biomarcadores de genotoxicidad. alcances y limitaciones

BIOMARCADORES DE
GENOTOXICIDAD.
ALCANCES Y
LIMITACIONES
Prof. Dra. Marta Ana Carballo
CIGETOX- CITOGENETICA HUMANA Y
GENETICA TOXICOLOGICA
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA CLINICA-INFIBIOC.
Facultad de Farmacia y Bioquímica.
Universidad de Buenos Aires
ENTORNO / AMBIENTE
EVENTOS BIOLÓGICOS
TEMPRANOS
EVENTOS BIOLÓGICOS TARDÍOS
ENFERMEDAD CLÍNICA
La Genética Toxicológica es la unión de dos grandes áreas
del conocimiento como son la Toxicología y la Genética.
Identifica y analiza la acción de los agentes con toxicidad
dirigida hacia los componentes hereditarios de los
organismos vivos.
•
•
•
•
1927 - Muller - radiaciones
1947 - Auerbach - agentes químicos
1953 - Watson y Crick - ADN
1969 - Alexander Hollaender - EMS
•Determina el impacto que los distintos agentes
(físicos, químicos, biológicos) pueden tener sobre
el material genético
•Trata de establecer la relación entre mutagenesis
e iniciación del proceso neoplásico
Componentes celulares proclives a los
procesos mutagénicos
Si hay una lesión en el ADN …
Reparación del
ADN
Proliferación normal
Errores en la reparación del
ADN
Daño severo del
ADN
Arresto del ciclo
celular
Proliferación anormal
9Micromutaciones
9Macromutaciones
Apoptosis
Necrosis
Tipos y frecuencias de daño en el ADN
Tipo
Tipode
dedaño
dañoen
enADN
ADN
Eventos/día/célula
Eventos/día/célula
%
%de
dedaño
dañototal
totaldiario
diario
(SSB)
(SSB)Ruptura
Rupturade
desimple
simplecadena
cadena
7
Metilación
Metilaciónde
delalaGuanina
GuaninaNN7
120.000
120.000
84.000
84.000
50,9
50,9
35,6
35,6
Depurinación
Depurinación
6
Metilación
Metilaciónde
delalaGuanina
GuaninaOO6
24.000
24.000
3.120
3.120
10,2
10,2
1,3
1,3
Oxidación
Oxidacióndel
delADN
ADN
Depirimidación
Depirimidación
2.880
2.880
1.320
1.320
1,2
1,2
0,5
0,5
Deaminación
Deaminaciónde
delalaCitosina
Citosina
(DSB)
(DSB)Rupturas
Rupturasde
dedoble
doblecadena
cadena
360
360
99
0,2
0,2
0,01
0,01
AGENTE
AGENTEGENOTOXICO
GENOTOXICO
Rayos
RayosXX
ROS
ROS
Agentes
Agentes
alquilantes
alquilantes
RI
RI
Luz
LuzUV
UV
Agentes
Agentes
antitumorales
antitumorales
Luz
LuzUV
UV
Hidrocarburos
Hidrocarburos
policíclicos
policíclicos
aromáticos
aromáticos
Errores
Erroresde
de
replicación
replicación
LESIONES
LESIONES
8-oxidG
8-oxidG
Rupturas
Rupturasde
de
simple
cadena
simple cadena
Fotoproductos
Fotoproductos
Aductos
Aductos
Dímeros
Dímerosde
de
pirimídinas
pirimídinas
PROCESOS
PROCESOS
Reparación
Reparaciónpor
por
escisión
escisiónde
de
bases
bases
(BER)
(BER)
Reparación
Reparaciónpor
por
escisión
escisiónde
de
nucleótidos
nucleótidos
(NER)
(NER)
Enlaces
Enlaces
cruzados
cruzados
Rupturas
Rupturasde
de
doble
doblecadena
cadena
DE
DE
A-G
A-G
T-C
T-C
Inserciones
Inserciones
Deleciones
Deleciones
REPARACION
REPARACION
Recombinación
Recombinación
Homóloga
Homóloga(HR)
(HR)
Reunión
de
Reunión de
extremos
extremosno
no
homólogos
(NHEJ)
homólogos (NHEJ)
Reparación
Reparaciónde
de
Mal
Mal
apareamiento
apareamiento
(MMR)
(MMR)
B
I
O
M
A
R
C
A
D
O
R
E
S
DE EXPOSICIÓN:
Señala presencia de sustancia
exógena o metabolitos, o producto de interacción entre
agente y molécula blanco.
INTERNO DE DOSIS
: Indica que el tóxico ha
entrado al orgsnimo..
DE SUSCEPTIBILIDAD:
Indicador de limitación
adquirida o inherente de un organismo para responder a la
exposición a un xenobiótico.
DE DAÑO BIOLOGICO EFECTIVO:
Indica
que el tóxico ha producido algún tipo de daño en el
organismo.
DE
EFECTO:
Indicador de una alteración
bioquímica, fisiológica o genética, resultado de la
exposición a un xenobiótico.
tico
DE RESPUESTA BIOLOGICA:
estadíos del proceso
alteraciones genéticas
DE ENFERMEDAD:
tempranas de la enfermedad.
de
daño.
representa
Representan
manifestaciones preclínicas o
EVALUACION
NIVELES DE COMPLEJIDAD
CRECIENTE
PRIMARIO (Bacteriano, Viral) (I)
SECUNDARIO (Cultivo de células) (II)
TERCIARIO (Organismo entero) (III)
CUATERNARIO (Epidemiológico) (IV)
Niveles de Evaluación
SEGUNDO NIVEL (II)
PRIMER NIVEL (I)
)
)
Nivel Molecular o bacteriano
Ensayos en procariotes o
eucariotes inferiores
)
Ejemplo: Test de Ames ;
Bacillus subtilius
)
)
Ensayos en cultivos de células
eucariotas
)
Ejemplo: Líneas celulares CHO,
V79, Hela , Linfocitos de Sangre
Periférica
CUARTO NIVEL (IV)
TERCER NIVEL (III)
) Nivel “In vivo”
)
)
Ensayos organismo entero
Ejemplos: Plantas, animales
(invertebrados o vertebrados) y
humanos expuestos
Nivel “In vitro”
)
)
Nivel Epidemiológico
Ensayos en poblaciones
expuestas
)
Ejemplo: exposición
accidental, terapéutica o laboral
de individuos expuestos
Principales Ensayos Utilizados en
Genética Toxicológica
•
Mutaciones Génicas
Test de Ames
Ensayo de reversión a triptofano en E.coli
Mutaciones génicas en cultivo de células de mamífero (HPRT o TK)
Mutaciones recesivas ligadas al sexo en Drosophila
• Evaluaciones citogenéticas en células de mamífero
Ensayo de aberraciones cromosómicas
Ensayo de intercambio de cromátides hermanas
Ensayo del micronúcleo
Evaluación de Aneuploidías
• Otros ensayos
Daño y reparación en células de mamífero
Estudios de recombinación mitótica en levaduras y/o Drosophila
Ensayo del locus específico en ratón
Ensayo del letal dominante
Análisis citogenético y Ensayo de traslocaciones heredables
Ensayo de alteraciones esqueléticas en ratón
ALCANCES
DISEÑO DE PROTOCOLOS PARA EVALUACION DE
DROGAS, ADITIVOS, MEDICAMENTOS, Y
COMPUESTOS QUIMICOS EN GENERAL
METODOLOGIAS DIAGNOSTICAS PARA LA
CARACTERIZACION DE DAÑO EN SINDROMES DE
INESTABILIDAD CROMOSOMICA
MONITOREO DE INDIVIDUO / S EXPUESTOS EN
FORMA LABORAL, ACCIDENTAL O TERAPEUTICA
Las agencias internacionales de
regulación han seleccionado grupos
de biomarcadores de efecto con el
objeto de lograr la mejor y más
segura caracterización del daño,
evaluando tanto “in vitro” como “in
vivo” la genotoxicidad potencial.
OPPTS: OFFICE OF PREVENTION, PESTICIDES AND TOXIC
SUBSTANCES (EPA)
OECD: ORGANIZATION FOR ECONOMIC COOPERATION AND
DEVELOPMENT (FDA)
Guidelines
S2A: Aspectos específicos de regulación de Ensayos
de genotoxicidad
S2B: Genotoxicidad: Una batería standard para el
ensayo de genotoxicidad de productos farmacéuticos
Los Comité Internacionales de Armonización (ICH) sugieren la
realización de baterías de ensayos constituidas por:
◊ un ensayo de reversión en bacterias
◊ un estudio citogenético para detectar daño cromosómico (test de
aberraciones cromosómicas) o
un estudio in vitro para
mutaciones génicas)
◊ un test in vivo para genotoxicidad que detecte daño cromosómico
(aberraciones cromosómicas o test de micronúcleo en ratón)
Test de Salmonella o Test de Ames
Desarrollo
de
cepas
de
S.typhimurium auxótrofas para
histidina que permiten evaluar
la
retromutación
de
este
organismo a histidina (+ ).
Es decir que una especie que
ha perdido una característica,
vuelve a adquirirla en base a
otra mutación.
TA100, TA98, TA1535, TA1537,
TA102, TA104
rfa, ∆uvr B, plásmido pKM101,
plásmido pAQ1
UN ESTUDIO CITOGENETICO PARA
DETECTAR DAÑO CROMOSOMICO
(TEST DE ABERRACIONES
CROMOSOMICAS )
O
UN ENSAYO IN VITRO PARA DETECTAR
MUTACIONES GENICAS
(MOUSE LYMPHOMA ASSAY)
ABERRACIONES CROMOSÓMICAS
• Detecta alteraciones numérica y estructurales.
• Se basa en evidenciar cambios en la morfología de
los cromosomas o en su número pudiendo detectar
modificaciones de ploidía.
• Se utiliza para determinar el efecto clastogénico y/o
aneunógeno de las drogas en estudio.
• Es el test más utilizado históricamente para
evaluación de drogas.
Metafase Parcial de Linfocitos de Sangre Periférica
con Aberraciones Cromosómicas
Metafase Parcial de línea celular CHO con
Aberraciones Cromosómicas
IM =Nºcel en estadíos de mitosis/Nº total cel interfase
Técnica de coloración diferencial de cromátide
o FPG- fluorescencia plus giemsa
IR= Nº cél. M1+2 Nº cél.
M2 + 3 Nº cél. M3/100
Ensayo de Mutaciones Génicas en Células
de Mamífero
Se puede realizar en distintas líneas celulares
L5178Y linfoma de ratón (TK)
TK6 línea linfoblastoide humana (HGPRT)
Ambos ensayos se basan en la adquisición de
resistencia a un producto.
Línea normal→no crece en presencia del producto.
Línea mutada→ crece en presencia del producto.
Para TK se seleccionan por resistencia a
Trifluorotimidina.
Las células deficientes en HPRT son seleccionadas
por resistencia a la 6-tioguanina u 8 azaguanina.
UN TEST IN VIVO PARA
GENOTOXICIDAD QUE DETECTE
DAÑO CROMOSOMICO
(ABERRACIONES CROMOSOMICAS
O TEST DE MICRONUCLEO EN
RATON)
Evento
Genotóxico
Mala segregación
Daño al ADN
Defectos en:
• Huso mitótico
• Centrómero
• Mala condensación
cromosómica
• Roturas de ADN
• Errores de reparación
MN
MN
Guidelines
S2 R1: Ensayos de genotoxicidad e
Interpretación de datos para Productos
farmacéuticos de uso Humano
◊ un ensayo de reversión en bacterias
◊ un estudio citogenético para detectar daño cromosómico (test de
aberraciones cromosómicas o , o TEST DEL MICRONÚCLEO in vitro o
ensayo de mutaciones génicas)
◊un test in vivo para genotoxicidad que detecte daño cromosómico
(aberraciones cromosómicas, test de micronúcleo en ratón, TEST DEL
COMETA)
◊ un ensayo de reversión en bacterias
◊ un test in vivo para genotoxicidad UTILIZANDO DOS TEJIDOS , uno que
detecte daño cromosómico (aberraciones cromosómicas, test de
micronúcleo en ratón) Y OTRO ENSAYO IN VIVO COMO TEST DEL
COMETA, UDS, TRANSGENIC MOUSE MUTATION ASSAY)
AGENTES
GENOTÓXICOS
Ensayo de
MNCB
Inhibe la
polimerización
de actina
CITOCALASINA B
No se forma
el anillo
contráctil
BLOQUEO
DE LA
CITOCINESIS
Célula Binucleada con MN
MICRONÚCLEOS
CARACTERÍSTICAS
Redondo u oval
Borde liso y uniforme
Igual plano focal que núcleo
No ser refringente
1/16 y 1/3 del diámetro del núcleo
Igual coloración y textura que núcleo
No superpuesto ni conectado
Se analizan 1000 células BN
Expresión de resultados:
• Nº MN/1000 células BN
• Frec. células BN con MN en 1000 BN
DETECTA
• Roturas de ADN simple cadena.
• Roturas de ADN doble cadena.
• Sitios Alcali lábiles.
• ADN-ADN y ADN-prot cross linking.
• Roturas simples asociadas con
mecanismos de reparación
incompletos
ANALISIS DE RESULTADOS
CONTEO VISUAL
Se deben contar 50 cometas/vidrio.
2 vidrios/muestra. Total: 100 células por
muestra.
Estableciendo Categorias de Daño:
1:< 20 micras
2: 20-40 micras
3: 40-80 micras
4: > 80 micras
• ID= n1+2 n2+ 3 n3+4 n4,
siendo n la cantidad de células dañadas que se
registraron para cada una de las cuatro
categorías.
SINDROMES DE
INESTABILIDAD
CROMOSOMICA
Inestabilidad cromosómica:
¾ Rearreglos, comportamiento citogenético
anormal.
¾ Causas:
• Mutaciones de proteínas involucradas en la replicación
y reparación del ADN.
• Fallos en puntos de control del ciclo celular.
• Anomalías centrosómicas.
• Defectos en la segregación.
• Mal funcionamiento de los telómeros.
• Recombinación homóloga vinculada a la reparación de
roturas de ADN de doble hebra.
Clasificación
¾ Síndromes clásicos
• Anemia de Fanconi
• Síndrome de Bloom
• Ataxia Telangiectasia
¾ Síndromes menos frecuentes
•
•
•
•
Nijmegen breakage
ICF
Cockayne
Xeroderma Pigmentosa
•
•
•
•
•
Riyadh
Rothmund-Thompson
Radial-renal
Craniostenosis-Microcefalia
Dubowitz
¾ Otros
factores intrínsecos hereditarios
Carcinogénesis Ambiental
exposición a agentes carcinogénicos
Defectos en la replicación o
Reparación del ADN
Incremento en el riesgo
de cáncer
Dependiendo del síndrome, el comportamiento anormal tomará la forma de:
•
•
•
•
Frecuencia elevada de aberraciones espontáneas
Niveles elevados de intercambio de cromátides hermanas
Hipersensibilidad cromosómica a Xenobióticos
Rearreglos cromosómicos estables o recurrentes
Características en común
Predisposición a tumores
Inmunodeficiencia
Retardo en el crecimiento
SINDROMES DE INESTABILIDAD
CROMOSOMICA
SINDROME DE BLOOM
Es autosómica recesiva.
Mayor frecuencia en judíos Askenazi
y japoneses.
Presentación:
microcefalia,
alteraciones de piel y deficiencia
inmunológicas. Poseen inteligencia
normal.
Riesgo: desarrollan distintos tipos de
cáncer y leucemias agudas.
Pronóstico de vida: la edad
promedio de vida son los 24 años (14
a 49).
Características citogenéticas::
rupturas de cormosomas dando figuras de cuadriradiales e
intercambio de cromátides hermanas.
El diagnóstico citogenético se hace mediante ICH espontáneo,
(90 o más) .
El gen afectado es el BLM que se encuentra en 15q26.1
ANEMIA DE FANCONI
Autosómica recesiva.
Presentación.:
retardo
mental,
malformaciones esqueléticas, anomalías
en piel, anemia severa.
Riesgo:
desarrollan
sindromes
mielodisplásicos y LMA
Pronóstico de vida: La edad de
sobrevida es hasta los 16 años y la causa
de muerte es hemorragia y sepsis
asociado a sindromes mielodisplásicos.
Tipos: 7 grupos . Los genes involucrados
se describen como FANC y se adicionan
las letras que van desde A hasta G. Por
ahora los de peor pronóstico son los del
grupo G.
Características
citogenéticas:
alteraciones
estructurales
espontáneas
que
se
ven
incrementadas cuando se exponen los cultivos a
agentes inductores de cross-linking. Para el
diagnóstico se utiliza DEB.
ATAXIA TELANGIECTASIA
Autosómica recesiva,
Ataxia cerebelar y telangiectasia
ocular, nariz y orejas
No reconocen mecanismos de
reparación de DSB
Presentación: segundo año de vida
con ataxia cerebelar progresiva,
disartria y distonía.
Riesgo: de leucemia y linfomas y
tumores de piel, ovario, mama y
estómago.
Pronóstico de vida: hasta la 4ª
década
con
medicación
permanante.
Características citogenéticas:
Incremento de alteraciones tipo cromátide,
roturas
cromosómicas,
triradiales
y
cuadriradiales
Gen ATM 11q22-q23.1
Diagnóstico
citogenético
mediante
exposición a rayos X o radiomiméticos (BLM)
BIOMONITOREO
DE INDIVIDUOS
EXPUESTOS
MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A
CITOSTATICOS
Edad
Tiempo de
trabajo
Sexo
Manifestaciones clínicas
A
28
2 años
F
Lagrimeo/ rinorrea y descamación en piel
B
32
3 años
M
Lagrimeo/ fotofobia
C
32
9 años
M
Irritación visual/sequedad
nasal/oligoazoospermia
D
33
2 años
F
Irritación visual/sequedad en pie
E
54
9 años
F
Sin síntomas
F
46
25 años
F
Sequedad conjuntival
G
36
2 años
F
Descamación/blefaritis/sequedad conjuntival
MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A
CITOSTATICOS
IM
IR
ICH
MN
A
2.5
1.6
7.3± 0.48
3.92
B
2.2
1.5
5.94± 1.28
2.88
C
2.3
1.48
7.46± 0.65
12.66
D
3.6
1.65
6.9± 0.98
11.99
E
3.2
1.61
6.18± 0.64
15.29
F
2.5
1.45
7.93± 1.13
32.50
G
2.7
1.38
8.42± 020
16.20
CONTROL: IM:1.5 -6.8
IR: 1.3-2.4
ICH : 2-7.8
MN: 3-23
ESTRATEGIAS
• 5 de los individuos presentan valores en el rango de
los controles históricos y de la literatura
• En tres casos alguno o varios de los biomarcadores
se encuentran modificados con respecto a los
valores control
• Se sugiere la repetición luego de pasado un mínimo
de 6 meses para analizar comportamiento celular
con el mismo biomarcador alterado y/o la
introducción de una nueva metodología que aporte
mayor sensibilidad.
LIMITACIONES
MOTIVO DE APLICACIÓN DEL ESTUDIO
ELECCION DEL/LOS BIOMARCADORES
ANAMNESIS
INTERPRETACION DEL RESULTADO
FACTORES CONFUNDENTES
Muchas Gracias
por su atención !!!
CIGETOX
Prof. Dra. Marta Ana Carballo
Dra. Marcela López Nigro- Bioq. Victoria Arroyo
Lic. y Ms. Susana Bartolotta
Becarios Doctorado: Bioq. Catalina Cortada;
Bioq. Fernanda Simoniello; Bioq. Natalia
Casanova
Becarios Iniciación: Med. Gabriel Angeleri- Lic.
Erika Portmann
Tesistas de Licenciatura: Estud. Silvana
Curieses- Estud. Natalia Balarino