P.C.R. "Técnica de amplificación enzimática de secuencias

P.C.R.
P.C.R.
"Técnica
"Técnica de
de amplificación
amplificación
enzimática
enzimática de
de secuencias
secuencias específicas
específicas
de
de DNA"
DNA"
• Paso 1: Desnaturalización del DNA
• Paso 2: Hibridación de los "Primers"
• Paso 3: Extensión
Paso
Paso 1:
1: Desnaturalización
Desnaturalización del
del DNA
DNA (>90ºC)
(>90ºC)
Paso
Paso 2:
2: Hibridación
Hibridación de
de los
los "Primers"(40-65ºC)
"Primers"(40-65ºC)
Paso
Paso 3:
3: Extensión
Extensión (72ºC)
(72ºC)
Final
Final del
del Primer
Primer Ciclo
Ciclo de
de PCR
PCR
Alineamiento
ón
Alineamiento yy extensi
extensión
5’
3’
TA C G
A T G C A T G C A T G C
Alineamiento
ón
Alineamiento yy extensi
extensión
5’
3’
• -T A C G T
• -A T G C A T G C A T G C * *
Alineamiento
ón
Alineamiento yy extensi
extensión
5’
3’
• -T A C G T A
• -A T G C A T G C A T G C * *
Alineamiento
ón
Alineamiento yy extensi
extensión
5’
3’
• -T A C G T A C
• -A T G C A T G C A T G C * *
Alineamiento
ón
Alineamiento yy extensi
extensión
5’
3’
• -T A C G T A C G
• -A T G C A T G C A T G C * *
El
El Poder
Poder de
de la
la P.C.R
P.C.R..
"En
"En cada
cada ciclo
ciclo de
de PCR
PCR se
se consigue
consigue duplicar
duplicar el
el
número
número de
de copias
copias de
de DNA"
DNA"
8
4
2
16
32
64
Detección
Detección
• ELISA en Microplaca
• Electroforesis en Gel de Agarosa
• Hibridación en membrana
• Secuenciación
Tipaje
-SSO de
Tipaje por
por PCR
PCR-SSO
de los
los genes
genes HLA
HLA clase
clase II
II
DNA
amplificado
Se añade el DNA
al soporte.
Reacción de color
La PCR amplifica
la parte seleccionada
Se añade los primers
marcados con biotina
Lavados
Identificación
del DNA unido
por la posición
en el soporte
Extracción DNA
Soporte con las
sondas unidas para
cada especificidad
HLA-II
Tipaje
-SSP de
Tipaje por
por PCR
PCR-SSP
de los
los genes
genes HLA
HLA clase
clase II
II
DNA
amplificado
La PCR amplifica
la parte seleccionada
Se añaden los primers
Extracción DNA
Se añade el DNA
al gel de agarosa.
Elisa
Elisa microplaca
microplaca
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
Productos
de PCR
biotinilados
BSA BSA BSA BSA
Lavar
Añadir
solución
stop
TMB oxidado
TMB
Av-HRP
Lavar
AvAv-HRP
AvAv-HRP
B AvAv-HRP
BSA BSA BSA BSA
Medir a 450
Añadir Substrato
para HRP
B
AvAv-HRP
BSA BSA BSA
BSA
BSA
Añadir Avidina-HRP
Visualización
Visualización del
del ADN
ADN
Conjugado
Sustrato
ADN*biotina
SA
HRP
TIPAJE
TIPAJE MEDIANTE
MEDIANTE
SECUENCIACIÓN
SECUENCIACIÓN (SBT)
(SBT)
HLA- A
HLA-B
Ex 2
HLA-C
Ex 2
Ex 2
Ex 3
Ex 3
Ex 3
Ex 4
Ex 4
Comparación de la secuencia obtenida con la base de datos
P.C.R.
P.C.R. de
de RNA:
RNA: RT-PCR
RT-PCR
• Preparación ARN:
– Eliminar ribonucleasas
– RNAm
– Guantes
– Recipientes de plástico estériles
– Soluciones libres de ARNasas
P.C.R.
P.C.R. de
de RNA:
RNA: RT-PCR
RT-PCR
• Transcripción Reversa del RNA para
convertirlo en cDNA
• P.C.R. del cDNA
Componentes
Componentes yy optimización
optimización de
de la
la
reacción
reacción de
de amplificación
amplificación
Muestra de ADN
Integridad del ADN: no puede estar fragmentado en
trozos más pequeños de lo que queremos amplificar.
Origen de la muestra y proceso de extracción: la muestra
no debe llevar agentes quelantes (EDTA). Tampoco debe
haber determinados factores sanguíneos, fenol,
detergentes... que inhibirían la actividad de la polimerasa.
Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente
cantidad para la amplificación de ADN genómico de copia
única se usan cantidades de 100-500 ng. En el caso de
zonas repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50 ng.
Diseño de los cebadores
El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%.
La relación máxima de purinas/pirimidinas será 60%/40%.
Deben evitarse zonas con largas secuencias de una sola base.
No seleccionar cebadores que en su extremo 3´ tenga una
importante estructura secundaria.
Recomendable, los extremos las últimas bases sean G o C.
Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de
cebadores (dimeros primers)..
Normalmente deben tener un tamaño de 18-30 pb.
La Temperatura de hibridación de los cebadores debe ser
similar en ambos y será variable en función de la secuencia de
los mismos. Generalmente oscila entre los 45 y 60 ° C.
DNA Polimerasa
Taq polimerasa, carecen de actividad 3´-> 5´ exonucleasa.
Conseguir las mejores condiciones para disminuir errores:
No usar un alto número de ciclos, ya que la tasa de error
es proporcional al número de estos (25-45).
La concentración de dNTPs debe ser igual para los 4,
siendo lo mas baja posible, sin perder rendimiento.
Disminuir en lo posible el tiempo de cada etapa.
La concentración de Mg++ no debe estar en exceso, ya que
disminuye la especificidad de la PCR.
Deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs)
dATP, dGTP, dCTP y dTTP.
Añadir en la solución de la reacción en concentraciones
iguales que normalmente oscila entre los 20 y los 200 mMol".
Los dNTPs pueden captar Mg++, por lo que las
concentraciones de ambos componentes deben guardar
siempre la misma relación. La concentración de Mg++ debe ser
de 0.5 – 1.0 mM veces superior a la concentración de dNTPs.
Amortiguador de la reacción
Por lo general está formado por:
10 mM tris-HCl (pH=8.4 a Tª ambiente)
50 mM KCl, 0.1%
1.5 mM MgCl2.
Adyuvantes (aumentan la especificidad y fidelidad de la PCR):
•El dimetilsulfóxido (DMSO al 10%) contribuye a la
disminución de la estructura secundaria del ADN
•Detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritón
x10, que ayudan a estabilizar la enzima.
•Polietilenglicol (PEG), glicerol, formamida, seroalbúmina
bovina (BSA), etc, aunque no son en ningún caso
imprescindibles.
Sales
Es de gran importancia la concentración de dos cationes
*KCl (Influye en la desnaturalización del ADN)
Elevadas concentraciones del K+ favorece la
desnaturalización de secuencias cortas de ADN.
Bajas concentraciones de K+ ayudan a la desnaturalización de
secuencias largas de ADN.
*MgCl++ (Aumenta la temperatura de hibridación del DNA)
Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidad de
la reacción.
Bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de
la reacción
Temperaturas y tiempos de los ciclos
La Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza en tres
etapas que constituyen un ciclo, que repite durante un número
determinado de veces:
1.- Desnaturalización
2.- Hibridación
3.- Elongación
El tiempo, la temperatura y el número de ciclos son factores
determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto
modificándolos podemos optimizar la reacción.
1.- Desnaturalización
Se trata de una etapa crítica ya que es muy importante que el
ADN molde se desnaturalice completamente.
Se recomiendan temperaturas de 94º-95ºC durante 30´´ a 1´
Alto contenido de G + C aumentar el tiempo o la Tª.
La actividad de la enzima decrece de manera muy rápida a
partir de los 95ºC, por lo que a estas temperaturas o
superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubación.
En la práctica se suele añadir un período de
desnaturalización antes de comenzar los ciclos para
asegurarnos que se produce a lo largo de toda la muestra de
ADN. Esta etapa suele ser de 5´a 94ºC.
2.- Hibridación
En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3
factores relacionados con los iniciadores: la composición de
bases, el tamaño y la concentración.
En la práctica, la temperatura de hibridación puede oscilar
entre 45ºC y 65ºC, durante un tiempo comprendido entre 30
segundos y 1 minuto.
Un aumento de temperatura favorece la especificidad ya que
disminuye las uniones incorrectas de los iniciadores.
Un aumento del tiempo favorece la inespecificidad por
amplificación de productos inespecíficos
3.- Elongación
En la mayoría de las reacciones, la etapa de extensión se
realiza a 72ºC.
Teóricamente esta temperatura puede variar entre 70-72ºC.
El tiempo de extensión depende del tamaño de la
amplificación. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para
elongar 1 Kb
En la práctica es normal que al final de todos los ciclos se
realice una última elongación de 5´a 72ºC.
Número de ciclos
Este número depende de la cantidad de ADN que existe en la
muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados.
Es importante no realizar un número alto de ciclos ya que
puede dar lugar a la amplificación de productos inespecificos
La reacción está producida por una enzima que tiene el efecto
meseta.
Después de un número de ciclos la amplificación deja de ser
exponencial y llega a fase estacionaria.
Cuando el efecto meseta se produce, la cantidad de ADN
sintetizado es suficiente para su posterior utilización.
Contaminación en la PCR
La PCR es una técnica muy sensible, por lo que se deben
evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no
deseado se amplifique.
Una de sus mayores ventajas se convierte en el principal
inconveniente.
Existen una serie de normas que ayudan a evitar las
contaminaciones:
Lugar físico exclusivo para realizar la PCR
Uso de instrumental exclusivo para la PCR
Utilización de reactivos y tubos estériles
Uso de guantes por el manipulador
Realización de controles de blanco
Organización
Organización del
del laboratorio
laboratorio
Preparación
ADN
Preparación
PCR
AREAS DE
TRABAJO
Post-PCR
CONTROLES
CONTROLES
• Control Positivo
– Interno
– Externo
• Control Negativo
– Wipe test
– Contaminación ambiental
PARAMETROS
PARAMETROS DETERMINADOS
DETERMINADOS EN
EN EL
EL
LABORATORIO
LABORATORIO MEDIANTE
MEDIANTE PCR
PCR
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
CARGA VIRAL HEPATITIS C
CARGA VIRAL HEPATITIS B
CARGA VIRAL HIV
GENOTIPO HEPATITIS C
CRIBADO Y GENOTIPADO DE PAPILOMAVIRUS
DETECCIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN HFE
FACTOR V LEIDEN
POLIMORFISMOS DE LA PROTOMBINA
MUTACIONES MTHFR
HLA B27
PCR HSV1
PCR HSV2
PCR CMV
PCR SEMICUANTITATIVA CMV
PCR EBV
PCR VZ
PCR HH6
PCR ENTEROVIRUS
CONTINUARA
PCR TIEMPO
REAL