tularemia

CAPÍTULO 2.1.18
TULAREMIA
RESUMEN
La tularemia es una zoonosis causada por Francisella tularensis. La bacteria causal es un
cocobacilo Gram negativo, de 0,2–0,5 µm × 0,7–1,0 µm, inmóvil y que no forma endosporas,
aerobio estricto y con una temperatura óptima de crecimiento de 37°C. Es oxidasa negativa,
catalasa débilmente positiva y requiere cisteína para su cultivo. Se encuentra de manera natural en
los lagomorfos (conejos y liebres) y en los roedores, especialmente en los roedores microtinos
(tales como los ratones y ratas de campo y las ratas almizcladas) y los castores. Asimismo, se ha
descrito que se pueden infectar una amplia gama de mamíferos y diversas especies de aves. Entre
los animales domésticos, parece que los gatos pueden actuar como transmisores de la bacteria.
Se reconocen dos tipos de F. tularensis teniendo en cuenta las características de cultivo,
epidemiológicas y de virulencia en algunos hospedadores. La tularemia está muy confinada al
Hemisferio norte y normalmente no se encuentra en los trópicos o el Hemisferio sur. Francisella
tularensis subsp. tularensis (Tipo A) se asocia a los lagomorfos en Norteamérica. Se transmite
principalmente mediante las garrapatas y las moscas picadoras, es muy virulenta para el hombre y
los conejos domésticos, y la mayoría de los aislamientos fermentan el glicerol. Francisella
tularensis subs. palaearctica (Tipo B) aparece sobre todo en los roedores acuáticos (castores,
ratas almizcladas) del norte de Norteamérica, y en las liebres y los pequeños roedores de Eurasia.
Se puede transmitir mediante artrópodos o por el agua, es menos virulenta para el hombre y los
roedores, y no fermenta el glicerol. Además de la transmisión por vectores, la tularemia se puede
propagar mediante el contacto con los animales infectados o fomites ambientales a través de la
inhalación, o por la ingestión de carnes poco cocidas de animales infectados o agua contaminada.
La enfermedad se caracteriza por fiebre, depresión y septicemia. En el hombre, puede producir
úlceras o abscesos en el lugar de la inoculación (raramente se observa en los animales), e
inflamación de los ganglios linfáticos regionales. En el examen post mórtem, entre las lesiones
puede haber necrosis caseosa de los ganglios linfáticos y múltiples focos de necrosis blancogrisácea en el bazo, hígado, médula ósea y pulmones. Habitualmente produce esplecnomegalia.
Es importante tener en cuenta que existe un riesgo elevado de infección directa del hombre por
contacto directo con el microorganismo. Por lo tanto, se recomienda que, para manipular los
materiales infectados, se tomen precauciones especiales como llevar guantes, mascarilla y
protectores oculares. La instalación debería cumplir los requisitos de Contención del Grupo 3 de
patógenos (véase el capítulo 1.1.2. Bioprotección y seguridad humana en los laboratorios
veterinarios de microbiología y en las instalaciones de los animales).
Identificación del agente: Se puede demostrar la presencia de la bacteria mediante impresión o
en muestras fijadas de los órganos, tales como el hígado, el bazo, la médula ósea, el riñón o el
pulmón, así como en los frotis de sangre. Los métodos inmunológicos, como la prueba de
inmunofluorescencia (FAT), son la forma más fiable para identificar la bacteria. Cuando se realiza
una tinción Gram, la bacteria aparece como bacilos Gram negativos muy pequeños y puntiformes,
que con frecuencia son difíciles de distinguir como bacterias. También se pueden teñir con la
tinción May–Grunwald–Giemsa y con tionina fenólica.
El microorganismo presenta unos requisitos nutricionales complejos. Para cultivarlo, es necesario
utilizar el medio Francis, el medio McCoy y Chapin o el agar Thayer-Martin modificado. Las
colonias son pequeñas, redondas y transparentes y no se aprecian antes de 48 horas de
incubación a 37°C. En el medio Francis, las colonias pueden confluir y presentar un aspecto
lechoso. Si se necesita transportar las muestras, se deberían inocular en caldo nutritivo estéril y
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conservar a 4–10°C si se trata de unas pocas horas o a –70°C si es probable que se prolongue el
tiempo de transporte.
Para facilitar el diagnóstico de la tularemia, se utilizaron en el pasado cobayas como animales de
experimentación, inoculándoles material procedente de tejidos infectados o de cultivos. Para
identificar F. tularensis, se ha remplazado la inoculación de los animales por los protocolos de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La prueba FAT permite demostrar la presencia de F.
tularensis en muestras patológicas.
Pruebas serológicas: Las pruebas serológicas son herramientas útiles en el diagnóstico de la
infección humana, pero tienen un valor limitado en las especies animales más susceptibles que,
normalmente, mueren antes de desarrollar anticuerpos. Las determinaciones epidemiológicas se
pueden realizar con animales domésticos, pero de especies relativamente resistentes, que
sobreviven a la infección, tales como ovejas, vacas, cerdos, perros o ungulados salvajes, debido a
que estas especies desarrollan anticuerpos. Se pueden emplear así mismo, especies de roedores
y lagomorfos de resistencia relativa. En los ensayos serológicos se pueden utilizar varias especies
de vida salvaje, como el alce americano, que están expuestas a F. tularensis.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Se dispone de una cepa viva
atenuada para vacunar a las personas que tengan un riesgo elevado de exposición a F. tularensis
virulenta. Sin embargo, esta vacuna solo tiene una aplicación restringida. Se puede estimar el
resultado de la vacunación demostrando la presencia de anticuerpos específicos y la capacidad de
proliferación de los linfocitos en presencia del antígeno de F. tularensis.
A. INTRODUCCIÓN
La tularemia es una zoonosis causada por Francisella tularensis. Se encuentra de forma natural en los
lagomorfos (conejos y liebres), especialmente en los roedores microtinos como los ratones de campo, las ratas
de campo y las ratas almizcladas, así como en los castores. Además, se ha descrito que se pueden infectar una
amplia gama de otros mamíferos, aves, anfibios e invertebrados (19, 20). La tularemia se presenta de forma
endémica en el Hemisferio norte. La enfermedad puede ocurrir como brotes epizoóticos en muchos países de
Norteamérica y Europa, mientras que únicamente se presenta en casos esporádicos en algunos otros países de
Europa y Asia. En raras ocasiones se ha descrito su presencia en los trópicos o en el Hemisferio sur. Algunos
brotes epizoóticos han surgido como resultado de la importación de lagomorfos infectados con una manifestación
subclínica.
Se reconocen los dos tipos de F. tularensis más relevantes desde el punto de vista clínico teniendo en cuenta las
características de cultivo, epidemiológicas y de virulencia. Francisella tularensis subesp. tularensis (Tipo A) se
relaciona sobre todo con los lagomorfos en Norteamérica. Se transmite fundamentalmente por las garrapatas o
las moscas picadoras, o mediante el contacto directo con los lagomorfos infectados. Es muy virulenta para el
hombre y los conejos domésticos, y la mayor parte de los aislamientos fermenta el glicerol. Francisella tularensis
subesp. palaearctica (Tipo B) se presenta principalmente en los roedores acuáticos (castores, ratas almizcladas)
y ratones de campo en Norteamérica, y en los lagomorfos (liebres) y roedores en Eurasia. Se transmite
fundamentalmente por contacto directo o por mosquitos, pero se puede transmitir por inhalación o a través de
agua o comida infectada. Es menos virulenta para el hombre y los conejos domésticos, y no fermenta el glicerol
(7, 14,15, 17, 22).
En animales susceptibles, a los síntomas de depresión grave les sigue una septicemia mortal. En estas especies
el curso de la enfermedad es aproximadamente de 2–10 días y es habitual que estos animales estén ya muertos
cuando se les vaya a realizar el diagnóstico. Normalmente, la mayoría de las especies domésticas no manifiestan
signos de tularemia, pero, después de la infección, desarrollan anticuerpos específicos frente al microorganismo.
Han surgido brotes en las ovejas con niveles elevados de mortalidad causados por el organismo del Tipo A (1,
17). Se ha informado de que, entre los animales domésticos, los gatos pueden actuar como transmisores de la
bacteria (46) y la enfermedad se extiende ocasionalmente desde los gatos a los humanos (8).
En la necropsia, los animales que mueren por la tularemia aguda habitualmente se encuentran habitualmente en
buena condición física. Se presentan signos de septicemia caracterizada por focos blanquecinos de necrosis
distribuidos al azar en el hígado, la médula ósea y el bazo. Además, suele haber esplecnomegalia. Los focos
necróticos varían en tamaño y, en algunos casos, puede que apenas se vean a simple vista. Normalmente los
pulmones están congestivos y edematosos y pueden aparecer áreas de consolidación y neumonía fibrinosa y
pleuritis. La fibrina puede estar presente en la cavidad abdominal. Con frecuencia existen focos de necrosis
caseosa en uno o varios ganglios linfáticos. Los ganglios linfáticos que más a menudo están afectados son los de
las cavidades abdominal y pleural y los que drenan las extremidades. En las especies menos susceptibles, la
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imagen histológica puede parecerse a la de la tuberculosis con granulomas crónicos en el hígado, el bazo, los
pulmones y los riñones.
Existe un riesgo elevado de infección humana por F. tularensis, ya que la dosis infectiva es extremadamente baja
y los animales infectados eliminan la bacteria a través de la orina y las heces. La infección puede producirse por
un simple contacto. Para evitar la infección humana deben tomarse las debidas precauciones, tales como llevar
guantes, mascarilla y protectores oculares, durante la manipulación de las muestras y los cultivos patológicos. La
instalación debería cumplir los requisitos de Contención del Grupo 3 de patógenos como se recoge en el capítulo
1.1.2 Bioprootección y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología y en las instalaciones
de los animales. Los países que carezcan de este tipo de laboratorios especializados, bien sea regionales o
nacionales, deberían enviar las muestras al laboratorio de referencia de la OIE. Los animales utilizados para la
inoculación experimental y sus residuos son especialmente peligrosos para el hombre.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
La presencia de Francisella tularensis se puede demostrar mediante frotis o cortes histológicos. Asimismo, se
puede identificar mediante el cultivo o la inoculación de los animales. Sin embargo, F. tularensis puede resultar
difícil de aislar a partir de los animales muertos o de las canales debido al desarrollo de otras bacterias. Como el
aspecto post mórtem es variable, en ocasiones el diagnóstico no resulta fácil y se prefieren los métodos
inmunológicos o inmunohistoquímicos, aunque sea difícil obtener los reactivos. Por tanto, a veces se recomienda
que las muestras fijadas se analicen en laboratorios equipados con los reactivos y métodos apropiados, tales
como el laboratorio de referencia de la OIE (véase la parte 3 de este Manual de animales terrestres).
a)
Frotis
Las preparaciones se realizan en portas y consisten en impresiones de órganos tales como el hígado, bazo,
médula ósea, riñón, pulmón o sangre. Las bacterias son abundantes en tales frotis, pero pueden pasar por
alto debido a su tamaño muy pequeño (0,2–0,7 µm). Se puede demostrar la presencia de la bacteria
mediante la inmunofluorescencia directa o indirecta. Esta es una herramienta de diagnóstico segura, rápida
y específica (13, 16, 18).
La tinción Gram de los frotis revela una dispersión de bacterias Gram negativas pequeñas y puntiformes,
cerca del límite de resolución. La utilización del microscopio con el objetivo de inmersión en aceite
incrementa la capacidad de resolución de la bacteria. Puede ser difícil distinguirla de los precipitados de
colorante.
b)
Cortes histológicos
Se puede demostrar la presencia de la bacteria a través de cortes empleando métodos
inmunohistoquímicos, tales como una prueba de inmunofluorescencia (FAT) (16). Normalmente se realiza la
prueba con muestras de hígado, bazo o médula ósea, fijadas con formalina tamponada neutra e incluidas
en parafina. Los portas se tratan con suero de conejo anti-tularemia, se lavan y posteriormente se tratan con
suero de oveja anti-conejo conjugado a isotiocianato de fluoresceína. Las muestras se examinan con un
microscopio de florescencia. En las lesiones necróticas y en la sangre se pueden observar grandes
cantidades de bacterias.
c)
Cultivo
Francisella tularensis no crece en los medios convencionales, aunque en ocasiones algunas cepas pueden,
durante el aislamiento inicial, crecer en agar sangre. La incubación se realiza a 37°C a temperatura
ambiente o 5% de CO2. Para el cultivo se debería utilizar sangre de corazón, hígado, bazo o médula ósea
procedente de animales moribundos. Es necesario emplear medios de cultivo especiales, tales como:
i)
Medio Francis: Agar peptona que contiene cisteína al 0,1% y glucosa al 1%, al que se le añade, antes
de solidificar, sangre desfibrinada humana o de conejo o caballo al 8–10%.
ii)
Medio McCoy y Chapin: Este medio consiste en 60 g de yema de huevo y 40 ml de solución salina
normal, cuidadosamente mezclada y coagulada por calor a 75°C.
iii)
Agar modificado de Thayer–Martin: Medio base de agar glucosa cisteína (GCA) suplementado con
hemoglobina e Iso VitaleX.
Los medios se pueden conservar hasta 8–10 días a 4°C. Las colonias que forma en medio McCoy son
pequeñas, prominentes, redondas y transparentes. Se obtiene un desarrollo superior en el medio Francis y
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en el agar modificado de Thayer–Martin, en los que las colonias confluyen y muestran una apariencia
lechosa y una consistencia mucoide. En cualquiera de los medios, las colonias no se apreciarán hasta
transcurridas 48 horas de incubación a 37°C.
iv)
Agar GCA con tiamina (BBL): Cuando se le añade sangre, el medio se denomina comúnmente GBCA
y se puede sustituir por el medio original no comercial descrito por Down et al. (5). Se suspenden 58 g
de material seco en 1 litro de agua destilada o desmineralizada y se mezcla a fondo. Se calienta con
agitación frecuente y se hierve durante 1 minuto. Se distribuye en tubos y se esteriliza en autoclave a
118–121°C durante 15 minutos.
Para volúmenes mayores (hasta de varios litros) de medio de cultivo, se autoclava a las mismas
temperaturas, pero durante 30 minutos. Se enfría hasta 45–48°C. Manteniendo condiciones asépticas, se le
añaden 25 ml de células sanguíneas concentradas o 50 ml de sangre de oveja o conejo desfibrinada. Se
mezcla a fondo y se vierte en placas. Se incuban a 37°C durante 24 horas antes de utilizar con el fin de
reducir la humedad de la superficie y comprobar que están estériles (5).
Se puede emplear el siguiente medio selectivo además de medios no selectivos: Agar corazón cisteína
(DIFCO) con sangre de conejo al 5%, y penicilina (100.000 unidades), polimixina B sulfato
(100.000 unidades), y cicloheximida (0, 1 ml de una solución base al 1%) por litro.
Entre los criterios diferenciales para la identificación de F. tularensis cabe destacar la ausencia de
crecimiento en los medios convencionales, la morfología celular distintiva y las reacciones de aglutinación
en porta e inmunofluorescentes específicas. Las bacterias son inmóviles, no esporuladas, con tinción bipolar
y de apariencia uniforme en los cultivos de 24 horas, pero pleomórficas en los cultivos de más tiempo de
incubación.
Francisella tularensis se puede identificar mediante frotis teñidos, mediante aglutinación con antisuero
hiperinmune a la tularemia o inoculación en animales. En las zonas de Norteamérica en las que pueden
existir ambos tipos de F. tularensis, el Tipo A se puede diferenciar del Tipo B por el hecho de que la mayor
parte de las bacterias adscritas al Tipo A fermentan el glicerol.
La bacteria también se puede identificar mediante ensayos de hibridación con sondas específicas que
hibridan con el ARNr 16S de F. tularensis, F. tularensis Tipo A, y F. tularensis Tipo B (10), o mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores diseñados para complementar regiones
específicas de las moléculas del ADNr 16S. El ensayo de PCR permitirá la identificación a nivel de género,
especie y subespecie (11).
d)
Prueba de la precipitación en tubo capilar de muestras patológicas
Los tejidos, tales como el bazo, hígado o médula ósea, se cubren con arena estéril en una cantidad de tres
a cinco veces su volumen de solución salina normal. Se transfiere la suspensión a un tubo y se añaden dos
volúmenes de éter etílico. Después de agitar, la mezcla, esta se deja estática durante 4–5 horas a
temperatura ambiente. Se agita de nuevo y a continuación se deja estática toda la noche.
Se extrae la fase acuosa y se centrifuga a 2.000 g durante 30 minutos. El sobrenadante, que contiene el
antígeno, se extrae y distribuye en tubos capilares a los que se les añade un antisuero anti-tularemia.
Los tubos se incuban a 37°C durante 3 horas, y posteriormente se mantienen a 4°C toda la noche. La
formación de un anillo de precipitado indicará un resultado positivo.
e)
Inoculación de animales
La inoculación de animales es extremadamente peligrosa y sólo se recomienda para la identificación del
agente en los casos en los que el cultivo sea negativo y la identificación del agente se necesita por razones
de tipo epidemiológico. Únicamente se debería establecer donde se disponga de jaulas e instalaciones de
bioseguridad apropiadas (véase el capítulo 1.1.2). Para la identificación de F. tularensis , deben utilizarse
pruebas de PCR.
Los animales de laboratorio (preferiblemente ratones) se inoculan con material de cultivo para confirmar la
naturaleza del aislamiento. Se pueden inocular las muestras patológicas para la detección directa de
F. tularensis. Habitualmente los ratones inoculados mueren antes de que se puedan formar las lesiones.
La inyección Intraperitoneal es suficiente para los pases de cultivos puros. En los ratones todas las vías de
administración, tales como la subcutánea, la percutánea o la intravenosa, conducirán a la infección, que es
invariablemente mortal en unos 2–10 días.
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f)
Técnicas moleculares
En los últimos años se ha elaborado la PCR como un excelente método de identificación de F. tularensis y
se ha evaluado su utilidad para detectar F. tularensis en ejemplares de las heridas de los humanos
afectados por tularemia (12).
Se ha demostrado que la PCR en tiempo real es una prueba muy sensible y específica, que ha supuesto un
gran avance en el diagnóstico, dado que el resto de las pruebas utilizadas en la identificación específica de
F. tularensis subesp. tularensis requieren mucho más tiempo para su aplicación (23).
También se ha elaborado un chip de ADN con el que se pueden identificar y diferenciar cepas de la
subespecie de virulencia moderada F. tularensis subesp. tularensis (3).
2.
Pruebas serológicas
En la actualidad se llevan a cabo pruebas serológicas para realizar el diagnóstico de la tularemia en el hombre,
pero son de valor limitado en las especies animales susceptibles, que suelen morir antes de poder producir
anticuerpos específicos. Las pruebas serológicas se pueden emplear, tanto en sueros como en extractos de
pulmón (18), en los estudios epidemiológicos de animales que son resistentes a la infección, tales como las
ovejas, las vacas, los cerdos, los ratones, los perros o las aves (18, 20). Al no existir diferencias antigénicas entre
el Tipo A y el Tipo B, se podría utilizar la bacteria menos virulenta F. tularensis palaearctica como antígeno en
todas las pruebas serológicas.
a)
Aglutinación en tubo
La prueba serológica que más se utiliza es la de aglutinación en tubo. El antígeno consiste en un cultivo de
F. tularensis en medio Francis. Las células del cultivo se recogen tras 5–6 días de incubación. Los cultivos
más jóvenes producen un antígeno más pobre. Las colonias se suspenden en alcohol al 96%, con lo que se
consigue una suspensión que se puede conservar durante 1–7 días a temperatura ambiente. El sedimento
se lava con solución salina normal y se resuspende en un volumen igual de solución salina normal. Se
añade cristal violeta en polvo hasta una concentración final de 0,25%. Las bacterias se tiñen con el cristal
violeta y se incuban a 37°C durante al menos 24 horas y, como mucho, 7 días.
Después de eliminar el sobrenadante, el sedimento se suspende en solución salina normal con o sin
timerosal (mertiolato) a una concentración final de 1/10.000, o formaldehído a una concentración final de
0,5%. La suspensión se calibra con sueros positivos y negativos, y se ajusta con solución salina hasta
conseguir un antígeno, que cuando se ensaye en un porta, produzca reacciones de aglutinación teñidas,
fácilmente visibles, contrastándolas con un fondo líquido claro.
La prueba se realiza en tubos que contienen una cantidad fija de antígeno (0,9 ml) y diferentes diluciones de
suero comenzando con 1/10, 1/20, 1/40, etc. Los resultados se leen después de 20 minutos de agitación, o
después de 1 hora en un baño María a 37°C y a continuación se deja toda la noche a temperatura
ambiente. El sedimento aglutinado se puede ver a simple vista o, preferiblemente, con una lupa manual. Los
tubos positivos son aquellos que muestran un sobrenadante claro. Hay que tener en cuenta posibles
reacciones cruzadas con Brucella abortus, B. melitensis y Legionella sp.
b)
Enzimoinmunoensayo
Otra prueba serológica, el enzimoinmunoensayo (ELISA), también permite un diagnóstico precoz de la
tularemia (4). Esta técnica se emplea mucho hoy en día con fines clínicos. Se utilizan diferentes antígenos,
bacterias enteras y componentes subcelulares (9), como los antígenos de refuerzo contra las
inmunoglobulinas IgA, IgM y IgG; 2 semanas después del inicio de la tularemia, se pueden detectar
anticuerpos específicos en el suero. La IgM se mantiene durante un largo periodo de tiempo y no se puede
utilizar como indicativo de una infección reciente (2). Para el diagnóstico rutinario, se puede emplear como
antígeno la bacteria inactivada por calor (65°C durante 30 minutos). La bacteria se puede utilizar para cubrir
placas de plástico, utilizando los procedimientos usuales (4) y posteriormente se añade la dilución seriada
del suero que se va a probar. Las reacciones positivas se pueden visualizar mediante anti-anticuerpos
marcados con un enzima. Asimismo, la prueba se debería leer en un fotómetro, utilizando como controles
sueros positivos y negativos.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
Se han preparado vacunas con la intención de proteger al hombre, pero como sucede en cualquier otro
desarrollo de vacunas, la realización de ensayos con animales, implica que alguna de las vacunas se podría
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Capítulo 2.1.18. — Tularemia
utilizar para proteger a los animales. No obstante, en la mayoría de los países no existe una vacuna autorizada
para su uso en los animales. Tampoco está disponible en el mercado ninguna vacuna contra la turalemia.
Antes de 1940, los intentos por desarrollar una vacuna contra la tularemia se llevaron a cabo utilizando bacterias
enteras muertas o extractos bacterianos. Ninguna de estas vacunas indujo una protección frente a las cepas más
virulentas de F. tularensis. Mejores resultados tuvieron las vacunas vivas atenuadas. La atenuación se consiguió
mediante el pase de cultivos de la bacteria a través de diversos medios con o sin antisuero. Estas vacunas vivas
atenuadas se han utilizado en las vacunaciones en masa de personas en la antigua Unión Soviética desde 1946,
bien como monocultivos o bien en forma de mezcla de cepas.
Se dispone de una vacuna viva atenuada de la cepa de F. tularensis, biovariedad palaearctica para la vacunación
restringida de individuos con un riesgo elevado de exposición a la bacteria (21).
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* *
NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la tularemia (véase el cuadro en la parte 3 de este Manual
de animales terrestres o consúltese la lista más actualizada en la página web de la OIE: www.oie.int).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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