evaluación de la actividad antiproliferativa de compuestos de

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIPROLIFERATIVA DE COMPUESTOS DE COORDINACIÓN COMO CERNIMIENTO DE ACTIVIDAD ANTINEOPLÁSICA. OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno emplee el ensayo de inhibición de la proliferación celular y tinción con sulforrodamida‐B como método de cernimiento para seleccionar compuestos con potencial actividad antitumoral. PROBLEMA Determinar la concentración inhibitoria 50 (CI50) de 3 compuestos de coordinación en la línea tumoral HeLa empleando el ensayo de inhibición de la proliferación y tinción con sulforrodamida‐
B; e identificar el compuesto más activo en esta línea tumoral. MATERIALES Puntas para pipeta automática de 10 L Puntas para pipeta automática de 200 L Puntas para pipeta automática de 1000 L Filtros 2 m de diámetro de poro Charola desechable para tinción Jeringas de 3 mL Gradilla para tubos Eppendorf EQUIPO Lector de microplacas Incubadora a 37°C y 5% CO2 REACTIVOS: Ácido tricloroacético al 10% Ácido acético al 1% Cisplatino Agua destilada MATERIAL BIOLÓGICO 5 3 4 1 Pipeta automática de 10L Pipeta automática multicanal de 200 L Pipeta automática de 100‐1000 L Tubos Eppendorf estériles Pipetas pasteur estériles Jeringas de 10 mL Vaso de precipitado de 50 mL 1 1 1 20 1 1 Campana de flujo laminar Microscopio óptico Tris base 10 mM (pH 10.5) Sulforrodamina‐B al 0.4% [Cu(4,7‐dimetil‐1,10‐fenantrolina)glicinato]NO3 Placa de 96 pozos sembrada con 2 * 104 células HeLa por pozo DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. Pesar 3 mg de cada compuesto a evaluar, disolver en agua destilada y aforar a 10 mL para obtener una concentración final de 300 g/mL 2. Filtrar cada una de las soluciones con filtros de 2m de diámetro de poro. 3. Filtrar 50 mL de agua destilada con filtros de 2m de diámetro de poro 4. En una gradilla para tubos Eppendorf colocar 15 tubos Eppendorf distribuidos en 3 líneas de 5 tubos cada una 1 2 3 4 5 Compuesto1 Compuesto 2 Compuesto 3 5. Preparar para cada compuesto diluciones con concentraciones finales de 1, 3, 10, 30 y 100 g/mL de acuerdo al siguiente esquema: Concentración Solución L agua L L L Solución 2 Solución final (g/mL) filtrada Solución stock 300 3 g/mL 1 1000 ‐ ‐ ‐ 0 2 300 600 ‐ ‐ 100 3 900 100 ‐ ‐ 30 4 900 ‐ 100 ‐ 10 5 900 ‐ ‐ 100 3 6. El alumno recibirá una placa de 96 pozos sembrada con 2*104 células HeLa por pozo, en cuatro cuadrantes de 3 x 5 pozos cada uno y 90 L/pozo de medio de cultivo 7. Administrar 10 L de la solución de prueba por pozo por triplicado de acuerdo al siguiente esquema 8.
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Pozo no tratado = pozo que no recibe inoculo celular ni tratamiento; pozo tratado= pozo administrado con 10 L de solución 2, 3, 4 ó 5 de uno de los compuestos a evaluar según el esquema; pozo control = pozo administrado con 10L de solución 1, es decir, agua destilada. Reunir las soluciones de cada uno de los compuestos en un contenedor independiente para cada uno de los metales y etiquetar según la sección “tratamiento de residuos”. Incubar durante 24 horas a 37°C y 5% CO2 Retirar el medio de cultivo aspirando con una pipeta pasteur cada pozo. Agregar 100 L/pozo de ácido tricloroacético al 10% frio e incubar durante 1 hora a 4°C. Retirar el ácido tricloroacético invirtiendo la placa en la tarja Enjuagar 5 veces con agua corriente y dejar secar a temperatura ambiente (24h) Adicionar 100 L/pozo de sulforrodamina‐B 0.4% e incubar por 30 minutos a temperatura ambiente. Retirar el colorante invirtiendo la placa en la tarja Agregar 200 L/pozo de ácido acético al 1% y agitar la placa golpeando ligeramente en una de las caras de la placa para disolver el colorante. Retirar la solución invirtiendo la placa en la tarja. Repetir las operaciones 14 y 15 tres veces. Dejar escurrir y secar las placas a temperatura ambiente durante 24h Solubilizar el colorante incorprado con 100 L/pozo de tris base 10 mM (pH 10.5) agitando suavemente la placa. Leer la absorbancia de la placa a 564 nm en un lector de microplacas. Inactivar las placas con hipoclorito de sodio y desechar. CUESTIONARIO 1. Transcribir las lecturas de absorbancia a una hoja de cálculo y realizar el siguiente procedimiento 2. Calcular el promedio de absorbancia de los pozos no tratados (Ā pozos no tratados) Ā pozos no tratados= _____________ sd= ___________ 3. Restar a cada Absorbancia el valor Ā pozos no tratados 4. ¿Por qué cree que se deban restar las absorbancias de los pozos no tratados al resto? __________________________________________________________________________
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__________________________________________________________________________ 5. Reportar en la siguiente tabla el promedio y desviación estándar (SD) del porcentaje de proliferación celular (% proliferación) para cada concentración y compuesto calculándolo con la siguiente fórmula: % proliferación = 100 * [T/C] Donde: T = absorbancia de los pozos tratados, C = absorbancia de los pozos control. Concentración Cisplatino Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4 0 0.3 1 3 10 6. Calcular mediante un análisis estadístico de supervivencia la concentración inhibitoria 50 y reportar en la siguiente tabla compuesto CI50 ERROR STD P 2 cisplatino 7. ¿Qué parámetro(s) estadístico(s) le indica que sus valores son confiables y cómo? __________________________________________________________________________
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__________________________________________________________________________ 8. ¿Qué compuesto presenta mayor actividad antiproliferativa en la línea celular HeLa? __________________________________________________________________________
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__________________________________________________________________________ 9. ¿Este ensayo permite evaluar la actividad citotóxica o la actividad citostática de un compuesto? Justifique su respuesta. __________________________________________________________________________
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____________________________________________________________________ 10. ¿Considera que alguno de los compuestos evaluados es un buen candidato para continuar su estudio en otros modelos? __________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________ 11. Dibuje las estructuras químicas de los compuestos evaluados. ¿Encuentra alguna similitud estructural a la cual se le pueda atribuir la actividad antiproliferativa? __________________________________________________________________________
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__________________________________________________________________________ 12. ¿Un valor pequeño de CI50 garantiza que el compuesto pueda emplearse como antineoplásico en la clínica? ¿Por qué? __________________________________________________________________________
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_________________________________________________________________________ CONOCIMIENTOS PREVIOS: 1. Dos ensayos para determinar la CI50. Fundamentos, ventajas y desventajas de cada uno de ellos 2. Cisplatino: Historia, mecanismo de acción, usos clínicos, CI50. DISPOSICIÓN DE RESIDUOS R1 = complejos de cobre (II) R2 = cisplatino R3 = complejos de estaño