Doble difusión en placa (Ouchterlony)

TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS
Bqca. Esp. Beda Elizabeth Mereles Rodríguez
La medición de las interacciones Ag-Ac con fines diagnósticos se
realizan por 2 vías
Dx directo
Utilización de Acs específicos
para detectar Ags
Dx. indirecto
Utilización de Ags específicos
para detectar Acs
Etapas de la reacción Ag-Ac
Para observarla se aplican técnicas que
utilizan marcadores
Etapas de la reacción Ag-Ac
aglutinación
Las reacciones secundarias valoran los cambios físicos de la
interacción Ag-Ac tras la formación del inmunocomplejo.
Formación del agregado visible
Cuando un Ag en solución es agregado
progresivamente a un antisuero forman pp del
complejo Ag-Ac.
 El entrecruzamiento Ags y Acs da origen a
estructuras enrejadas tridimensionales que
forman grandes agregados que pp.
 A medida que se agregan más Ag se
alcanza un óptimo después del cual, se forma
menos pp. En esta etapa puede demostrarse
que el sobrenadante contiene complejos
solubles de Ag-Ac.
TIPOS DE INMUNOENSAYOS
Inmunoensayo
Marcados,
conjugados a
moléculas que
emiten señales
detectables
RIA (Marcador: isótopo radiactivo)
ELISA (Marcador: enzima)
IF (Marcador: partícula fluorescente)
CLIA (marcador: sust.quimioluminiscente)
Formación de
complejos Ag-Ac
No marcados,
medidos por
visualización
directa
Precipitación
Aglutinación
Método
INMUNOENSAYOS
Comparación de
sensibilidad
Sensibilidad
mg Ab/ml
Técnicas de
interacción 2ª
Técnicas de
interacción 1ª
TECNICAS DE INTERACCIÓN SECUNDARIA
Antígeno
soluble
Anticuerpo
PRECIPITACIÓN
AGLUTINACIÓN
Antígeno
particulado
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS
DE INTERACCIÓN SECUNDARIA
Técnicas inmunológicas de
precipitación
Técnicas inmunológicas de precipitación
Antígeno
soluble
Se basan en la aparición de un precipitado visible cuando se
enfrentan antígenos solubles con sus anticuerpos específicos
Técnicas inmunológicas de precipitación
Precipitación en medio líquido
De uso infrecuente en la actualidad,
detecta la presencia de Ags ó Acs,
cuando se mezclan en fase líquida.
Precipitación en medio sólido
Utiliza un soporte sólido gelificado en el
que difunden el Ags y Acs. Se distinguen
2 dos categorías: inmunodifusión y
técnicas inmunoelectroforéticas.
Técnicas de precipitación en medio sólido
Se basan en el hecho de las proteínas pueden difundir libremente
a través de los poros del gel.
Hay ausencia de reacción fca y qca entre los inmunoreactantes y
el gel.
Al contactarse Ag y Ac específicos, forman banda de pp en la
zona de equivalencia.
Los soportes más utilizados
son los geles de agarosa
Estructura macroreticular con una
malla muy abierta
Ausencia de grupos iónicos , es
una estructura neutra e inerte
No hay interacción de las moléculas
a difundir con la estructura del gel.
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS DE PRECIPITACIÓN
VENTAJAS
Existen varias pruebas
Se observan fácilmente
No requieren equipos costosos
Pueden ser cuali o cuantitativas
DESVENTAJAS
Poseen baja sensibilidad
Técnicas de pp en medios gelosados
Varias técnicas
Técnica de difusión doble de Ouchterlony
Técnica de difusión radial
Técnica de inmunoelectroforesis
Técnica de contrainmunoelectroforesis
Inmunoprecipitación
Métodos de inmunodifusión doble
Usos
P/ determinar la concentración de Ags o Acs
(cuantitativos)
P/ comparar Ags y evaluar su pureza
(cualitativos)
Doble difusión en placa (Ouchterlony)-IDD
Base del método: Difusión de
macromoléculas en gel de agar
Difusión depende de:
concentración del gel
concentración de reactantes
tamaño de las moléculas Ag y Ac
Técnica de ID bidimensional (IDD)
Ambos inmunoreactantes difunden radialmente uno hacia el otro
 Cuando están en la zona de equivalencia se observa la banda de pp
Distancia de difusión de los reactantes
Relación directa
r/ concentración
Relación inversa
r/ PM
Se formarán tantas bandas de pp como sistemas Ag-Ac
se tengan en la muestra
IDD. Patrones de precipitación
Ag y Ac sembrados en pocillos
Difusión de los mismos
Formación de banda de pp
Antígenos
ayb
Antisuero
anti a + anti b
(I) Antígenos idénticos: las líneas no se cruzan (Identidad total)
(II) Antígenos diferentes: las líneas se cruzan (No identidad)
(III) Antígenos relacionados: las líneas se unen parcialmente (Id. parcial)
Ag a
Ag a
PATRONES DE PRECIPITACIÓN
Anti a+ anti b
Ag ab
1
Antígenos: a y b
Antisuero: anti a + anti b
Ag b
1 Identidad total
2 Identidad parcial
3 No identidad
Anti a+ anti b
Ag a
Anti a+ anti b
2
Ag b
3
Inmunodifusión Radial (IDR)
Método de cuantificación de antígenos
Útil en inmunología clínica para cuantificar
diversas proteínas plasmáticas:
 Inmunoglobulinas Igs G, A, M
 Fracciones del complemento C3 y C4
 Factores de coagulación
 Otras
Técnica de inmunodifusión radial
Ig G en MP
Ag en pocillo
MP
Gel agarosa
Halo de difusión
Pocillo cavado en el gel
16 – 20 horas
24 hs
D2
inmunoprecipitación
Anti – Anticuerpo Ig G incorporado en
capa de agarosa
Ac incorporado al gel
C mg/dL
El diámetro del
círculo del pp
guarda relación
con la cantidad
de Ag.
Bandas de pp
circulares
Bandas de pp circulares
Se establece una curva de referencia con
cantidades conocidas del Ag y se interpola
los valores de las muestras desconocidas.
Se puede utilizar tabla diámetro vs concentración
provisto con la placa. Verificar si el control da
resultado esperado
INMUNOELECTROFORESIS
Método combinado
 Electroforesis de mezcla de Ags de acuerdo a su
carga
 Difusión de proteínas separadas, que reaccionan con
Abs específicos y precipitan
•Diferenciar fracciones antigénicas específicas
•Determinar Acs monoclonales clásicos en
mieloma, linfomas
•Otros
INMUNOELECTROFORESIS
Siembra del Ag
Soporte: agarosa+ buffer pH alcalino
Electroforesis del antígeno
Migración de antígenos por carga
ÁNODO
CÁTODO
Formación de un canal
Siembra del Ac
Difusión de Ag y Ac
Formación de banda de pp
Electroforesis del antígeno
Siembra del Ac y difusión de Ag y Ac
Canal
Formación de banda de pp
Tinción y observación de bandas de pp
Las inmunoprecipitaciones se interpretan comparándolas con patrones
Ag patrón
Ag
desconocido
TÉCNICA DE CONTRAINMUNOELECTROFORESIS
Agarosa+buffer pH alcalino
Antigeno
Anticuerpos
Electroendosmosis
Cualitativo
Banda de pp
Antígeno
Antisuero
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS
DE INTERACCIÓN SECUNDARIA
Técnicas inmunológicas de
aglutinación
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS DE AGLUTINACIÓN
Se basan en la aparición de una aglutinación visible a simple vista cuando
se enfrentan antígenos particulados con sus anticuerpos específicos
Anticuerpo
Célula o
partícula
Antígeno
Anticuerpo
Célula o
partícula
Antígeno
Antígeno
particulado
Aglutinación Directa (AD):
Esta técnica inmunológica se puede llevar a cabo si los Ags
son partículas en forma nativa.
Ej: Detección de Ags eritocitarios
Aglutinación Directa (AD)
Ej: Detección de anticuerpos contra Ags microbianos
+
-
Aglutinación Indirecta (Al) o Pasiva (AP)
Esta técnica se basa en que los Ags solubles pueden fijarse sobre
partículas más grandes ej. glóbulos rojos, partículas de látex, gelatina, etc.
HEMAGLUTINACION INDIRECTA
TANIZACION de GR
+ Ac.tánico
Hematies
Hematies tanados
SENSIBILIZACIÓN
Hematies tanados + Antígeno
Hematies sensibilizados
DESARROLLO DE LA PRUEBA
Hematies sensibilizados + Acs
específicos
Hemaglutinación
-
+
Titulación de sueros
Técnica semi-cuantitativa
Técnica de aglutinación reversa pasiva
Antígenos
Anticuerpos unidos a
partículas
Técnica de inhibición de la aglutinación (1)
1º
2º
Ag soluble Vs Ag unidos a partículas