Metalo-ß-lactamasas en aislamientos clínicos de Pseudomonas

Original Breve
Rev Peru Med Exp Salud Publica
METALO-β-LACTAMASAS EN AISLAMIENTOS CLÍNICOS DE
Pseudomonas aeruginosa EN LIMA, PERÚ
Edgar Gonzales-Escalante1,a, William Vicente-Taboada2,b, Roky Champi-Merino3,a,Javier Soto-Pastrana4,a,
Wilfredo Flores-Paredes5,b, Margarita Lovera-García5,a, Nancy Chuquiray-Valverde6,a,
Carlos Bejarano-Cristobal6,a, Maritza Puray-Chávez 7,a, Segundo León-Sandoval7,a,c
RESUMEN
Con el objetivo de detectar y caracterizar molecularmente las metalo-β-lactamasas (MβL) en aislamientos clínicos
de Pseudomonas aeruginosa, se realizó un estudio trasversal en seis hospitales de referencia de Lima (Perú) en
agosto de 2011. Se evaluó 51 aislamientos de P. aeruginosa, resistentes a ceftazidima y con sensibilidad reducida a
carbapenémicos. El ensayo fenotípico se realizó con el método de aproximación de discos con sustratos (ceftazidima,
imipenem y meropenem) y con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). La detección de genes MβL se realizó
mediante la técnica de reacción en cadena de polimerasa multiplex. A través del método fenotípico se detectaron
MβL en el 15,7% de los aislamientos, en todos ellos la detección de genes mostró la presencia del gen blaIMP. La
descripción del primer reporte de MβL en aislamientos de P. aeruginosa en el Perú debería alertar a los equipos de
vigilancia epidemiológica intrahospitalaria para promover su control y prevenir su diseminación.
Palabras clave: Farmacorresistencia bacteriana; Penicilinasa; Genes MDR; Proteínas asociadas a resistencia a
múltiples medicamentos; Pseudomonas aeruginosa (fuente: DeCS BIREME).
METALO-β-LACTAMASES IN CLINICAL ISOLATES OF
Pseudomonas aeruginosa IN LIMA, PERU
ABSTRACT
The aim of this study was to detect and characterize molecularly metallo-β-lactamase (MβL) in clinical isolates of
Pseudomonas aeruginosa. We carry out a cross sectional study in six publics hospital in Lima on August 2011.
51 isolates of P. aeruginosa resistant to ceftazidime and reduced susceptibility to carbapenemes were evaluated.
The phenotypic assay was performed using the approximation method with substrate disks (ceftazidime, imipenem and
meropenem) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). MβL gene detection was performed using the technique of
polymerase chain reaction (PCR) multiplex. Through MβL detected phenotypic method in 15.7% of isolates. Detection
of genes revealed the presence of the gene in the 8 isolates blaIMP. The first report of MβL in P. aeruginosa in Peru
was described, this should alert the monitoring equipment in the institutions to promote control their spread.
Key words: Drug resistance, bacterial; Penicillinase; Genes, MDR; ltidrug resistance-associated proteins; Pseudomonas
aeruginosa (source: MeSH NLM).
INTRODUCCIÓN
La Pseudomonas aeruginosa, es el patógeno humano
más importante del género Pseudomonas, caracterizado
por su alta virulencia y morbimortalidad. Tradicionalmente
considerado como un patógeno oportunista asociado
a múltiples infecciones intrahospitalarias, ahora se
3
4
5
6
7
a
1
2
sabe que la P. aeruginosa se encuentra asociada a
infecciones adquiridas tanto en la comunidad como
en ámbitos nosocomiales.
Existen pocas opciones terapéuticas efectivas para las
infecciones causadas por este microorganismo, ello
debido a la elevada resistencia intrínseca que este
Instituto Nacional de Salud del Niño. Lima, Perú.
Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas. Lima, Perú.
Hospital Nacional Hipólito Unanue. Lima, Perú.
Hospital Nacional Docente Madre Niño San Bartolomé. Lima, Perú.
Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen. Lima, Perú.
Hospital Alberto Sabogal Sologuren. Lima, Perú.
Laboratorio de Epidemiología Molecular y Genética, Instituto de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.
Tecnólogo médico; b médico patólogo clínico; c magister en Enfermedades Infecciosas y Tropicales
Recibido: 19-12-12 Aprobado: 17-04-13
Citar como: Gonzales Escalante E, Vicente Taboada W, Champi Merino R, Soto Pastrana J, Flores-Paredes W, Lovera García M, et al. Metalo-β-lactamasas en
aislamientos clínicos de Pseudomonas aeruginosa en Lima, Perú. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2013;30(2):241-5.
241
Gonzales-Escalante E et al.
Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2013; 30(2):241-45.
presenta ante diferentes familias de antimicrobianos (1,2).
La farmacorresistencia de este microorganismo esta
relacionado a diferentes mecanismos tales como la
alteración de las bombas de eflujo o la alteración de la
permeabilidad en la membrana celular. La alteración
de la MexAB-OprM, que es una bomba de eflujo,
compromete de manera simultánea la sensibilidad a
penicilinas, cefalosporinas, quinolonas y al meropenem.
Otro ejemplo es la pérdida de la porina OprD, que se
encuentra en la membrana externa y es utilizada por
los carbapenémicos, y no por otros β-lactámicos,
para su penetración en la célula; cuya alteración se
asocia a la resistencia a imipenem y a una sensibilidad
reducida a meropenem, esta pérdida es mediada por
la mutación de los genes que codifican esta porina (3,4).
Sin embargo, es la adquisición de genes codificantes de
metalo-β-lactamasas (MβL) el mecanismo de resistencia
bacteriana que tiene una alta implicancia epidemiológica,
debido a su capacidad de diseminación horizontal.
Las MβL poseen cuatro características principales:
poseen actividad contra los carbapenemes; no hidrolizan
los monobáctamicos, como el aztreonam; son inhibidas
por quelantes, como el ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA), o el mercapto acetato de sodio, y requieren
cationes divalentes (generalmente Zn­­+2) como cofactor
para su actividad catalítica; además de ello, las MβL
no son inhibidas por los antibióticos suicidas (ácido
clavulánico, sulbactan y tazobactan) que bloquean la
acción de las serino-β-lacamasas (5,6). Diversas familias de
MβL han sido identificadas hasta el momento y, debido a
sus características bioquímicas, han sido divididas en tres
subgrupos. El subgrupo 3a incluye enzimas con amplio
espectro de hidrólisis para penicilinas, cefalosporinas e
imipenem, muchas enzimas de este subgrupo necesitan
de Zn+2 para desarrollar su actividad. El subgrupo 3b
comprende enzimas que hidrolizan preferentemente
carbapenemes siendo consideradas las verdaderas
carbapenemasas, todas las enzimas de este subgrupo
necesitan Zn+2 para su actividad y son inhibidas por el
EDTA. El subgrupo 3c comprende enzimas que hidrolizan
rápidamente ampicilina (7,8).
A pesar de que en otras partes del mundo han sido
ampliamente documentadas, en nuestro país los
genes productores de MβL no han sido detectados
hasta la fecha. La aproximación de un disco que
contenga un agente quelante como el EDTA a un disco
que contenga un carbapenémico podría resultar una
herramienta útil para la detección de MβL; ello debido
que el efecto sinérgico entre los carbapenémicos y el
agente quelante sería indicativo de la presencia de
MβL. Sin embargo, ningún método fenotípico ha sido
suficientemente estandarizado o recomendado para
la detección de MβL en el laboratorio de microbiología
242
clínica (9,10). El objetivo de este estudio fue detectar y
caracterizar molecularmente las MβL responsables de la
resistencia a carbapenémicos en aislamientos clínicos
de Pseudomonas aeruginosa.
EL ESTUDIO
Se realizó un estudio trasversal, en el cual se
estudiaron 51 aislamientos consecutivos y no
repetitivos de P. aeruginosa provenientes de pacientes
hospitalizados en seis hospitales públicos de Lima (uno
pediátrico, uno materno-infantil, uno oncológico y tres
generales) recolectados durante el mes de agosto de
2011. Los criterios de selección de los microorganismos
fueron señalados siguiendo las recomendaciones de la
Subcomisión de Antimicrobianos de la Sociedad Argentina
de Bacteriología (10,11); es decir, que durante las pruebas
de disco difusión la P. aeruginosa tuviera resistencia
a ceftazidima (halos menores a 15 mm) y sensibilidad
reducida a los carbapenémicos (halos menores a 21 mm
de imipenem o meropenem). El procesamiento de los
aislamientos se realizó en el Laboratorio de Epidemiologia
Molecular del Instituto de Medicina Tropical de la
Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
Se realizaron pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos en los aislamientos mediante la técnica
de disco difusión, de acuerdo con las recomendaciones
del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).
Se incluyeron discos conteniendo aztreonam 30 µg
(ATM); ceftazidima 30 µg (CAZ); cefepima 30 µg (FEP);
imipenem 10 µg (IPM); meropenem 10 µg (MEN);
piperacilina/tazobactam 100/10 µg (TZP); amikacina 5
µg (AMK); gentamicina 10 µg (GEN); ciprofloxacina 5 µg
(CIP), y colistin 10 µg (COL, Oxoid®). Inmediatamente
después del tiempo de incubación, los diámetros de los
halos de inhibición para cada uno de los antimicrobianos
se registraron e interpretaron de acuerdo con las normas
CLSI 2012 (12).
Para la determinación fenotípica de las MβL se utilizó la
la técnica de aproximación del disco modificada. Para
ello se inocularon las placas según las recomendaciones
del CLSI para la prueba de disco difusión, y se
colocaron discos conteniendo EDTA (Laboratorios
Britania-Argentina: EDTA 372 µg / mercapto acetato
de sodio 900 µg) y discos comerciales conteniendo
imipenem 10 µg, meropenem 10 µg y ceftazidima 30 µg
(Oxoid®), respetando la distancia de 1,5 cm de centro
a centro entre los discos con antibióticos y el inhibidor.
Las placas se incubaron durante 18 horas a 35 ºC. Un
agrandamiento en el halo de inhibición del disco con
antibiótico en la zona adyacente al disco con EDTA fue
interpretado como posible presencia de MβL (9,10).
Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2013; 30(2):241-45.
Metalo-β-lactamasas en Pseudomonas aeuruginosa
Tabla 1. Pares de cebadores empleados en la detección
genotípica de las Metalo-β-lactamasas en aislamientos
de Pseudomonas aeruginosa
Cebador
IMPF
IMPR
VIMF
VIMR
GIMF
GIMR
SIMF
SIMR
SPMF
SPMR
Secuencia
5’-GGAATAGAGTGGCTTAAYTCTC-3’
5’-CCAAACYACTASGTTATCT-3’
5’-GATGGTGTTTGGTCGCATA-3’
5’-CGAATGCGCAGCACCAG-3’
5’-TCGACACACCTTGGTCTGAA-3’
5’-AACTTCCAACTTTGCCATGC-3’
5’-TACAAGGGATTCGGCATCG-3’
5’-TAATGGCCTGTTCCCATGTG-3’
5’-AAAATCTGGGTACGCAAACG-3’
5’-ACATTATCCGCTGAAACAGG-3’
Figura 1. Gel de agarosa de la corrida electroforética de PCR
multiplex para MβL en los 8 aislamientos de P. aeruginosa
positivos para blaIMP
La detección genotípica de la MβL se realizó mediante
un ensayo de Multiplex-PCR empleando como molde
ADN total (10). Los pares de cebadores empleados se
detallan en la Tabla 1.
Los reactivos empleados fueron de Invitrogen (EE. UU.).
Se empleó un termociclador VERITI Applied Byosistem
(EE. UU.) y la siguiente reacción de amplificación: desnaturalización 94 °C, 5 min; seguida de 36 ciclos de: desnaturalización 94 °C, 30 s; hibridación 52 °C, 40 s; amplificación 72 °C, 50 s; y un período final de elongación 72 °C, 5
min. Los fragmentos esperados fueron IMP (188pb), VIM
(390pb), SPM (271pb), GIM (477pb) y SIM (570pb).
HALLAZGOS
A través del método fenotípico se detectaron
aislamientos sospechosos de producir MβL en el 15,7%
(8/51) de los aislamientos, en ellos se observó sinergia
entre los carbapenémicos y el disco que contenía
EDTA. El 25% (2/8) de los aislamientos sospechosos
de producir MβL fueron sensibles al aztreonam, a pesar
de ser este un indicador de la presencia de las MβL.
En todos los casos los aislamientos fueron sensibles a
colistin. Los datos de susceptibilidad se muestran en la
Tabla 2. La detección de los genes codificantes de MβL
por Multiplex-PCR reveló la presencia del gen blaIMP
en los ocho aislamientos sospechosos de producir
MβL que fueran detectados por el ensayo fenotípico
empleando EDTA (Figura 1), lo que indica que los
ensayos de detección fenotípica resultaron adecuados.
DISCUSIÓN
Si bien los resultados obtenidos pertenecen a un periodo
corto y la situación epidemiológica es particular para las
distintas instituciones del país, es importante notar que
la prevalencia de MβL en aislamientos de P. aeruginosa
resistentes ceftazidima y con sensibilidad reducida
a carbapenémicos resultó ser similar a la de otros
estudios realizados en América Latina. En Argentina,
dos estudios han señalado frecuencias de 11 y 14%, en
ambos casos se aisló la enzima VIM (13,14); en Chile se
encontró una frecuencia de 18,6% de MβL también del
tipo VIM (15). En tanto que en Brasil se ha señalado que
el gen prevalente es SPM-1 con frecuencias que varían
entre 5 a 62%, en diferentes regiones del país, en el caso
del gen IMP la prevalencia va de 2 a 8% y, finalmente, el
gen VIM fue detectado con una prevalencia del 30% (16).
Tabla 2. Susceptibilidad antimicrobiana de P. aeruginosa productoras de Metalo β lactamasas.
Aislamientos
(identificación)
1 (s2287)
2 (5764)
3 (322)
4 (1609)
5 (385)
6 (c3638)
7 (c3743)
8 (c3869)
Tipo de
Muestra
ABr
Sec
Her
Orn
Orn
Cat
ATq
ATq
CAZ
8/R
6/R
6/R
6/R
9/R
6/R
6/R
6/R
FEP
6/R
6/R
6/R
6/R
7/R
6/R
6/R
6/R
Susceptibilidad antimicrobiana (mm/interpretación)
ATM
AMK
GEN
CIP
COL
TZP
33 / S
6/R
6/R
8/R
16 / S
13 / R
6/R
6/R
6/R
6/R
15 / S
15 / R
11 / R
6/R
6/R
6/R
15 / S
16 / R
10 / R
6/R
6/R
6/R
14 / S
6/R
34 / S
6/R
6/R
6/R
16 / S
23 / S
6/R
6/R
6/R
18 / R
15 / S
6/R
6/R
6/R
6/R
21 / R
15 / S
6/R
6/R
6/R
6/R
6/R
14 / S
6/R
IPM
14 / R
6/R
6/R
6/R
6/R
6/R
6/R
6/R
MEN
18 / I
6/R
6/R
6/R
6/R
6/R
6/R
11 / R
Nota: la lectura de la susceptibilidad antimicrobiana se realizó según los criterios de la CLSI 2012; los números arábigos representan el diámetro (mm)
del halo alrededor del disco de difusión y, las letras son la interpretación (S: sensible, I: intermedio, R: resistente)
CAZ: ceftazidima; FEP: cefepime; AMK: amikacina; GEN: gentamicina; CIP: ciprofloxacina; ATM: aztreonam; COL: colistina; TZP: piperacilina/
tazobactan; IPM: imipenem; MEM: meropenem; ABr: aspirado bronquial, Sec: secreción, Her: herida, Orn: orina, Cat: catéter, ATq: aspirado traqueal
243
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La no detección de genes para MβL en 84,3% de los
aislamientos de P. aeruginosa resistentes a ceftazidima
y con sensibilidad reducida a los carbapenémicos,
asociado al resultado de la prueba fenotípica refuerza
la hipótesis que la producción de MβL no es el principal
mecanismo de resistencia a los carbapenémicos en
P. aeruginosa. Este resultado sugiere la ocurrencia de
otros mecanismos de resistencia, como mutaciones en
el gen OprD, que resultan en porinas con reducida
afinidad por el imipenem y es considerado el
principal responsable por la resistencia al imipenem
en P. aeruginosa (17) La resistencia al meropenem puede
ser resultado de la hiperexpresión de sistemas de eflujo (18).
Si bien las MβL no hidrolizan eficientemente al aztreonam, por lo cual no son capaces de conferir resistencia
a este antibiótico, en esta investigación se obtuvieron
dos aislamientos sensibles, los demás valores se interpretaron como resistentes; por lo que no resulto un buen
indicador de la presencia de MβL; sin embargo, la resistencia a dicho agente no descarta su presencia (5,6). En
este caso, la resistencia a este antibiótico estaría mediada por otro mecanismo de resistencia no analizado
en el presente estudio, como por ejemplo, la presencia
de β-lactamasas de espectro extendido o sobre expresión de un sistema de eflujo (19,20). En todos los casos se
observo sensibilidad a colistin, siendo este una buena
alternativa terapéutica en caso de P. aeruginosa multirresistente.
Algunas limitaciones de nuestro estudio deben ser
reconocidas, el tiempo en que se recolectaron las
muestras y su cantidad no permiten determinar la
magnitud del problema, por lo que hacen faltan estudios
mayores para conocer la realidad nacional en torno a la
resistencia bacteriana mediada por MβL en P. aeruginosa.
Además, es necesaria la realización del secuenciamiento
para conocer las variantes alélicas de esta enzima y su
codificación genética que nos permita conocer si existen
otros genes de resistencia relacionados, como enzimas
modificadoras de aminoglucósidos.
En conclusión, se ha descrito el primer reporte de MβL
en P. aeruginosa en el Perú, la descripción molecular
de estas enzimas ha señalado que el gen blaIMP estuvo
presente en todos ellas. El desarrollo de este mecanismo
de farmacorresistencia en el Perú podría tener un
grave impacto en el ámbito clínico y epidemiológico,
en particular de los hospitales incluidos en el presente
estudio; por lo cual los equipos de vigilancia de estos
hospitales deberían promover medidas de control para
evitar su diseminación.
Agradecimientos: al personal del Laboratorio de Epidemiología
Molecular y Genética del Instituto de Medicina Tropical de
la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, por el apoyo
brindado para la realización de esta investigación.
Contribuciones de autoría: EGE, WVT, RCM, JSP y WFP
han participado en la concepción del artículo, la recolección
de datos, material de estudio y redacción del artículo. MPC y
SLS participaron en la idea de la investigación, la redacción y la
asesoría técnica y administrativa. Además, MLG, NCV Y CBC
participaron en la recolección de datos y material de estudio y
redacción del artículo. Todos los autores aprobaron la versión
final del manuscrito.
Fuentes de financiamiento: autofinanciada
Conflictos de interés: los autores declaran no tener conflicto
de interés.
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Correspondencia: Edgar Gonzales Escalante
Dirección: Av. Brasil 600, Lima 05, Perú.
Teléfono: (511) 330-0066 anexo 3201.
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