deteccion y tipificacion molecular de virus papiloma

Detección y Tipificación Molecular de Virus Papiloma Humano en Hombres mediante
Nested Multiplex PCR (NMPCRs)
Dr. Leoncio Arcos
1
2
1,2
Universidad de Guayaquil. Unidad de Postgrado en Investigación y Desarrollo. Guayaquil, Ecuador
Programa de Biotecnología. Maestría en Biotecnología, Biología Molecular, Ingeniería Genética. Guayaquil, Ecuador
e-mail: leoncioarcossolí[email protected]
INTRODUCCIÓN
RESULTADOS
Virus Papiloma Humano (VPH) causa una de las infecciones de transmisión sexual (ITS) más frecuente en el
mundo y, cáncer cérvico-uterino (CCU) en 99,7%
(Albero et al., 2013; Silva et al., 2013). Infecta hombres
y mujeres. Asociado principalmente a lesiones como verrugas ano-genitales, neoplasias intraepiteliales de pene
(NIP) y ano (NIA) (Partridge et al., 2007). Otros estudios en hombres han asociado infección por VPH a condilomas genitales,
papilomatosis respiratoria recurrente (PRR), cáncer de pene, anal, perianal, oral, orofaríngeo, cáncer de próstata y uretra (Martín-Ezquerra et
al., 2012).
El empleo de iniciadores Nested Multiplex PCR
(NMPCRs) reportado por Sotlar et al., 2004 permitió
amplificar la región de los genes E6/E7 del ADN viral en
los genotipos VPH de alto riesgo (AR) 16, 33, 68, 18,
39, 58, 31, 52 , 59 y; bajo riesgo (BR) 43, 6/11 y 42,
amplificados previamente con los iniciadores universales
de la región GPE6/E7. En la figura #1 se esquematiza la
ubicación de los productos de amplificación, tomando
como referencia una secuencia de VPH 16(accesión #
AB889493).
Existe varios géneros para esta familia de virus, de los
cuales sólo Alpha-papillomavirus, Beta-papillomavirus y
Gamma-papillomavirus infectan humanos. Descritos
más de 200 genotipos con tropismo por epitelios escamosos estratificados como: piel, mucosa oral y tracto
ano-genital (Kaspersen et al., 2011).
Figura 1. Detección y Tipificación molecular de VPH
mediante NMPCR GP-E6/E7. Diagrama de la posición
de los productos de amplificación obtenidos con los
marcadores específicos en relación al genoma de VPH16 (accesión # AB889493). Los iniciadores están organizados en 4 mezclas.
Fuente: Sotlar et al., 2004
El método más utilizado para detección de VPH en
hombre es la amplificación de ADN viral mediante la
técnica de reacción de polimerasa en cadena (RPC) y sus
variantes. La tipificación permite identificar cada uno de
los genotipos virales con técnicas como: reverse line
blot (RLB), sistema de genotipificación de VPH múltiple (MPG), entre otros (Figliuolo et al., 2012).
En Ecuador, poco es conocido sobre los genotipos VPH
que infectan la población. Estudios para determinar genotipos en población femenina asociados a cáncer cérvico-uterino, no incluyen muestras de hombres. El presente estudio para detección y tipificación molecular de
VPH explora adecuadas áreas anatómicas de pene para
obtener muestras significativas; optimizar y aplicar metodologías moleculares existentes y, mediante secuenciamiento tipificar los genotipos circulantes en la población- hombre de Ecuador.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras cepillado pene y verruga-ano
Extracción de ADN
La optimización de NMPCRs permitió amplificar fragmentos correspondientes de cada genotipo evaluado
(457, 398, 334, 333, 322, 280, 277, 274, 263, 229, 219 y
215 pb para genotipos HPV 16, 33, 6/11, 68, 18, 39, 42,
58, 31, 52, 43 y 59, respectivamente) En la figura #2 se
observa los productos amplificados con muestras certificadas previamente por metodología de tipificación para
genotipos de alto y bajo riesgo basada en hibridación insitu.
Figura 2. Resultados de amplificación por NMPCRs de muestras positivas, previamente verificadas. MPM: Marcador de Peso Molecular; 1-8 muestras amplificadas para diferentes genotipos de
VPH. Muestras 1: genotipos 16, 68; 2: genotipos 16, 58, 43; 3: genotipos 16, 58, 43; 4: genotipos 58, 43; 5: genotipo 31; 6: genotipo 52; 7: genotipo 6/11; 8: genotipo 42; 9: amplificación con
los iniciadores GP-E6-3F(f); GP-E7-5B y GP-E7-6B ( r ).
En la tabla #1 se observa la frecuencia de 12 genotipos de
VPH evaluados mediante NMPCRS a partir de ADN extraído a 29 muestras (25 cepillado de pene y 4 verrugas
anal-ano), observando 59% de muestras positivas (17/29)
los genotipos 43, 16, 6/11, 42, 58 y 52 con mayor porcentaje de incidencia (31%, 28%, 24%, 24%, 14%, 10%) respectivamente. El genotipo de AR 59 no amplificó en ninguna de las muestras evaluadas.
Tabla 1. Frecuencia 12 genotipos de HPV evaluados en este estudio mediante NMPCRs.
Detección y tipificación de genotipos VPH mediante
NMPCRs :
 1ra PCR: Iniciadores universales para la región
GPE6/E7 (GP-E6-3F -f- GP-E7-5B y GP-E7-6B-r- .
 NMPCRs: iniciadores específicos de genotipos 16,
33, 6/11, 68, 18, 39, 42, 58, 31, 52, 43 y 59
Secuenciamiento y
Análisis Bioinformático:
BioEdit
Mega 6


Genotipos
43
16
6/11
42
58
52
68
18
31
33
39
59
Positivos
9
8
7
7
4
3
2
2
1
1
1
0
% incidencia
31%
28%
24%
24%
14%
10%
7%
7%
3%
3%
3%
0%
Rango
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
De 17 muestras positivas un alto porcentaje con infección simple (un genotipo); infecciones múltiples (mayor a 3 genotipos);
infecciones dobles (dos genotipos) e infecciones triples (3 genotipos) correspondientes a 41% (n=7), 29% (n=5), 18%
(n=3), 12% (n=2) de muestras positivas, respectivamente. En
la figura #3 se observa amplificación de varias muestras con
más de un genotipo detectado.
1
2
Ubicación del estudio:
1. Guayaquil: 4 muestras/ano
2. Machala: 25 muestras/pene
Figura 3. Amplificación mediante NMPCRs de muestras positivas con amplificaciones simples, dobles y múltiples. MPM: Marcador de Peso Molecular; 1-12 muestras clínicas con amplificación de diferentes genotipos. 1: con genotipos 16, 43; 2: genotipos 16, 58, 43; 3: genotpos 16, 43; 5: genotipos 33, 52; 7: muestra con genotipos 52,42; 8-9 muestras con genotipo 42;
10-12:muestras con genotipos 43 .
La tabla 2 presenta distribución total de genotipos evaluados. Las muestras 7, H1-4 contienen el mayor número de genotipos. Las muestras con un genotipo 42,9%
(n=3) son los genotipos de bajo riego 06/11, 42 y 43
(14,3% cada genotipo). Las muestras con un genotipo de
alto riesgo 57,1% (n=4) genotipos 52 y 68 (28,6% cada
genotipo).
Tabla 2. Distribución de muestras de cepillado pene y verruga-ano positivas frentes a 12 genotipos
de HPV evaluadas mediante NMPCRs.
Genotipos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
43
16
6/11
42
58
52
68
18
31
33
39
59
1
0
1
1
1
2
1
3
1
4
1
5
1
6
1
7
X
X
1
8
1
9
X
X
X
2
0
X
X
X
X
2
1
2
2
X
X
X
X
2
3
2
4
X
X
X
X
X
2
5
H
1
H
2
H
3
H
4
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
CONCLUSIONES
1. La estrategia Nested-Multiplex-PCR desarrollada por
Sotlar et al., 2004 aplicada en el estudio puede ser
empleada para detección y tipificación de un número
mayor de genotipos de VPH circulantes en la población hombres. Combinada con técnicas de separación
como Electroforesis Capilar aplicada por Dictor y
Warenholt, 2011 ofrecería una prueba más sensible,
específica y rápida.
2. La infección por VPH es prevalentemente alta (59%)
en muestras de hombres sexualmente activos sugiriendo transmisión a sus parejas. VPH en hombres se
manifiesta con escasos y ocasionales signos. Está
considerado “reservorio” silente.
3. Un alto porcentaje de infecciones múltiples sugiere
incremento de parejas sexuales que facilita la diseminación de VPH. Se observa que la región anal es el
sitio anatómico infectado con el mayor número de
genotipos evaluados.
4. La estrategia Espectrometría de Masas para tipificación de VPH reportada por Yi et al., 2011 y Du et al.,
2011 devela la capacidad de la técnica para tipificar
todo genotipo y variante en transición circulante. Su
rendimiento alto y bajo costo combinada con PCRcontribuiría a elevar la calidad de vida en la población, ecuatoriana.
AGRADECIMIENTOS
Consejo de Educación Superior, Instituto Nacional de
Salud Pública e Investigación (INSPI) - Subproceso de
Virología, Solca Portoviejo, Universidad Estatal de Guayaquil, Universidad Estatal de Cuenca y Universidad
Técnica de Machala.
REFERENCIAS
1. Albero G., Villa L., Lazcano-Ponce E., Fulp W, Papenfuss M, Nyitray A., Lu B.,
Castellsagué X., Abrahamsen M., Smith D., Bosch X., Salmerón J., Quiterio M.,
and Giuliano A. 2013. Male circumcision and prevalence of genital human papillomavirus infection in men: a multinational study. BMC Infectious Diseases;
13:18.
2. Dictor M. and Warenholt J. 2011. Single-tube multiplex PCR using type-specific
E6/E7 primers and capillary electrophoresis genotypes 21 human papillomaviruses in neoplasia. Infect Agent Cancer. 6: 1.
3. Partridge J., Hughes J., Feng Q., Winer R., Weaver B., Xi L., Stern M., Lee S.,
O’Reilly S., Hawes E., Kiviat N., and Koutsky L. 2007. Genital Human Papillomavirus Infection in Men: Incidence and Risk Factors in a Cohort of University
Students. The Journal of Infectious Diseases; 196:1128–36.
4. Sotlar K., Diemer D., Dethleffs A., Hack Y., Stubner A., Vollmer N., Menton S.,
Menton M., Dietz K., Wallwiener D., Kandolf R., Bültmann B. (2004). Detection
of high-risk human papillomavirus E6 and E7 oncogene transcripts in cervical
scrapes by nested RT Polymerase chain reaction. J. Med. Virol. 74(1), 107-116.
5. Yi X., Li J., Yu S., Zhang A., Xu J., Yi J., Zou J., Nie X., Huang J., and Wang J.
2011. A New PCR-Based Mass Spectrometry System for HighRisk HPV, Part I.
Am J Clin Pathol; 136:913-919.