metodología de detección y cuantificación de

METODOLOGÍA DE DETECCIÓN Y
CUANTIFICACIÓN DE
CIANOBACTERIAS Y CIANOTOXINAS
Antonio Quesada
Universidad Autónoma de Madrid
Índice
• Identificación y cuantificación de
cianobacterias potencialmente tóxicas
– Taxonomía de cianobacterias
• Métodos de detección y cuantificación de
cianotoxinas
– Métodos cromatográficos
– Otros métodos: ELISA, PP1
• Resumen
METODOLOGÍAS
Recepción de las
muestras
Identificación
taxonómica
Fluorómetro,
Microscopio
Preparación
Filtración, extracción,
concentración
Determinación
Tox. disolución
ELISA, LC/MS
Determinación
Tox. particulada
ELISA, PP,
LC-MS, HPLC
IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN
DE CIANOBACTERIAS POTENCIALMENTE TÓXICAS
MUESTRA DE AGUA VIVA
UTERMÖHL
FLOTACIÓN
FLUOROMETRÍA
IDENTIFICACIÓN (lista de géneros o especies)
CUANTIFICACIÓN
DISTRIBUCIÓN DE GRUPOS ALGALES (%)
BIOMASA DE CIANOBACTERIAS (CLOROFILA a)
ABUNDANCIA RELATIVA
(% Y/O CLASES )
CONCENTRACIÓN
DE CÉLULAS,
BIOVOLUMEN
TAXONOMÍA DE CIANOBACTERIAS
• Criterios tradicionalmente morfológicos (aspecto),
actualmente además genéticos y fisiológicos.
• Órdenes → familias →(subfamilias) → géneros →
especies →(variedades).
• Más de 2000 especies.
• Constantes variaciones por revisión de expertos.
CIANOBACTERIAS POTENCIALMENTE TÓXICAS
• Alguna de sus cepas a nivel mundial ha sido tóxica.
Potencial ≠ siempre tóxico
• Unos 20 géneros tóxicos descritos. Aprox. 25 especies
potencialmente tóxicas en España.
• Los más importantes en España:
– Microcystis (Microcistinas), Aphanizomenon
(Cilindrospermopsina), Anabaena (anatoxina-a)
– Cylindrospermopsis, Planktothrix, Woronichinia,etc
COLONIALES
(Orden Chroococcales)
Microcystis aeruginosa
50 µm
FILAMENTOSAS SIN HETEROCISTOS
(Orden Oscillatoriales)
Planktothrix agardhii
10 µm
FILAMENTOSAS CON HETEROCISTOS
(Orden Nostocales)
ACINETO
HETEROCISTO
ACINETO
HETEROCISTO
Aphanizomenon flos-aquae
Anabaena crassa
Aphanizomenon ovalisporum
FLOTACIÓN vs UTERMÖHL
FLOTACIÓN
UTERMÖHL
Tipo de muestra
Viva
Fijada (lugol)
Microscopio
Óptico
Óptico invertido
Cuantificación
Abundancia relativa (%)
Concentración de Células
Biovolumen
•Rápido
•Evita otras algas
•Cuantificación precisa
•Método estandarizado (norma
UNE-EN 15204:2007)
Inconvenientes
•subestima taxones no
formadores de blooms
•Cuantificación poco precisa
•Tedioso
•Lugol altera aspecto real
•Demasiadas especies
•Posible subestimación de
formadoras de “scums”??
Aplicación recomendada
Gestión: detección rápida de
especies más abundantes
formadoras de acumulados
Investigación y/o gestión a medio
plazo: seguimientos temporales
precisos
Ventajas
Experto
Recomendable
Imprescindible
CLAVE DE IDENTIFICACIÓN (MUY) SIMPLIFICADA
¿Unicelular, colonial, filamentosa?
Unicelular
Filamentosa
Colonial
¿Heterocistos?
¿Microcystis?
¿Woronichinia?
NO
SÍ
OSCILATORIALES
¿Planktothrix?
NOSTOCALES
¿Apuntamiento?
NO
¿Anabaena?
Cylindrospermopsis?
SÍ
¿Aphanizomenon?
Métodos de detección y cuantificación
de cianotoxinas
Métodos cromatográficos de detección
Técnicas para la separación de compuestos en una mezcla que
permita una detección individualizada de uno o varios analitos
Constan de:
1.Separación cromatográfica
2.Detección
Empleados en muy diversos campos
Separación cromatográfica
1.Compuestos añadidos conjuntamente a una fase móvil
2.Compuestos atraviesan fase estacionaria
3.Los compuestos son retenidos o eluidos según sus
características químicas o físico químicas
4.Los compuestos abandonan la fase estacionaria ordenados
inversamente a su grado de retención
RT: 0,56 - 77,23
646
13,44
612
12,73
100
95
NL:
6,81E8
TIC MS
09071605
90
85
80
599
12,46
75
723
15,04
70
2686
55,92 2707
56,36
65
60
55
72
1,48
50
570
11,86
540
11,23
774
16,10
2590
53,93
45
40
35
30
84
1,73
2288
47,64
468
9,73
126
2,61 298
6,19
25
2497
51,99
2256
46,97
899
18,71
20
2738
57,01
2768
57,63
15
990
20,60
10
1273
26,50
1705
35,49
1498
31,18
5
2137
44,49
2966
61,76
3700
77,04
3200
66,63
0
10
20
30
40
Time (min)
50
60
70
RT: 5,11 - 23,84
646
612
13,44
12,73
100
80
60
40
298
6,19
20
411 454
8,54 9,44
570
540
11,86
468 11,23
9,73
723
15,04
NL:
6,81E8
TIC MS
09071605
774
16,10
790
16,44
899
18,71
0
990
20,60
1105 1124
23,00 23,39
NL:
2,28E7
m/z=
994,50995,50 MS
09071605
898
18,69
100
-LR
80
60
40
20
0
294
6,11
359 407
7,46 8,46
468
9,73
100
839
826 17,46
17,19
650 683
642
556
13,52
11,56 13,36
14,21
598
12,44
80
912
18,98
1012 1091 1145
21,06 22,71 23,83
NL:
2,08E8
m/z=
519,50520,50 MS
09071605
-RR
60
40
20
311
6,46
0
366
7,61
450 497
581
9,36 10,34 12,08
614 669 749
12,77 13,92 15,58
844 895
924 991 1068 1141
17,56 18,62 19,23 20,62 22,23 23,75
791
16,46
788
16,40
100
80
60
871
18,12
NL:
1,48E7
m/z=
1044,501045,50 MS
09071605
-YR
40
20
0
294
6,11
6
575
387 464 468 504
8,04 9,65 9,73 10,48 11,96
8
10
12
643
13,38
860
17,89
709
14,75
14
Time (min)
16
895
18,62
18
1000 1027
20,81 21,37
20
22
1090
22,69
Otros métodos de análisis de Microcistinas
-Test de Inhibición de Protein-fosfatasa (PPI)
- Ensayo de inmunodetección (ELISA)
PPI-test (Inhibición enzimática de la protein
fosfatasa)
• Kit comercial (ZEU- Inmunotec)
• Microcistinas  Inhibición de enzimas proteinfosfatasas (tipos 1 y 2A)
• Principio: Reducción de la defosforilación como medida indirecta de su concentración.
Extracto Pfasa +
Sustrato (pnitrofenolfosfato)
Microcistinas
Defosforilación
(cambio de color)
Cuantificación
por absorbancia
405nm
ELISA – Enzyme-linked inmunosorbent assay
• Kits comerciales (Envirogard®, …)
• Basado en la interacción entre anticuerpos y toxina.
• Mecanismo:
1. Placa multipocillo con anticuerpos
2. Adición de muestra [MC desconocida]
3. Adición de conjugado MC-enzima
Unión competitiva a
sitios de unión
4. Adición de sustrato (genera color en presencia del conjugado)
5. Medición de la absorbancia a 450nm
Selectividad
100
RMN
MALDI-TOF
LC/MS
75
HPLC
50
25
ELISA
PP
Bioensayo
µg
ng
pg
Sensibilidad
fg
Gracias!!