Células fetales en sangre materna para

Células fetales en sangre materna para diagnóstico genético prenatal
Fetal cells in maternal blood for prenatal genetic diagnosis
Peter Chedraui Alvarez *
Gisella Saltos Fuentes *
Mónica Maquilón **
Resumen
Summary
Con el advenimiento de técnicas de separación celular
y avances en biología molecular, se ha logrado el
diagnóstico genético de células que se hallan en la
circulación materna. Aunque el diagnóstico prenatal
citogenético basado en amniocentesis o biopsia de
vellosidades coriónicas (BVC ) son altamente
confiables, sin embargo acarrean a un riesgo bajo pero
significativo de pérdidas. Los métodos invasivos con
riesgos en relación al producto deben ser
recomendados a un pequeño subgrupo de embarazadas
que podrían estar en el más alto riesgo de anomalías
cromosómicas. Hay muchas interrogantes con respecto
a este método pero es de una importancia primordial
debido a su no invasividad, quedará por contestarse en
el futuro las muchas interrogantes y su utilidad para los
diversos grupos necesitados de este método.
El
propósito de este trabajo es hacer una revisión objetiva
de este nuevo pero significativo método diagnóstico, ver
sus aplicaciones prácticas e implicaciones ético y
clínico-prácticas.
With the coming of free cell sorting techniques and
advances in molecular biology , it has been possible to
genetically diagnose
cells found in maternal
circulation. Although the cytogenetic prenatal diagnosis
that relies on amniocentesis or chorionic villous
sampling (CVS) are highly reliable, they do bring a
small but significant risk of losses. The invasive
methods with risk in relation to the embryo should be
recommended to a small subset of pregnant women that
could be at higher risk of chromosomic anomalies.
There are many questions concerning this method but it
is of great importance due to its non invasiveness ,
many questions in the future will be answered and its
use for the diverse groups needing this method. The
purpose of this work is to review this new but
significant diagnostic method, study its practical
applications and ethical and
clinical-practical
implications.
Palabras Claves: Células Fetales, Citogenética,
Vellosidades Coriónicas, Amniocentesis.
Introducción
Aunque el diagnóstico prenatal citogenético
basado en amniocentesis o biopsia de vellosidades
coriónicas BVC son altamente confiables, sin
embargo conllevan a un riesgo bajo pero
significativo de pérdidas. La unión de técnicas de
separación celular y avances en biología
molecular, han permitido el diagnóstico genético
de células halladas en la circulación materna. Los
métodos invasivos con riesgos en relación al
producto deben ser recomendados a un pequeño
subgrupo de embarazadas que podrían estar en el
más alto riesgo de anomalías cromosómicas (por
ej: mujeres mayores de 35 años) (4). La búsqueda
de trisomías fetales 21 basadas en la edad es
relativamente ineficaz debido a que mujeres de 35
años o menos aportan con el 80% de las trisomías
21, además no hablan del costo de estas pruebas.
En pacientes de bajo riesgo hay maneras de
identificar fetos con anormalidades cromosómicas
y estas incluyen marcadores séricos maternos de
proteínas fetales o placentarias como: estrioles
conjugados, alfa feto proteínas y gonadotropina
coriónica humana, todas las cuales detectan
aproximadamente el 60% de las trisomías 21 con
una tasa de falsos positivos del 5%. Tenemos
también Ultrasonográficos: engrosamiento nucal,
defectos cardíacos, acortamiento de los huesos
largos, identificando estos el 40-60% de fetos
afectados. La pregunta es como acercarnos a
pacientes de bajo riesgo sin aumentar la tasa de
pérdidas. Podría estar la respuesta en el estudio de
células fetales halladas en sangre materna??.
* MD Gineco - Obstetra. Médico de la Maternidad “Enrique C. Sotomayor”. Guayaquil - Ecuador
** Obstetriz Co-autora y colaboradora
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Revista “Medicina” Vol. 5 N° 2. Año 1999
El propósito de este trabajo es hacer una revisión
objetiva de este nuevo pero significativo método
diagnóstico.
correlación entre detección de cuerpos Y
quinacrina positivos y productos masculinos al
nacer.
Inmunobiología
A pesar de esto, el uso de estas células se ve
complicado por dos hechos; primero: que las
superficies celulares fetales de linfocitos no son
hereditariamente diferentes de su contraparte
materna, por lo tanto se requiere no solo
paternidad conocida sino también una pareja
polimórfica. Segundo: la persistencia de células
fetales en sangre materna hasta 5 años posparto
trae consigo problemas diagnósticos en una mujer
multípara.
Aunque Schmorl hace 100 años demostró
trofoblastos en la circulación pulmonar de una
paciente que murió de las complicaciones de
eclampsia, las células fetales en sangre materna no
fueron consideradas material de estudio prenatal
hasta que Walknowska en 1969 observó células
con cariotipo XY en linfocitos cultivados de 21
embarazadas, 19 de las cuales tuvieron productos
varones. Durante los años 70’ se dobló esfuerzos por desarrollar métodos para enriquecer la
proporción de células fetales en una muestra
sanguínea materna. Estos incluyen columnas de
nylon lana, técnicas de cultivo celular selectivo,
sorteo celular fluorescente. Revisemos ahora que
células blancos pueden ser estudiadas.
Trofoblastos
Por su morfología única, contacto íntimo con la
sangre materna y presencia documentada en sangre
materna periférica constituyen las células fetales
adecuadas para estudio. Un factor confuso ha sido
la inhabilidad de desarrollar anticuerpos (Ac)
monoclonales específicos para antígenos de
superficie de células trofoblásticas. En muchos
estudios iniciales los trofoblastos fetales aislados
demostraron luego ser leucocitos maternos que
habían absorbido antígenos trofoblásticos. Otra
desventaja del uso de estas células es su naturaleza
multinuclear, complicando el análisis FISH
(Hibridización in situ fluorescente) y el fenómeno
de mosaicismo confinado a la placenta que ya ha
sido reconocido en la Biopsia de vellosidades
coriónicas.
Leucocitos
Durante los años 70’ se documentó metafases
masculinas de cultivos sanguíneas periféricas de
embarazadas con productos masculinos. Estas
pruebas eran intensas debido a la necesidad de
analizar cientos de células maternas
para
documentar pocas células fetales. El grupo de
Herzenberg utilizó técnicas de sorteo-flujo para
poder enriquecer la muestra y demostró alta
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Eritrocitos nucleados
Siendo mononucleares, abundantes en sangre fetal
durante el primer trimestre, raro en sangre materna
y con una vida media limitada constituyen un
excelente blanco. La mayor parte de la madres son
compatibles con sus fetos, un pequeño número de
eritrocitos fetales parecen ser tolerados por la
madre.
Desde 1990 han sido descubiertas en sangre
materna CSRN (células sanguíneas rojas
nucleadas), tanto por sus características
morfológicas, tinción de Hemoglobina fetal por
técnica de Kleihauer-Betke, como identificadas
por Ac monoclonales hacia el CD71 receptor
transferrina expresada en células que incorporan
hierro.
Frecuencia de células fetales en sangre materna
Debido a su rareza el aislamiento de estas células
ha sido un reto. Su rango varía entre 1 en 105
hasta 1 en 109. Existe un incremento gestacional
dependiente de 1 en 105 en el primer trimestre
hasta 1 en 104 a término. Hamada (2) usando
FISH (Hibridización in situ fluorescente) necesitó
escrudiñar mas de 144.000 células para evidenciar
1 sola célula que hibridizar con la sonda del
cromosoma Y, por lo tanto se necesita métodos
para poder enriquecer la muestra antes de su
análisis citogenético (5).
Una interesante interrogante es el momento del
pasaje de las células fetales a la circulación
materna. Se podría decir que a mayor edad
Células fetales en sangre materna para diagnóstico genético prenatal
gestacional, mayor el pasaje de células. En el
primer trimestre es mayor el número de células
nucleadas y fácilmente detectable. Si se utiliza
amplificación de secuencias de cromosoma Y por
medio de PCR (Polymerase Chain Reaction) se
puede lograr con éxito entre las semanas 6-12 pero
mejor por encima de la semana 16, este dato aboga
a favor de su uso como diagnóstico prenatal (1).
Variabilidad
embarazadas
biológica
entre
mujeres
Es sumamente variado el número de células fetales
obtenidas en una muestra venosa materna de 20
ml. También es desconocido el hecho de que las
células fetales estén presentes en todas las
embarazadas, debido a múltiples factores que
influyen la transferencia de células fetales a la
circulación materna como: placentación, embarazo
múltiple, incompatibilidad de grupos sanguíneos,
complicaciones médicas maternas como diabetes,
Preeclampsia y sangrados. Se podría decir que se
detectan más células fetales en sangre materna
cuando el feto es citogenéticamente anormal, los
eritrocitos de algunos fetos con aneuploidías son
significativamente mas grandes que aquellos
normales para la misma edad gestacional.
Una herramienta molecular que ha permitido el
reconocimiento de estas células fetales en sangre
materna es el PCR por medio del cual se amplifica
secuencias de DNA del cromosoma Y para poder
rescatar células fetales. Para poder sobre llevar la
limitación de solo captar células masculinas y
poder tener acceso células fetales femeninas se
realiza determinaciones de secuencias alfa HLA
DQ.
Siendo muy raras las células fetales en sangre
materna , se debe amplificar el DNA con métodos
de PCR hacia secuencias genéticas fetales en los
20-40 ml de sangre venosa materna. Para detectar
aneuploidías se necesita enriquecimiento celular
fetal, ya sea de manera “positiva” aumentando el número de células fetales o de manera “ negativa” por depleción de células materna no requeridas.
Al determinar por PCR secuencias del cromosoma
Y en las madres portadoras de fetos masculinos se
facilita el escrudiñaje celular y también se limita
este método diagnóstico a madres con hijos
varones. El número total de células es calculada
comparando la cantidad de trifosfato de
deoxiribonucleótido marcado con P32 incorporado
a las muestras amplificadas (3).
Persistencia de células fetales posparto
Se ha reportado la presencia de linfocitos
masculinos en circulación materna con un rango de
1 a 5 años luego del parto, lo que trae consigo una
posibilidad de error diagnóstico del embarazo
actual en estudio. Existen muchas controversias al
respecto de este hecho ya que algunos autores solo
han amplificado con PCR secuencias de DNA en
sangre materna y otros han usado técnicas de
enriquecimiento
para
detectar
pequeñas
subpoblaciones de células fetales.
Mediante técnicas de sorteo de flujo de células se
ha detectado linfocitos del tipo CD34 CD38 hasta
27 años posparto. El hecho que el embarazo induce
un bajo grado de quimerismo ha sido una
observación sorprendente, de modo que para fines
de diagnóstico es mejor utilizar CSRN ya que son
más diferenciadas y tienen una vida media limitada
(2).
Otro método utilizado es el uso de Ac
monoclonales hacia la cadena Gamma de la
hemoglobina fetal, lo que puede escrudiñar células
fetales en muestras invadidas con células
maternas. Al eliminar las células maternas
contaminantes es posible cultivar las pocas células
fetales utilizando eritropoyetina, este es un método
que promete mucho en el futuro.
Durante años pasados FISH ha alcanzado
aceptación clínica como método de análisis de
cromosomas en metafase e interfase. La ventaja
de este método es que no requiere que las células
se dividan. Se ha utilizado para diagnóstico de
aneuploidías del primer trimestre en muestras de
BVC y amniocentésis del 2do trimestre. El
porcentaje de células fetales aneuploides tienen un
rango que va desde 0%-74%.
Consideraciones éticas e implicaciones clínicoprácticas
Técnicas
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Revista “Medicina” Vol. 5 N° 2. Año 1999
Su uso desde el punto de vista práctico puede
circundar a mujeres mayores de 35 años con riesgo
de aneuploidías. Se ha escogido esta edad debido a
que es el punto en el que el riesgo de tener fetos
cromosómicamente anormal iguala el riesgo de
aborto relacionado al procedimiento.
Como
acercamiento alternativo sería recomendable que
toda mujer embarazada tenga escrudiñeo fetal
celular, seguido de amniocentésis o BVC (menos
de 11 sem) si es que los resultados sugieren
aneuploidía. Se puede utilizar este método en la
incompatibilidad Rh ya que a pesar del uso
mundial de Gamma globulina Rh (D) aun ocurre
eritoblastosis fetal 10.6 de 10.000 nacimientos
vivos. Se puede utilizar para rastrear desordenes
monogénicos como fibrosis quística, retardo
mental por Síndrome Frágil X, distrofia muscular
de Duchene y las hemoglobinopatías Alfa y Beta.
Desde el punto de vista ético hay que tomar en
consideración que muchas mujeres de riesgo se
niegan a métodos invasivos por el temor a
pérdidas. Debido a que el rastrear células fetales
en sangre materna no trae consigo riesgo, no
habría razón para no realizarse; sin embargo
algunas pacientes no desean saber de antemano si
su producto tiene Síndrome de Down. Si esta
prueba se vuelve rutinaria estarían las pacientes
intimidadas a realizarla? Estarían los cuidadores
de salud obligados a imponerla y de saber que el
producto es anormal, rechazarían el seguro a cubrir
debido a una condición preexistente?. Otra
consternación sería el poder seleccionar el sexo de
manera voluntaria, lo cual en conjunto con el uso
del RU480 podría ser peor. Quizá una solución
sería permitir esta prueba a parejas con
condiciones ligadas al cromosomas X.
Sumario
Hay muchas interrogantes con respecto a este
método pero es de una importancia primordial
128
debido a su no invasividad, quedará por
contestarse en el futuro las muchas interrogantes y
su utilidad para los diversos grupos necesitados de
este método.
Referencias
1. Bianchi DW, Shuber AP, De Maria MA: Fetal cells
in maternal blood: Determination of purity and yield
by quantitative polymerase chain reaction. Am J
Obstet Gynecol 171: 922-926, 1994
2. Hamada H, Arinami T, Hamaguchi H; Fetal
nucleated cells in maternal peripheral blood after
delivery. Am J Obstet Gynecol 170: 1188-1193,
1994
3. Price JO, Elias SH, Wachtel SS, Klinger K: Prenatal
diagnosis with cells isolated from maternal blood by
multiparameter flow cytometry.
Am J Obstet
Gynecol 165: 1731-1737, 1991
4. Steele CD, Wapner RJ, Smith JB: Diagnóstico
prenatal en células fetales aisladas de sangre
materna: un repaso.
Clinical Obstetrics and
Gynecology 87: 741, 1995
5. Van Wijk IJ, Van Vught JM, Mulders MA:
Enrichment of fetal trophoblast cells from the
maternal peripheral blood followed by detection of
fetal deoxyribonucleic acid with a nested X/Y
polymerase chain reaction. Am J Obstet Gynecol
174 (3): 871-876, 1996
Dr. Peter Chedraui Alvarez
[email protected]
Teléfono: 321940