Hepatitis B: genotipos, viremia y resistencias

HEPATITIS B: Genotipos, Viremia y
Resistencias.
Curso de Biología Molecular para clínicos
VIH y hepatitis
Vigo 15 y 16 de enero de 2010
HEPATITIS B: Genotipos, Viremia y
Resistencias.
(Ganem & Prince, N Engl J Med 2004;350:2719-20)
HEPATITIS B: Genotipos, Viremia y
Resistencias.
HEPATITIS B: Genotipos, Viremia y
Resistencias.
Principales características de los distintos genotipos del VHB
Genotipos
Subgenotipos
Subtipos
Tamaño
(nucleótidos)
A
A1-A3
(A4-A5)
adw2, ayw1
3221 nt
B
B1-B5
adw2, ayw1
C
C1-C5
D
D1-D5
Diferencias
genómicas (ORF)
Distribución
geográfica
Sexual,
Parenteral
Europa, África,
Norte América e
India
3215 nt
Vertical
Asia
adw2, adrq+,
adrq-, adr, ayr
3215 nt
Vertical
Asia
ayw2, ayw3
3182 nt
Delección de 11 AAs en
preS1 (1-11)
Vertical, Sexual,
Parenteral
Mundial
ayw4
3212 nt
Delección de 1 AA en
preS1 (11)
Horizontal
África Occidental
adw4q-, adw2,
ayw4
3215 nt
Sexual, Vertical?
América Central
y del Sur
G
adw2
3248 nt
Sexual
Europa, América
H
adw4
3215 nt
Sexual,
Horizontal,
Vertical
América Central
y del Sur
E
F
F1-F4
Inserción de 2 AAs en
HBc (153 y 154)
Principal ví a
de transmisión
Inserción de 12 AAs en
HBc y delección de 1
AA en preS1
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Cepas híbridas o recombinantes
Origen en las i
o
ognotipos
ocn /diferetes
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Determinación del genotipo viral del VHB:
1-Ensayos de secuenciación directa y análisis filogenético.
-Elaborados en el propio laboratorio y basados en la secuenciación
completa o parcial del gen S
-Comerciales (TRUGENE HBV Genotyping kit, Siemens Medical
Solutions Diagnostics)
2-Otros ensayos.
-Hibridación reversa mediante sondas específicas (INNO-LiPA HBV
Genotyping, Innogenetics).
-PCR selectiva (tiempo real y múltiple genotipo específica).
-RFLP
-Ensayos serológicos
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Significado clínico del genotipo viral en la infección por el VHB
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Progresión de la enfermedad hepática en la historia
natural de la hepatitis B
Factores del huésped:
Edad avanzada
Sexo
Consumo de alcohol
Tabaquismo
Factores de origen viral:
Presencia de HBeAg
Genotipo viral (genotipo C del VHB)
Coinfección con otros virus (VHC, VHD y VIH)
Replicación viral activa
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El estudio REVEAL-HBV*, encuentra que la cuantificación
de la carga viral del VHB es esencial para caracterizar el
estado en que se encuentra la infección, así como para
evaluar el riesgo de desarrollo de cirrosis y HCC al existir
una relación directa entre este y el nivel de carga viral en
el momento del inicio del seguimiento o bien con el
mantenimiento de niveles altos de replicación durante el
mismo.
*Chen CJ et al. JAMA (2006); 295: 65-73, Iloeje UH et al. Gastroenterology (2006); 130: 678-86 y
Chen CJ et al. Clin Liver Dis (2007); 11:797-816
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Consideraciones a las recomendaciones y guías para el manejo de la
infección por el VHB
El manejo de la infección por el VHB se basa primordialmente en la medida de la
carga viral antes, durante y después del tratamiento tal como se recoge en las
diferentes recomendaciones y guías terapéuticas con objeto de estandarizar la
práctica clínica.
Existen controversias referentes al manejo de algunos pacientes, especialmente en
la determinación e interpretación de valores de corte utilizados para definir la
indicación del tratamiento y la respuesta al mismo, sobretodo por que ya se
reconoce que los niveles bajos de ADN también pueden estar asociados con la
enfermedad hepática progresiva y pueden justificar el tratamiento.
Por lo tanto la monitorización seriada de los niveles de ADN-VHB es más
importante que cualquier valor aislado de corte arbitrario, especialmente en el
pronóstico y en la determinación de la necesidad de tratamiento.
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Características genéricas de los ensayos de
cuantificación del ADN-VHB
Debido al nivel variable de virus circulante, la detección y cuantificación
del ADN-VHB requiere del uso de técnicas moleculares, a este respecto
se necesitan ensayos que sean sensibles, específicos, seguros, precisos,
reproducibles y que tengan un amplio rango dinámico de cuantificación que
permita la interpretación fiable de los datos de carga viral.
Los ensayos de PCR en tiempo real los que mejor se ajustan hoy en día a
estos requerimientos, además su desarrollo ha permitido disponer de
ensayos mucho más sensibles, con un formato susceptible de ser
automatizado, con un menor riesgo de contaminación por arrastre y sobre
todo con un amplio rango dinámico de cuantificación que los hace
especialmente útiles para la monitorización del tratamiento antiviral.
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Características de los ensayos comerciales disponibles para la cuantificación del ADN-VHB
Frabicante
Ensayo
Método
Procedimiento
Sensibilidad
Linealidad
Siemens
Medical
Solutions
Diagnostics
VERSANT HBV DNA 3.0
Hibridación
y
amplificación
de señal
(bDNA)
Semiautomático
3.3 X 10 3
cp/mL
3.3 X 10 3-1.0 X
10 8 cp/mL
Roche
Diagnostics
COBAS Amplicor HBV
Monitor
PCR
Semiautomático
2.0 X 10 2
cp/mL
2.0 X 10 2-2.0 X
10 5 cp/mL
Roche
Diagnostics
COBAS Ampliprep
/COBAS TaqMan
PCR tiempo
real
Automático
20 UI/mL
20-1.7 X 10
UI/mL
8
Abbott
Molecular
RealTime HBV PCR
PCR tiempo
real
Automático
10 UI/mL
10-1.0 X 10
UI/mL
9
QIAGEN
Diagnostics
RealArt HBV PCR
PCR tiempo
real
Automático
2 UI/mL
2-1.0 X 10
UI/mL
Smart HBV
PCR tiempo
real
Automático
322 cp/mL
322-1.2 X 10
cp/mL
Cepheid
Factor de conversión de 1 UI/mL equivalente a 5.7 cp/mL.
8
9
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Consideraciones finales al uso de los e
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Introducción
La resistencia puede ser definida en términos técnicos, virológicos o clínicos, de ahí
la disparidad de conceptos. Clínicamente se define fácilmente en términos de
fluctuaciones de carga viral que es el mejor indicador disponible de la replicación
viral. En otros aspectos la resistencia se define como un cambio estadísticamente
significativo en un parámetro de un test.
La terapia antiviral es la única opción para controlar y prevenir la progresión de la
enfermedad crónica en la infección por el VHB. Su objetivo es reducir el ADN-VHB
al nivel más bajo posible, idealmente por debajo del límite de detección de los
ensayos de PCR a tiempo real, para asegurar un grado de supresión virológica que
conduzca a la remisión bioquímica, mejora histológica y a la prevención de las
complicaciones.
La reducción sostenida del ADN-VHB a niveles indetectables también es necesaria
para reducir el riesgo de resistencia a NUCs, ya que el principal problema
concerniente al tratamiento prolongado con estos antivirales es sin duda la selección
de mutaciones de resistencia.
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Factores que favorecen la selección de mutaciones de resistencia a
los NUCs
La prolongada persistencia del genoma viral (cccDNA) en el núcleo de los
hepatocitos infectados.
La alta tasa de variabilidad espontánea del VHB durante la replicación viral
(probabilidad de encontrar especies minoritarias resistentes antes de iniciarse el
tratamiento).
Las cargas virales elevadas antes del inicio del tratamiento.
La inhibición incompleta de la replicación viral durante el tratamiento.
La exposición previa a otros NUCs (resistencia cruzada).
La mala adherencia al tratamiento.
Los estados de inmunosupresión.
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(Soriano V, AIDS (2006) 15: 143-52)
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Nivel de susceptibilidad antiviral para las variantes
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Resistance Mutations in POL/RT
Terminal
Protein
1
Spacer
183
POL/RT
RNaseH
349 (rt1)
692 (rt 344)
845 a.a.
F__V__LLAQ__
YMDD
I(G)
II(F)
LMV Resistance
LdT Resistance
ADV Resistance
TDF Resistance
ETV Resistance
A
B
C
D
E
rtV173L rtL180M rtM204V/I rtV207I
rtL180M
rtM204V/I
rtA181T/V
rtI233V rtN236T
rtA194T
rtI169T rtL180M rtT184X
rtM204V/I
rtS202I
rtM250I/V
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Métodos para la detección de mutaciones de resistencias a NUCs.
Métodos genotípicos:
1-Ensayos de secuenciación directa.
-Elaborados en el propio laboratorio (convencional, clonal, etc.)
-Comerciales (TRUGENE HBV Genotyping kit, Siemens Medical Solutions
Diagnostics)
2-Ensayos de detección de mutaciones puntuales (PMA).
-Hibridación mediante sondas específicas (LiPA).
-PCR selectiva (alelo específica y a tiempo real).
-Minisecuenciación (PCR + hibridación)
-RFLP.
-Microarrays con oligonucleotidos (Chips de ADN)
-Espectrometría de masas
-PiSEQ (UDPS)
Métodos fenotípicos:
1-Ensayos basados en la transfección transitoria con plásmidos.
2-Ensayos basados en la transducción con vectores víricos (Baculovirus recombinantes).
3-Fenotipo virtual (SeqHepB, Genopheno HBVSeq, HBV Grade).
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Prevención de la resistencia antiviral
La supresión completa de la replicación viral es crucial para reducir el riesgo de
resistencia antiviral ya que la generación y amplificación de la población
mutante es absolutamente dependiente de la replicación.
La mejor manera de prevenir o minimizar el desarrollo y extensión de la
resistencia consiste en evitar la terapia innecesaria, en la elección y
combinación cuidadosa de la misma, en la vigilancia y monitorización y en el
manejo de la resistencia preexistente si la hubiese, para evitar la resistencia
cruzada con otros antivirales que limite las futuras opciones de tratamiento o
rescate.
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Pre S and S gene Muta
Polymerase gene Mutants
PBC, Precore and Core Mutants
A1762T, G1764A, G1896A (pcW28stop),...
14
X gene Mutants
K130M, V131I….
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121
s-s-124
158 Y
F
99
137
--s--s- 149
107 -s-s- 138 139
s-s-147
144 G
D
164
E
D
145
R
E
M
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Mutational complexity of the Precore/Core Region
D48E S65P E80A I88S
K130M (3) V131I (3) R138M
H139G H139G K140I P147H S153F
X gene
Core
Pre-core
Pol
G1896A
(pcW28stop
En II
nt1727 BCP
DR2
NRE
epsilon
nt mutations
A1762T (3)
G1764A (3)
C1766T
G1786T
A1789G
C1790T (10)
A1792T
A1793G
nt1845 (2)
DR1
polyA
Frameshift at aa21 (1)
I59V (2)
L60I
Frameshift at aa64 (7)
E77Q
V93M (9)
A131P
R151C
G155R
P171Q (9)
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Gracias por su atención
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