cepa de streptococcus thermophilus, procedimiento de fermentacion

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : C12N 1/20
11 Número de publicación:
2 125 050
6
51
ESPAÑA
A23C 9/123
//(C12N 1/20
C12R 1:46)
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 95932806.3
kFecha de presentación : 28.09.95
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 783 566
kFecha de publicación de la solicitud: 16.07.97
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Cepa de Streptococcus thermophilus, procedimiento de fermentación que utiliza esta
cepa y producto obtenido.
k
73 Titular/es: Compagnie Gervais Danone
k
72 Inventor/es: Benbadis, Laurent;
30 Prioridad: 30.09.94 FR 94 11722
126-130 rue Jules Guesde
92300 Levallois Perret, FR
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.02.99
k
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 125 050 T3
16.02.99
Aviso:
k
k
Oudot, Elisabeth y
De Villeroche, Jacques
k
74 Agente: Curell Suñol, Marcelino
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 125 050 T3
DESCRIPCION
5
La presente invención se refiere a una cepa Streptococcus thermophilus, a la utilización de esta cepa
para la obtención de productos lácteos fermentados y a los productos obtenidos por la utilización de esta
cepa.
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La elección de las bacterias lácticas para la producción de productos lácteos fermentados hace intervenir diferentes criterios, en particular la actividad acidificante y la formación de componentes aromáticos
que aseguran las propiedades organolépticas del producto y la producción de agentes espesantes que desempeñan una función sobre la textura y la untuosidad.
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La actividad acidificante se caracteriza esencialmente por tres parámetros: la cinética de acidificación,
la acidez titulable o el pH final de fermentación que condiciona los caracteres organolépticos del producto
y su aptitud para la conservación, y la postacidificación que se desarrolla en el curso de la conservación
del producto.
Una velocidad de acidificación elevada permite reducir el perı́odo durante el cual la preparación a base
de leche es sensible a los contaminantes (pH > 4,7) y disminuir ası́ el riesgo de contaminación bacteriana.
20
25
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35
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El aumento de la velocidad de acidificación mejora también la economı́a del procedimiento aumentando la productividad y la flexibilidad del material industrial.
Las propiedades de postacidificación de las cepas son particularmente importantes para la conservación de los productos. En efecto, los productos frescos fermentados son conservados a temperaturas
comprendidas entre aproximadamente 4◦ C y 8◦C por una duración que no excede, en general, de 4 semanas; pero, si la actividad metabólica de las bacterias es reducida por la conservación en frı́o, la misma
no está bloqueada y provoca la producción de ácido láctico a partir de la lactosa, lo que tiene como
consecuencia una disminución del pH y un aumento del sabor ácido que degradan las propiedades organolépticas del producto.
Además de los criterios considerados para su contribución a la calidad de los productos, otros elementos más especı́ficamente ligados al procedimiento intervienen también en la elección de las cepas, como
la temperatura de fermentación, la velocidad de acidificación y la resistencia a los fagos.
La resistencia a los fagos es un criterio muy importante en la elección de las cepas para disminuir el
riesgo de incidentes fágicos en producción, susceptibles de bloquear más o menos largo tiempo el conjunto
de la producción para descontaminación.
No se conocen hasta el presente cepas de S. thermophilus que presenten una velocidad de acidificación
y un grado de acidez elevados, asociados a una actividad postacidificante muy baja o casi nula.
En efecto, se observa de una manera general que los cultivos de S. thermophilus que tienen una actividad de postacidificación reducida muestran a menudo una actividad acidificante limitada durante la
fermentación, lo que no permite alcanzar el grado de acidez deseado en los productos. Además, estas
cepas tienen a menudo un crecimiento lento, necesitan unos porcentajes de inoculación elevados y una
duración de incubación más larga que son incompatibles con la economı́a de un procedimiento industrial.
La presente invención tiene por objeto una cepa de S. thermophilus que presenta una cinética de
acidificación rápida que permite alcanzar un grado de acidez elevado y que no postacidifica en el curso
de la conservación de los productos frescos fermentados.
Más particularmente, la presente invención se refiere a una cepa de S. thermophilus DN-001 116 depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) con el n◦ I-1477 y sus mutantes
que tienen caracterı́sticas de acidificación de la leche similares.
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60
Por cepas mutantes que tienen caracterı́sticas acidificantes de la leche similares a la cepa depositada,
se entiende designar unas cepas que pueden obtenerse en particular por mutación y selección a partir de
la cepa de referencia y/o por transformación genética con la ayuda de vectores.
Las caracterı́sticas acidificantes son un pH de final de incubación de 4,6 en menos de 4 horas y una
variación de pH a 28 dı́as de menos de 0,2 unidades pH, preferentemente menos de 0,1 unidad.
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ES 2 125 050 T3
5
Las cepas mutantes pueden obtenerse a partir de la cepa de referencia, en particular por mutación
y selección según sus propiedades acidificantes. Las técnicas de mutación son conocidas, ası́ como las
pruebas que permiten controlar las propiedades acidificantes (en particular Spinnier H.E., Corrieu G.
“Automatic method to quantify starter activity based on pH meassurement” J. of Dairy Research, 56
(1989) 755-764); de Roissart H. y Luquet F.M. Edición Lorica ISBN: 2-9507477-0-1).
Estas cepas son más particularmente interesantes para la preparación de productos lácteos fermentados de todos los tipos.
10
15
Es por lo que la presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de productos lácteos
fermentados en el cual un substrato lácteo es puesto en fermentación con por lo menos una cepa de S.
thermophilus.
Es también posible prever en este procedimiento la utilización de una asociación de una o varia cepas
bacterianas, en particular con otras bacterias lácticas tales como Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus casei o Bifidobacterium.
Preferentemente, el substrato lácteo es la leche natural o reconstituida, descremada o no, o bien unos
medios a base de leche o de producto de origen lácteo.
20
25
Este substrato puede comprender unos elementos corrientemente utilizados para la preparación de
postres lácteos, elementos sólidos tales como frutas, pepitas de chocolate o cereales por ejemplo, pero
también productos azucarados o chocolateados lı́quidos. La cepa según la invención presenta por otra
parte la ventaja de resistir a los azúcares, lo que permite fermentar unos productos azucarados que contienen en particular sacarosa.
La presente invención se refiere también a los productos lácteos fermentados obtenidos por la utilización de este procedimiento, en particular quesos frescos fermentados y yogurts por ejemplo.
30
35
Los productos obtenidos por la utilización de esta cepa presentan un sabor suave y sus propiedades
organolépticas son conservadas en el curso del almacenado.
El cultivo de las cepas según la invención, puras o en asociación con otras cepas, puede también ser
utilizado como probiótico en la alimentación humana o animal y también como fermento para ser utilizado en el procedimiento según la invención.
Otras caracterı́sticas y ventajas de la presente invención aparecerán con la lectura de los ejemplos
siguientes.
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Ejemplo 1
Comparación de la velocidad de acidificación y de la actividad de postacidificación de diferentes cepas de
S. thermophilus
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50
55
Una leche descremada reconstituida con 12 % de materia seca y enriquecida con 0,1 % de extracto de
levadura es esterilizada 15 min a 121◦C. Se utiliza un cultivo activo de S. thermophilus que comprende
108 células por mililitro para inseminar este medio con 1 % (v/v). El germen se obtiene después de
aproximadamente 4 horas de incubación a 44◦C. El germen es utilizado para inocular (1 % v/v) un litro
de leche descremada reconstituida con 12 % de materia seca, enriquecida con 0,1 % de extracto de levadura
y previamente pasteurizada a 95◦ C durante 30 min. La leche inoculada es removida y después incubada
a 44◦ C. Cuando la acidez alcanza un pH de 4,6, la preparación es enfriada 16 horas a 4◦C. Esta leche
fermentada es sometida a una prueba de conservación a 8◦ C durante 28 dı́as. El pH después de 28 dı́as
de conservación es comparado para las diferentes cepas. Los resultados están representados en la tabla
1. La cepa I-1477 corresponde a la cepa DN-001 116. Solamente la leche fermentada con la cepa S.
thermophilus DN-001 116 presenta una postacidificación casi nula después de 28 dı́as de conservación a
8◦C. La cepa DN-001 116 muestra una velocidad de acidificación rápida, se alcanza un pH de 4,6 en
menos de 4 horas de incubación a 44◦ C.
60
3
ES 2 125 050 T3
TABLA I
Código
cepa
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01
02
03
04
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07
08
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DN-001
DN-001
DN-001
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DN-001
DN-001
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DN-001
DN-001
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DN-001
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DN-001
DN-001
DN-001
DN-001
DN-001
DN-001
003
004
013
015
022
023
025
031
032
047
054
064
067
094
107
111
116
138
143
145
147
156
162
171
181
223
225
228
230
236
242
276
277
280
289
342
343
Tiempo de
incubación
4
7
7
6
5
3
6
5
4
3
4
5
4
3
3
3
3
4
4
3
6
4
4
5
4
5
3
4
6
5
3
5
3
6
4
5
3
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
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h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
46
21
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16
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55
48
43
18
42
19
30
09
54
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33
45
15
05
40
09
24
05
30
33
30
54
35
15
30
51
25
35
00
50
30
55
pH de final
de incubación
pH a 28 dı́as
Diferencia
4,60
4,62
4,65
4,65
4,60
4,59
4,64
4,60
4,61
4,60
4,60
4,60
4,60
4,61
4,62
4,60
4,61
4,60
4,59
4,60
4,64
4,60
4,60
4,58
4,61
4,60
4,60
4,61
4,64
4,63
4,61
4,60
4,61
4,62
4,61
4,60
4,62
4,31
4,26
4,25
4,30
4,15
4,19
4,41
4,40
4,51
4,18
4,16
4,10
4,10
4,08
4,52
4,11
4,58
4,12
4,18
4,17
4,11
4,12
4,14
4,08
4,11
4,21
4,25
4,16
4,20
4,10
4,11
4,18
4,20
4,10
4,06
4,53
4,25
0,29
0,36
0,40
0,35
0,45
0,40
0,23
0,20
0,10
0,42
0,44
0,50
0,50
0,53
0,10
0,49
0,03
0,48
0,41
0,43
0,53
0,48
0,46
0,50
0,50
0,39
0,35
0,45
0,44
0,53
0,50
0,42
0,41
0,52
0,55
0,07
0,37
Ejemplo 2
Comparación de la actividad de postacidificación de la cepa S. thermophilus 001 116 con otras S. thermophilus
55
60
El germen se prepara como en el ejemplo 1. Este germen es utilizado para inocular (1 % v/v) un
litro de leche descremada reconstituida con 12 % de materia seca, enriquecida con 0,1 % de extracto de
levadura y previamente pasteurizada 30 min a 95◦C. La leche inoculada es removida y después incubada
a 44◦ C. Cuando la acidez alcanza 80◦D, la preparación es enfriada durante 16 horas a 4◦ C. Esta leche
fermentada es sometida a una prueba de conservación a 8◦ C durante 28 dı́as. La tabla 2 presenta la
duración de la incubación y la evolución del pH y de la acidez Dornic cuando tiene lugar el almacenado
a 8◦ C durante 28 dı́as.
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ES 2 125 050 T3
TABLA 2
5
Código
cepa
Tiempo
incubación
Acidez
Dornic y pH
de fin de
incubación
Acidez
Dornic
y pH
a 24 h
Acidez
Dornic
y pH
a 28 dı́as
Acidez
Dornic y
diferencia de pH
sobre 28 dı́as
001 116
3 h 25
80◦ D, 4,80
86◦D, 4,77
92◦ D, 4,63
+12◦ D, -0,17
ST25
5 h 30
80◦ D, 4,75
86◦D, 4,77
95◦ D, 4,57
+15◦ D, -0,20
ST44
3 h 55
80◦ D, 4,75
88◦D, 4,71
111◦D, 4,35
+21◦ D, -0,40
10
15
La postacidificación de la cepa ST25 es comparable con la cepa de DN-001 116 pero su velocidad de
acidificación es mucho más lenta. La cepa ST44 que presenta una velocidad de acidificación satisfactoria
muestra una postacidificación muy importante.
20
Ejemplo 3
Estabilidad de una leche ultrafiltrada fermentada preparada con la cepa DN 001 116
25
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Se prepara una mezcla compuesta por un retenido de leche ultrafiltrada con 6 % de proteı́nas (NTNPN x 6,38) y de crema con 40 % de materia grasa. La proporción de cada uno de los dos constituyentes
es 82 % de retenido y 18 % de crema. Se adiciona el hidrolizado de caseı́na 0,03 % (w/w). El contenido
de la mezcla es de 5,3 % de proteı́nas y de 7,2 % de materia grasa. La preparación es sometida a un
precalentamiento a 75◦ C, una homogeneización a 75◦ C y a 200 bars, y después a una pasteurización
a 95◦C durante 8 min. antes de enfriado a 40◦ C. La mezcla es a continuación inseminada con una
preparación concentrada congelada de la cepa DN-001 116 a razón de 30 g/100 l de un germen con 9.109
CFU/g. El mezclado inseminado es incubado a 40◦C hasta la obtención de un pH de aproximadamente
4,7. Después de descuajado y extracción del cuajo, este sufre un lisado en una válvula adaptada antes de
enfriado a 20◦ C en un intercambiador de placa. El producto lisado es enfriado y es entonces acondicionado
en bote de 1 kg. Estos botes, después de paletización, pasan a un túnel de aire frı́o a fin de enfriar el
producto a 4◦ C. El producto es a continuación sometido a una prueba de conservación a 4◦ C y a 10◦ C.
Los resultados están representados en la tabla 3.
TABLA 3
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Conservación a 4◦ C
Conservación a 10◦ C
Número de dı́as
pH
Degustación
pH
Degustación
0
4,70
(+++)
4,70
(+++)
3
4,66
(+++)
n.d.
(+++)
12
4,66
(+++)
4,66
(+++)
24
4,63
(++)
4,58
(++)
(+++) bueno, muy suave
(++) bueno, suave
Estos resultados confirman que la cepa S. thermophilus DN-001 116 presenta una postacidificación
muy reducida a 4◦ C y a 10◦C.
60
5
ES 2 125 050 T3
Ejemplo 4
Carácter de resistencia a los fagos de la cepa S. thermophilus DN-001 116
5
10
60 fagos de S. thermophilus han sido aislados en el curso de 10 años de producción y en unas fábricas
de diferentes zonas geográficas. El análisis de su espectro de huéspedes ha permitido clasificarlos en 7
subgrupos. La resistencia de la cepa DN-001 116 ha sido ensayada para unos fagos representativos de
estos 7 subgrupos (Φ15, Φ57, Φ47, Φ77, Φ76, Φ29, Φ65), el tı́tulo de los fagos excedı́a de 107 Unidades
que Forman Placas/ml (Los fagos subrayados han sido descritos en la publicación Biochimie (1990) 72,
855-862). La cepa DN-001 116 es resistente a todos los fagos ensayados.
Ejemplo 5
Resistencia a los azúcares
15
Se procede como en el ejemplo 3 pero adicionando al medio a fermentar unas cantidades variadas de
sacarosa, se mide el tiempo para obtener el pH blanco:
20
- medio con 9 % de sacarosa:
- medio con 13 % de sacarosa:
pH 4,7
pH 4,7
620 min
920 min
La cepa Streptococcus thermophilus ha sido depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) con el n◦ I-1477 en fecha 22 septiembre 1994.
25
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REIVINDICACIONES
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1. Cepa de Streptococcus thermophilus depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) con el n◦ I-1477 y sus mutantes que tienen caracterı́sticas de acidificación de la leche
similares.
2. Cepa de Streptococcus thermophilus según la reivindicación 1, que corresponde a la cepa n◦ I-1477.
10
3. Cepa de Streptococcus thermophilus según una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque
los mutantes se obtienen por mutación y selección de sus propiedades acidificantes.
4. Procedimiento de preparación de productos lácteos fermentados en el cual un substrato lácteo es
puesto en fermentación con por lo menos una cepa de S. thermophilus según una de las reivindicaciones
1 a 3.
15
20
5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la fermentación se efectúa en presencia de por lo menos otra cepa de bacteria.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la otra cepa de bacteria es una
bacteria láctica.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque la bacteria láctea es elegida entre:
Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei y Bifidobacterium.
25
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque el substrato lácteo
es leche.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado porque el substrato contiene
unos elementos sólidos.
30
35
10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque los elementos sólidos son unas
frutas, unos productos chocolateados o unos cereales.
11. Productos fermentados obtenidos por la realización del procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 10.
40
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50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
7