BILIRRUBINA TOTAL Y DIRECTA

BILIRRUBINA
TOTAL Y DIRECTA
Método JENDRASSIK colorimétrico
punto final
PRINCIPIO
La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico
diazotado produciendo un pigmento color rojo-violáceo
(azobilirrubina) que se mide fotocolorimétricamente a 546-578 nm.
Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente
con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta)
requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite su
reacción. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubina total
(conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debe
agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción.
SIGNIFICADO CLÍNICO
La Bilirrubina es un pigmento biliar de color amarillo anaranjado
que resulta de la degradación de la hemoglobina.
Dicha
degradación se produce en el bazo. La bilirrubina se conjuga en el
hígado y se almacena en la vesícula biliar. La hiperbilirrubinemia
es el resultado de un incremento de la bilirrubina en plasma, se dá
por una destrucción rápida de los hematies como resultado de
alteraciones sanguíneas tales como anemia hemolítica.
En recién nacidos el aumento del nivel de bilirrubina puede
deberse a una incompatibilidad de grupos sanguíneos, sepsis,
inmadurez hepática o
defectos hereditarios ligados a la
conjugación de la bilirrubina.
CONTENIDOS
ÁCIDO SULFANÍLICO
Acido Clorhídrico, Acido Sulfanílico, Agua Desmineralizada.
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
• Los reactivos contienen menos del 0.1% de ázida sódica. La
ázida sódica puede reaccionar con tuberías de cobre y plomo
formando compuestos explosivos. Las regulaciones locales para
el desecho de compuestos peligrosos deben ser respetadas,
descartar con abundante agua.
Bilirrubina Directa (BD)
MATERIALES
ADICIONALES
REQUERIDOS
NO
SUMINISTRADOS
• Solución Salina o Cloruro de Sodio 0.9%
• Baño termoregulado.
• Espectrofotómetro o foto colorímetro de filtros capaz de medir
absorbancia a 546 nm y 578nm.
• Pipetas automáticas.
• Cronometro y/o timer.
MUESTRAS
Suero o Plasma con heparina o EDTA libre de hemolisis. La
muestra debe ser preferiblemente fresca. En caso de no efectuarse
el ensayo en el momento, el suero debe conservarse hasta 12
horas en el refrigerador (2-10oC) y protegido de la luz.
La bilirrubina en suero es estable hasta tres meses conservado a
-20°C y protegido de la luz.
La acción de la luz es capaz de destruir en una hora hasta un 50%
de la bilirrubina presente en la muestra. Por tal motivo debe
protegerse cuidadosamente.
PROCEDIMIENTO
Long de onda para bilirrubina total:
Long de onda para bilirrubina directa:
Medición:
Temperatura:
578 nm (560-600 nm)
546 nm (530-555 nm)
1 cm de paso de luz
Ambiente
Pipetear en tubos de ensayo:
BLANCO
PRUEBA
PRUEBA
Solución 1
200µl
200µl
Solución 2
-
1 gota (50µl)
Cloruro de sodio 0,9%
2 ml
2 ml
Prueba
200µl
200µl
Mezclar, dejar estar exactamente 5 min.(cronómetro) a
temperatura ambiente. Medir la extinción de la prueba frente al
blanco de prueba (EBD).
CÁLCULOS
La concentración ( C ) de bilirrubina en la prueba se calcula según:
Longitud de onda
Bilirrubina
Total
578 nm
Bilirrubina
Directa
546 nm
C (mg/dl)
10,8 x EBT
14,4 x EBD
C (µmol/l)
185 x EBT
246 x EBD
VALORES DE REFERENCIA
Bilirrubina total:
Bilirrubina directa:
hasta 1 mg/dll ó 17 µmol/l
hasta 0,25 mg/dl ó 4,3 µmol/l
EDAD
PREMATUROS
A TÉRMINO
Medida frente a un blanco prueba.
Hasta 24 h
1,0 – 6,0 mg/dl
2,0 – 6,0 mg/dl
Bilirrubina Total (BT)
Hasta 48 h
6,0 – 8,0 mg/dl
6,0 – 7,0 mg/dl
3 – 5 días
10,0 – 15,0 mg/dl
4,0 – 12,0 mg/dl
Pipetear en tubos de ensayo:
BLANCO
PRUEBA
PRUEBA
NITRITO DE SODIO
Sodio Nitrito, Glicocola (glicina), Sodio Cloruro, Sodio Hidróxido
0.1 N, Sodio Hidróxido 1.0 N, Sodio Azida, Agua
Desmineralizada.
Solución 1
200µl
200µl
Solución 2
-
1 gota (50µl)
SOLUCIÓN DE CAFEÍNA
Solución 3
1 ml
1 ml
Cafeína, Sodio Benzoato, EDTA Di sódico, Sodio Acetato
Anhidro, Agua Desmineralizada.
Prueba
200µl
200µl
TARTRATO
Sodio Tartrato, Sodio Hidróxido, Agua Desmineralizada.
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
Todos los reactivos están listos para su uso.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
• Conservado entre 15°C y 30°C y protegido de la luz, estable
hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
Mezclar, dejar estar 10 a 60 min a temperatura ambiente
Solución 4
1 ml
1 ml
Mezclar, dejar estar 5 - 30 min. a temperatura ambiente. Medir
la extinción de la prueba frente al blanco de prueba (EBT).
Nota: Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios
intervalos de referencia.
CONTROL DE CALIDAD
Pueden ser empleados todos los sueros con valores de Bilirrubina
Total y Directa determinados por este método.
Nosotros
recomendamos el uso de nuestro suero de origen humano IHR
Diagnóstica para verificar la funcionalidad del procedimiento de
medida. Cada laboratorio debe establecer su propio programa de
control de calidad interno, así como procedimientos de corrección
en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias
aceptables.
2015-11v3
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CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO
LINEALIDAD
La reacción es lineal hasta 25 mg/dl. Para valores superiores, diluir la
muestra con suero fisiológico y el resultado obtenido se multiplica por el
factor de dilución
REPETITIVIDAD
Concentración media
0.98 mg/dl B.Directa
0.9 mg/dl B.Total
S.D.
0.025
0.05
C.V.%
2.6
5.6
REPRODUCIBILIDAD
Concentración media
0.96 mg/dl B.Directa
0.9 mg/d B.Total
S.D.
0.028
0.05
C.V.%
2.9
5.6
CORRELACIÓN
Una comparación entre este procedimiento y un reactivo similar usando 30
muestras entre 0.5 y 5.5 mg/dl produjo las siguientes ecuaciones:
Bilirrubina Total y= 0.98x+0.02 con un coeficiente de correlación (r) igual a 0.987.
Bilirrubina Directa y= 1.04x+0.07.con un coeficiente de correlación (r) igual a 0.998.
INTERFERENCIAS
La presencia de hemólisis disminuye el valor de bilirrubina.
Algunos medicamentos y sustancias pueden interferir, para mayor
información consulte Yooung, D.S. et al, Clin. Chem. 21:1D (1975)5 .
BIBLIOGRAFIA
1. Ehrlich, P., Zeitschr, Sur Anal. Chemie 23:275 (1884).
2. Michaelsson, M., Scand. J. Clin. Lab. Invest. (Suppl. 49) 13:1 (1961).
3. Martinek, R.G., Clin. Chim. Acta 13:161 (1966).
4. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, Philadelphia, W.B. Saunders, p.1028
(1976).
5. Young, D.S., et al, Clin. Chem. 21:1D (1975).
6. Gambino, S.R., et al, Bilirubin Asay (Revised), Commission on Continuing Education,
Am. Soc. of Clin. Path., Chicago, (1968).
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