Inmovilizacion 2

2011 Volumen 3, No. 6
Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila
INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS Y ENZIMAS
1
1
2
Raúl Fajardo-Ochoa , Juan Alberto Osuna-Castro , Carlos VillaVelázquez-Mendoza , Pilar
Escalante-Minakata2 y Vrani Ibarra-Junquera3*
1
Universidad de Colima, Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, km 40 autopista ColimaManzanillo, Tecomán, Colima, MEXICO.
2
Universidad de Colima Facultad de Ingeniería Civil, km 9 carretera Colima-Coquimatlán, Coquimatlán,
Colima, MEXICO, CP 28400.
3
Universidad de Colima, Facultad de Ciencias Químicas, km 9 carretera Colima-Coquimatlán,
Coquimatlán, Colima, MEXICO, CP 28400.
*Correo electrónico: [email protected], [email protected]
INTRODUCCIÓN
El término inmovilización de células y enzimas se refiere a células y enzimas físicamente confinadas o localizadas
en una cierta región definida en el espacio reteniendo sus propiedades y actividades catalíticas. Asimismo,
dependiendo del tipo de inmovilización tanto las células como las enzimas pueden ser inmovilizadas de forma
permanente o temporal para ser utilizadas repetida y continuamente en diversos proceso químicos.
Por razones técnicas y económicas la mayoría de los procesos químicos catalizados por enzimas o llevados a cabo
por células requieren su reutilización o el continuo uso de biocatalizadores durante largos periodos de tiempo. Bajo
esta perspectiva, la inmovilización debería ser definida como una técnica capaz de reutilizar o dar uso continuo de
biocatalizadores y células. Por lo tanto, la sencillez y el bajo costo de los métodos de inmovilización juegan un papel
fundamental en la selección de protocolos de inmovilización. Es por ello que por medio de la inmovilización es
posible no solo controlar la ubicación de las células o las enzimas sino también modificar sus propiedades
selectivamente.
En este artículo se presenta una breve revisión del estado del arte de la inmovilización de células y enzimas,
haciendo énfasis en los distintos métodos de inmovilización y cómo inciden en las propiedades de las enzimas y
células inmovilizadas. De igual forma, se discuten aspectos relacionados con la selección de soportes o matrices
durante el proceso de inmovilización.
1.
INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS
La investigación sobre inmovilización de organismos unicelulares ha generado gran interés en la comunidad
científica, debido a sus grandes ventajas técnicas y económicas respecto a la fermentación tradicional. Entre las
principales ventajas que presentan los sistemas biotecnológicos que utilizan células inmovilizadas se encuentra su
facilidad para el manejo de una mayor densidad celular comparado con los procesos tradicionales, un mejor control
en sistemas continuos y la posible recuperación de la biomasa para su posterior reutilización. En general, los
materiales para inmovilizar células deben cumplir importantes requisitos como: ser grado alimenticio (según sea el
caso), bajo costo, disponibilidad, no degradables y aptos para condiciones de pH y temperatura bajas (Bakoyianis et
al., 1992 y 1996; Bardi y Koutinas, 1994; Fumi et al., 1987; Shimobayashi y Tominaga, 1986). Los métodos de
inmovilización de células más usados son la autofloculación (Verstrepen y Klis, 2006; Stewart y Russel, 1986), la
adsorción sobre soportes (Bardi et al., 1996) y la incorporación de levaduras en matrices sólidas.
La floculación es un proceso que muchas cepas sufren de manera natural (Stewart y Russel, 1986). La adsorción
consiste en la adhesión de las levaduras a la superficie externa de un soporte como es el caso del gluten (Stewart y
Russel, 1986) o de la DEAE-Celulosa (Lommi y Ahvenaimen, 1990). La incorporación de células a matrices sólidas
se realiza por el atrapamiento de las mismas en el seno de un material polimérico. Las matrices más adecuadas son
polímeros naturales como el alginato, el carragenato y el agar ya que polimerizan en condiciones muy suaves
aunque también se pueden usar matrices sintéticas como poliacrilamida y poliuretano (Groboillot et al., 1994).
El “atrapamiento” de levaduras en matrices sólidas puede realizarse por difusión de las células en matrices sólidas
sintetizadas previamente (Baron y Willaert, 2004) o por formación de las matrices alrededor de las células
(Ramakrishna y Pakasham, 1999). Este método de inmovilización permite conseguir grandes concentraciones de
biomasa (Stewart y Russel, 1986) con el uso de reactores fluidizados (Verbelen et al., 2006). Además se pueden
inmovilizar en matrices independientes células que no podrían coexistir en contacto directo debido al efecto “killer”
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(Pérez e et al., 2001). No obstante, al igual que los otros métodos de inmovilización presenta desventajas. Las más
importantes son los posibles problemas de difusión de nutrientes y productos a través de la matriz porosa y la pobre
resistencia mecánica de los soportes sólidos (Verbelen et al., 2006).
La inmovilización de levaduras en perlas de alginato y poliacrilamida se ha utilizado con éxito en la fermentación de
vino blanco y en la producción de etanol (Cachon y Divies, 2001). Debido a cambios en la composición de las
células por interacción con el soporte de alginato, estos catalizadores se vuelven más activos y se observa que la
fermentación ocurre a mayor velocidad respecto a los casos en los que se emplean levaduras libres (Galazzo y
Bailey, 1990). Otra ventaja importante de estos sistemas inmovilizados es que el soporte protege la levadura de la
acción de inhibidores, metales pesados, fenoles y temperaturas extremas. Además, a diferencia de los flóculos de
biomasa, estos sólidos al ser más sencillos de manejar, permiten un mejor control de la actividad catalítica en
reactores de tipo lote y continuos.
La implementación de sistemas con levaduras inmovilizadas ha sido de especial interés para el área de los vinos
espumosos. La forma tradicional de preparación de estos vinos implica el uso de levaduras libres y la posterior
eliminación de éstas por medio del “dégorgement”, esto es mediante congelación (-25°C) del cuello de la botella
donde las levaduras se acumulan por sedimentación durante el “remuage”. Este proceso lento y costoso puede ser
sustituido mediante el uso de levaduras inmovilizadas en perlas de alginato sin que la cinética del proceso se vea
afectada consiguiéndose las mismas propiedades organolépticas que los vinos producidos de manera tradicional
(Yokotsuka et al., 1997). En el año 2001 el “Institute Oenologique des Vins de Champange (IOC)” reportó la
fabricación de tres millones de botellas mediante el uso de este tipo de tecnología (Divies y Chacon, 2005). También
se han reportado estudios en los que se usan estos dispositivos para la producción de sidra espumosa y vinos de
piña (Divies y Deschamps, 1986).
Cabe destacar que combinando esta tecnología con el uso de reactores de alta presión y reactores de flujo continuo
ha sido posible la producción a gran escala de vinos espumosos con composiciones y propiedades sensoriales
similares a los fabricados tradicionalmente en botellas con levaduras libres (Iconomopoulou et al., 2002)
En el campo de los vinos espumosos también se ha implementado el uso de membranas acopladas al tapón de la
botella que permiten el contacto entre el vino y las levaduras durante la fermentación final (Lemonnier, 1992). Esta
técnica alarga los tiempos de fermentación, pero ofrece la posibilidad de realizar el “dégorgement” de manera más
sencilla sin necesidad de enfriar la botella.
Otro proceso de interés en el que la inmovilización de células exhibe gran potencial es en la fermentación
maloláctica. Este proceso es esencial en la preparación de muchos vinos, ya que la transformación de ácido
maloláctico en ácido láctico y anhídrido carbónico reduce la acidez y mejora la calidad de los mostos. Esta
fermentación es difícil de controlar mediante las técnicas de fabricación tradicionales, ya que las bacterias que
catalizan dicha fermentación, principalmente Oenococcus oeni, son especialmente sensibles a la temperatura, pH y
concentración de SO2. En 1991, se reportó que el O. oeni inmovilizado en perlas de alginato se puede adaptar
fácilmente a procesos en continuo sin que se observe pérdida de actividad en procesos de fermentación maloláctica
(Fleet et al., 1991). Sin embargo, también se han reportado resultados en los que sí se observa una pérdida
importante de actividad en sistemas parecidos (Naouri et al., 1991).
Con base en lo presentado anteriormente es posible afirmar que la producción de vinos espumosos se ha
beneficiado con el uso de tecnologías que involucran la inmovilización de células. No obstante, es de esperar que
con un mejor entendimiento de los procesos de fermentación y la fisiología de los microorganismos inmovilizados,
sea posible implementar esta tecnología a otros procesos de producción.
1.1 Problemas con la inmovilización de células
Si bien, el uso de células inmovilizadas en matrices sólidas ha permitido la implementación de procesos de
fermentación en sistemas de flujo continuo. Existen numerosos problemas que se presentan a nivel industrial, los
cuales se describen a continuación.
Los sistemas floculados presentan un difícil manejo debido a que la floculación depende de factores como el pH, la
concentración de Ca2+, temperatura y la agitación (Verstrepen et al., 2003; Sampermans et al., 2005). Además, cada
cepa de levadura presenta un comportamiento diferente (Jin y Speers, 1999).
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Otro caso, es el uso de membranas microporosas como filtros para retener las levaduras en el reactor, lo cual
resulta muy costoso cuando se emplean reactores continuos. El mayor problema que presenta esta técnica es el
bloqueo que eventualmente sufren los poros de la membrana debido a partículas o a las mismas levaduras (Lebeau
et al., 1998). Por otro lado, la inmovilización de células por adsorción sobre la superficie de materiales es fácil de
conseguir, pero al ser la adsorción un fenómeno fundamentalmente electrostático, durante los procesos en continuo,
especialmente por efecto de la agitación, las células se liberan del soporte. Además, por este método es difícil
inmovilizar grandes cantidades de biomasa (Verbelen et al., 2006).
1.2 Otros métodos de inmovilización de células para procesos de fermentación
Si bien, existe una problemática alrededor del uso de células inmovilizadas, hoy en día se han enfocado esfuerzos
en el desarrollo de rutas novedosas que permitan el desarrollo de sistemas inmovilizados mediante el uso de
materiales porosos diferentes a los polímeros de origen natural que se han usado hasta ahora. Muchos de estos
sólidos porosos podrían encontrar un lugar importante en los procesos de producción de vinos y fermentaciones
alcohólicas en general.
Las zeolitas y los diferentes zeotipos son materiales microporosos muy usados en diversos procesos catalíticos,
prueba de ello es su extensa aplicación (Corma, 1995). Debido a su tamaño de poro pequeño, no sería posible
inmovilizar levaduras dentro de sus cavidades. Sin embargo, el uso de membranas zeolíticas sí podría ser de gran
utilidad en procesos de fermentación en los que se requiere eliminar el etanol del reactor de forma selectiva (Bowen
et al., 2003). Para tal aplicación se podrían emplear materiales zeolíticos hidrofóbicos convencionales como la
zeolita beta (Camblor et al., 1996) o materiales híbridos orgánicos-inorgánicos como los metilaluminofosfatos-alfa y
metilaluminofosfatos–beta (Maeda et al., 1997). Cabe mencionar que la producción de membranas zeolíticas
compactas y con propiedades mecánicas adecuadas no es sencilla y hoy en día sigue siendo un reto para muchos
grupos de investigación.
Los materiales mesoporosos templados mediante aglomeraciones micelares (Taguchi y Schuth, 2005), aunque
siguen sin presentar el tamaño de poro adecuado para la inmovilización de levaduras, sí permiten la inmovilización
de enzimas (Yiu y Wright, 2005). Esto hace que estos sólidos tengan un interés especial en la industria vinícola ya
que mediante el uso de enzimas podrían modificarse la naturaleza de algunas sustancias responsables de aromas y
sabores característicos del vino consiguiéndose productos con propiedades organolépticas diferentes. Los
materiales mesoporosos más adecuados para la inmovilización de enzimas serían los sólidos del tipo SBA-15
debido a su gran tamaño de poro (Zhao et al., 1998). La inmovilización de las enzimas se conseguiría por difusión
de las mismas en los poros del sólido previamente funcionalizado con moléculas que “anclarían” la enzima a la
pared del material (Hartmann, 2005). Sólidos como los que se proponen aquí podrían usarse en procesos en
continuo o en sistemas fluidizados.
La inmovilización de levaduras requiere de materiales macroporosos con radios del orden de algunas micras. Estos
materiales pueden sintetizarse mediante dos técnicas:
La primera hace uso de esferas sintetizadas por polimerización en microemulsión, que posteriormente son usadas
como moldes que se recubren con precursores de óxidos, metales u otros materiales (Grochowicz et al., 2008;
Marrero-López et al., 2008). Por medio del proceso de calcinación de las esferas es posible sintetizar materiales
macroporosos de cavidades esféricas regulares conectados por ventanas de menor tamaño. Mediante esta técnica
sería posible sintetizar biosólidos de gran resistencia mecánica en los que no habría grandes problemas de difusión
de reactivos o productos. El paso más complejo de síntesis sería la inoculación de las células en el interior del
sólido, ya que aunque los poros pueden ser muy grandes, las levaduras deben difundir por las ventanas que
comunican los poros. La estructura 3D de canales que estos materiales exhiben podría resultar de interés para la
fabricación de membranas para la retención de levaduras en reactores en continuo.
El segundo método que posee gran potencial es el uso de materiales porosos sintetizados por congelación
unidireccional y posterior liofilización (Choi et al., 2009). Esta técnica de preparación de sólidos macroporosos, al ser
reciente, es la menos explorada en el campo de la catálisis. Este método implica la congelación de una solución de
partículas que pueden ser poliméricas, silíceas, metálicas etc. a temperatura de nitrógeno líquido de manera
unidireccional y a velocidad controlada. El proceso que parece complejo, es en realidad un método sencillo de
fabricación de materiales macroporosos que, además, permite la incorporación de especies biológicas in-situ en la
matriz durante la síntesis del material debido a que no se requiere calcinación de ningún molde orgánico. Para
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inmovilizar bacterias dentro de una matriz polimérica Gutiérrez et al. (2007), partieron de una suspensión acuosa
concentrada de bacterias E. coli protegidas con alginato de calcio y glucosa. Las cuales incorporaron a la
suspensión alcohol polivinílico y la mezcla se transfirió a una jeringa de insulina. Esta se introdujo en un baño con
nitrógeno líquido a velocidad controlada (5.9 mm/min) y posteriormente se liofilizó. Durante el proceso de
congelación unidireccional se producen frentes de congelación perpendiculares a la dirección de inmersión en los
que los cristales de hielo apartan las “impurezas”, que en este caso serían las bacterias y el alcohol polivinílico. Una
vez eliminado el hielo por liofilización se obtiene una matriz porosa de alcohol polivinílico en la que quedan retenidas
las bacterias. En este caso las bacterias se recubrieron con alginato-glucosa para protegerlas durante el proceso de
congelación criogénica. Métodos similares de protección deben usarse si se pretende inmovilizar sistemas
biológicos sensibles al proceso de congelación. Otra ventaja de este método es que se obtienen monolitos con la
forma y geometría del recipiente que contiene la suspensión que se congela, en lugar de los clásicos polvos que dan
como resultado los otros métodos de inmovilización. También es posible modular el tamaño de poro al jugar con la
relación masa suspendida/agua de la suspensión a congelar y con la velocidad de inmersión. De ahí que estos
métodos novedosos de inmovilización de células abran un abanico de posibilidades empleando matrices sólidas de
diversa naturaleza, y así de esta forma lograr diseñar sistemas de fermentación que trabajen en reactores continuos.
Asimismo, existen otros métodos modernos que no requieren del uso de dispositivos inmovilizadores complejos.
Uno de estos métodos es el uso de catalizadores artificiales inertes, como los nanotubos de carbono, que inducen la
floculación de los micro-organismos. Utilizando nanotubos de carbono, células de Saccharomyces cerevisiae han
sido inmovilizadas exitosamente por el método de floculación (T.A. Mamvura, 2010). Aunque esta técnica aporta
buenos resultados con respecto a la inmovilización, la síntesis selectiva de nanotubos de carbono sigue siendo
costosa.
Es común que la inmovilización de levaduras y enzimas con los métodos mencionados anteriormente enfrenten
problemas técnicos y científicos. No obstante, es importante plasmar una visión sobre las expectativas y
potencialidades que tienen estos materiales en el proceso de fermentación alcohólica. Por lo tanto, surge la
motivación para realizar investigación profunda y novedosa fundamentada en el hecho de que los recientes avances
en la síntesis de micro y nano materiales porosos aún no se han permeado al campo de la catálisis con levaduras.
Por lo cual, se abren nuevos horizontes en el área de investigación y aplicación de estos métodos de inmovilización
de células.
2.
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS
En la actualidad, la industria requiere gran cantidad de enzimas con el fin de obtener productos con mejores
características y menor costo. Por ello, la implementación de procedimientos que aumenten la estabilidad de las
enzimas y permitan su reutilización ha sido por muchos años el objetivo de diversos laboratorios alrededor del
mundo. La preparación y estabilización de enzimas ha sido un tema de estudio desde hace casi 50 años (PiugMuset, 1964) y es de interés tanto científico como económico.
La inmovilización combina la actividad elevada y específica de las biomoléculas activas, como las enzimas o
anticuerpos, con la estabilidad química y mecánica del soporte. Consiste en mantener la biomolécula unida o
atrapada en un soporte físico, conservando su actividad catalítica y permitiendo el flujo de sustratos y productos. Las
enzimas pueden ser inmovilizadas en sustratos naturales y/o sintéticos por medios químicos (uniéndolas al sustrato
mediante enlaces covalentes) o físicos (fuerzas electrostáticas o membranas), y pueden además ser encapsuladas
mecánicamente la adición de agentes que formen una película protectora alrededor de la enzima inmovilizada,
permitiendo el paso de reactivos y productos de pequeño tamaño, pero no de proteínas (Heering et al., 2004; Wang
y Caruso, 2005).
Las enzimas inmovilizadas presentan varias ventajas sobre su contraparte en solución. Permiten un uso continuo,
reutilización y control de las concentraciones de proteína empleada. Asimismo, es viable mejorar la estabilidad y
actividad de la enzima en función del pH y la temperatura, además, al ser inmovilizadas quedan protegidas ante
enzimas proteolíticas, aumentando así la eficiencia del sistema. Sin embargo, la inmovilización también puede
presentar ciertas desventajas, por ejemplo, la actividad de la enzima puede verse afectada por el proceso de
inmovilización, además, la velocidad de reacción puede estar limitada por la velocidad de difusión de sustratos y
productos hacia dentro y fuera del sistema.
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2.1 Clasificación de métodos de inmovilización
Los métodos de inmovilización de enzimas se clasifican en dos rubros: métodos reversibles y métodos irreversibles
(Gupta y Mattiasson, 1992).
2.1.1 Métodos de Inmovilización Irreversibles
El concepto de inmovilización irreversible implica el enlace del biocatalizador a un soporte de manera permanente,
por lo cual el biocatalizador no puede ser liberado sin destruir o modificar su actividad biológica o el soporte. Los
procedimientos más comunes de inmovilización irreversible son el enlace covalente, enlace cruzado, atrapamiento y
micro encapsulado.
a)
Formación de enlaces covalentes
La inmovilización de proteínas por métodos basados en la formación de enlaces covalentes están entre los más
usados. La ventaja de estos métodos estriba en la naturaleza estable de los enlaces formados entre las enzimas y el
soporte. De igual manera, las enzimas en este método no son liberadas en la solución en uso. Sin embargo, para
lograr altos niveles de enlace, los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad catalítica no deben
involucrar un enlace covalente con el soporte aunque esto puede resultar difícil de lograr en algunos casos.
Los métodos covalentes de inmovilización son empleados cuando existe un requerimiento estricto de ausencia de
enzimas en el producto.
Los métodos de acoplamiento en general pueden dividirse en 2 clases: 1) activación de la matriz o soporte por
adición de una función reactiva en un polímero y 2) modificación del polímero para producir un grupo activado. Los
procesos de activación son comúnmente diseñados para generar grupos electrofílicos en el soporte, el cual durante
el acoplamiento reaccionan con los fuertes nucleófilos en las proteínas. Los principios básicos que controlan el
acoplamiento covalente con matrices son análogos con las usadas en la modificación química de proteínas. Las
reacciones más usadas involucran las siguientes cadenas de amino ácidos: lisina (grupo amino), cisteína (grupo
tiol), y ácidos aspártico y glutámico (grupo carboxilo).
En este método se enlaza covalentemente la enzima con un soporte insoluble natural o sintético. El enlace se da
entre algún grupo funcional reactivo de la enzima (amino, Cis-tiol, Tir-hidroxil o His-imidazol) y el soporte
previamente activado, generalmente recubierto con grupos funcionales orgánicos en la superficie (Monocapas tiol
autoensambladas, oro, CNBr-Sepharosa, etc.) (Figura 1). El seguimiento de la inmovilización se realiza
cuantificando la concentración de proteína libre (generalmente por el método de Bradford), y de la proteína unida
covalentemente al soporte (ej. ácido bicinconínico). Las desventajas de este método radican en el sitio del enlace,
ya que puede modificarse el sitio activo o pueden ocurrir impedimentos estéricos que reduzcan la actividad. Sin
embargo, esto es poco probable y puede verse reducido al dirigir el enlace a sitios específicos y/o con una
orientación molecular definida (Wood et al., 1997; Heering et al., 2004). Además, la unión por enlace covalente
confiere a la enzima una inmovilización más estable a cambios de pH y temperatura en el medio (Queiroz-Claret et
al., 1997).
Soporte con grupos
funcionales en la superficie
Enzima inmovilizada y
orientada mediante
enlace covalente
Sitio de enlace
Figura 1. Enzimas inmovilizadas en un soporte físico por enlace covalente, las enzimas se encuentran orientadas
espacialmente en el soporte
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b) Formación de enlaces cruzados
Con esta técnica los soportes no son necesarios, ya que la inmovilización se da por un enlace directo entre enzimas,
que puede ser mediado o no por un agente de unión. Generalmente se añade el agente de bajo peso molecular (ej.
glutaraldehído) a la enzima en solución, uniendo covalentemente los grupos funcionales de las enzimas para formar
agregados (Figura 2). Este método tiene como ventaja su sencillez, sin embargo, es susceptible a cambios
pequeños de pH y temperatura en las condiciones de operación (Gódia-Casablancas, 2005).
Proteína inmovilizada
Agente de unión
Figura 2. Enzimas inmovilizadas por enlaces cruzados (líneas negras).
c)
Atrapamiento
El método de atrapamiento está basado en la oclusión de las enzimas dentro de una red polimérica que permite al
sustrato y a los productos pasar a través de ellos y retener las enzimas (O’Driscoll, 1976). Este método difiere de
los métodos de acoplamiento covalente descritos anteriormente, ya que las enzimas no están enlazadas a la matriz
o soporte. Existen diversos métodos de atrapamiento de enzimas como el de gel (Bernfeld y Wan, 1963) o
atrapamiento por fibras (Dinelli et al, 1976), microencapsulado (Wadiack y Carbonell, 1975) y por inclusión. El uso
práctico de estos métodos es limitado debido a la baja transferencia de masa a través de las membranas o geles.
Atrapamiento por inclusión. Con este método la enzima queda atrapada dentro de una matriz de gel que permite
una fácil difusión de productos. La matriz puede ser de origen natural o sintético y de diversos materiales (Sílica gel,
poliacrilamida, agarosa, carregnatos, entre otros), y pueden clasificarse como geles húmedos, geles secos
(xerogeles) o geles en aerosol (aerogeles) (Figura 3). En este método las enzimas son colocadas en una solución
que posteriormente es gelificada (por temperatura o adición de polimerizantes), quedando atrapadas dentro de la
matriz (Figura 3A). En algunos casos el gel es sometido a un proceso de secado y molido, obteniendo así mayor
área de contacto entre la enzima y la solución que contiene el sustrato (Figura 3B), dando como resultado esferas
de 2 µm con un tamaño de poro de 35 ± 7 Å (Mureseanu et al., 2005). También es posible incrementar la capacidad
de inmovilización de los geles al utilizar agentes estabilizadores (sorbitol, polietilenglicol, diferentes mono- o
disacáridos) y surfactantes (lecitina, lactosa, 3-sn-fosfatidilclorina, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB))
(Mureseanu et al., 2005), o al añadir agentes policatiónicos o polianiónicos con carga contraria a la enzima o a
regiones de la superficie de la misma como el poli(1-vinilimidazol) (PVI) y la poli(etilamina) (PEI) antes de la
polimerización (Chen et al., 1998). La inclusión tiene la ventaja de prevenir el acceso de proteasas y mantener
intacta la estructura de la proteína, por lo que su actividad no se ve afectada. Sin embargo, el tamaño de los poros
no puede ser controlado, es difícil de escalar y reutilizar ya que el gel puede disolverse bajo ciertas condiciones o
tras poco tiempo de uso, y un aumento en la cantidad de enzima cargada más allá de cierto punto no implica
necesariamente un aumento de la actividad, debido a las limitantes de difusión que se podrían presentar.
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A
Matriz de gel
Proteína inmovilizada incluida en la matriz
B
Matriz de gel reducida
a pequeñas esferas
Proteína incluida
en las esferas
Figura 3. Enzimas inmovilizadas por inclusión dentro de una matriz de gel. A) gel húmedo. B) esferas del gel seco y
triturado.
Atrapamiento por micro-encapsulación. El método puede ser de dos tipos: por microencapsulación en soportes
porosos (con un diámetro de 2-50 nm), que posteriormente pueden ser recubiertos con un revestimiento
nanocompuesto, atrapan la enzima en su interior y permiten el paso de sustratos y productos (Figura 4A); por
microemulsión o liposomas, combinando la enzima con agentes emulsificantes y agitando para formar micelas que
la protegen de medios ácidos/alcalinos, proteasas y durante los periodos de almacenamiento (Chen et al., 1999;
Kuiper et al., 2008) (Figura 4B).
En la microencapsulación las partículas porosas (esferas de sílice con nanoporos, micropartículas de CaCO3, etc.)
son puestas en suspensión con la enzima por un tiempo dado (aprox. 40 min), y la cantidad de enzima inmovilizada
es monitoreada por espectroscopía. La desventaja radica en la inclusión de la enzima en el interior de la matriz, ya
que generalmente queda atrapada en la superficie exterior y puede desprenderse paulatinamente debido al tipo de
interacciones presentes o tras varios ciclos de uso (Volodkin et al., 2004). Sin embargo, esto se ve solucionado al
controlar el tamaño de poros de las esferas y al dar un tratamiento con un agente que encapsule la proteína (ej.
policloruro de dialilamonio, nanopartículas de sílice, polihidrocloruro de alilamina o poliestirensulfonato) evitando su
fuga y protegiéndola de proteasas, además, este método por su naturaleza de interacción suave, permite una alta
actividad y resistencia a cambios de pH y temperatura (Wang y Caruso, 2004; 2005).
La microemulsión tiene la ventaja de ser muy sencilla, suficientemente porosa para permitir que la enzima funcione
en un sistema en solución, pero al mismo tiempo protegida del ambiente degradante. También puede llevarse a
cabo repetidas veces (emulsión múltiple), agregando agentes emulsificantes secundarios y espesantes (ej. goma
arábiga, Tween 80, polestireno40-b-poili(isocianoalanina(2-thiophen-3-il-etil)amida)50, entre otros), para proporcionar
una mayor protección. Además, por la naturaleza de los reactivos utilizados, puede tener uso farmacológico en la
administración oral de inmunoglobulinas. La desventaja de este método radica en la pérdida de actividad ante la
inmovilidad de la proteína al quedar atrapada en la interface agua/aceite, o al ser desnaturalizada por el esfuerzo de
corte generado durante la preparación de las micelas (Chen et al., 1999; Kuiper et al., 2008). El diámetro de las
micelas puede variar de 100 a 250 nm, dependiendo de los emulsificantes utilizados, de la fluidez del copolímero y
de la habilidad de la enzima para ser adsorbida en la membrana.
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Proteína inmovilizada
dentro de los poros
A
Soporte esférico poroso
Proteína inmovilizada
dentro de la micela
B
Figura 4. Enzimas inmovilizadas por encapsulación.
A) microencapsulación dentro de esferas porosas. B) Microemulsión en micelas.
2.1.2 Métodos de Inmovilización Reversible
En el método de inmovilización reversible, las enzimas inmovilizadas pueden ser desprendidas del soporte bajo
condiciones no extremas. El uso de métodos reversibles para la inmovilización de enzimas es altamente atractivo,
principalmente por razones económicas debido a que el soporte puede regenerarse y recargarse con enzimas
nuevas cuando la actividad enzimática decae. Existen distintos método de inmovilización reversible, que a
continuación se describen:
Por adsorción
El método de adsorción emplea soportes orgánicos o inorgánicos que presentan un adsorbente activo (monocapastiol auto ensambladas, oro, entre otros) en los cuales, las enzimas son atraídas y retenidas por medio de
interacciones iónicas o fuerzas débiles (puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones
hidrofóbicas) (Figura 5) (Wood et al., 1997). Este método consiste en poner en contacto la enzima en solución
acuosa con un soporte adsorbente por un lapso de tiempo dado (2-48 h), para después lavar el soporte y eliminar la
enzima que no fue inmovilizada. Presenta la ventaja de mantener intacta la actividad de la enzima, ya que la unión
es débil y no afecta su conformación, sin embargo, esta característica hace que al mismo tiempo la unión sea
reversible y sensible a cambios de pH y temperatura.
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Soporte con adsorbente activo
cargado negativamente
Proteína inmovilizada con
una región cargada
positivamente
Figura 5. Enzimas inmovilizadas en un soporte físico. A) Por adsorción, la región positiva de la proteína interactúa
con el soporte negativo.
Adsorción no específica. El método de inmovilización reversible más simple es la adsorción no específica, el cual
se basa en la adsorción física o enlace iónico (Messing, 1976; Woodward, 1985). En la adsorción física las enzimas
son unidas a la matriz a través de puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, o interacciones hidrofóbicas;
mientras que enlaces iónicos de enzimas son producidos a través de uniones con sales. La naturaleza de las
fuerzas involucradas en la inmovilización no covalente resulta en un proceso que puede ser reversible cambiando
las condiciones que influyen en la resistencia de la interacción (ej. pH, resistencia iónica, temperatura y polaridad del
solvente). La inmovilización por adsorción es fácil de realizar y usualmente preserva la actividad catalítica de la
enzima. Dichos métodos son, por lo tanto, atractivamente económicos, pero pueden presentar problemas como la
liberación de enzimas cuando las interacciones son relativamente débiles. De igual forma es difícil encontrar
condiciones bajo la cuales las enzimas permanecen enlazadas fuertemente y activas.
Adsorción hidrofóbica. Otro método es el uso de interacciones hidrofóbicas, donde la adsorción hidrofóbica ha
sido utilizada como un principio cromatográfico por más de 3 décadas. Consiste en variables experimentales
conocidas como el pH, concentración de sales, y la temperatura (Porath, 1987). La resistencia de las interacciones
radica en la hidrofobicidad del adsorbedor y de la proteína. La hidrofobicidad del adsorbedor puede ser regulada por
el grado de sustitución del soporte y por el tamaño de la molécula ligante hidrofóbica. El éxito de la inmovilización
reversible de la β-amilasa y amiloglucosidasa en soportes de hexilagarosa ha sido reportada (Caldwell et al 1976;
Caldwell et al, 1982). Muchos otros ejemplos de enlace reversible con adsorbedores hidrofóbicos ha sido también
mostrado en la literatura. (Cashion, 1982; Yon, 1974; Dixon, 1979)
Quelación o enlace metálico. Sales de metales de transición o hidróxidos depositados en la superficie de soportes
orgánicos han podido ser enlazados gracias a la coordinación de los grupos nucleofílicos en la matriz. Se utilizan
principalmente sales de titanio y circonio, siendo este método conocido como inmovilización por enlace metálico
(Cabral, 1991; Cabral, 1986; Kennedy, 1985). La sal metálica o el hidróxido es precipitado en el soporte (ej.
celulosa, quitina, acido algínico y bases de sílice) por calentamiento o neutralización. Debido a los factores
estéricos es posible para la matriz ocupar todas las posiciones de coordinación del metal, por lo tanto algunas de las
posiciones permanecen libres para coordinarse con grupos de enzimas.
La elusión de proteínas enlazadas puede ser fácilmente lograda por competencia con ligantes solubles o
disminuyendo el pH. El soporte es subsecuentemente regenerado lavándolo con un fuerte quelante como el ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA). Estos soportes metálicos han sido utilizados ampliamente en cromatografía de
proteínas (Porath, 1992; Kagedal, 1998).
Formación de enlaces disulfuro. Estos métodos son únicos, porque aunque se forma un enlace covalente estable
entre la matriz y la enzima, es posible que se rompan los enlaces por medio de una reacción utilizando agentes
apropiados como el dithiotreitol (DTT) bajo suaves condiciones. Además, debido a que la reactividad de los grupos
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tiol pueden ser modulados mediante la alteración del pH, la actividad es alta para métodos que usan enlaces
disulfuro, con la condición de que el apropiado tiol adsorbente con alta especificad sea utilizado (Carlsson, 1998).
Puntos críticos. Cabe mencionar que aunque la inmovilización sea dirigida a un sitio y/o por un método específico,
los enlaces químicos y las interacciones entre la enzima y el soporte son complejos, y un método de estabilización
único no asegura que las interacciones sean 100% propias del método (Wood et al., 1997). La estabilidad de
proteínas globulares en una matriz generalmente depende de las interacciones electrostáticas, interacciones
estéricas, cambios en el estado de hidratación y reacomodos en la estructura de la proteína (Volodkin et al., 2004),
además, dicha estabilidad es determinada por la combinación de fuerzas electrostáticas globales e interacciones
locales específicas (Chen et al., 1998). Las fuerzas electrostáticas globales tienen efecto directo en la adsorción de
la enzima, y el pH del medio altera el grado de influencia de estas fuerzas electrostáticas, en especial la interacción
proteína-sustrato (Volodkin et al., 2004).
En lo que concierne a la mejora de la estabilidad de enzimas han surgido dos conceptos fundamentales, el primero
indica que al restringir el movimiento de los segmentos en las cadenas de la proteína se reduce la probabilidad de
un cambio estructural irreversible; el segundo, un cambio similar irreversible en la estructura de la proteína ocurre
por el choque de los segmentos con la superficie en la que la enzima es inmovilizada o adsorbida (Chen et al.,
1998).
En algunos casos cuando se estabiliza una enzima por inmovilización, un cambio estructural irreversible puede ser
prevenido restringiendo el movimiento de los segmentos al encerrar la enzima en cavidades estrechas (Chen et al.,
1998). Un tamaño de poro similar al tamaño de la enzima es más apropiado para obtener una buena actividad
(Mureseanu et al., 2005). Un alto rendimiento en la estabilización puede ser logrado al añadir azúcares a la enzima
en solución, ya que estos pueden contribuir a mantener la estructura tridimensional de la proteína, lo que es crucial
para su actividad, además, el tipo y la cantidad de azúcar utilizado en la estabilización es determinante para generar
una alta actividad catalítica (Mureseanu et al., 2005). A continuación se indican algunas enzimas que han sido
inmovilizadas por distintos métodos (Tabla 1).
Tabla 1. Comparación entre los distintos métodos de inmovilización de enzimas
Enzima
Cit C
Lisozima
Proteasa
Método de inmovilización
Microencapsulación
Catalasa
HRP
Microencapsulación
Gox An
HRP Ar
Microemulsión
IgG de leche
Gox An
Lox Av
GLyOx So
Lipasa N
Estearasa GB
Lipasa MY
Microemulsión
Inclusión
Característica
BMS
BMS
BMS
BMS
PDDA/SiNP
CaCO3 poroso
Enzima inmovilizada
Cantidad
Porcentaje
231 mg/g
23.10%
397 mg/g
39.70%
203 mg/g
20.30%
75 mg/g
7.50%
75 mg/g
7.50%
1.5 pg/esfera
PS-PIAT
Tween-80
Proteína de soya
Estearato de sacarosa
Sílica-Gel
Sílica-Gel/PVI
Sílica-Gel/PEI
58.70%
50%
56.10%
0.5 mg/g
1 mg/g
1 mg/g
% de actividad tras
Tipo de protección
la inmovilización Proteasas pH
T Tiempo
Referencias
Wang y Caruso, 2005.
35% Tras 25 ciclos
No
Si
Si
70% Tras 25 ciclos
Si
Si
Si
Volodkin et al ., 2004.
37%
Si
Si
Si
Si
Si
SI
-
Si
Si
SI
-
Si
Si
Si
-
Si
Si
-
Kuiper et al ., 2008.
Chen et al ., 1999.
Chen et al ., 1998.
0.05%
20%
Mureseanu et al ., 2005.
Inclusión
MTS
0.10%
46%
0.10%
20%
Covalente
22%
Wood et al ., 1997.
Cit C Sc
Adsorción
SAMS
78%
Queiroz-Claret et al ., 1997.
Fosfatasa 2A
Covalente
CNBr-Sepharosa
70-85%
Casi 100%
Neg
Neg Si
Enzimas: Citocromo C (Cit C), peroxidasa de rabano (HRP), glucosa oxidasa de Aspergillus niger (GOx An), peroxidasa de rábano de Amoracia rusticana (HRP Ar), inmunoglobulina G de leche (IgG),
glucosa oxidasa de Aspergillus niger (GOx An) lactato oxidasa de Aerococcus viridans (LOx Av), glicolato oxidasa de Spinacia oleracea (GLyOx So), lipolasa de Thermomyces lanuginosus
recombinante de Aspergillus oryzae (Lipolasa N), estearasa de Mucor miehei (Estearasa GB), lipasa MY de Candida cylindracea (Lipasa MY), citrocromo C de Saccharomyces cerevisiae (Cit C Sc)
y fosfatasa 2A de Yarrowia lipolytica (Fosfatasa 2A).
Abreviaciones: BMS, Silica con mesoporos bimodales; PDDA/SiNP, poli(dialilmetilamonio)/nanopartículas de sílica; PS-PIAT, polestireno40-b-poili(isocianoalanina(2-thiophen-3-il-etil)amida)50;
PVI, poli(1-vinilimidazol); PEI, poli(etilamina); MTS, micelas de silica templada; SAMS, monocapas tiol autoensambladas. -, no reportado; Neg, efecto negativo.
2.2 Selección de soportes
Las características de las matrices o soportes son de gran importancia en la determinación de la eficiencia del
sistema de inmovilización de enzimas. Las propiedades ideales de un soporte incluyen la resistencia física a la
compresión, hidrofilicidad, inertes entre las enzimas y sus derivados, biocompatibilidad, resistencia al ataque
microbial y bajo costo (Trevan, 1980; Brodelius y Mosbach, 1987; Buchholz y Klein, 1987). Asimismo, los soportes
pueden clasificarse en inorgánicos y orgánicos en función de su composición química. En donde los soportes
orgánicos pueden dividirse en polímeros naturales y sintéticos (Cabral y Kennedy, 1991).
Las características físicas de los soportes (como el tamaño medio de partícula, resistencia mecánica a la
compresión, etc.) son de gran importancia en el comportamiento del sistema inmovilizador y determinará el tipo de
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reactor por usar bajo condiciones técnicas. En particular, el parámetro de poro y el tamaño de partícula establecerán
el total del área superficial, por lo tanto la adecuada selección incidirá en la capacidad de enlace de las enzimas. Los
soportes no porosos muestran pocas limitaciones difusionales, pero presentan baja capacidad de carga. Por lo
tanto, los soportes porosos son generalmente preferidos por su alta área superficial que permite una alta carga de
enzimas, así como porque las enzimas inmovilizadas quedan aisladas del medio ambiente. Se debe controlar la
distribución del tamaño de poro en los soportes porosos para optimizar la capacidad y las propiedades de flujo. A
pesar de las muchas ventajas de los soportes inorgánicos (ej. alta estabilidad ante degradación física, química y
microbial), la mayoría de las aplicaciones industriales se realizan con soportes orgánicos. El carácter hidrofílico es
uno de los factores más importantes que se utilizan para determinar el nivel de actividad de las enzimas
inmovilizadas (Gemeiner, 1992). Una excelente matriz o soporte que ha sido utilizada es la agarosa. Además de su
alta porosidad que influye en su elevada captación de proteínas, también presenta un carácter hidrofílico, fácil
obtención, ausencia de grupos con carga (el cual previene la adsorción no específica del sustrato y los productos) y
es de bajo costo. Sin embargo, como la mayoría de las enzimas son relativamente inestables, el costo del
aislamiento es todavía alto, y es técnicamente difícil recuperar un enzima activa después de una reacción.
CONCLUSIONES
En conclusión, la inmovilización de células y enzimas es un proceso prometedor en la industria, con las ventajas y
desventajas antes mencionadas, y bajo condiciones que pueden ser optimizadas en el laboratorio, pero sobre todo
con un enorme campo de aplicación. Este proceso puede ayudar a mejorar la producción de alimentos, fármacos,
químicos y bioproductos de interés científico y económico.
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