Identificación genética de componentes biológicos en alimentos

genética
Identificación genética de
componentes biológicos en alimentos
El trabajo presentado corresponde a una nueva línea de
investigación puesta en marcha por AZTI, financiado por el
Dpto. de Agricultura y Pesca del Gobierno de Vasco, con la
creación de un nuevo laboratorio de genética, ante la demanda
existente para este tipo de estudios, que permiten
identificar los productos pesqueros y alimenticios una vez
procesados y evitar el fraude en el etiquetado. Los análisis
genéticos se han revelado los últimos años como una
poderosa herramienta que es capaz, no sólo de identificar
especies, sino incluso de caracterizar poblaciones de la misma
especie, variedades y razas. Estas técnicas se basan en el
análisis del ácido desoxirribonucleico (ADN) que se utiliza como
marcador molecular
MIGUEL ANGEL PARDO
GONZÁLEZ (AZTI)
TESTUA:
as necesidades de control
de calidad de los alimentos exigen en muchas ocasiones verificar la identidad genética de sus componentes. Si
bien esta identificación no suele
revestir problemas cuando se
trata de alimentos frescos, resulta cada vez más complicada
conforme aumenta el grado de
procesamiento de los alimentos.
En principio, la morfología o la
composición química de un organismo pueden permitir su
identificación a nivel de especie
e incluso al nivel de raza o variedad. Sin embargo, cuando se
trata de alimentos procesados o
que contienen mezclas de distintos componentes biológicos, la
molécula de ADN (ácido desoxiribunucleico) es la que presenta
mayor estabilidad y la que contiene mayor cantidad de información para determinar la especie e incluso la variedad a la que
pertenece cada componente alimentario. Cuando el procesamiento del alimento ha elimina-
L
do cualquier traza de ADN de
sus componentes biológicos su
identificación se hace prácticamente imposible. Para poder llevar a cabo esta tarea es necesario tener cierto conocimiento de
la estructura genómica de muchas especies así como del nivel
de variabilidad nucleotídica en
distintas regiones genómicas.
Además hay que desarrollar distintas aplicaciones de la PCR
(Polymerase Chain Reaction)
para poder analizar la variación
genética y de este modo, poder
solucionar los problemas de
identificación que puede requerir la industria alimentaria. Los
problemas a resolver van desde
la autentificación de especies y
variedades para detectar fraudes por sustitución de componentes a la detección de componentes no declarados en la composición del alimento.
¿Cómo es la estructura del ADN
y su organización en el genoma?
El ADN es una macrómolécula
muy larga de aspecto filamentoso y formada por un gran número de desoxiribonucleótidos, ca-
da uno de ellos compuesto por
una base nitrogenada (adenina,
guanina, timina y citosina), un
azúcar y un grupo fosfato. Las
bases de las moléculas del ADN
son las portadoras de la información genética, en tanto que
los grupos de azúcares y fosfato
tienen un papel estructural. Esta macromolécula presenta una
estructura tridimensional de doble hélice cuyo aspecto más importante es la especificidad del
emparejamiento de las bases situadas en el interior de la misma.
La función del ADN es la de almacenar la información genética en la célula. Esta información
se almacena en lo que se denomina gen (la unidad genética
fundamental) y que junto a la
proteína (unidad bioquímica
compuesta de aminoácidos) conforman los dos pilares fundamentales de los seres vivos. La
proteínas son los ladrillos fundamentales que dan forma a las
células y que ejecutan las reacciones biológicas, mientras que
los genes son las instrucciones
que permiten a las células cons-
FIGURA 1. BASES
NITROGENADAS DEL
ADN
FIG. 2. ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DEL
ADN
El código genético es la
relación entre la secuencia de millones de bases
en el ADN y la secuencia
de aminoácidos en las
proteínas, deduciéndose
que cada aminoácido se
traduce leyendo un triplete de bases (codon).
Finalmente, se puede generalizar diciendo que
un gen codifica una proteína, siempre y cuando
consideremos que la mayoría de los genes eucariotas son discontinuos.
Esto quiere decir que las
secuencias que codifican
proteínas (exones) están
embebidas en un mar de
secuencias espaciadoras
no codificantes (intrones), por lo que no toda
la información contenida en el ADN se traduce
a proteínas (en mamíferos solo un 4% de los genes codifican proteínas).
sustrai
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truir las proteínas y transmitir
la información hereditaria de
generación en generación. La
manera que tiene la célula de
relacionar ambas unidades fundamentales es mediante lo que
se denomina como código genético.
Hasta ahora hemos visto que la
información genética de la célula se almacena en forma de
ADN en la célula, pero ¿cómo se
estructura la información en el
genoma?. Estudiemos, por ejemplo, el genoma humano que contiene 3000 millones de bases.
Todo ADN eucariota contiene
un 10% de ADN satélite que son
millones de repeticiones de secuencias de unas 300 pb, un
20% de lo que se denomina como fracción intermedia que son
secuencias repetidas entre cien
y mil veces, y un 70% de la fracción lenta que esta muy poco repetida. Haciendo un balance,
aproximadamente un 30% son
secuencias repetitivas.
Esta gran cantidad de secuencias repetitivas no codificantes
dentro del genoma hacen que el
ADN sea una herramienta másMA
útil que las proteínas a la hora
de encontrar marcadores moleculares que nos sirvan como herramienta para identificar el
origen de los componentes biológicos en los alimentos o en cualquier otra muestra biológica.
¿Qué son los marcadores
moleculares?
Los marcadores moleculares son
biomoléculas que se pueden relacionar con un rasgo genético.
Las biomoléculas que se pueden
relacionar son las proteínas (antígenos e isoenzimas) y el ADN
(genes conocidos, fragmentos de
secuencia y función desconocida).
Los primeros marcadores fueron
desarrollados en los 70 y se basaron en la identificación de
proteínas e isoenzimas por electroforesis. Pero esta técnica no
es suficientemente polimórfica
para diferenciar variedades o especies próximas debido a que las
proteínas son el resultado de la
expresión génica, que puede ser
distinta de unos tejidos a otros,
70
sustrai.64
de una etapa de desarrollo a
otra, de un medio ambiente a
otro, y de una época del año a
otra. Los avances de la tecnología del ADN recombinante han
permitido desarrollar marcadores moleculares basados en el
ADN que son los que presentan
mayor estabilidad y contienen
mayor cantidad de información
para determinar la especie e incluso la variedad a la que pertenece cada componente alimentario. Un marcador molecular
puede ser monomórfico que es
invariable en todos los organismos estudiados, pero cuando
presenta diferencias en el peso
molecular, actividad enzimática,
estructura o sitios de restricción
se dice que es polimórfico.
Cuando el marcador presenta
un gran número de polimorfismos se dice que es hipervariable.
En los últimos años se han descrito muchas regiones de interés
como marcadores. De entre todas ellas se puede destacar el
gen citocromo b mitocondrial
que ha sido muy utilizado en la
identificación de componentes
biológicos en alimentos. Este
gen se encuentra en el genoma
mitocondrial. Las celulas eucariotas presentan unos orgánulos
denominados mitocondrias que
son los encargados de generar
energía. Estos orgánulos tienen
un genoma propio que presenta
unas características especiales
que le hacen muy interesante a
la hora de ser utilizado en la
identificación de especies. Estas
características son su alto número de copias, su alta tasa de
mutación y la ausencia de recombinación genética (ya que se
hereda vía materna).
¿Para que se utiliza la técnica
PCR (polimerase chain
reaction)?
Una vez seleccionado el marcador genético adecuado se debe
de aislar de entre todo el genoma para su posterior análisis.
Para ello se utiliza la técnica denominada reacción en cadena de
la polimerasa (PCR). Cuando el
investigador Kary Mullis concibió su idea en 1983 revolucionó
las técnicas en biología molecular que
existían hasta entonces. Básicamente, se
le ocurrió una sencilla forma para empezar y parar la acción
de un enzima polimerasa (cataliza la
reparación y formación de ácidos nucleicos en la célula) y en consecuencia una manera de amplificar y
seleccionar una secuencia de
ADN exponencialmente (millones de veces) de entre todo el genoma.
Una vez tengamos el marcador
amplificado se analizan los polimorfismos que presenta mediante técnicas genéticas. Para
poder llevar a cabo esta tarea
existen una gran variedad de
técnicas que nos permiten analizar los marcadores genéticos.
Una de las más utilizada es la
técnica RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
que consiste en una digestión
con enzimas de restricción (tijeras biológicas) de los marcadores genéticos amplificados por
PCR y posterior análisis en geles electroforéticos que separan
a los fragmentos de ADN según
su tamaño. De este modo se obtienen diferentes patrones de
bandas que se corresponden con
una especie concreta.
Autentificación de túnidos en
conserva: una necesidad
compartida de la industria y los
consumidores
Como ya se ha comentado, la
identificación de especies de interés comercial está tomando
mucha importancia en la industria agroalimentaria para evitar
fraudes en el etiquetado de productos procesados. AZTI está
desarrollando varios proyectos
de investigación orientados a la
identificación de la especie de
origen en productos marinos. Se
ha estimado que en el mundo se
comercializan cerca de veinticinco mil especies de productos marinos que carecen de control en
cuanto a su denominación exacta de origen, lo que presta a un
etiquetado fraudulento.
FIGURA 3. ESQUEMA DE LA REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA
La técnica PCR consiste
en una desnaturalización de las dos hebras
del ADN, seguida de la
unión específica de unos
cebadores a las hebras
de ADN sobre la que actúa la polimerasa y una
fase final de elongación
en la que el enzima alarga la hebra obteniéndose
una copia idéntica a la
original. Todo esto es un
ciclo que se repite entre
30 y 40 veces, de este modo la amplificación del
fragmento deseado es exponencial.
Esta técnica tiene una
serie de características
que delatan su amplia
expansión en los últimos
15 años: es versátil
(aplicable a la medicina
forense, investigación
bioquímica, industria
alimentaria, etc...), barata, rápida (en unas horas se pueden llegar a
amplificar un fragmento
millones de veces) y no
requiere un ADN molde
puro (de hecho puede
utilizarse incluso ADN
fósil altamente degrada-
La identificación de especies de interés comercial está tomando mucha
importancia en la industria agroalimentaria para evitar fraudes.
FIGURA 4. ESPECIES DE TÚNIDOS CON MAYOR INTERÉS COMERCIAL
En este contexto, las conservas
de túnidos tienen una gran importancia en cuanto al volumen
de ventas y su importancia económica en el sector de la alimentación. Además, en los últimos años se ha extendido la comercialización de productos de
alto valor añadido susceptibles
de fraude. Atendiendo a la regulación europea 1536/92 el término "atún blanco" incluye exclusi-
vamente a la especie Thunnus
alalunga. Por lo tanto, aquellos
productos que se comercialicen
con esta denominación, o la más
popular en la CAPV "bonito del
norte", deben de proceder de esta especie y no de ninguna otra.
La denominación "atún claro"
debe ser incluida en aquellos
productos que contengan únicamente Thunnus albacares, conocido vulgarmente como ‘yellow-
fin’ o ‘rabil’. Por último, dentro
de la denominación de "atún" se
puede incluir cualquier especie
perteneciente al género Thunnus o especies afines como Katsuwonus pelamis (listado).
El tratamiento térmico al que se
somete una conserva es tan
fuerte que incluso el ADN se encuentra altamente degradado.
Este hecho es un problema a la
hora de poder autentificar por
técnicas genéticas este tipo de
productos ya que los fragmentos
que se obtienen no son mayores
de 200 pb (pares de bases). Esto
dificulta enormemente el encontrar un marcador suficientemente polimórfico como para
poder ser usado en la identificación de especies afines filogenéticamente, como en el caso de
las especies del género Thunnus.
En este trabajo hemos amplificado un fragmento del gen del
citocromo b mitocondrial de 276
pb mediante la técnica Nested
Primer PCR. Este fragmento
obtenido es suficientemente polimórfico y grande como para
desarrollar un método de identificación de especies de túnidos
en conservas por PCR-RFLP,
que pueda detectar fraudes de
manera sencilla y rápida que beneficien al consumidor y a la industria conservera.
Actualmente se está analizando
el ADN mitocondrial de más de
do). Sin embargo, presenta los inconvenientes de conocer parte de la secuencia a amplificar y además de tener en cuenta muchas variables como la concentración de los sustratos de la reacción, la temperatura, la presencia de
inhibidores, el número de ciclos, la especificidad de los cebadores que franquean la secuencia a amplificar, etc...
La técnica Nested Primer PCR es una modificación de la PCR y consiste en
dos amplificaciones secuenciales utilizando dos pares de cebadores. En la
primera reacción se obtienen un fragmento que es utilizado como ADN molde de una segunda reacción de amplificación. En esta segunda reacción se
utilizan dos cebadores internos que nos permiten obtener un fragmento interno que es el que finalmente se utiliza como marcador molecular. De este
modo se aumenta mucho la especificidad de la reacción y el rendimiento final de la misma es mayor. Además se evitan efectos inhibitorios en la reacción de PCR, algo muy habitual en los alimentos.
diez especies comerciales de gádidos (bacalaos) para desarrollar
un método de identificación de
estas especies en fresco y en alimentos procesados.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido subvencionado por el Dpto. de Agricultura
y Pesca del Gobierno Vasco.
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