiertas, invertidas Las capsulas pasan a la estación de sellado donde son cerradas a presión por los segmentos (9). Finalmente pasan a la estación de eyección (10, 11). Un sistema opcional Deduster ayuda a la selección de las capsulas por el peso, las capsulas que no cumplan con el peso teórico son removidas por succión. FIN 124 UNA (1) (2) (3) (10) (4) (9) (7) Las encapsuladoras son sistemas rotatorios de alta velocidad que pueden manufacturar de 40.000 hasta 150.000 o más capsulas por hora. Existen en el mercado diferentes tipos de tamaño de capsula, los tamaños más utilizados son los 000 y los 00, estas capsulas pueden estar hechas de celulosa o de almidón. 125 ANEXO E. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO TABLETEADORA 126 GENERAL DE UNA ANEXO F DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO GENERAL DE UNA MAQUINA DE RECUBRIMIENTOS Y PINTURAS. Depositar las tabletas en la tolva Para un buen proceso de recubrimiento se deben tener en cuenta ciertos factores que se deben establecer previamente Velocidad y tiempo de rotación de la tolva Temperatura de secado Presión de los aspersores Establecer la inyección de aire de secado al equipo Composición de los recubrimientos y pinturas La rotación inicia y los aspersores aplican homogéneamente la mezcla de recubrimientos de lactosa, sacarosa, dextrosa o manitol a las tabletas. La temperatura de secado fija los recubrimientos a las paredes de la tableta para evitar que se despeguen. Los productos finales son analizados para probar que la tableta mantuvo sus condiciones organolépticas FIN 127 ANEXO G. Buenas Prácticas de Manufactura (BPM’s) para suplementos nutricionales – Código de Regulación Federal, Capitulo 21 parte 111. Buenas Prácticas de Manufactura para la producción, empaque, etiquetado u operaciones de mantenimiento de los suplementos nutricionales. Las BPM’s de la Industria Nutracéutica están más encaminadas hacia las BPM’s Farmacéuticas que hacia las BPM’s de alimentos (Crowley, 2006). Esta regla final está compuesta por catorce subpartes A-P en donde se dan a conocer las pautas y recomendaciones que se deben seguir para trabajar con BP Ms. Las subpartes son: - Subparte A - Generalidades - Subparte B - Personal - Subparte C - Planta Física y alrededores - Subparte D – Equipos y Utensilios - Subparte E – Requerimientos para establecer sistemas de control de producción y procesos. - Subparte F – Sistema de control de producción y procesos: Requerimientos para el control de calidad - Subparte G – Sistema de control de producción y procesos: Requerimientos para componentes, empaques y etiquetas, y para el producto recibido para empacas y etiquetar como Suplemento Nutricional - Subparte H – Sistema de control de producción y procesos: Requerimientos para la documentación máster de manufactura. - Subparte I – Sistema de control de producción y procesos: Requerimientos para la documentación de los lotes (batch). - Subparte J – Sistema de control de producción y procesos: Requerimientos para las operaciones de laboratorio 128 - Subparte K – Sistema de control de producción y procesos: Requerimientos para las operaciones de manufactura - Subparte L – Sistema de control de producción y procesos: Requerimientos para las operaciones de empaque y etiquetado. - Subparte M – Mantenimiento y Distribución - Subparte N – Devolución de Suplementos Nutricionales - Subparte O – Quejas de productos - Subparte P – Documentos y almacenamiento 1. Generalidades La normatividad para los suplementos alimenticios comienza en Octubre 25 de 1994 con la creación de DSHEA (Dietary Supplement Health and Education Act.) la cual estipula que deben haber buenas prácticas de manufactura para la fabricación de suplementos alimenticios, tomando como guía las buenas prácticas de manufactura en la industria alimenticia (CFR, 2007). En el año 2003 se lanza una nueva propuesta debido al crecimiento en el número de consumidores. A las BPM actuales se agregaron una serie de tópicos importantes como la inclusión de la obligatoriedad de la documentación de los procesos llevados a cabo, con el fin de llevar un registro o historial de las BPM’s utilizadas en el procedimiento. Finalmente la norma fue revisada por la FDA y finalmente en Junio 25 de 2007 publica oficialmente la norma que rige la producción y control de calidad de los suplementos nutricionales (CFR, 2007) La FDA es la entidad encargada de proponer las regulaciones para BPM para los ingredientes dietéticos y suplementos dietéticos, esta regulación establece las mínimas BPM que aseguran que el compromiso del productor en realizar cada una de sus actividades relacionadas con el proceso de manufactura, empaque o tiempo de espera de las materias primas o del mismo suplemento dietético hace que se asegure que el producto no podría estar adulterado. Además esta regulación hace que el 129 productor evalúe la identidad, pureza, calidad, dureza y composición de los ingredientes dietéticos (materias primas) y suplementos dietéticos (CFR, 2007). 2. Personal Supervisores de la compañía deben ser calificados para la toma de medidas necesarias para excluir alguna persona de sus operaciones si esta se conoce como fuente de contaminación microbiana. Las prácticas higiénicas y el procedimiento que se debe seguir cuando el personal se encuentra enfermo o infectado y así evitar la contaminación cruzada. Cuando el personal se encuentre enfermo: − No debe de entrar en contacto con ninguna de las áreas de almacenamiento, producción, etiquetado y empaque. − Debe excluirse de las áreas de trabajo y operaciones hasta que se obtengan los resultados del examen médico que certifique al supervisor de área que su permanencia no traiga como consecuencia una contaminación al producto por origen microbiano; una vez obtenido este tipo de resultado se le hace notificación al supervisor y de inmediato se reintegrara al empleado. Practicas Higiénicas: El Vestuario debe: − Evitar el contacto con componentes, producto y superficies. − Mantener una adecuada limpieza del personal. − Estar compuesto de gorro, tapa bocas, cubre zapatos y cubre barba (cuando aplique) 130 Personal Debe: − Lavarse y sanitizar si es necesario las maños antes de volver al sitio trabajo y cuando entre en contacto con un producto contaminado. − Retirarse las joyas u otros objetos que pueden caerse dentro de las materias primas, equipos, áreas de producción y empaque. − Usar guantes cuando las maños vayan a entrar en contacto con el producto o alguno de sus componentes, de la misma manera se deben usar en el momento de la limpieza de la maquinaria implicada en la fabricación del producto. No debe: − Almacenar vestuario en lugares donde entre en contacto con la producción de suplementos alimenticios − Reutilizar el vestuario cuando es desechable − Consumir alimentos, tomar bebidas, fumar y comer chicle en las áreas de producción − Usar maquillaje, esmalte, medicamentos para la piel o cualquier material extraño que pueda entrar en contacto con el producto. Calificación del personal Personal capacitado en las áreas de manufactura, empaque, etiquetado y despacho, además de identificar a la persona encargada del departamento de control de calidad y que esta a su vez tenga la capacidad de dirigir y delegar funciones (CFR, 2007). 3. Áreas Las áreas se deben mantener en condiciones que eviten la contaminación de los suplementos alimenticios, las áreas según la norma se divide en: El campo o alrededores, que es la zona externa de la industria y la planta física que es donde se da la producción de los suplementos alimenticios. 131 • Campos alrededor de la planta física: Para evitar posibles riesgos y peligros la norma ha propuesto una serie de observaciones que se deben seguir para los alrededores de la planta física son: (CFR, 2007) 9. Almacenamiento apropiado de equipos, remoción efectiva de basuras y cortar el césped (si lo hay) que este muy cerca de la planta física, con esto se evita la posible llegada de plagas o la reproducción de las mismas. 10. Mantener limpias las zonas de parqueo, las vías o patios cercanos a la planta física para evitar la contaminación. 11. Revisar que las zonas de drenaje estén en buen funcionamiento para evitar posibles filtraciones de desechos y por ende contaminación de los suplementos alimenticios. 12. Se debe tener un sistema de tratamiento de basuras fuera de la planta física para evitar la contaminación con los desechos, y reducir el impacto de contaminación causada por la industria. 13. En el caso que la empresa tenga un terreno aledaño con prados o pastos que no cumplan con estas especificaciones se deben intensificar los controles realizados dentro de la planta física. • Planta física: La planta física se debe mantener en perfecto estado reparando posibles fallas oportunamente y manteniendo limpias las instalaciones, para ello se deben usar agentes limpiadores, sanitizadores que estén libres de microorganismos patógenos y sean seguros bajo las condiciones de utilizó. No se deben usar sustancias toxicas en superficies en donde este expuesto el suplemento alimenticio, pero por otro lado estas sustancias pueden ser usadas para las siguientes labores: (CFR, 2007) 14. Para mantener limpio y sanitizado donde no allá contacto directo con el suplemento alimenticio 15. Para realizar pruebas en el laboratorio (pruebas de potencia) 16. En el mantenimiento de los equipos y la planta física 132 • Abastecimiento de agua y tuberías: El agua que ingresa a la planta física debe ser potable y tener una temperatura adecuada, se debe revisar que la presión con la que el agua entra por las tuberías sea optima para evitar posibles estancamientos los cuales ayudan a la proliferación de microorganismos que pueden afectar y contaminar el producto. Las tuberías de agua deben tener el ancho y largo necesario para abastecer a toda la planta física en cualquier momento y para cualquier emergencia (CFR, 2007). Por otra parte las aguas residuales deben tener su propia tubería y pasar por un sistema de tratamiento o por sistemas de neutralización que reduzcan su nivel de contaminación. (CFR, 2007) • Manejo de basuras: Las basuras son un vector de contaminación ya que pueden atraer plagas y la reproducción de las mismas, por lo que los desechos de la compañía deben salir sellados evitando olores y derrames (CFR, 2007). Es importante tener supervisores de salinización en las áreas de producción que estén revisando constantemente que los empleados cumplan con las normas establecidas y que todo se realice con el mínimo riesgo de contaminación del producto. (CFR, 2007) 3.1 Bodega La bodega es donde se realiza la recepción de las materias primas para la fabricación de los suplementos alimenticios, estos son almacenados, evaluados y clasificados para su posterior utilizó. A cada una de las materias primas que llegan a la bodega se les deben hacer pruebas de identidad para comprobar la pureza y demostrar que sirven para realizar suplementos alimenticios. A parte de los análisis que se realizan al recibir la materia prima, los supervisores de calidad también tienen que realizar un chequeo de los análisis y los métodos de 133 análisis que el proveedor realizo antes de en despachar la carga, se debe tener en cuenta los limites que maneja y las pruebas realizadas; después de esto se debe verificar que los resultados concuerden evidenciando de esta forma que la materia prima es estable (CFR, 2007). Tras aceptar el estado de las materias primas están ya pueden ser usadas para realizar suplementos alimenticios, aunque siempre se tienen que realizar controles periódicos tanto físicos (identidad, potencia, desintegración, estabilidad, entre otros) como microbiológicos para verificar y certificar que no se contamino el producto durante su proceso de producción. (CFR, 2007) 3.2 Manufactura En la zona de manufactura es donde se realiza la parte más importante en la fabricación de un suplemento alimenticio, esta zona incluye desde el pesado, la mezcla de las materias primas y su transformación a capsulas, tabletas o cápsulas liquidas. De igual forma es el sector con mayor riesgo de contaminación cruzada o la alteración en las características del suplemento alimenticio. En esta zona se encuentran las máquinas encargadas de mezclar, comprimir, sellar, pintar el suplemento alimenticio terminado. Manufactura es la zona en donde se tienen que llevar a cabo más controles a nivel microbiológico, químico y físico, con el fin de monitorear el suplemento alimenticio a lo largo del proceso (CFR, 2007). El control de calidad en la zona de manufactura esta dictado por la norma en el subtítulo K, dice que se deben tomar todas las precauciones necesarias para el manejo de los suplementos alimenticios con el fin de evitar la contaminación del producto, estas recomendaciones son: (CFR, 2007) 134 17. Realizar los procesos de manufactura bajo condiciones que eviten la contaminación del suplemento alimenticio y lo proteja contra la posible contaminación y crecimiento de microorganismos. 18. Lavar y limpiar los componentes de las máquinas que pueden contener grasas o aceites para prevenir la contaminación del suplemento alimenticio. 19. Para lavar, usar agua que cumpla con los estándares estatales, pare evitar que puedan contener posibles cargas microbianas que pueden contaminar el producto y en dado caso que el agua sea un componente del suplemento alimenticio, tiene que ser totalmente potable. 20. Realizar pruebas físicas, químicas y microbiológicas con el fin de verificar la estabilidad del producto durante el proceso. 21. Si es necesario esterilizar, pasteurizar, congelar, refrigerar, controlar el pH, la humedad, el Aw, con el fin de microorganismos y prevenir la descomposición. 22. Guardar o almacenar de forma segura los componentes de los suplementos alimenticios que son más susceptibles a la contaminación por microorganismos. Para ellos se deben leer las características de cada materia prima y clasificarla en la bodega. 23. Optimizar los procedimientos de manufactura con el fin de agilizar el proceso y proteger el suplemento alimenticio contra la contaminación. Algunos de los procedimientos que se pueden optimizar son: a. Limpiar y sanitizar las superficies de contacto con el suplemento alimenticio b. Usar control de temperaturas para evitar afectar las propiedades organolépticas del producto c. Usar controles de tiempo con el fin de evitar daño en la composición del producto. d. Con el fin de evitar la entrada de sustancias extrañas, tales como metales, y que puedan alterar la composición del suplemento alimenticio, para este caso de situaciones se pueden usar: • Filtros • Magnetos 135 • Detectores de metales 24. Identificar todas las líneas de procesos y máquinas usadas durante el proceso de manufactura indicando el numero de lote la máquina que se utilizó para el procedimiento, todo esto debe ir debidamente documentado, con el fin de llevar registro de las materias primas utilizadas y de cual hay exceso o deficiencia (CFR, 2007). 3.3 Empaque y Etiquetado El empaque y etiquetado es el último proceso que se lleva a cabo, el producto terminado ahora tiene que ser introducido en los recipientes contenedores mediante una serie de máquinas que llevan a cabo distintos procesos, estos son: llenado, introducción de algodón, poner la tapa del envase, sellar con plástico la tapa y finalmente etiquetar el envase. En el primer proceso mencionado es donde por última vez el producto está en contacto directo con alguna superficie, ya que después es introducido al envase y solo vuelve a tener contacto directo cuando un cliente lo use (CFR, 2007). Lo primero que se debe tomar en cuenta para empaquetar un suplemento alimenticio es un recipiente que asegure la calidad que lleva el producto y evite el contacto directo de este con el medio ambiente ya que esto podría ocasionar contaminación o la alteración de alguna de sus propiedades (CFR, 2007). Otra parte importante es la etiqueta del producto, la cual informa el contenido completo del recipiente, la etiqueta tiene que ser revisada electrónica y electroquímicamente para comprobar su estabilidad frente a condiciones adversas (CFR, 2007). Antes de comenzar a empaquetar y etiquetar se tiene que hacer un revisión minuciosa de los recipientes y las etiquetas verificando que el lote del producto que se va llenar 136 en los recipientes concuerden con las especificaciones de la etiqueta y el empaque. Las especificaciones son rangos de control en los diferentes procesos con el fin de asegurar la calidad de los suplementos alimenticios, y que sean empacados y etiquetados de una forma más segura. Estás especificaciones se dictan en la norma en el subtitulo E §111.70: 9. Se deben establecer especificaciones en cualquier paso o procedimiento que se lleve a cabo durante el proceso de manufactura con el fin de asegurar que se cumplan con los estándares de calidad y para que las características que se escriben en la etiqueta se ajusten a las llevadas en la documentación del control en manufactura. 10. A cada componente o materia prima que se usa en manufactura se le deben realizar una serie de análisis antes de comenzar a ser procesado, estos análisis son: 25. Establecer la identidad de la sustancia − Establecer la composición de la sustancia, realizando para ellos análisis de pureza, potencia y desintegración de la materia prima. Estas características deben ser iguales al principio y al final del proceso de manufactura. − Se deben establecer límites de alerta, límites de aceptación y límites de acción para los distintos tipos de contaminación que puedan alterar las características del producto. 11. Durante el proceso de producción de los suplementos alimenticios también se deben realizar controles para asegurarse que no se alteren las características del producto ni se contamine, por lo tantos es determinante volver a realizar las mismas pruebas escritas anteriormente. Todo esto tiene que ser revisado por el personal de control de calidad quien es el encargado de aceptar o no el producto según los límites previamente establecidos. 137 12. Las características que tiene el producto se deben especificar en la etiqueta para dar información al usuario de lo que está consumiendo, por otra parte, los empaques que tengan contacto directo con el suplemento alimenticio no pueden tener características que alteren la composición del suplemento alimenticio. 13. Para el suplemento alimenticio terminado también se deben establecer especificaciones (identidad, potencia pureza y composición final) así como los limites y las posibles causas de contaminación que pueden alterar el producto. 14. Si se recibe un producto de un proveedor para empacado y etiquetado, se deben realizar los respectivos análisis mencionados anteriormente para probar la calidad del producto. Para realizar un proceso de llenado, empaquetado y etiquetado en óptimas condiciones la norma en el subtitulo L redacta una serie de pasos que se deben llevar a cabo, estos son: (CFR, 2007) 26. Limpiar y sanitizar todos los instrumentos de llenados de las máquinas involucradas (empaque y etiquetado) en el proceso antes y después de correr un producto. 27. Proteger el suplemento alimenticio de la contaminación, especialmente de la contaminación por partículas de aire. 28. Establecer delimitaciones espaciales entre productos diferentes prevenir posibles mezclas. 29. Llevar un orden en los recipientes que se van usando con el fin de prevenir confusión entre el recipiente y el producto con que se llena, ya que el contenedor no es el mismo en todos los casos. 30. Asignar y delimitar un número de lote o número de control, es importante para la identificación y el seguimiento de un producto terminado, y también puede ser utilizado para establecer cuál sería una muestra estadísticamente significativa del lote para realizar los análisis de control de calidad y de esta forma verificar si el producto cumple con las especificaciones propuestas. 138 31. Remoción oportuna de los empaques o etiquetas que sean obsoletas para asegurar que no se vuelvan a usa en un futuro. Por otro lado, si en algún momento se cometió algún error durante el proceso, se tiene que hacer un re-empacado y etiquetado, pero este debe cumplir con las siguientes especificaciones para evitar posibles confusiones: 32. Solo se debe llevar a cabo el proceso siempre y cuando allá pasado por una revisión de control de calidad que acceda a este proceso. Si control de calidad no está de acuerdo con el proceso el producto puede ser eliminado o se puede realizar exámenes más avanzados para tomar una decisión. 33. Se debe examinar una muestra representativa del lote para verificar que con esta contaminado y que cumple con las especificaciones. 34. Los lotes que son rechazados deben ser puestos en cuarentena para verificar posteriormente la causa de la contaminación o la insuficiencia con el cumplimiento de las especificaciones. Por último siempre se debe mantener una documentación acerca de los procesos que se llevan a cabo para llevar un control interno de los lotes y productos que han sido empaquetados y etiquetados; la razón principal es la trazabilidad en caso de quejas o investigaciones por efectos adversos. (CFR, 2007). 3.4 Requerimientos para las operaciones de manufactura Todos los procedimientos que se llevan a cabo en el área de manufactura deben estar escritos y deben ser acatados. Los procedimientos establecidos deben asegurar que el producto manufacturado cumpla con las especificaciones finales. Durante la manufactura de los suplementos nutricionales se deben tener todas las precauciones 139 necesarias para prevenir la contaminación de los ingredientes o del producto (capsula, tableta, softgel, etc.), estas precauciones incluyen: - Se deben desarrollar las operaciones de manufactura de tal forma que se minimicen los riesgos de crecimiento bacteriano, bien sea en el producto o sobre la superficie de los equipos. - Lavar o limpiar los ingredientes que contengan residuos de suelo y otro contaminantes. - Utilizar agua que cumpla con las mínimas características requeridas por el estado y que no contamine los suplementos nutricionales cuando el agua se vuelva un ingrediente durante la manufactura de un suplemento. - Desarrollar análisis físicos, químicos y microbiológicos para asegurar la calidad a lo largo de todo el proceso de manufactura. - Almacenar los ingredientes y los suplementos que sean más sensibles a la contaminación microbiana en lugares especiales donde pueda ser prevenida. - Identificar y almacenar cualquier ingrediente o suplemento que este siendo revisado de forma tal que se prevenga la contaminación o la mezcla con otros ingredientes o suplementos. - Desarrollar pasos mecánicos tales (cortar, clasificar, inspeccionar, secar, mezclar, pulverizar, desintegrar y/o aislar). Con el fin de evitar de cualquier forma posible la contaminación de los ingredientes o los suplementos, algunos de los mecanismos son: o Limpiar y sanitizar las superficies de contacto. o Utilizar controles de temperatura o Utilizar controles de tiempo o Utilizo de métodos efectivos para detectar cualquier metal o cualquier otra sustancia extraña que pueda entrar al ingrediente, a la mezcla o al suplemento. 140 o Identificar todas las líneas de trabajo utilizadas durante el proceso de manufactura con el fin de identificar el lugar y el paso del proceso que se está llevando a cabo con el suplemento. - Se debe tener toda la documentación necesaria con todos los procedimientos utilizados para asegurar la operación de manufactura. 3.5 Equipos y utensilios Los equipos y utensilios se deben: − Calibrar los instrumentos que son usados en el área de manufactura o que son utilizados para evaluar alguno de los componentes del producto. − Calibrar, inspeccionar y revisar el equipo automático, mecánico y electrónico − Realizar un adecuado mantenimiento, limpieza y sanitizar cuando sea necesario al equipo, los utensilios y algunas superficies que entren en contacto el producto. − Los equipos y utensilios deben tener un adecuado diseño, construcción y desempeño para que los procedimientos de limpieza sean realizados de la manera apropiada Los equipos deben: − Incluir una bodega para almacenar el producto no utilizado en el proceso de manufactura − Usar aire comprimido o gas − Usar un sistema automático, mecánico o electrónico − Tener un diseño apropiado para que el producto no entre en contacto con lubricantes, combustibles, fragmentos metálicos o de vidrio y otros materiales extraños. Todos los equipos y utensilios que se utilizan deben: 141 − Tener una instalación y mantenimiento que facilite la limpieza del equipo, utensilios y de todos los espacios adyacentes a ellos. − Ser resistentes a la corrosión − Ser fabricados en materiales no tóxicos − Proteger durante el proceso de manufactura al producto − Estar correctamente diseñados para que eviten la acumulación de producto residual u otros productos que se puedan acumular en áreas muertas o inaccesibles y que puedan traer como consecuencia una contaminación cruzada. − Estar diseñados y construidos en un material resistente a los componentes del producto, a los agentes de limpieza y agentes sanitizantes. Cada uno de los congeladores, refrigeradores y otros compartimentos que se usen para el almacenamiento en frio del producto deben: − Tener un record de temperaturas promedio, máximas y mínimas. − Sistema de alarma automático que indique un cambio significativo de temperatura durante el proceso. Los instrumentos y controles usados en manufactura, empaque, etiquetado o que son utilizados para la manipulación del producto y de aquellos instrumentos que se utilizan para medir, regular o llevar el record de temperaturas, pH, actividad del agua u otras condiciones para el control o prevención del crecimiento de microorganismos u otra contaminación deben: − Ser exactos y precisos − Ser adecuadamente mantenido y numerado para los distintos propósitos para los cuales fue creado. 142 Todo tipo de instrumentos y controles que son usados para la fabricación del producto se deben calibrar: − Antes de su primer uso − Frecuencia según lo indique manual de uso de cada uno de los instrumentos − En cada intervalo de producción o cuando sea necesario para ajustar la precisión y exactitud del instrumento. − Cada vez que se repara o remplaza una pieza del equipo Se deben tener limpio y sanitizado si es necesario, todo el equipo y utensilios que son utilizados en el área de manufactura, empaque, etiquetado y despacho o cualquier superficie u instrumento que entre en contacto con el producto, además de asegurarse que todas las superficies que entran en contacto con el producto estén debidamente limpias y sanitizadas antes de su uso y después de su uso. El equipo de limpieza debe de ser portátil para que este en ningún momento entre en contacto con superficies de trabajo. El uso del equipo automático, mecánico y electrónico en las áreas de manufactura, empaque, etiquetado y equipos que estén en contacto directo con el producto deben: − Estar diseñados y seleccionados adecuadamente para que las características del producto sean constantes durante la producción. − Determinar que el producto va a cumplir con las características que se requieren durante el proceso cuando el equipo opere bajo límites máximos y mínimos. − Calibrar, inspeccionar o revisar habitualmente el equipo para asegurar su buen funcionamiento. 143 − Establecer un apropiado uso del equipo automático, mecánico y electrónico (incluyendo su software) en las áreas de manufactura, empaque, etiquetado y que el protocolo de uso cuente con previa autorización del jefe de control de calidad en cada una de las áreas. − Usar adecuadamente los controles de los equipos en cada una de las áreas para asegurar un buen funcionamiento respecto al uso asignado. 3.6 Documentación Se debe tener documentación por lo menos pasado un año y medio pasado la vida útil del producto si no está especificada su vida útil, por el contrario si la vida útil es descrita se deben mantener registros hasta dos años después de expirado el producto (CFR. 2007). Se debe tener también los documentos originales como registro escrito o electrónico. La FDA está en capacidad de pedir cualquier documento de cualquier área, se debe hacer una copia de todos los documentos requeridos por la FDA y continuar con el almacenamiento de documentación (CFR, 2007). 144 ANEXO H Ventajas y Desventajas de algunos desinfectantes Fuente: Wirtanen, 2003 145 ANEXO I FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD DE LOS ANTIMICROBIANOS ‐ ‐ ‐ AGUA ‐ ‐ NUMERO DE MICROORGANISMOS Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO TEMPERATURA ‐ Bacterias Gran negativas como Pseudomonas sp. Son más resistentes a los agentes limpiadores Las bacterias que están en fase logarítmica son más susceptibles a las que se encuentran en la fase estacionaria ‐ El rango de eliminación aumenta a medida que aumenta la temperatura ‐ Los bactericidas ácidos (aniónicos) son más efectivos a pH bajo Los bactericidas catiónicos tienden a ser inhibidos por pH bajos y/o aniones Las soluciones acidas, tienen mayor efecto bactericida si se calienta, ya que el calor tiende a aumentar la disociación de los ácidos. El material orgánico puede inactivar gran parte o todo el agente limpiador; por esta razón se debe añadir grandes volúmenes de agente limpiador para que actúe sobre los microorganismos. ‐ pH ‐ ‐ MATERIA ORGANICA ‐ ‐ TIEMPO Solvente de los productos de limpieza y desinfección Arrastra la suciedad Aumenta el efecto letal del calor sobre lo microorganismos Aguas duras (Calcio y Magnesio), reduce la capacidad antiséptica. El tiempo de contacto con la superficie de aplicaron es de gran importancia para la desinfección. El tiempo necesario para desinfectar diversas sustancias, depende del contacto, concentración y otros factores. Fuente: Arias, 2005 146 ANEXO J. 2.8 Descripción de limpieza manual de equipos. 145 146 ANEXO K - Diagrama general pruebas In Vivo e In vitro 147 ANEXO L Susceptibilidad antimicrobiana (KIRBY-BAUER) 148 149 ANEXO M DIAGRAMA DE FLUJO TÉCNICA DEL COEFICIENTE FENÓLICO Preparación de soluciones de alcohol isopropílico y fenol. Vf= 5mL Preparación de la solución del microorganismo. Bacterias = 24 horas Levadura= 72 horas Set de Evaluación ‐ ‐ ‐ Dieciséis tubos de caldo BHI Dos diluciones de fenol Tres diluciones de alcohol isopropílico. Evaluación a tres tiempos de exposición 5, 10 y 15 minutos. Adición de 0,5 mL del microorganismo prueba a la solución del desinfectante. Cumple el tiempo de exposición de la solución del microorganismo y desinfectante ld Incubar a la temperatura y tiempo adecuado dependiendo del microorganismo. 150 Lectura de Resultados Cálculo del número del coeficiente fenólico El número del coeficiente fenólico se calculó después de haber realizado la metodología por triplicado cumpliendo con los parámetros establecidos para su debido cálculo. 151 ANEXO N DIAGRAMA DE FLUJO – PRUEBA EN SOPORTE “Carrier”. Preparación del pool de microorganismo (Escherichia coli y Staphylococcus aureus) con 54, 48 y 24 horas de incubación. Esterilización de los soportes a 15 lbs de presión a 121˚C por 15 minutos. Preparación de la solución de alcohol isopropílico al 70%. Preparación y esterilización del caldo Leethen y caldo BHI. Preparación de la solución de materia orgánica (Suero bovino) Parámetros para la evaluar en la evaluación de superficies. Prueba # 1 Del volumen final del pool de microorganismos tomar la mitad del volumen y adicionarlo en un contenedor estéril. En igual proporción adicionar la solución de materia orgánica al pool de microorganismos Servir 5 mL de la solución del microorganismo y materia orgánica en tubos estériles 152 10 Tubos Con la ayuda de un gancho estéril tomar un soporte y adicionarlo a solución de materia orgánica y microorganismo Incubar por 30 minutos a 35˚C +/‐ 2 Con la ayuda de un gancho estéril tomar el soporte y colocarlo en la superficie del papel filtro (caja de petri) Incubar por 30 minutos a 35˚C +/‐ 2 Con la ayuda de un gancho estéril tomar el soporte y colocarlo en la solución de alcohol isopropílico por 10 minutos. Con la ayuda de un gancho estéril tomar el soporte y colocarlo el caldo leethen por 30 minutos. Con la ayuda de un gancho estéril tomar el soporte y depositarlo en el caldo BHI. Incubar Caldo Leetheen y Caldo BHI. Tubos positivos (crecimiento) realizarles pase a Agar nutritivo TSA Realizar tinción de Gram Pases a agar selectivos: Escherichia coli = EMB; Staphylococcus aureus Vogel Johnson 153 Test Coagulasa: Staphylococcus aureus Prueba # 2 Servir en tubos estériles 5 mL únicamente del pool de microorganismos. 10 Tubos Con la ayuda de un gancho estéril tomar un soporte y adicionarlo a solución de materia orgánica y microorganismo Incubar por 30 minutos a 35˚C +/‐ 2 Con la ayuda de un gancho estéril tomar el soporte y colocarlo en la superficie del papel filtro (caja de petri) Incubar por 30 minutos a 35˚C +/‐ 2 Con la ayuda de un gancho estéril tomar el soporte y colocarlo en la solución de alcohol isopropílico por 10 minutos. Con la ayuda de un gancho estéril tomar el soporte y colocarlo el caldo leethen por 30 minutos. Con la ayuda de un gancho estéril tomar el soporte y depositarlo en el caldo BHI. Incubar Caldo Leetheen y Caldo BHI. 154 Tubos positivos (crecimiento) realizarles pase a Agar nutritivo TSA Realizar tinción de Gram Pases a agar selectivos: Escherichia coli = EMB; Staphylococcus aureus Vogel Johnson Test Coagulasa: Staphylococcus aureus Prueba # 3 Servir en un tubo estéril 5mL del pool de microorganismos Con la ayuda de un gancho estéril tomar un soporte y adicionarlo a solución de materia orgánica y microorganismo Incubar por 30 minutos a 35˚C +/‐ 2 Con la ayuda de un gancho estéril tomar el soporte y colocarlo en la superficie del papel filtro (caja de petri) Incubar por 30 minutos a 35˚C +/‐ 2 Con la ayuda de un gancho estéril tomar el soporte y colocarlo el caldo leethen por 30 minutos. Con la ayuda de un gancho estéril tomar el soporte y depositarlo en el caldo BHI. Incubar Caldo Leetheen y Caldo BHI. 155 Tubos positivos (crecimiento) realizarles pase a Agar nutritivo TSA Realizar tinción de Gram Pases a agar selectivos: Escherichia coli = EMB; Staphylococcus aureus Vogel Johnson Test Coagulasa: Staphylococcus aureus Prueba # 4 Se tomó 1 mL de la sln de materia orgánica Adicionarlo en caldo BHI Incubar por 35˚C +/‐ 2 por 48 Pase agar Nutritivo Si hay crecimiento Tinción de Gram Pases agares selectivos (M.O Patógenos) Prueba # 5 Con la ayuda de un gancho estéril tomar un soporte Transferirlo al caldo BHI Incubar por 35˚C +/‐ 2 por 48 156 Lectura por presencia o ausencia de turbidez Si hay crecimiento Pase agar Nutritivo Tinción de Gram Pases agares selectivos (M.O Patógenos) La lectura de resultados se realizó con base a la siguiente tabla: (prueba # 1 y 2) Número de tubos Interpretación La materia orgánica interfiere > 8 tubos positivos en la acción bactericida del desinfectante sobre la superficie. La actividad del desinfectante se ve afectada, para mayor 5 a 7 tubos positivos seguridad repetir la prueba o aumentar la concentración de materia orgánica. La < 5 tubos positivos interfiere en orgánica la no actividad bactericida del desinfectante sobre la superficie. materia 157 ANEXO O Evaluación de la efectividad de la remoción de material orgánico por parte del detergente Se preparó una solución de Alconox 1% (detergente) Se preparó una solución de materia orgánica al 1%. Soportes acero inoxidable (limpios) Pesar los soportes limpios (Ci) Con la micropipeta adicionar 0.5 mL al soporte Dejar secar Pesar nuevamente los soportes (Cs) Adicionarlos a la canasta de disolución Vaso de disolución con la solución del detergente Sumergirlo aproximadamente por 50 veces Extraer los soportes de la canasta de disolución Lavar los soportes con agua destilada 158 Dejar secar Pesar nuevamente los soportes (CL) Calcular el porcentaje de residuo restante 159 ANEXO P PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO • Agar Plate Count (PC) Composición Ingredientes Digerido pancreático de caseína Extracto de levadura Dextrosa Agar Concentración g/L 5.0 g 2.5 g 1.0 g 10.0 g Disolver 23.5 g del polvo en 1 L de agua y mezclarlo. Calentar con agitación frecuente y dejar hervir durante 1 minuto. Autoclave a 121°C por 15 minutos finalmente ajuste el pH a 7.0+/-0.2. • Agar Papa Dextrosa (PDA) Composición Ingredientes Almidón de papa Dextrosa Agar Concentración g/L 4.0 g 20. g 15.o g Suspender 39 g de polvo en un litro de agua estéril y agitar para mezclar. Calentar con agitación y dejar hervir durante 1 minuto. Autoclave a 121°C por 15 minutos. Para promover el crecimiento de hongos y levaduras ajuste el pH a 3.5 adicionando 14 mL de una solución de acido tartárico al 10%v/v por cada litro de medio preparado. El medio se debe usar después de agregado el acido ya que si se solidifica no se puede recalentar para servir. o Preparación de la solución de Acido Tartárico al 10%v/v Pesar 9.99 g de acido tartárico al 99% teniendo en cuenta sus precauciones de uso. Disolver en 99 mL de agua destilada estéril. 160 • Agar Tripticasa Soya (TSA) Composición Ingredientes Digerido pancreático de caseína Digerido enzimático de soya Cloruro de Sodio Agar Concentración g/L 15.0 g 5.0 g 5.0 g 15.0 g Suspenda 40 g de medio en un litro de agua destilada estéril y mezcle vigorosamente. Caliente con agitación y deje hervir por 1 minuto. Autoclave a 121°C por 15 minutos. Ajuste el pH a 7.0+/- 0.2 • Caldo Brain Hearth Infusion (BHI) Composición Ingredientes Infusión de cerebro corazón Digerido péptico de tejido animal Digerido pancreático de gelatina Dextrosa Cloruro de Sodio Fosfato di-sodio Concentración g/L 6.0 g 6.0 g 14.5 g 3.0 g 5.0 g 2.5 g Suspenda 38 g de medio en 1 L de agua destilada estéril y agite fuertemente. Caliente con frecuente agitación y deje hervir durante 1 minuto. Autoclavar a 121°C por 15 minutos. Ajuste pH a 7.4 +/-0.2 y sirva en tubos de 17x100mm. • Caldo Lactosa Composición Ingredientes Extracto de carne Digerido pancreático de gelatina Lactosa Concentración g/L 3.0 g 5.0 g 5.0 g 161 Disuelva 13 g de medio en un litro de agua destilada estéril y agite vigorosamente para mezclar. Autoclave a 121°C por 15minutos. Ajuste pH 6.9 +/-0.2 Servir en tubos de 17x100mm. • Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) Composición Ingredientes Digerido pancreático de gelatina Lactosa Sacarosa Fosfato di Potásico Eosina Y Azul de metileno Agar Concentración g/L 10.0 g 5.0 g 5.0 g 2.0 g 0.4 g 65 mg 13.5 g Suspenda 36 g de medio en un litro de agua destilada estéril, mezcle vigorosamente. Caliente con agitación frecuente y deje hervir durante 1 minuto. Autoclave a 121°C por 15 minutos, enfrié a 44°C ajuste el pH a 7.2+/-0.2 y sirva en cajas de petri. • Agar Mc Conkey Composición Ingredientes Digerido pancreático de caseína Digerido Pancreático de gelatina Digerido péptico de tejido animal Lactosa Sales Biliares Cloruro de Sodio Agar Rojo Neutro Cristal Violeta Concentración g/L 17.0 g 1.5 g 1.5 g 10.0 g 1.5 g 5.0 g 13.5 g 0.03 g 1.0 mg 162 Suspenda 50 g de medio en un litro de agua destilada estéril mezclar vigorosamente. Caliente con agitación y hierva durante 1 minuto. Autoclavar a 121°C por 15 minutos, dejar enfriar hasta 50 - 55°C, ajuste el pH a 7.4+/-0.2 y sirva en cajas de petri. • Agar Hektoen Composición Ingredientes Digerido péptico de tejido animal Extracto de levadura Sales biliares Lactosa Sacarosa Salicina Cloruro de Sodio Tiosulfato de Sodio Citrato Férrico de Amonio Agar Azul de Bromotimol Fuchina ácida Concentración g/L 12.0 g 3.0 g 9.0 g 12.0 g 12.0 g 2.0 g 5.0 g 5.0 g 1.5 g 13.5 g 64.0 mg 0.1 g Suspenda 75 g de medio en un litro de agua destilada estéril y mezcle para homogenizar. Caliente hasta ebullición con frecuente agitación. NO SOBRECALIENTE Y NO AUTOCLAVE. Deje enfriar a una temperatura de 50 a 55°C, ajuste el pH 7.5+/- 0.2 y sirva en cajas de petri. • Agar XLD Composición Ingredientes Xilosa L-Lisina Lactosa Sacarosa Cloruro de Sodio Extracto de levadura Rojo de fenol Concentración g/L 3.5 g 5.0 g 7.5 g 7.5 g 5.0 g 3.0 g 0.08 g 163 Desoxicolato de sodio Tiosulfato de Sodio Citrato Férrico de amonio Agar 2.5 g 6.8 g 0.8 g 13.5 g Suspenda 55 g de polvo en un litro de agua destilada estéril y mezcle para homogenizar. Calentar con frecuente agitación hasta antes de que el medio hierva. NO SOBRE CALENTAR NI AUTOCLAVAR. Deje enfriar de 55 a 50°C, ajuste el pH 7.2 +/-0.2. Utilícelo inmediatamente después de alcanzar esta temperatura sirviéndole en cajas de petri. • Agar Vogel Johnson Composición Ingredientes Triptona Extracto de levadura Manitol Fosfato Di potásico Cloruro de Litio Glicina Agar Rojo Fenol Concentración g/L 10.0 g 5.0 g 10.0 g 5.0 g 5.0 g 10.0 g 15.0 g 25.0 mg Disuelva 60 g del polvo en un litro de agua destilada estéril y mezcle para homogenizar. Caliente en constante agitación y hierva durante 1 minuto. Autoclave a 121°C por 15 minutos. Enfrié de 45 a 50°C. Adicione 20 mL de telurito de sodio al 1% y agite. Ajuste el pH 7.2 +/-0.2 y sirva en cajas de petri. • Agar MRS Composición Ingredientes Peptona Proteica No. 3 Extracto de Carne Extracto de levadura Concentración g/L 10.0 g 10.0 g 5.0 g 164 Dextrosa Polisorbato 80 Citrato de amonio Acetato de Sodio Sulfato de Magnesio Sulfato de Manganeso Fosfato di potásico Agar 20.0 g 1.0 g 2.0 g 5.0 g 0.1 g 0.05 g 2.0 g 15.0 g Disuelva 70 g de medio en un litro de agua destilada estéril y mezcle vigorosamente. Caliente con agitación y deje hervir por 1 minuto. Autoclave a 121°C por 15 minutos. Ajuste el pH a 6.5 +/-0.2. Deje enfriar en baño termostatado a 55 - 50°C. • Agar Cetrimide Composición Ingredientes Digerido pancreático de gelatina Cloruro de magnesio Sulfato de potasio Cetrimide Agar Concentración g/L 20.0 g 1.4 g 10.0 g 0.3 g 13.6 g Suspenda 45.3 g de polvo en un litro de agua destilada estéril y mézclelo con 10 mL de Glicerol ultra puro. Caliente con agitación frecuente y hierva durante 1 minuto. Autoclave a 121°C por 15 minutos. Deje enfriar hasta 55 - 50°C ajuste el pH 7.2+/-0.2 y sirva en cajas de petri. • Agua de peptona 0.1% Composición Ingredientes Peptona Cloruro de Sodio Concentración g/L 10.0 g 5.0 g 165 Disuelva 15 g de polvo en un litro de agua destilada estéril. Caliente con agitación frecuente y deje hervir durante 1 minuto. Autoclave a 121°C por 15 minutos. Ajuste el pH a 7.2 +/-0.2. Deje enfriar de 50 a 55°C y sirva en el contenedor para su uso determinado. • Caldo Letheen AOAC modificado Composición Ingredientes Polisorbato 80 Peptona Cloruro de Sodio Concentración g/L 5.0 g 10.0 g 5.0 g Disuelva 5 g de polisorbato 80 en 400 mL de agua destilada estéril y caliente con frecuente agitación, hierva hasta que el caldo quede translucido. Adicione 10 g de peptona y 5 g de cloruro de sodio en 600 mL de agua destilada estéril para completar un volumen final de un litro. Caliente con agitación frecuente y deje hervir durante 10 minutos. Ajuste el pH a 7.0+/-0.2 y sirva en tubos de 17x100mm. Autoclave a 121°C por 20 minutos. 166 ANEXO Q. FORMATO DE TABLA DE RESULTADOS 1. Evaluación de la efectividad de los agentes de limpieza 1.1. Técnico de dilución en tubo Initial Recount Alconox Tube Plate Tube Plate 0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 50% 70% 80% 50% 70% 80% 1' 5' 15' Initial Recount Alconox Tube Alcohol Plate (ufc/mL) Tube Plate (ufc/mL) 0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 50% 70% 80% 50% 70% 80% 1' 5' 15' Initial Recount Alconox Tube Alcohol Plate (ufc/mL) Tube Plate (ufc/mL) 0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 50% 70% 80% 50% 70% 80% 1' 5' 15' Initial Recount Alconox Tube Alcohol Plate (ufc/mL) Tube Plate (ufc/mL) 0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 50% 70% 80% 50% 70% 80% 1' 5' 15' Initial Recount Alcohol Alconox Tube Alcohol Plate (ufc/mL) Tube Plate (ufc/mL) 0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 50% 70% 80% 50% 70% 80% 1' 5' 15' 167 1.2 Método del coeficiente fenólico Microorganism Time Inoculum 1. E. Coli Microorganism Microorganism Microorganism Microorganism 50% 70% 5' 10' 15' Time Fenol Alcohol Tube Tube 1/80 1/90 30% 50% 70% 5' 10' 15' Time Fenol Alcohol Tube Tube 1/70 1/80 30% 50% 70% 5' 10' 15' Time Fenol Alcohol Tube Tube 1/60 1/70 30% 50% 70% 5' 10' 15' Time 5. Salmonella Tube 30% 4. Staphylococcus aureus Tube 1/90 3. Candida albicans Alcohol 1/80 2. Pseudomonas Phenol Fenol Alcohol Tube Tube 1/90 1/100 30% 50% 70% 5' 10' 15' 168 2. Evaluación de superficies Microorganims 1. E.coli Microorganims 2. S. aureus LB Mod. BHI Gram Medios Selectivos C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 LB Mod. BHI Gram Medios Selectivos C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 169 3. Evaluación de efectividad de la limpieza con Alconox. ESTUDIO DE EFECTIVIDAD DE LA LIMPIEZA CON ALCONOX® Nombre del Producto Fecha AF Lot# Peso Inicial (g) 170 Peso con producto (g) Peso Limpio (g) 4. Monitoreo físico, químico y microbiológico 5. Evaluación del proceso de limpieza - caso o condición extrema 171 ANEXO R ANÁLISIS DE VARIANZA DE LAS PRUEBAS IN VITRO * Los resultados esperados se clasificaron de acuerdo a la inhibición total del crecimiento (Satisfactorio) y en la no inhibición total o parcial del crecimiento (No satisfactorio). 172 Piedrahita-Navarrete Diana Carolina 1 Forero-Vargas Rafael Alberto ANALYSIS AND EVALUATION OF MANUAL CLEANING PROCESSES OF EQUIPMENT USED IN DIETARY SUPPLEMENTS MANUFACTURING. ANALISIS Y EVALUACION DE LOS PROCESOS DE LIMPIEZA MANUAL DE EQUIPOS DE MANUFACTURA EN UNA INDUSTRIA NUTRACEUTICA. -Evaluation of Manual Cleaning ProcessD. Piedrahita1, R. Forero1, J. Arias2, D. Congote3 Quality Control Department1, Javeriana University Industrial Microbiology Career Director2, Quality & Regulatory Affairs Manager3. [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected] Arnet Pharmaceutical Corp - 2525 Davie Road, Bldg. 330 - Fort Lauderdale. Florida 33317. United States of America. Abstract The effectiveness of an anionic detergent (Alconox) and a disinfectant (Isopropyl Alcohol) utilized during the manual cleaning of manufacturing equipment were evaluated in this study. In vitro tests were separated in two parts: suspension and carrier test. Suspension tests were the Phenol Coefficient (AOAC 955.11), Kirby-Bauer disk diffusion method and Tube dilution method, while carrier test was the Use dilution method (AOAC 955.15). In vivo test was carried out by taking swab samples of the equipment’s surfaces before and after the cleaning process in order to identify the residues and microorganisms left behind the cleaning process. The process was then evaluated by the worst case scenario. The microorganisms used were Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans. Isopropyl Alcohol (70% v/v) solution was suitable for the inhibiting of bacterial growth even, at (1) one minute of exposure; nevertheless, bactericidal action was inactivated by organic matter at 0.25 g/mL (Bovine Serum). Alconox showed bactericidal action against Staphylococcus aureus at 2% w/v Piedrahita-Navarrete Diana Carolina 2 Forero-Vargas Rafael Alberto after 5 minutes of exposure. Immersion of the removable small pieces of equipment in 70% v/v isopropyl alcohol solution as well as periodic intervals of disinfectant solutions were some feedbacks given once the study was over. Key Words: Cleaning evaluation, Anionic Detergent, Disinfection, Isopropyl Alcohol, and Manual Cleaning. Resumen Se evaluó la eficacia los agentes limpiadores Alconox (detergente aniónico) y alcohol isopropílico (desinfectante) utilizados durante la limpieza manual de equipos; se llevaron a cabo pruebas in vitro de suspensión y superficies e in vivo en donde se tomaron muestras de las superficies de los equipos del área de manufactura una vez finalizados los procesos de limpieza. Finalmente, se utilizó el criterio del caso o condición extrema. Los microorganismos que se utilizados fueron: Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans. La concentración de alcohol isopropílico (70% v/v) es adecuada para el uso establecido, inhibiendo el crecimiento de los microorganismos en suspensión desde (1) un minuto de exposición. En la evaluación de superficies para el alcohol isopropílico se observó que el desinfectante es sensible a a concentraciones de materia orgánica de 0.25 g/mL. Alconox evidenció acción bactericida frente a Staphylococcus aureus a una concentración del 2% p/v en un tiempo de exposición de 5 minutos; según el tipo de residuo alconox debe ser utilizado a diferentes concentraciones. La inmersión de las partes pequeñas removibles de la maquina en Alcohol isopropílico 70% v/v y la rotación del desinfectante, son algunas sugerencias tras la finalización de este trabajo. Palabras clave: Evaluación de la limpieza, Detergente aniónico, desinfección, Isopropil Alcohol y Limpieza Manual. INTRODUCTION Equipment cleaning processes are implemented as a way to improve product safety. To validate these processes, the odds of microbial contamination as well as products carryover to the next product must Piedrahita-Navarrete Diana Carolina 3 Forero-Vargas Rafael Alberto decrease. In its Guide to Inspections Validation of Cleaning Processes (1993) the Food and Drug Administration (FDA) expects to have written Standard Operatives Procedures (SOPs) detailing the cleaning processes used for various pieces of equipment. Cleaning processes used between batches of the same product do not require validation.AS opposed to different formula products. Several authors argue that Manual Cleaning (MC) should only be evaluated rather than validated (Morales, 2006; Health Products and Food Branch Inspectorate, 2000) due to the inherently variability of the process. Instead, operators carrying out the MC process should be adequately trained, monitored, and once in a while assessed (Health Products and Food Branch Inspectorate, 2000). Cleaning agents and test surfaces must be considered prior to initializing the development of either a validation or evaluation plan. Suitable disinfectant validation can support equipment MC. Disinfectant validation is known as “establishing documented evidence that a disinfection process will consistently remove or inactive known or possible pathogens from inanimate objects” (Martinez, 2006). This disinfectant process might be the only validated procedure that manual cleaning can have as long as operators perform the preparation of the cleaning agents according to the SOP. Disinfectant validation was achieved after some tests were performed: suspension test, carrier test, surface tests, and capacity test and practical test if neccesary (Reybrouck, 1998). Furthermore, in order to have a successful cleaning process microorganisms and their disinfectant resistance methods are require. The aim of this study was to analyzed and evaluate the manual cleaning process of equipment used in Dietary Supplement manufacturing. MATERIALS AND METHODS Media and Reagents: Media and Broths used were obtained from: BD BBL™, BD Difco™, BD Bacto™, EMD Chemicals and Sigma-Aldrich®. Media and Broth were prepared and held as instructed in their labels. Letheen Broth ingredients were modified as AOAC 955.11 (1964) and 955.15 (2006) Piedrahita-Navarrete Diana Carolina 4 Forero-Vargas Rafael Alberto methods declare. The modified letheen broth did not have lecithin, which was not necessary for the neutralization of the 70% v/v Isopropyl Alcohol solution as Ascenzi (1995) suggested in his study. Test Surfaces: The surface tested was stainless steel type 304 cylinders with 5 to 7 mm of width and 5 mm of diameter. The cylinders were cut from stainless steel 30 cm bar. Subsequently, the cylinders were polished with the Dayton 4Z123H polisher machine. The cylinders looked like the penicylinders the AOAC Use-Dilution Method (2006) suggested for utilize. Cleaning Agents: The disinfectants used in this study were: Phenol solution (5%v/v USP; Spectrum Chemicals and Laboratory Products cat# LC18195-2) and 99% v/v Anhydride Isopropyl Alcohol solution (UNIVAR-USA cat# 285820). The Phenol Coefficient Method required different dilutions of the 5% v/v Phenol Solution as well as 99% v/v Anhydride Isopropyl Alcohol solution. The procedure was achieved in a flow laminar cabinet using: air masks (North cat# 7700-30L), 5 mL, 10 mL and 25 mL pipettes (Kimax cat# 37025; 37007; Pyrex cat# 7101), 10 – 100 µL micropipette (VWR International, LLC; cat# 40000-028) and 17x100 mm plastic tubes (VWR International, LLC; cat# 60818-618). The sufficient amount of 5% v/v Phenol solution was added to the test tubes to acquire the following concentrations; 1/60, 1/70, 1/80, 1/90 and 1/100, and 5 mL of Zephyrhills® distilled was then added. Then these were submitted to the Autoclave (Electric Pressure Steam Model 25x) for 20 minutes at 121°C with 15 Lbs of pressure. Isopropyl Alcohol solutions of 20% v/v to 80% v/v were used and measure in 10 mL dispensers (Barnstead International; cat# 9010-EA), when the suitable volume of 99% v/v Isopropyl Alcohol was introduced to the test tubes referenced above (5 mL). Piedrahita-Navarrete Diana Carolina 5 Forero-Vargas Rafael Alberto The Alconox preparation was done according to its instructive manual. To make a 1% w/v solution, 15 g of the powder was dissolved in 100 mL of tap or purified water and mixed thoroughly. For 5 mL test tubes, approximately 20-fold of the weight above was weighed. Test Microorganisms: The microorganisms used were: Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Salmonella enterica (ATCC 6539), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) y Candida albicans (ATCC 10231). They were from Lyfocults® (PML Microbiologicals). Microorganisms were reconstituted and held as described in the product insert; storage temperature was kept between 2-8°C. Stock cultures on petri dish (Spectrum Chemicals & Laboratory Products; cat# 960-25563) with Triptone Soy Agar (TSA; BD BBL™; cat# 211043) were prerared for the bacteria, while the stock Candida albicans culture was prepared in Potato Dextrose Agar (PDA; EMD Chemicals cat# 1.10130.0500).An incubation period of 2 days was carried out for bacteria and 3 days for yeast both at 37°C (Incubator Boekel model 132000). After the stocks cultures were stored as mentioned (Refrigerator, VWR; model R144GA14) above, they were subcultured monthly as the Association of Official Analytical Chemists International (AOAC) methods suggest. When each microorganism was utilized, one or more colonies were pulled out of the stock culture and isolated in TSA or PDA, depending on the microorganisms. Afterward, growth colonies were inoculated into 5 mL tube of Brain Hearth Infusion Broth (BHI; BD Difco™ cat# 211057) until the turbidity was similar to the 4th tube in McFarland’s scale (12x108cfu/mL). Culture concentrations were checked by dilutions (10-1 to 10-8) and counted on Plate Count Agar (PC; EMD Chemicals cat# 1.05463.5007). Identification of Microorganisms: Using the stock cultures of each microorganism, Gram coloration, selective agar isolation, as well as Oxi/ferm tube II (BD BBL™; cat# 212116) were used for the identification of bacteria strain. The latter was done as described by Gilardi (1985). A coagulase Piedrahita-Navarrete Diana Carolina 6 Forero-Vargas Rafael Alberto plasma test (BD Bacto™; cat# 240827) for Staphylococcus aureus strain was done as described in the BBL coagulase plasma package insert, and assisted by the Bayliss & Hall (1965) study. Finally, carbohydrate fermentation and Gram coloration (Mannitol, dextrose, lactose and sucrose) were also done to identify the yeast. Cleaning Agents Evaluation Dilution tube method: evaluates the bacterial effectiveness of both cleaning agents in at 1, 5 and 15 minute. Isopropyl Alcohol test solutions were: 50% v/v, 70% v/v and 80% v/v. Alconox test solutions were: 0.5% w/v, 1% w/v and 2% w/v. Each cleaning agent test tube was inoculated with 0.5 mL of microorganism suspension (as prepared above) and hung until the test time mark. Once the testing time was reached, it was mixed and 3 mL was taken out of each tube; 1 mL went to BHI and the other 2 mL where for depth count using PC agar. The presence of turbidity indicated that the cleaning agent did not totally inhibit the microorganisms and the depth count revealed many log units the microorganism reduced at each contact time. The Disinfectant eliminated at least 3 to 5 log units (Bloomfield, et al. 1993; Gelinas, et al. 1983). Disk Diffusion Susceptibility test (Kirby-Bauer): Made a massive spike of each microorganism over the surface of Mueller Hintotn agar plates. Sterile filter paper disks of 5 mm diameter (Whatman Filter #1; cat# 100125) were submerged in the cleaning agent’s solutions and then transferred them to the surface of the media (Guimarães, et al. 2000). For each plate used two filter disks of the same concentration and a third disk impregnated with distilled water was used as control. This modification is similar to what Mitchell and Carter (2000) developed. An incubating period time of 24 hours at 37°C for bacteria and 72 hours at 37°C for Candida albicans. The zone of inhibition showed microorganism susceptibility; just 0.5 mm diameter onward zones were taken into account as susceptible. Piedrahita-Navarrete Diana Carolina 7 Forero-Vargas Rafael Alberto Phenol coefficient Method (AOAC modified): was carried out as described in the AOAC 955.11 for each microorganism and the nutrient broth was changed to BHI. Use-dilution method (AOAC modified) was carried out as described in the AOAC and assisted by the Guimarães (2000) method. Modifications were as follow: BHI as nutrient broth and Neutralizer media was Letheen broth without lecithin, where used since it did not affect the neutralizer effect against 70% v/v Isopropyl Alcohol solution (Aszenci, 1995). Alconox effectiveness test: Prepared an adequate amount of cleaning agent according to the manufacturer’s directions. Spiked 100 to 500 µL of formulation onto a preweighed, stainless steel cylinder (used above) and allowed it to air dry. Weighed the coupon again and recorded the weight. Attached the coupon to a USP disintegration apparatus and dipped the coupon about 50 times into the cleaning agent solution. Washed the coupon in distilled/deionized water, dried and reweighed. The limits were 0.1 w/w for products with allergenics compounds and 1.0% w/w for innocuous products. Calculated by the equation 1 below: % 100% Equation 1. Percentage (%) Residue Remaining after detergent application. Monitoring and Sampling: Different equipment was sampled in the manufacturing area (Tableting, Encapsulating and Blending machines). Product contact parts where focus. The company’s microbiological analysis was used. Samples of the first run after cleaning were taken and analyzed by the company’s (HPLC and Atomic Absorption) in house laboratory. Another laboratory was used to test for phosphorus in order to identify residues from: the previous product manufactured and detergent used. 8 Piedrrahita-Navarrrete Diana Carolina C Forero-Vaargas Rafaell Alberto Worst case Scenario: Lactobacilli L product waas used due to t its bacteriial concentraation. A depth count was conduccted before and a after thee equipment’s cleaning process p usinng the comppany’s methoods. The next product’s samples were w also suubmitted to microbial m analyses. RESULTS Growth (%) Staphyylococcus aurreus ATCC 6538 6 Tube diilution Test. 100% 50% 15' 5' 1' 0% + 0.5% + - + 1% - + 2% % - + 50% - + 70% 80% 1' % 100% 0% ALCO ONOX 100% 0% 100% 0% 0% 1000% ALCOHOL L 0% 100% % 0% 100% 5' 100% % 0% 100% 0% 0% 100% 0% 1000% 0% 100% % 0% 100% 15' 100% % 0% 100% 0% 0% 100% 0% 1000% 0% 100% % 0% 100% Figure 1 In vitro. v S.aureus, Tube Dilutioon Test. Alcon nox & Isoprop pyl Alcohol. Different D conccentrations at different times. Table 1 Phenool Coefficient Number of eaach microorgaanism. Microoorganism Phenoll Coefficient Nu umber Escherrichia coli 24 Pseudomonnas aeruginosa 40 Salmonnella typhi 24 Staphylococcus aureus 21.1 Candidda albicans 17.96 9 C Piedrrahita-Navarrrete Diana Carolina Forero-Vaargas Rafaell Alberto Use dilution Metthod E. coli 2a. 2b. Growth (%) Growth (%) 100% 80% 60% 40% 20% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 0% Growtth % Use Dilution n Method S. aureus a 0% Growth Inh. Grrowth Control C 100% Growth Inh. Growth Test 666.7% 2c. % 33.3% Groowth In nh. Control 0% 1000% Growth Growth G Inh. Testt 76.6% 23.3% Alconox effectiveness e Tests Residual i (%) 1.5% A Allergens p/p 1.0% % % Residual 0.5% In nnocuos p/p 0.0% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 11 12 13 144 15 16 17 18 19 20 Numberr of Tests Enccapsulators - Bacteria Co ontrol 2d. CFU/25cm2 250 200 150 100 UFC/25cm2 100 50 0 05 2/0 2/06 2/07 3/08 8 3/09 Samples aaverage AFTER Cfu u/25cm2 Acceptable Limit Cfu/25cm2 Samples aaverage BEFORE CFU/25cm2 4/30 M Month/Day Figure 2 in vitro v Disinfecttant effectiven ness against (aa) E.coli and (b) ( S.aureus in n prescence of 0.25g/mL off albumin on the test su urface (304 sttainless steel cylinders). (cc)Alconox effeectiveness agaainst several kinds k of Nutrraceutical products and (d) On-going bacterial con ntrol on the encapsulator’s surfaces s beforre and after dee MC. 100 Piedrrahita-Navarrrete Diana Carolina C Forero-Vaargas Rafaell Alberto Enccapsulators - yeast and molds m controll 10 CFU/25cm2 10 Samples average AFTER CFU/25cm2 Acceptab ble Limit CFU/25ccm2 Samples Average BEFORE CFU/25cm2 CFU/25cm2 8 6 4 2 0 2/05 2/06 2/07 3/08 3/09 4/30 Figure 3 On-going g yeast and moolds control on n the encapsulator’s surfaces before and after the MC. Table 2 Accep ptable Limit Criteria C utilizeed to evaluate after the MC C. (USP/NF 20007) Limit Acceptable Limit Criteria Physical Lim mit V Visual Limit (Noo visual organic matter after MC C) Ch hemical Limit (P Products carryover) 10 ppm for innocuous products. p 0.1 ppm for allergens com mpounds Micro obiological Limitt (surfaces) < 100 CFU U/ 24-30 cm2 foor bacteria. < 10 CFU/ 244-30 cm2 for yeast and mold. Absence of : (E Escherichia coli, Salmonella sp, P Pseudomonas aeeruginosa, Staphyylococcus aureuus andd Candida albicaans DISCUSSIO ON The microorrganisms weere successfuully identifieed and confiirmed using Bergey’s Manual M (19944). In the initial part of o this study y, all the miccroorganism ms were succcessfully idenntified usingg the methodd above. Kirby Bauerr’s susceptib bility test waas voided forr Isopropyl Alcohol A soluutions for evvery microorrganism; due to, its quick evaporation rate of about 2.4 2 g/m2/houur (Crook, 2000). Thosse results were w not Piedrahita-Navarrete Diana Carolina 11 Forero-Vargas Rafael Alberto analyzed within this study; in contrast, the isopropyl alcohol’s tube dilution method achieved the expected results. In vitro Dilution tube method (all data is not available) demonstrate that even with 1 minute of direct exposure all test strains were inhibited with concentrations as low as 50% v/v of Isopropyl alcohol solution (see Figure 1). On the other hand, 0.5%w/v and Alconox’s recommended concentration of 1.0% w/v did not inhibit any of the microorganisms even with the longest exposure time (15 minutes) in this study. Despite this information there was an undersized decrease in the log final reckon estimate. Figure 1 shows a particular behavior in the 2%w/v Alconox solution. It showed bactericide activity against Staphylococcus aureus, possibly due to EDTA which is one of Alconox’s ingredients. EDTA starts cell membrane fluidization at low levels (Glover, 1999), and since Gram positive bacteria is less resistant than Gram negative or yeast (Russell, 1998), EDTA could affect the cell membrane of Staphyloccocus aureus causing its inhibition at 5 minute of exposure. The other suspension test (phenol coefficient) demonstrated that the disinfectant had more bactericide activity than phenol. Furthermore, Isopropyl Alcohol’s preparation is easy and its risks are lower than phenol. The phenol coefficient numbers of each microorganism are shown in table 1. The 70% v/v Isopropyl Alcohol solution was determined to be the most advantageous concentration to use. It is less toxic and more efficient than the 80% and 100% v/v. Concentrations of Isopropyl Alcohol above 50% v/v but below 95% v/v recommended by Kingleren (1995) and Meyer (1996). Pseudomonas aeruginosa was the most resistance bacteria of the study, due to the high content of Mg2+ in the outer membrane creating strong polysaccharide (LPS)-LPS Links (Russell, 1998). Results observed in the Use-dilution method are shown in figures 2 (a, b). With 0.25g/mL, the 70% v/v Isopropyl Alcohol solution lost its effect against bacteria. Bloomfield (1993) study showed that with 0.03g/mL of albumin the effectiveness of 70% v/v Isopropyl alcohol was minimally affected. Piedrahita-Navarrete Diana Carolina 12 Forero-Vargas Rafael Alberto However, the bactericide effect remaining achieved the acceptable limits (3 to 5 log units). Even with 10 minutes of exposure time the disinfectant did not affect the microbial growth. The remaining dust needs to be vacuumed in order to achieve a worthy cleaning process. Isopropyl Alcohol would only work properly if there is not too much residue left on the equipment’s surface (Fraise, 1999). Organic matter mechanisms to disinfectant inactivation could be the followings: disinfectant absorption by protein colloids and the development of active less inherit systems, due to the bond of disinfectant’s functional group (-OH) to organic matter’s foreign proteins. Disinfectant inactivation could improve microorganism growth (MacDonell & Russell, 1999). Analyses of Alconox’s effectiveness were shown in figure 2 (c). Greater concentration of detergent (double to 2% w/v as recommended) was used when vitamin and herbal extracts residue were cleaned. For Alconox’s optimum use, sterile hot water must be utilized in order to remove residues. The limits established on the 0.1% w/w were not achieved in several test number (5, 14 and 15) and the herbal extract tested ( test #16) was over the innocuous acceptable limit (1% w/w). In vivo evaluation (all data is not available) confirm the effectiveness of the cleaning process on manufacturing equipment (see figure 2d and 3). This process was done as Schmidt (2003) referenced in his study: First the machine had to be disassembled, subsequently rinsed parts with tap water, cleaned with detergent, rinsed again with tap water, and finally disinfected with 70% v/v an Isopropyl Alcohol solution then let it dried and reassembled the machine. Analytical methods samples and phosphorus quantification did not find any anomalies. Residues, as well as microbial count, were under the limits table 2 after the cleaning process. At the same time, the next batch product did not shown representative residue of the previous product. This could utilize as assurance for the cleaning process (data not available). Piedrahita-Navarrete Diana Carolina 13 Forero-Vargas Rafael Alberto The evaluation of the worst case scenario was partially achieved. The whole cleaning process showed to be effective in removing residues. Nevertheless, the microbial depth count after the process was high and did not achieved the acceptable limit criteria mentioned above. The latter may happened because the visual limit was not reached during the worst case scenario, and as this study confirmed the residual organic matter could affect the disinfectant effectiveness. CONCLUSIONS The company may change their disinfectant periodically in order to avoid resistance microorganisms. Isopropyl Alcohol Solutions can be blended with other broad and more effective bactericides such as Clorox (5.25% v/v). The company’s SOP should explain cleaning agent preparation better, in order to minimize human error. In addition frequently supervision of the MC is needed either the wash rooms (for rinse) or the assembling room (disinfection). ACKNOWLEDGMENTS Thanks to Diego Congote (Company’s Quality & Regulatory Affairs Manager). Our deepest appreciations to the entire company for letting us conduct our study in the best way possible and special thanks to the entire laboratory and manufacturing personnel. REFERENCES - ASCENZI, J.M. 1995. Handbook of Disinfectants and Antiseptics. Marcel Dekker, Inc. New York, United States.3: 46p. - Association of Official Analytical Chemists International (AOAC). 2000. Off. Meth. Analysis. Phenol Coefficient Method 955.11. 1117p. - BAYLISS, B.G. & HALL, E.R. 1965. Plasma coagulation by organisms other than Sraphylococcus aureus. 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