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ANTIGLOBULINAS HUMANAS POLIESPECIFICAS.
VERDE O TRANSPARENTE
PARA PRUEBAS DE ANTIGLOBULINA DIRECTA E
INDIRECTA
indebido almacenamiento de las muestras. Los sueros que
no son procesados inmediatamente, deben almacenarse de
2 – 8 ° C por no más de 48 horas o ser congelados. El suero
debe ser separado de las células rojas para ser almacenado.
METODOS.
PRINCIPIO.
La anti-globulina humana poliespecífica reacciona con las
inmunoglobulinas humanas y/o complemento unido a la
superficie de las células rojas, resultando una aglutinación
de células sensibilizadas adyacentes. En las pruebas de
antiglobulina, las células rojas son lavadas completamente
para remover inmunoglobulinas no unidas al glóbulo rojo. El
lavado es necesario para prevenir la neutralización de la
anti-globulinas humana por proteínas no ligadas. La antiglobulina humana poliespecífica anti-IgG-C3d agregada a
células lavadas, causará aglutinación si las células están
sensibilizadas con inmunoglobulinas o complemento. Las
células no sensibilizadas no aglutinarán con la anti-globulina
humana.
REACTIVOS.
La fracción anti-IgG de la anti-globulina humana Elite es
preparada por inmunización de conejos con IgG humana
purificada. La actividad no específica en el suero de los
conejos es removida por absorción. El componente anti-C3d
es un anticuerpo IgM preparado de sobrenadante de cultivo
de células hibridoma de bazo de un ratón inmunizado o de
células de mieloma de ratón. La anti-IgG de conejo y el antiC3d monoclonal, están mezclados y diluidos a niveles
óptimos en solución buffer que contiene albúmina bovina.
La anti-globulina poliespecífica está disponible transparente
o verde, éste último contiene Azul V y Tartrazina. Los
reactivos contienen azida de sodio 0.1% como preservativo y
debe ser usado como se proporciona.
PRECAUCIONES.
Uso IN VITRO exclusivamente. Almacene de 2 – 8 ° C. No
congele o exponga a elevadas temperaturas. Contaminación
del reactivo con suero humano o gammaglobulinas inactivará
la anti-globulina humana. Turbidez marcada puede indicar
contaminación o deterioro del reactivo. No lo use después de
la fecha de expiración.
La anti-globulina humana Elite, ha sido estandarizada para
técnicas en tubo como se describe abajo. El reactivo no ha
sido estandarizado para técnicas en microplaca y los
usuarios de las técnicas en microplaca deben asegurarse de
que el reactivo encuentre sus requerimientos.
A. PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA.
La prueba directa de antiglobulina es usada para demostrar
in vivo la sensibilización de las células. Glóbulos rojos
lavados del paciente o donador son probados directamente
con antiglobulina humana.
TÉCNICA – PRUEBAS EN TUBO.
1. Agregue 1 volumen de suspensión de células
rojas 2-3% del paciente en tubos marcados.
2. Lave las células mínimo 4 veces con buffer
salina isotónico (pH 6.9) siendo cuidadoso al
decantar completamente en cada lavado.
3. Agregue 2
volúmenes de antiglobulina
humana Elite al botón de células, mezcle el
contenido del tubo completamente.
4. Centrifugue el tubo de 15 – 20 segundos a
900 – 1000 rev.* Suspenda suavemente el
botón de células y examine aglutinación.
Apunte los resultados. Las reacciones pueden
ser examinadas con ayudas ópticas o
microscópicamente.
NOTA: Incubación a temperatura ambiente sobre los 5
minutos y la re-centrifugación puede incrementar la fuerza
de reacción debido a los componentes anti-complemento de
este reactivo. Sin embargo la centrifugación inicial seguida
de la adición de la antiglobulina humana no debe ser omitida
ya que algunas reacciones anti-IgG pueden ser afectadas
adversamente por la incubación adicional o la recentrifugación. Por otra parte los reactivos monoespecífios
pueden ser usados para demostrar la sensibilización de las
células in vivo.
5. La confirmación de la validez de toda
reacciones negativas o débiles positivas se
hacen con células rojas sensibilizadas con IgG.
Como células control Coombs.
RECOLECCION DE MUESTRAS.
Las muestras para las pruebas anti-globulina directa deben
ser obtenidas en EDTA para prevenir la unión del
complemento in Vitro, la prueba debe ser hecha dentro de
las 24 horas de la recolección. Si se carece de EDTA, las
muestras pueden obtenerse en ACD, CPD o CPDA-1
preferible que sangre coagulada. Si solamente se dispone de
muestras coaguladas, estas no deben ser refrigeradas antes
de la prueba. Pruebas con resultados positivos, obtenidos de
muestras que han sido refrigeradas deben ser interpretados
con cuidado.
En los procedimientos de anti-globulina indirecta, para la
detección o identificación de anticuerpos debe usarse suero
fresco obtenido de sangre coagulada. El uso de plasma no
está recomendado ya que los anticoagulantes pueden
interferir con la detección de anticuerpos ligados al
complemento. Los coágulos de fibrina pueden desarrollarse e
interferir en pruebas que utilicen plasma. Las pruebas deben
ser hechas lo más pronto posible para minimizar la
posibilidad de reacciones falsas positivas o negativas que
pueden ser encontradas debido a la contaminación o al
B. PRUEBA ANTIGLOBULA INDIRECTA
La prueba de antiglobulina indirecta es usada en pruebas de
compatibilidad, detección de anticuerpos, identificación de
anticuerpos, prueba Du o pruebas para la detección de
antígenos. La prueba es usada para demostrar in vitro la
sensibilización de las células rojas. Pruebas de rutina pueden
incorporar fases de incubación a 37° C seguido por la fase de
antiglobulina. Un auto-control ( que consiste en suero y
células de la muestra a examinar) debe ser corrido en
paralelo cuando se desarrolle la prueba de compatibilidad,
detección de anticuerpos o identificación de anticuerpos. Las
células sanguíneas con prueba de antiglobulina directa
positiva no deben ser usadas en pruebas para detección de
antígenos por el método de antiglobulina indirecto.
C. TÉCNICA – PRUEBA L.I.S.S. EN TUBO
1. Ponga en tubos apropiadamente marcados 2 – 4
volúmenes de suero y 1 volumen de suspensión de reactivo
de células rojas 2-3% o células preparadas en buffer salino
Si albúmina bovina u otros
isotónico (pH 6.9).
potenciadores son usados, agregue y úselos deacuerdo a las
indicaciones del productor.
Mezcle completamente.
2. Incube 45 – 60 minutos a 37° C.
NOTA: Dependiendo del potenciador empleado, los tubos
pueden ser incubados por períodos cortos de tiempo.
Consultar el inserto proporcionado por el productor, sobre
los tiempos óptimos de incubación para el agente
potenciador empleado.
3. Lave las células con buffer salino isotónico (pH 6.9)
mínimo 4 veces, teniendo cuidado de decantar la salina
completamente y resuspenda el botón de células después
de cada lavado. Descarte completamente la salina después
del último lavado.
1. Agregue 2 volúmenes de antiglobulina humana Elite al
botón de células. Mezcle completamente y centrifugue
de 900 – 1000 rev. Por 15 – 20 segundos. *
2. Suspenda suavemente cada botón de células y examine
inmediatamente por aglutinación. Apunte los resultados.
3. Confirme la validez de todas las reacciones negativas
usando células rojas sensibilizadas con IgG como células
control Coombs.
D. TÉCNICA – PRUEBA L.I.S.S. EN TUBO
1. Lave las células de prueba y posibles células
control positivas y negativas dos veces en
buffer salino isotónico (pH 6.9).
2. Lave las células una vez en LISS
3. Resuspenda las células lavadas en una
concentración de 1.5% en LISS.
4. Ponga en tubos precalentados:
2 volúmenes de suero (muestra)
2 volúmenes de suspensión de células 1.5 %
5. Mezcle bien e incube 15 – 20 minutos a 37°
C
6. Lave las células 4 veces en grandes
volúmenes de buffer salina isotónico (pH
6.9). Decante completamente luego del
último lavado.
7. Al botón de células agregue 2 volúmenes de
antiglobulina humana Elite.
8. Mezcle y centrifugue a 900 – 100 rev. Por 15
– 20 segundos.*
9. Resuspenda suavemente el botón de células
y examine por aglutinación. Las reacciones
pueden ser examinadas con ayudas ópticas o
microscópicas.
10. Confirme la validez de todas las reacciones
negativas, usando células rojas sensibilizadas
con IgG, o células control Coombs.
*El tiempo apropiado para la centrifugación puede ser
determinado como el que produce una reacción fuerte de
AHG (antiglobulina humana) con células sensibilizadas, y aún
permite resuspensión fácil de células no sensibilizadas.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.
La aglutinación de células rojas en presencia de antiglobulina
humana Elite es un resultado positivo que indica la presencia
de IgG humana o componentes del complemento en las
células sanguíneas rojas. Una prueba de antiglobulina directa
negativa, no necesariamente descarta una HDN (enfermedad
hemolítica del recién nacido) especialmente si se sospecha
de incompatibilidad ABO. NO se espera hemólisis después de
agregar la antiglobulina humana.
ESTABILIDAD DE LA REACCION.
Los pasos de lavado deben ser completados lo más pronto
posible y sin interrupciones. Seguida de la adición de la
antiglobulina humana todas las pruebas deben ser
centrifugadas y leídas inmediatamente. Demoras en la
lectura o en los lavados pueden resultar en la disociación de
los complejos antígeno –anticuerpo produciendo falsos
negativos o reacciones positivas débiles.
CONTROLES.
Para confirmar la especificidad y la reactividad de
antiglobulina humana Elite es recomendable que el reactivo
sea probado cada día que se use con células
rojas
sensibilizadas con IgG como células control Coombs y células
no sensibilizadas. La actividad anti-complemento puede ser
demostrada por prueba con células preparadas por dos
pasos o técnicas de sucrosa de baja fuerza iónica.
LIMITACIONES
Resultados falsos positivos o negativos, pueden ocurrir por
contaminación bacteriana o química de los materiales de la
prueba, inadecuado tiempo de incubación o temperatura,
incorrecta o excesiva centrifugación, inadecuado lavado de
las células o introducción de suero humano o
gammaglobulinas, incorrecto almacenamiento de los
materiales de la prueba o por omisión de algún reactivo en la
prueba.
NOTA.
Las reacciones de antiglobulina indirecta, falsas negativas
son resultado del método, del lavado de las células, de las
preparaciones de salina isotónica esterilizadas en bolsas
plásticas que son en principio destinadas para irrigación o
uso intravenoso. Este problema ha sido observado cuando
soluciones destinadas para el conteo y medida de células ha
sido usada en lugar de salina en las pruebas antiglobulina.
CARACTERÍSTICAS.
Antes de distribuir cada lote de antiglobulina humana Elite,
es probado para asegurar que los niveles de actividad
contenidos de anti-IgG y de anti-C3d se encuentren dentro
o excedan los estándares mundiales regulados por las
autoridades. La potencia de la IgG está demostrada en
pruebas que emplean células recubiertas de anti-D y Fya. La
potencia del anti-C3d es determinada usando células que
han sido preparadas en dos fases o la técnica de sucrosa de
baja fuerza iónica. La presencia de contaminación de
aglutininas heteroespecíficas o anticuerpos para C4d ha sido
excluida en las pruebas empleando células rojas de todos los
grupos ABO y células recubiertas con C4d. La actividad de
algunos componentes de anti-IgM, anti-IgA, anti-cadena
liviana que pueda estar presente no ha sido establecida.