Regulación de la COX-2 por el NaCl en la mácula densa

Regulación de la COX-2 por el NaCl en la mácula densa durante la diabetes mellitus
inducida en ratas.
Informe Final del Proyecto 20070566 a cargo del Dr. Pedro López Sánchez, ESM.
RESUMEN
Aproximadamente el 33% de los casos de insuficiencia renal terminal están asociados con
nefropatía diabética, lo que convierte a este padecimiento en la causa más común de
enfermedad renal terminal (Sheets , 2002).La nefropatía diabética se presenta en el 50% de
los pacientes con DM 1 y alrededor del 20 al 40% de los pacientes con DM tipo 2. (Molitch
2001). La causa exacta del desarrollo de la nefropatía es desconocida. Existen varios
factores asociados al desarrollo de complicaciones renales durante la diabetes mellitus.
Dentro de los cambios iniciales se ha observado un aumento de la COX-2 en la mácula
densa. (Thomson, 2001)(Harris, 2004). Se ha implicado a la COX-2 en el desarrollo de
alteraciones hemodinámicas durante la diabetes mellitus (Sanchez PL, 1999) (Komers,
2001) (Harris, 2001). Se sabe que la Angiotensina II se encuentra regulando la expresión de
la COX-2, y a su vez, el NaCl regula la liberación de renina, el primer eslabón del sistema
renina-angiotensina-aldosterona. (Cheng, 2001).Por lo tanto resulta de interés evaluar la
expresión de la COX-2 durante la manipulación de la carga de sodio en un modelo de
diabetes.
Se formaron 9 grupos divididos en ratas control, a las que se les inyectó citrato de sodio y
al resto de los grupos conformados por animales hechos diabéticos mediante la inyección
de estreptozotocina (STZ) (65mg/kg). A suvez, se formaron grupos con dieta alta en sodio,
sodio normal y sodio bajo. Un grupo fue tratado con acetazolamida para inducir un
aumento en la excreción renal de sodio. Los tratamientos se administraron durante 7 días.
Se midió el peso corporal, ingesta de agua, ingesta de alimento, volumen urinario en 24 hrs,
peso renal, proteinuria, creatinina plasmática, creatinina urinaria, depuración de creatinina
y expresión de la COX-2 en la corteza renal mediante western blot. Así mismo, se hicieron
cortes histológicos de riñón para documentar la hipertrofia inducida por la diabetes.
Se encontró que las ratas diabéticas tuvieron una pérdida de peso significativa, presentaron
un mayor peso renal, mayor consumo de agua, alimento y volumen urinario con respecto al
control y estos parámetros no fueron modificados por los tratamientos. No se observó
diferencia entre los grupos con respecto a la concentración plasmática de creatinina y la
depuración de creatinina. Se observó mayor proteinuria en las ratas diabéticas con respecto
al control y el tratamiento con captopril y/o losartán disminuyó significativamente la
proteinuria. En cuanto a la expresión de la COX-2, se encontró que las ratas diabéticas
presentaron una mayor expresión de la COX-2 y el tratamiento con dieta baja en sodio
aumentó significativamente su expresión, efecto que no ocurrió con la administración de
dieta normal o alta en sodio. La acetazolamida semejó los resultados de la dieta alta en
sodio.
Este estudio nos da evidencia que en la Diabetes Mellitus temprana hay una hipertrofia
renal y que la concentración de NaCl juega un rol importante en la regulación de la
expresión de COX-2 en ratas diabéticas.
INTRODUCCIÓN
La diabetes mellitus (DM) es un grupo de trastornos o enfermedades metabólicas que se
manifiesta por hiperglucemia. Existen dos principales formas de diabetes: DM1 que se
caracteriza por deficiencia absoluta de insulina por destrucción de cels β y la DM2
caracterizada por resistencia a la insulina y/o secreción anormal de insulina. La
hiperglucemia crónica de la diabetes es asociada con disfunción, daño y falla de varios
órganos, especialmente los ojos, riñón, nervios, corazón y vasos sanguíneos. Muchos
procesos patogénicos están incluidos en el desarrollo de la diabetes, puede además a largo
plazo tener complicaciones como la retinopatía, nefropatía y la neuropatía periférica. El
impacto social y emocional de la diabetes y la demanda de la terapia puede causar
disfunción psicosocial en los pacientes y sus familias. (Committee of American Diabetes
Association 2001)
En México esta patología la padece el 8.2% de la población entre los 20 y 69 años, y el
30% de estos desconoce que la padece; en nuestro país existen 4 millones de personas
enfermas, llegando esta patología a ocupar el tercer lugar dentro de la mortalidad general.
(Norma oficial Mexicana 2002)
La DM es una patología que conlleva a múltiples lesiones en el funcionamiento normal
del organismo, una de ellas es el daño que produce al riñón, provocando lo que se llama
nefropatía diabética, patología que ocupa el 32% dentro de las causas de Insuficiencia
renal.
La nefropatía diabética es la tercera parte de todos los casos de estado final de enfermedad
renal. Los pacientes con DM1 desarrollan en 50% de los casos nefropatía diabética y en
DM2 del 20 al 40%. (Molitch 2001). Es la primera causa de muerte e invalidez de los
diabéticos.
Aunque la patogénesis exacta es desconocida, muchos factores contribuyen a la enfermedad
renal diabética; de los muchos factores de riesgo identificados en la patogénesis de la
neuropatía se encuentran alteraciones metabólicas y las alteraciones hemodinámicas, dentro
de estas anormalidades hemodinámicas se encuentra la Hipertensión Arterial intrarrenal y
alteraciones intrarrenales hemodinámicas. La HA glomerular en particular juega un papel
importante en esta patología (O´brian1997).
El incremento en la tasa de filtración glomerular en gran parte se debe a una reducción en la
resistencia vascular intrarrenal aferente comparada con la de arterias eferentes, resultando
en incremento de la diferencia de presión hidrostática transcapilar glomerular que puede
dañar al endotelio glomerular, epitelial y células mesangiales, contribuyendo esto a la
progresión de nefropatía diabética.
Estos efectos se explican por la activación de la retroalimentación tubuloglomerular y/o el
aumento vasodilatador de PGE2 liberada.
Las prostaglandinas han sido implicadas en la patología de la hemodinámia renal, en
especial las generadas por la COX-2 (Schambelan 1985). La COX es una enzima
encargada del metabolismo del ácido araquidónico (ácido graso polinsaturado de 20
carbonos), este derivado de fosfolípidos de la membrana liberado por la fosfolipasa A2. Las
COX son enzimas que se encargan de convertir el ácido araquidónico en un endoperóxido
cíclico la PGG2 y esta a través de una peroxidasa se convierte PGH2 (materia prima para la
síntesis de prostaglandinas, tromboxanos y prostaciclinas). La COX-1 no tiene efecto en la
hemodinámia renal, esta se encuentra en arterias y arteriolas, glomérulo y túbulo colector.
La COX-2 se encuentra en forma constitutiva en asa de henle, mácula densa y podocitos
(Harris, RC 1994). En el glomérulo la prostaglandina que se encuentra en mayor medida
expresada es la PGI2 en humanos y la PGE2 ratas, aunque también se encuentra PGF2α y
TXA2, en túbulos se encuentra la PGE2 en mayor cantidad. Estas prostaglandinas se
encargan de la regulación fisiológica en el riñón, en la modulación de la vasodilatación
arteriolar aferente después de la estimulación de la macula densa, atenuando la respuesta
mitogénica y estimulación de la liberación de renina. Se sabe que la activación de COX-2
en macula densa es inducida por un bajo nivel de NaCl (Harris 2000)
La disminución de sal aumenta la expresión de COX-2 en macula densa en ratas normales,
incrementando la secreción de renina por las células yuxtaglomerulares. (Komers 2001).
Thomson y colaboradores demostraron que la hiperfiltración glomerular no sólo se
desarrolla por desorden en la función microvascular, sino que resulta principalmente por
un aumento en la reabsorción del túbulo proximal dado por la hipertrofia que la DM induce
en el riñón, y no como se pensaba, que por causa del aumento en la tasa de filtración
glomerular el túbulo se hipertrofiaba como una adaptación al aumento de la carga filtrada.
Este autor demostró que en la diabetes inducida por estreptozotocina , la ornitina
descarboxilasa (ODC), enzima que interviene en el desarrollo de la hipertrofia proximal
inducida por la DM, aumenta un día después de administrar la estreptozotocina y que
administrando difluorometilornitina, un inhibidor específico de la ODC se atenúa la
hipertrofia renal (Thomson 2001). Como se sabe, el TCP absorbe cerca del 65% del NaCl
del FG, y del restante 35%, sólo 10% alcanza la MD. Este NaCl regula la expresión de
COX-2, la cual a su vez, participa en el mecanismo de señalización para la liberación de
renina (Harris 2004). Resulta interesante, por lo tanto dilucidar si el aumento en la
absorción de NaCl inducido por la hipertrofia que la DM produce en el TCP, influye en el
expresión de la COX-2 en MD.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La diabetes mellitus es una patología que afecta a todo el organismo, durante su evolución
predispone a diferentes complicaciones como la nefropatía diabética. El riñón durante la
DM, sufre cambios en cuanto a su fisiología normal (aumenta la TFG, hay reducción de la
resistencia vascular periférica, diferencia de la presión hidrostática transcapilar y aumento
en la reabsorción del túbulo proximal); la patogénesis de estos cambios es aún desconocida
pero se han identificado algunos factores que contribuyen a ello, como lo son las
alteraciones hemodinámicas (HAS, y alteraciones intrarrenales). En la DM hay una
hipertrofia del túbulo proximal lo que aumenta reabsorción de NaCl y glucosa. La mácula
densa sensa este cambio, activando la retroalimentación túbulo glomerular. La disminución
de NaCl estimula la expresión de COX-2 la cual participa la producción de PGE2 y en la
señalización para la liberación de renina, controlando de esta manera las arteriolas aferentes
y eferentes para estabilizar la TFG. Por lo tanto resulta interesante ver si la hipertrofia que
la DM produce en el túbulo proximal influye en la expresión de COX-2 en macula densa
debida la cantidad de NaCl sensado a ese nivel.
HIPÓTESIS
La mácula densa controla la tasa de filtración glomerular al sensar el NaCl que recibe; en la
DM como resultado de la hipertrofia del TCP disminuye el NaCl sensado en MD, la que
responde con un aumento de la COX-2 y a su vez PG´s produciendo dilatación arteriolar
aferente. Por lo tanto al modificar la reabsorción de NaCl en TCP habrá una disminución de
COX-2 en MD.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el papel del NaCl en la regulación de la expresión de COX-2 en MD durante la DM
inducida por estreptozotocina en ratas macho.
OBJETIVOS PARTICULARES
1) Caracterizar los cambios en la expresión de COX-2 en la DM inducida por
estreptozotocina.
2) Estudiar si la administración de una dieta con bajo sodio influye en la expresión de
COX-2 en la corteza renal en la nefropatía diabética.
3) Estudiar si la administración de una dieta con alto sodio influye en la expresión de
COX-2 en la corteza renal en la nefropatía diabética.
4) Estudiar si la administración de acetazolamida influye en la expresión de COX-2 en
la corteza renal de la neuropatía diabética.
MATERIAL Y MÉTODOS.
Modelo
Se usaron ratas wistar macho con un peso aproximado de 250±20 g. Los animales se
mantuvieron en condiciones controladas de luz, temperatura con acceso libre al alimento de
acuerdo al grupo. Se indujo diabetes en ellas con estreptozotocina 65 mg/Kg. por vía
intraperitoneal, a las 48 hrs. se comprobó la hiperglucemia usando un glucómetro por
refracción. Los animales se dividieron en nueve grupos, con una n para cada uno de ellos
de seis, el primero fue el grupo control, el segundo ratas con DM, el tercero ratas controles
alimentadas con dieta baja en sodio, el cuarto son ratas diabéticas alimentadas con bajo
sodio, el quinto grupo fueron ratas control tratadas con dieta alta en sodio, el sexto grupo
de ratas diabéticas tratadas con dieta alta en sodio, el séptimo ratas que se les aplicó el
vehículo de acetazolamida, el octavo grupo fueron ratas control tratadas con acetazolamida
y el noveno grupo ratas diabéticas tratadas con acetazolamida.
Medición e indicadores de función renal.
Cuarenta y ocho hrs antes de el sacrificio, se colocaron las ratas en cajas metabólicas para
la recolección de orina, registrando el volumen urinario de 24 hrs, se cuantificó además el
consumo de agua, así como el peso de los animales; la orina se conservó a –80 oc para su
posterior análisis (glucosuria, proteinuria, excreción de sodio, excreción de creatinina y
prostaglandinas), al momento del sacrificio se obtuvo sangre por vía intracardíaca para
cuantificar glicemia, sodio y creatinina.
Inmunoblot (western blot) de la expresión de la enzima Cox-2
Al final de los 7 días de tratamiento los animales se les extrajeron ambos riñones,
disecándolos en corteza, médula y papila. Se tomó la corteza homogenizando 100 mg de
tejido a 4 ºC en Tris-HCl (0.1 M, pH 7.4) el cual contenía un cocktail antiproteasas. El
homogenizado se centrifugó a 10,000 rpm a 4 ºC, por 15 minutos. Se midieron las proteínas
por el método de Bradford. La electroforesis se realizó durante 2 horas a 88 V y se
transfirieron las proteínas a membranas de PVDF durante 45 minutos a 15 volts. Las
membranas se bloquearon en una solución de TBST-Leche al 5% durante 2 h a temperatura
ambiente. Después se incubaron con un anticuerpo policlonal de conejo contra la enzima
COX-2 a 4oC toda la noche. Luego de varios lavados se incubaron con sustrato
quimioluminiscente, se expusieron a película fotográfica y digitalizaron para realizar
densitometría. Se usó β actina como proteína de referencia para las normalizaciones.
Histología
Los animales de los grupos a analizar se sacrificaron, los riñones se perfundieron con
solución salina y se fijaron en formaldehído al 10 %. Después se incluyeron en parafina y
se hicieron cortes que se tiñeron con hematoxilina y eosina. Mediante un sistema de análisis
de imágenes, se determinó el área de las células de los túbulos renales y se compararon con
animales control.
Análisis estadístico
Para todos los grupos se calculó la media ± el error estándar (SE). Para analizar los
resultados que reproducen el modelo de diabetes se utilizó t de Student; para determinar si
existen diferencias entre grupos con diferentes tratamientos se utilizó ANOVA. Las medias
se compararon con la prueba de Bonferroni. Se consideró una diferencia significativa si
p<0.05.
Resultados.
En la siguiente tabla se muestran los valores obtenidos en los parámetros de función renal e
hipertrofia. DM: Diabética, ↑ NaCl = dieta alta en sodio, ↓ NaCl = dieta baja en sodio, ACT = acetazolamida.
PLASMA
Grupos
Glucosa
mg/dl
Na+
mmol/l
ORINA
(24 h)
Proteinas
mg/dl
Creatinina Cl
ml/min
Peso renal
g
* p<0.05
Control
70.50±2.37
1762.21±54.70
16.48 ±0.93
1.02±0.09
0.98±0.008
DM
267.5±7.69*
699.08±50.32*
30.92±4.26*
1.10±0.13
1.04±0.015*
Control ↑ NaCl
72.66±4.31
9864.83 ± 335.63
15.64±1.16
1.21±0.59
0.94±0.01
DM ↑ NaCl
254.66±7.31*
14888.45±708.97*
37.59±1.37*
0.95±0.13
1.01±0.01*
Control ↓ NaCl
84.33±5.69
1499.53±87.85
18.59±0.96
1.02±0.09
0.93±0.02
DM ↓ NaCl
277.33±15.10*
363.68 ± 77.73*
29.19±1.61*
1.01±0.07
1.05±0.02*
Control ACT
65.16±3.78
1947±162.86
30.31±1.56
2.57±0.19*
0.97± 0.006
250.33±12.27*
2610±286.85*
32.34±2.94*
2.32±0.19*
1.07 ±0.01*
DM ACT
En esta tabla se aprecia como la DM diminuye la excreción renal de NaCl, pero cuando se
administra dieta alta en sodio, la excreción se incrementa aún más que el control. Por otro
lado, la dieta baja en sodio potencia la disminución dela excreción renal de este ión,
mientras que la acetazolamida, un diurético de asa que aumenta la secreción de sodio,
efectivamente aumenta la secreción del ión en la DM. Tal como se esperaba, todos los
animales con DM presentan proteinuria significativa y las dietas no modifican este cambio.
La depuración de creatinina no se modifica en ningún tratamiento, excepto la
acteazolamida, debido a los cambios que induce en el túbulo proximal. Finalmente,
ninguno de los tratamientos modifica la hipertrofia renal que induce la diabetes.
Túbulo proximal
200
*
Área cel (mm2)
100
0
C
DM
En esta figura se muestran los resultados obtenidos en histología. Como se aprecia, la DM
induce un aumento en el área celular, indicando hipertrofia. Ninguno de los tratamientos
modificó este cambio.
COX-2
1.2
*
β-Actina
1.0
COX2/B-actina (U.A.)
0.7
0.5
C
D
En la figura anterior se muestra el inmunoblot de las ratas control y diabéticas. Se aprecia
que la diabetes aumenta la expresión protéica de esta enzima durante la primera semana de
inducida la diabetes.
COX-2
β-Actina
1.50
*
COX-2/b-actina (U.A.)
1.25
1.00
*
*
0.75
0.50
DM
DM ↑ Na
+
DM ↓ Na
+
DM Acet
En esta figura se muestra los resultados del inmunoblot en los grupos con dietas
modificadas y el tratamiento con acteazolamida. Como se aprecia, la dieta alta en sodio
regula a la baja la expresión de la COX-2 durante la diabetes, mientras que la dieta baja en
el ión aumenta de manera importante su expresión. La acteazolamida semeja el tratamiento
con dieta alta en sodio.
Conclusiones.
Este estudio nos da evidencia que en la Diabetes Mellitus temprana hay una hipertrofia
renal y que la concentración de NaCl juega un rol importante en la regulación de la
expresión de COX-2 en ratas diabéticas.
Este hallazgo es importante debido a que tiene relevancia para el tratamiento de la diabetes
mellitus y sus complicaciones. Dado que los cambios que conllevan a la futura insuficiencia
renal por nefropatía diabética se inician desde la primera semana de la presencia de la
diabetes, es de gran importancia el diagnóstico temprano con la finalidad de prevenir, y
esperamos en un futuro revertir, los daños que la hiperglucemia ha iniciado en el riñón. Así
mismo, refuerza las medidas terapéuticas sobre el control estricto de la ingesta de sodio en
el paciente diabético, dado que la COX-2 se considera una enzima que participa en la
aparición y desarrollo de la nefropatía.
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