viruela ovina y viruela caprina

CAPÍTULO 2.7.14.
VIRUELA OVINA Y VIRUELA CAPRINA
RESUMEN
La viruela ovina y caprina son enfermedades víricas de las ovejas y de las cabras que se
caracterizan por fiebre, aparición de pápulas o nódulos generalizados, vesículas (raramente),
lesiones internas (particularmente en los pulmones), y por la muerte. Ambas enfermedades están
causadas por cepas de un capripoxvirus, que puede infectar a las ovejas y a las cabras. Aunque la
mayoría de las estirpes examinadas causan la enfermedad clínica en su forma más grave ya sea
en las ovejas o en las cabras, se han aislado algunas cepas que son igualmente patógenas en
ambas especies. Se ha propuesto que se haga referencia a la viruela maligna de las ovejas y de
las cabras causada por capripoxvirus, así como a la viruela ovina y caprina de Kenia, la dermatitis
caprina de India y la forma nodular de la enfermedad de las ovejas y de las cabras del norte de
África, como la viruela caprina.
La viruela caprina es endémica en África (al norte del Ecuador), Oriente Medio, Turquía, Irán,
Afganistán, India, Nepal, en zonas de la República Popular China, y, desde 1984, en Bangladesh.
Recientemente, la enfermedad ha hecho frecuentes apariciones en el sur de Europa.
Identificación del agente: La confirmación más rápida de la viruela caprina en el laboratorio es la
identificación de los viriones típicos de la viruela caprina utilizando el microscopio electrónico de
transmisión en combinación con un historial clínico de la infección generalizada de la viruela
caprina. El virión de la viruela caprina es diferente del otro poxvirus que comúnmente infecta a las
ovejas y a las cabras – un parapoxvirus que causa el ectima contagioso o dermatitis pustular
contagiosa. Se puede identificar un antígeno de precipitación mediante una prueba de
inmunodifusión en gel de agar (IGDA) utilizando material de biopsia de un ganglio linfático de un
caso precoz de viruela caprina y de sueros inmunes específicos; sin embargo, se produce una
reacción cruzada con parapoxvirus. El capripoxvirus crece en los cultivos de tejidos de origen
ovino, caprino o bovino, aunque los aislamientos de campo pueden necesitar hasta 14 días para
crecer, o requerir uno o más pases adicionales en cultivos de tejidos. El virus produce inclusiones
intracitopasmáticas que se observan con claridad mediante la tinción con hematoxilina y eosina. El
antígeno se puede detectar también en cultivos de tejidos utilizando sueros específicos y las
técnicas de inmunoperoxidasa o de inmunofluorescencia. El antígeno de los capripoxvirus y los
cuerpos de inclusión se pueden observar en los cortes obtenidos en un microtomocriostato o en
cortes de parafina teñidos a partir de material procedente de lesiones de biopsias o exámenes post
mórtem.
Se ha elaborado un enzimoinmunoensayo (ELISA) utilizando un suero de detección policlonal
obtenido frente a un recombinante del antígeno inmunodominante de capripoxvirus. Se ha descrito
también la detección del genoma empleando cebadores específicos de capripoxvirus para los
genes de las proteínas de fusión y de unión.
Pruebas serológicas: La prueba de neutralización vírica es la prueba serológica más específica,
pero, debido a que la inmunidad a la infección de la viruela caprina está predominantemente
mediada por células, la prueba no es lo suficientemente sensible para identificar a los animales
que han tenido contacto con el virus y que solo han desarrollado niveles bajos de anticuerpos
neutralizantes. Las pruebas IGDA y de inmunofluorescencia indirecta son menos específicas
debido a las reacciones cruzadas con anticuerpos frente a otros poxvirus. El análisis de
inmunoelectrotransferencia (Western blotting) es sensible y específico, pero resulta caro y difícil de
llevar a cabo utilizando la reacción entre el antígeno P32 de capripoxvirus y los sueros de prueba.
El uso de este antígeno, expresado en un vector adecuado, en una prueba ELISA ofrece la
posibilidad de realizar una prueba serológica aceptable y estandarizada.
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Capítulo 2.7.14. — Viruela ovina y viruela caprina
Requisitos para las vacunas y los productos biológicos de diagnóstico: Las vacunas vivas y
las inactivadas se han empleado para el control de la viruela caprina. Todas las cepas de
capripoxvirus examinadas hasta ahora comparten un sitio de neutralización principal y muestran
una protección cruzada. Las vacunas inactivadas proporcionan inmunidad a corto plazo en el mejor
de los casos.
A. INTRODUCCIÓN
La viruela ovina y la viruela caprina son endémicas en África del norte y central, en Oriente Medio y en India. La
viruela caprina está causada por cepas de capripoxvirus y produce una enfermedad clínica característica en
razas plenamente susceptibles de ovejas y cabras, que es difícil confundir con ninguna otra. En los animales
autóctonos, la enfermedad y la mortalidad generalizadas son menos frecuentes, aunque sí se observan en los
lugares donde la enfermedad ha estado ausente en una zona o en un pueblo durante un período de tiempo al
introducir métodos intensivos de cría, o en asociación con los agentes causales de otras enfermedades, tales
como el virus de la peste de los pequeños rumiantes o el virus de la fiebre aftosa.
La viruela caprina es la restricción más importante para la introducción de razas exóticas de ovejas y cabras, y
para el desarrollo de la producción intensiva de animales de cría. Las cepas de capripoxvirus que originan la
dermatosis nodular contagiosa (tal como la Neethling) se encuentran también en los bovinos, pero no hay
pruebas de que estas cepas causen la enfermedad en ovinos y en caprinos de forma natural. La distribución
geográfica de la dermatosis nodular contagiosa difiere de la de la viruela ovina y caprina.
Las cepas de capripoxvirus se transmiten entre los ovinos y los caprinos, aunque la mayoría solamente causan la
enfermedad clínica más grave en una especie; también se produce la recombinación entre estas cepas,
originando un espectro que muestra preferencias intermedias por el hospedador y un rango de virulencia.
Algunas cepas son patógenas tanto en ovinos como en caprinos. La viruela caprina tiene la capacidad de
propagarse y establecerse en países fuera de su distribución normal. En 1983 se propagó a Italia, en 1985 y
1989 a Chipre, y en 1988 y en numerosas ocasiones posteriores a Grecia, pero no llegó a establecerse en estos
países. Sin embargo, en 1984 se propagó a Bangladesh donde persiste. En 2005, un brote en cabras de Vietnam
puso de manifiesto que la viruela caprina tiene una distribución geográfica más amplia de lo que se creía hasta
ese momento.
El período de incubación está entre 8 y 13 días después del contacto entre un animal infectado y los animales
susceptibles. Dicho período puede reducirse a 4 días después de una infección experimental por inoculación
intradérmica o por transmisión mecánica por insectos. Algunas razas de oveja europea, tal como la Soay,
pueden morir de una infección aguda antes del desarrollo de las lesiones cutáneas. En otras razas se produce
una elevación inicial de la temperatura rectal por encima de los 40°C, seguida, en primer lugar, por el desarrollo
de máculas – pequeñas zonas rodeadas de hiperemia que son más obvias sobre la piel no pigmentada – entre
los 2–5 días, y, posteriormente, por el desarrollo de pápulas – hinchazones duras de entre 0,5 y 1 cm de
diámetro – que pueden cubrir el cuerpo o restringirse a la entrepierna, la axila y el periné. Las pápulas pueden
estar cubiertas por vesículas llenas de fluido, pero esto no es muy común. En algunas razas de cabra europea se
ha observado una forma de viruela caprina hemorrágica, en la que todas las pápulas parecen unirse por todo el
cuerpo; esta forma es siempre mortal.
Dentro de las 24 horas de la aparición generalizada de pápulas, los animales infectados desarrollan rinitis,
conjuntivitis y el aumento del tamaño de todos los nódulos linfáticos superficiales, en particular de los nódulos
preescapulares. Las pápulas sobre los párpados producen blefaritis de gravedad variable. Conforme se ulceran
las pápulas de las membranas mucosas de los ojos y de la nariz, las secreciones se vuelven mucopurulentas, y
las mucosas de la boca, el ano, y el prepucio o la vagina se necrosan. La respiración se hace pesada y ruidosa
por la presión en el tracto respiratorio superior producida por los nódulos linfáticos retrofaríngeos hinchados,
debido al desarrollo de lesiones pulmonares.
Si el animal afectado no muere en esta fase aguda de la enfermedad, las pápulas comienzan a necrosarse a
partir de la necrosis isquémica después de la formación de trombos en los vasos sanguíneos situados en la base
de la pápula. En los siguientes 5–10 días, las pápulas forman costras que persisten hasta 6 semanas dejando
pequeñas cicatrices. Las lesiones cutáneas son susceptibles al ataque de las moscas, y es común una neumonía
secundaria. No es habitual la anorexia a no ser que las lesiones en la boca interfieran físicamente la
alimentación. El aborto es poco común.
Las lesiones cutáneas son a menudo menos manifiestas en el examen post mórtem del animal con infección
aguda que en el animal vivo. Las membranas mucosas parecen necrosadas y todos los nódulos linfáticos del
cuerpo han aumentado de tamaño y están edematosos. Las pápulas, que pueden ulcerarse, se pueden
encontrar habitualmente en la mucosa abomasal, y algunas veces en la pared del rumen y del intestino grueso,
en la lengua, en el paladar duro y en el blando, en la tráquea y en el esófago. Ocasionalmente, pueden
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observarse zonas de aproximadamente 2 cm de diámetro en la superficie del riñón y del hígado, y se ha descrito
su presencia en los testículos. Con frecuencia se observan numerosas lesiones graves de hasta 5 cm de
diámetro por todas las partes de los pulmones y en particular, en los lóbulos diafragmáticos.
Los síntomas y las lesiones observadas en el examen post mórtem varían considerablemente con la raza del
hospedador y la cepa de capripoxvirus. Las razas autóctonas son menos sensibles y, con frecuencia, muestran
solo unas pocas lesiones que pueden confundirse con picaduras de insectos o con la dermatitis pustular
contagiosa. Sin embargo, se observan con frecuencia casos de animales afectados de viruela caprina de forma
generalizada y a veces mortal en casos de: corderos que han perdido su inmunidad derivada de la maternidad;
animales a los que se ha mantenido aislados; y animales traídos a zonas endémicas, procedentes de pueblos
aislados, y, en particular, si se les ha sometido a estrés durantes el desplazamiento a largas distancias y se les
ha mezclado con otras ovejas y cabras y sus patógenos. Después de la infección con capripoxvirus se produce
invariablemente una gran mortalidad en razas ovinas y caprinas importadas sin ninguna protección previa. La
viruela caprina no es infecciosa para los humanos.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
•
Recogida, envío y preparación de muestras
El material para el aislamiento del virus y la detección del antígeno debe recogerse mediante biopsia o en el
examen post mórtem a partir de las pápulas cutáneas, de las lesiones de los pulmones o de los nódulos
linfáticos. Las muestras para el aislamiento del virus y para el enzimoinmunoensayo (ELISA) de detección de
antígenos se recogerán en la primera semana de la manifestación de los signos clínicos, antes de que se
produzcan anticuerpos neutralizantes. Las muestras para la detección genómica mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) pueden recogerse cuando ya está presente el anticuerpo neutralizante. Para el
aislamiento del virus también se puede también la capa leucoplaquetaria de la sangre recogida en heparina o
EDTA (ácido etilendiamino tetracético) durante el estadio virémico de la viruela caprina (antes de la
generalización de las lesiones o en los cuatro días de generalización de la enfermedad). Las muestras para el
examen histológico han de incluir tejido procedente de las áreas circundantes, y se han de colocar
inmediatamente después de su recogida en formalina al 10% en un volumen que sea diez veces el de la
muestra.
Los tejidos en formol no necesitan requisitos especiales para el transporte. Las muestras de sangre para el
aislamiento del virus a partir de la capa leucoplaquetaria se recogerán en tubos con anticoagulante, se colocarán
inmediatamente en hielo y se procesarán lo antes posible. En la práctica, las muestras de sangre deben
conservarse a 4°C durante dos días antes de su procesamiento, pero no deben congelarse o mantenerse a
temperatura ambiente. Los tejidos destinados al aislamiento de virus, la detección de antígenos o la detección de
genoma se conservarán a 4°C, en hielo o a –20°C. Si hay que transportar las muestras a largas distancias sin
refrigeración, el medio de transporte deberá contener glicerol al 10%; las muestras tendrán el tamaño suficiente
para que el medio de transporte no llegue a la parte central de la biopsia que se utilizará para el aislamiento o la
detección del virus.
El material para el análisis histológico se preparará mediante técnicas normalizadas y se teñirá con hematoxilina
y eosina (H-E). El material de las lesiones para el aislamiento de virus y para la detección del antígeno se
homogeneiza. Una técnica para la homogeneización es la siguiente: se corta el tejido empleando tijeras y
fórceps, y después se muele en un almirez y la mano de mortero con arena estéril y un volumen igual de tampón
salino fosfato (PBS) que contenga penicilina sódica (1.000 unidades internacionales [UI]/ml, sulfato de
estreptomicina (1 mg/ml), micostatina (100 UI/ml) o fungizona (2,5 µg/ml) y neomicina (200 UI/ml). La suspensión
homogeneizada se congela y descongela tres veces y posteriormente se clarifica por centrifugación, empleando
una centrífuga de mesa, a 600 g durante 10 minutos. La capa leucoplaquetaria puede prepararse a partir de 5–
8 ml de sangre sin coagular por centrifugación a 600 g durante 15 minutos; la capa se transfiere cuidadosamente
a 5 ml de agua bidestilada fría empleando una pipeta Pasteur estéril. Pasados 30 segundos, se añaden 5 ml de
medio de crecimiento frío y a doble concentración, y se mezclan. La mezcla se centrífuga a 600 g durante
15 minutos, se desecha el sobrenadante y el sedimento de células se resuspende en 5 ml de medio de
crecimiento como el medio de Eagle modificado de Glasgow (GMEM). Después de la centrifugación a 600 g
durante 15 minutos, el sedimento resultante se resuspende en 5 ml de GMEM recién preparado.
Alternativamente, la capa leucoplaquetaria se puede preparar a partir de una muestra heparinizada utilizando un
gradiente de Ficoll.
a)
Cultivo
El capripoxvirus crecerá en cultivos de tejidos de origen bovino, ovino y caprino, aunque se considera que
los cultivos primarios y secundarios de células de testículo (LT) o de riñón (LK) de cordero son las más
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susceptibles, en particular las que se derivan de una raza ovina lanar. A continuación se ofrece un ejemplo
de una técnica de aislamiento; se inocula un frasco de cultivo celular de 25 cm2 de células ovinas de
testículo o riñón (con un 90% de confluencia) con 1 ml ya sea de la suspensión de la capa leucoplaquetaria
o del sobrenadante de la preparación clarificada de la biopsia, y se permite la absorción a 37°C durante
1 hora. Posteriormente, se lava el cultivo con PBS caliente y se cubre con 10 ml de un medio adecuado,
como GMEM, conteniendo antibióticos y suero fetal bovino al 2%. Si se dispone de ellos, se infectan
también tubos de cultivos de tejidos que contengan células LT o LK y un cubreobjetos, o portaobjetos con
cultivos de tejidos.
Los frascos se examinarán diariamente durante 14 días en busca de indicios de efecto citopático (ECP), y si
el medio está turbio se reemplaza. Las células infectadas desarrollan un ECP característico consistente en
la retracción de la membrana celular de las células circundantes, y finalmente en el redondeamiento de las
células, quedando la cromatina nuclear situada en el margen. Al principio solo se observan pequeñas zonas
de ECP, algunas veces tan solo 4 días después de la infección, que se expanden durante los siguientes 4–
6 días hasta cubrir todo el tapiz celular. Si antes de 7 días no hay pruebas del ECP, se congelará y
descongelará el cultivo tres veces, y el sobrenadante clarificado se inoculará en un cultivo fresco de células
LT o LK. Al primer signo de ECP en los frascos, o antes, en el caso de que se estén usando varios
cubreobjetos infectados, se tomará un cubreobjetos, se fijará con acetona y se teñirá empleando H-E. La
presencia de los cuerpos de inclusión intracitoplásmáticos eosinófilos que son de tamaño variable, pero que
pueden ser hasta la mitad del tamaño del núcleo y están rodeados por un halo claro, es indicativo de la
infección por poxvirus. La formación de sincitios no es una característica de la infección por capripoxvirus.
Si el efecto citopático se debe a la infección por capripoxvirus del cultivo celular, se puede evitar o retrasar
mediante la inclusión de un suero anticapripoxvirus en el medio. Esto proporciona una identificación
preliminar del agente. Algunas cepas de capripoxvirus se han adaptado para crecer en las células de riñón
de mono verde africano (células Vero), pero estas no se recomiendan para el aislamiento primario.
•
Microscopía electrónica
Antes de la centrifugación, el material de la suspensión original se prepara para su examen en un
microscopio electrónico de transmisión de la siguiente manera: sobre una gota de la suspensión colocada
sobre parafina o sobre una placa de cera, se deja flotar una rejilla de microscopía electrónica de 400 mallas
hexagonales con un substrato de pileoform-carbón activado por una descarga luminiscente en vapor de
pentilamina. Transcurrido 1 minuto, la rejilla se transfiere a una gota de tampón Tris/EDTA, pH 7,8, durante
20 segundos y después a una gota de ácido fosfotungsténico al 1%, pH 7,2, durante 10 segundos. Se
escurre la rejilla empleando papel de filtro, se deja secar al aire y se coloca en el microscopio electrónico. El
virión de la viruela caprina tiene forma de ladrillo y está cubierto por elementos tubulares cortos y mide
aproximadamente 290 × 270 nm. Algunos de los viriones pueden rodearse de una membrana que procede
de la célula del hospedador y se debe examinar el mayor número posible de células para confirmar su
aparición (19).
Los viriones de los capripoxvirus no se distinguen de los de ortopoxvirus, pero, aparte del virus vacunal,
ningún ortopoxvirus causa lesiones en las ovejas o en las cabras. Sin embargo, el capripoxvirus se
distingue de los viriones de parapoxvirus que causan dermatitis pustular contagiosa, puesto que aquellos
son más pequeños, de forma ovalada, y cada uno de ellos está cubierto por un único elemento tubular
continuo que aparece como estriaciones sobre el virión.
•
Histología
Después de la preparación, de la tinción con H-E y del montaje del material de biopsia fijado con formalina,
se examinarán varias secciones al microscopio óptico. En el examen histológico, los aspectos más
característicos de las lesiones cutáneas en fase aguda son un infiltrado celular masivo, vasculitis y edema.
Las lesiones tempranas se caracterizan por una inflamación perivascular marcada. Inicialmente, la
infiltración es por macrófagos, neutrófilos y ocasionalmente eosinófilos, y a medida que progresa la lesión
se infiltran más macrófagos, linfocitos y células plasmáticas. Un rasgo característico de todas las
infecciones por capripoxvirus es la presencia en la dermis de cantidades variables de “células de la viruela
ovina”. Estas células de la viruela ovina pueden aparecer también en otros órganos en los que hay lesiones
microscópicas de viruela ovina y caprina. Estas células son grandes, estrelladas, eosinófilas, con
inclusiones intracitoplásmáticas mal definidas y núcleos vacuolados. La vasculitis va acompañada de
trombosis e infarto, produciendo edema y necrosis. Los cambios epidérmicos consisten en acantosis,
paraqueratosis e hiperqueratosis. Los cambios en los órganos son similares, con infiltración celular
predominante y vasculitis. Las lesiones en el tracto respiratorio superior se caracterizan por la ulceración.
•
Inoculación animal
El sobrenadante de la preparación de la biopsia clarificada (véase la sección B.1.a. Cultivo) se puede
utilizar también para la inoculación intradérmica en corderos sensibles. Estos corderos se examinarán
diariamente en busca de evidencias de una reacción cutánea.
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b)
Métodos inmunológicos
•
Pruebas con anticuerpos fluorescentes
El antígeno de capripoxvirus también puede identificarse en cultivos de tejidos infectados sobre
cubreobjetos o sobre portaobjetos, utilizando pruebas con anticuerpos fluorescentes. Los cubreobjetos o los
portaobjetos se lavarán, se dejarán secar al aire y se fijarán con acetona fría durante 10 minutos. La prueba
indirecta utilizando sueros ovinos o caprinos está expuesta a la aparición de un color de fondo muy oscuro y
a reacciones no específicas. Sin embargo, se puede preparar un conjugado directo a partir de sueros de
ovejas o cabras convalecientes o de conejos hiperinmunizados con capripoxvirus purificado. Como control
negativo deben incluirse los cultivos de tejidos sin infectar, porque las reacciones cruzadas pueden causar
problemas debido a los anticuerpos contra los antígenos de los cultivos de tejidos. Se ha utilizado también
la técnica con anticuerpos fluorescentes sobre portaobjetos en cortes de tejido preparados en un
microtomocriostato.
•
Inmunodifusión en gel de agar
Para la detección del antígeno de precipitación de capripoxvirus se ha utilizado la prueba de inmunodifusión
en gel de agar (IDGA), pero tiene la desventaja de que este antígeno es compartido por el parapoxvirus. La
agarosa (1%) se prepara en tampón borato, pH 8,6, se disuelve por calor, y se vierten 2 ml sobre un
portaobjetos de cristal (76  26 mm). Cuando al agar se ha solidificado, se excavan 6 pocillos formando una
roseta alrededor de un pocillo central. Cada pocillo mide 5 mm de diámetro, y hay una distancia de 7 mm
entre el centro del pocillo central y el centro de cada uno de los pocillos periféricos. Los pocillos se llenan de
la siguiente manera: en tres pocillos de la periferia se depositan 18 µl de la suspensión de la lesión
alternando con el antígeno de control positivo, y en el pocillo central se depositan 18 µl de suero de control
positivo de capripoxvirus. Los portaobjetos de colocan en una cámara húmeda a temperatura ambiente
durante 48 horas, y se examinan para detectar la formación de líneas de precipitación visibles empleando
un transiluminador. El material ensayado es positivo si se forma una línea de precipitación con el suero
control que confluye con la producida por el antígeno de control positivo. Esta prueba, sin embargo, no
permite distinguir entre la infección de la viruela caprina y la dermatitis pustular contagiosa (ectima
contagioso).
Para preparar el antígeno para la prueba IDGA, uno de los dos frascos de 125 cm2 con células LT o LK se
infecta con capripoxvirus y, cuando se alcanza un grado de efecto citopático del 90% (8–12 días), se
recogen las células. Se congela y descongela el frasco dos veces, y se agita este para liberar las células del
frasco. El contenido se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos, se decanta la mayor parte del
sobrenadante y se guarda, y el sedimento se resuspende en el sobrenadante restante. Las células se
lisarán utilizando una sonda ultrasónica durante 60 segundos aproximadamente. A continuación este
homogenado se centrifuga como antes, el sobrenadante resultante se mezcla con el que ya está recogido.
El sobrenadante mezclado se añade a un volumen igual de sulfato amónico saturado a pH 7,4 y se deja a
4°C durante 1 hora. Esta solución se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos, y el precipitado se recoge y
se resuspende en un volumen pequeño de solución salina al 0,8% para su uso en la prueba IGDA. El frasco
que no se ha infectado se procesa de forma totalmente idéntica para obtener el antígeno control del cultivo
celular (17).
•
Enzimoinmunoensayo
Después de la clonación de la proteína estructural P32 de capripoxvirus, que es muy antigénica, se puede
utilizar el antígeno recombinante expresado para la producción de reactivos para el diagnóstico, incluyendo
la obtención de antisuero policlonal monoespecífico contra P32 y la producción de anticuerpos
monoclonales (MAb). Estos reactivos han facilitado la elaboración de un ELISA muy específico (4, 5).
Utilizando antisuero de conejo hiperinmune, obtenido por inoculación a conejos con capripoxvirus
purificado, se puede inmovilizar el antígeno de la viruela caprina procedente de suspensiones de biopsias o
del sobrenadante de cultivos de tejidos en una placa ELISA. A continuación, la presencia del antígeno
inmovilizado puede ponerse de manifiesto utilizando un suero de cobaya obtenido contra el grupo
específico de la proteína estructural P32, la inmunoglobulina comercial anticobaya de ratón conjugada con
peroxidasa de rábano y una solución de substrato cromogénico.
c)
Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos
Mediante las técnicas serológicas no es posible distinguir entre las cepas de capripoxvirus de los bovinos,
los ovinos y los caprinos. Sin embargo, estas cepas se pueden caracterizar comparando los fragmentos
genómicos originados por la digestión con HindIII de su ADN purificado (2, 16). Con esta técnica y con la
secuenciación del genoma, se han identificado las diferencias entre los aislamientos de diferentes especies
(12) pero no son consistentes, y hay pruebas de difusión de cepas entre especies y de recombinación entre
cepas en condiciones naturales (10).
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Capítulo 2.7.14. — Viruela ovina y viruela caprina
Se puede utilizar la técnica de la PCR para detectar el genoma de capripoxvirus en muestras de biopsia o
en cultivos de tejidos. Los cebadores para los genes de las proteínas víricas de unión y de fusión son
específicos para capripoxvirus, y la naturaleza de los productos de la PCR puede confirmarse utilizando los
lugares de reconocimiento de las enzimas de restricción (11, 13).
2.
Pruebas serológicas
a)
Neutralización vírica
Un suero de ensayo se puede titular bien frente a un título constante de capripoxvirus (100 DICC50 [dosis
infectiva 50% en cultivo celular]) o bien una cepa de un virus de referencia se puede titular frente a una
dilución constante de un suero de ensayo para calcular el índice de neutralización. El método preferido es el
índice de neutralización debido a la sensibilidad variable de los cultivos de tejidos a capripoxvirus, y la
consecuente dificultad para garantizar el uso de 100 DICC50. Según la descripción de la prueba, se utilizan
placas de microtitulación de cultivos de tejidos de 96 pocillos de fondo plano, pero se puede realizar
perfectamente igual en tubos de cultivos de tejidos introduciendo los cambios apropiados para los
volúmenes utilizados, aunque la lectura de un punto final en los tubos es más difícil. Se ha descrito que el
uso de células Vero en la prueba de neutralización de virus produce resultados más consistentes (20).
•
Procedimiento del ensayo
i)
Los sueros de ensayo, incluyendo un control positivo y un control negativo, se diluyen 1/5 en medio
Eagle/HEPES (N-2-hidroxietilpiperazina, ácido N-2-etanosulfónico) y se inactivan a 56°C durante
30 minutos.
ii)
A continuación, se deposita un volumen de 50 µl del primer suero inactivado en los pocillos de las
columnas 1 y 2, de las filas A a la H de la placa de microtitulación. El segundo suero se coloca en los
pocillos de las columnas 3 y 4, el tercero en las columnas 5 y 6, el suero de control positivo en las
columnas 7 y 8, el control de suero negativo en las columnas 9 y 10, y se depositan 50 µl de medio
Eagle/HEPES sin suero en las columnas 11 y 12 y en todos los pocillos de la fila H.
iii)
Una cepa de referencia de capripoxvirus, que normalmente es una cepa vacunal que se sabe que
crece bien en cultivos de tejidos, con un título superior a log10 6 DICC50 por ml se diluye en medio
Eagle/HEPES en frascos con tapón de rosca para obtener diluciones logarítmicas seriadas de log10
5,0; 4,0; 3,5; 3,0; 2,5; 2,0; 1,5 DICC50 por ml (equivalente a log10 3,7; 2,7; 2,2; 1,7; 1,2; 0,7;
0,2 DICC50/50 µl).
iv)
Comenzando por la fila G y por la preparación de virus más diluida, se añaden 50 µl de virus a cada
pocillo de esa fila. Esto se repite con cada dilución del virus, colocando la dilución con el título más alto
en la fila A.
v)
Las placas se cubren y se incuban a 37°C durante 1 hora.
vi)
Las células LT se preparan a partir de monocapas crecidas con anterioridad en una suspensión de
105 células/ml en medio Eagle con antibióticos y suero fetal bovino al 2%. Después de la incubación
de las placas de microtitulación, se añaden 100 µl de la suspensión celular a todos los pocillos,
excepto a los pocillos H11 y H12, que sirven como pocillos de control para el medio. Los restantes
pocillos de la fila H son los controles celulares y séricos.
vii)
Las placas de microtitulación se cubren y se incuban a 37°C durante 9 días.
viii) A partir del cuarto día, se examinan diariamente las monocapas en busca de pruebas del ECP,
utilizando un microscopio de inversión. En las células de la fila H no ha de haber ECP. Utilizando la
cepa vacunal 0240 KSGP de capripoxvirus, la lectura final se toma el 9º día, y el título del virus en
cada titulación réplica se calcula según el método Kärber (14). Si se deja más tiempo, siempre se
produce un aumento del virus, de modo que el virus que al principio estaba neutralizado parece
disociarse del anticuerpo.
ix)
Interpretación de los resultados: El índice de neutralización es la diferencia entre el título del virus en
un suero negativo y el del suero de ensayo. Un índice ≥1.5 es positivo. La prueba puede hacerse más
sensible si se examina el suero del mismo animal antes y después de la infección. Debido a que la
inmunidad a la viruela caprina está predominantemente mediada por células, un resultado negativo, en
particular después de la vacunación en la que la respuesta es débil, no implica que el animal del que
se ha obtenido el suero no esté protegido.
Se ha descrito un método que mantiene constante el virus y varía el suero en el que se utilizan
diluciones del suero en un rango desde 1/5 a 1/500 y células de músculo fetal bovino. Debido a que
estas células tienen menor sensibilidad a los capripoxvirus que las células LT, el problema del
aumento del virus queda resuelto.
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Capítulo 2.7.14. — Viruela ovina y viruela caprina
b)
Inmunodifusión en gel de agar
La prueba IGDA no puede recomendarse como una prueba serológica para la diagnosis de la viruela
caprina, debido a la reacción cruzada con anticuerpos contra el virus de la dermatitis pustular contagiosa,
que es la principal prueba diagnóstica diferencial. Una consecuencia de esta reacción cruzada es la
aparición de resultados falsos positivos.
c)
Prueba indirecta con anticuerpos fluorescentes
Para la prueba indirecta con anticuerpos fluorescentes, se pueden utilizar los cultivos de tejidos infectados
con capripoxvirus cultivados sobre cubreobjetos o los cultivos de tejidos sobre portaobjetos. En la prueba se
incluirán el control del cultivo celular sin infectar y los sueros de control positivo y negativo. Los cultivos
infectados y los cultivos control se fijan con acetona a –20°C durante 1 hora y se guardan a 4°C. Las
diluciones de los sueros de prueba se realizan en PBS, comenzando con una dilución 1/5, y los positivos se
identifican utilizando una gammaglobulina antioveja conjugada con isocianato de fluoresceína (8). Las
reacciones cruzadas pueden tener lugar con el virus del ectima contagioso, con el de la estomatitis papular
bovina y quizás con otros poxvirus.
d)
Análisis por inmunoelectrotransferencia (Western blot)
El análisis por inmunoelectrotransferencia de los sueros de ensayo frente a los lisados de células infectadas
por capripoxvirus proporciona un sistema sensible y específico para la detección del anticuerpo contra las
proteínas estructurales de capripoxvirus, aunque la prueba es cara y difícil de llevar a cabo (7).
Las células LT infectadas por capripoxvirus deben recogerse cuando se observe un efecto citopático del
90%, a continuación se congelan y descongelan tres veces, y los desechos celulares se sedimentan por
centrifugación. Se decanta el sobrenadante y las proteínas se separan después por electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS/PAGE). Se recomienda un sistema vertical de gel
discontinuo, empleando gel de concentración con acrilamida (5%) en Tris (125 mM), pH 6,8, y SDS (0,1%),
y gel de resolución con acrilamida (10–12,5%) en Tris (560 mM), pH 8,7, y SDS (0,1%), utilizando un
tampón de desarrollo de glicina que contenga Tris (250 mM), glicina (2 M), y SDS (0,1%). Antes de cargar el
gel, se preparan las muestras del sobrenadante mediante ebullición con un tampón de lisis adecuado.
Como alternativa al antígeno del cultivo celular, se puede utilizar también un virus purificado o la proteína
recombinante expresada de P32 (6, 11).
Simultáneamente con las muestras de proteínas, se hacen correr los marcadores de peso molecular. Una
vez separadas las proteínas en el gel SDS/PAGE se transfieren electroforéticamente a una membrana de
nitrocelulosa (NCM). Después de la transferencia, la membrana se aclara exhaustivamente con PBS y se
bloquea con albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en PBS, o con leche en polvo desnatada al 5% en PBS, y
se deja en un agitador rotatorio a 4°C toda la noche. A continuación, la NCM puede separarse en tiras
utilizando un aparato comercial que permite el ensayo simultáneo de múltiples muestras de suero, o bien se
puede cortar en tiras e incubar luego cada una de ellas por separado. La NCM se lava cuidadosamente
realizando cinco cambios de tampón PBS durante 5 minutos en un agitador rotatorio, y después se deja en
un agitador a temperatura ambiente durante 1,5 horas con el suero apropiado a una dilución de 1/50 en
tampón de bloqueo (3% BSA y Tween 20 al 0,05% en PBS; o leche en polvo al 5% y Tween 20 al 0,05% en
PBS). Se lava de nuevo la membrana exhaustivamente y se incuba (en el tampón de bloqueo) con antiinmunoglobulinas de la especie conjugadas con peroxidasa de rábano a una dilución determinada
previamente mediante titulación. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1,5 horas, la
membrana se lava y se le añade una solución de tetrahidrocloruro de diaminobencidina (10 mg en 50 ml de
50 mM Tris-HCl, pH 7,5, y 20 µl de peróxido de hidrógeno al 30% [v/v]. Acto seguido se incuba en un
agitador a temperatura ambiente durante aproximadamente 3–7 minutos con observación constante, y se
detiene la reacción mediante lavado con PBS antes de que el color de fondo se vea en exceso. Para cada
ocasión se utilizará un suero de control positivo y negativo.
Las muestras que se consideren positivas en el ensayo y el control positivo originarán un patrón de bandas
consistente con una reacción con las proteínas de pesos moleculares 67, 32, 26, 19, y 17 kDa – las
proteínas estructurales principales de capripoxvirus – mientras que las muestras de suero negativas no
reaccionarán dando este patrón. El suero hiperinmune preparado contra parapoxvirus (virus del ectima
contagioso) reaccionará con algunas de las proteínas de capripoxvirus, pero no con la de 32 kDa que es
específica de capripoxvirus.
e)
Enzimoinmunoensayo
Se ha elaborado un ELISA para capripoxvirus empleando la expresión de la proteína estructural P32 de
capripoxvirus y los MAb obtenidos contra la proteína P32 (6, 11).
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Capítulo 2.7.14. — Viruela ovina y viruela caprina
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
Se ha utilizado una variedad de vacunas de capripoxvirus vivas atenuadas e inactivadas para proteger a las
ovejas y a las cabras contra la viruela caprina (véanse las referencias 4 y 15 para las revisiones). Todas las
cepas de capripoxvirus de origen ovino, caprino o bovino examinadas hasta ahora comparten un sitio de
neutralización principal, de forma que los animales recuperados de la infección con una cepa son resistentes a la
infección por cualquiera de las otras (3). En consecuencia, es posible utilizar una sola cepa de capripoxvirus para
proteger a las ovejas y a las cabras contra todas las cepas de campo del virus, con independencia de que su
origen estuviera en Asia o África (18, 20).
Hay dos formas antigénicas de capripoxvirus, el virión intacto cubierto por elementos tubulares cortos, y el virión
intacto cubierto además por una membrana que procede de la célula hospedadora. Esta última es la forma
producida normalmente por el animal infectado, mientras la primera es la que se observa cuando el virus se
produce por congelación y descongelación de cultivos de tejidos infectados. Las vacunas muertas producidas a
partir de cultivos de tejidos están formadas por viriones casi completamente desnudos, y cuando se utilizan como
una vacuna no estimulan la inmunidad para que el virión se envuelva con la membrana. Esto explica en parte el
poco éxito que tienen las vacunas inactivadas. Un factor adicional es que las vacunas inactivadas son menos
eficaces que las vivas (que replican al virus vacunal) en la estimulación de la respuesta inmune mediada por
células, que es la respuesta protectora predominante a la infección por poxvirus. Las vacunas muertas de la
viruela caprina proporcionan, como mucho, una protección temporal. Una serie de cepas de capripoxvirus han
tenido un uso extendido como vacunas vivas (9), por ejemplo, la cepa de la viruela ovina y caprina de Kenia
0240, utilizada en ovejas y cabras, las cepas Rumana y RM-65, utilizadas principalmente en ovejas, y Mysore y
Gorgan utilizadas en cabras. La inmunidad contra la viruela caprina en las ovejas y las cabras después de la
vacunación con la cepa 0240 dura más de un año y probablemente proporcionará una protección para toda la
vida frente al desafío letal. La cepa 0240 no se utilizará en razas bovinas Bos taurus.
Se está elaborando una nueva generación de vacunas de la viruela caprina que utiliza el genoma de
capripoxvirus como vector para los genes de otros patógenos de los rumiantes, por ejemplo, los genes de los
virus de la peste bovina y de la peste de los pequeños rumiantes (PPR). La vacuna recombinante proporcionará
protección contra la viruela caprina, la peste bovina y la PPR en una sola vacuna (1).
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Una cepa de capripoxvirus utilizada en la producción de una vacuna debe ir acompañada de un historial en
el que se describa su origen y su pase por cultivos de tejidos o animales. Debe ser inocua para utilizarla en
todas las variedades de ovejas y cabras en las que se pretende emplear, incluyendo los animales preñados.
No debe ser transmisible, debe permanecer atenuada después del pase posterior por un cultivo celular, y
proporcionar una protección completa frente al desafío de cepas de campo virulentas por un mínimo de un
año. Será conveniente preparar una cantidad de inóculo original del virus vacunal y guardarlo con el fin de
proporcionar un inóculo de trabajo constante para la producción regular de vacunas.
b)
Método de cultivo
El inóculo de vacuna debe liofilizarse y guardarse en viales de 2 ml a –20°C. Se puede guardar en estado
húmedo a –20°C, pero de ser así, es más estable a –70°C o a temperatura más baja. Para obtener un
rendimiento óptimo, el virus debe cultivarse en células primarias o secundarias LT o LK de oveja lanar.
También pueden utilizarse células Vero.
c)
Validación como vacuna
Debe demostrarse que los lotes de siembra son:
i)
Puros: Estar libres de virus ajenos, en particular de pestivirus, tales como el virus de la enfermedad de
la frontera y de la diarrea vírica bovina, y libres de contaminación por bacterias, hongos y/o
micoplasmas.
ii)
Inocuos: No producir reacción clínica en ninguna de las razas de ovejas o cabras cuando se les
administra por la vía recomendada.
iii)
Eficaces: Estimulador una inmunidad completa a la viruela caprina en todas las razas de ovejas y
cabras durante al menos 1 año.
En la sección C.4. se describen las pruebas necesarias.
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Capítulo 2.7.14. — Viruela ovina y viruela caprina
2.
Método de producción
Los lotes de vacuna se producen sobre monocapas de células secundarias LT o de células primarias LK. Se
reconstituye un vial de inóculo vírico con GMEM y se inocula en una monocapa de células LT o LK, que
previamente se ha lavado con PBS templado, y se permite la adsorción a 37°C durante 15 minutos antes de
recubrir la mezcla con GMEM adicional. Transcurridos 4–6 días, deberá apreciarse un gran efecto citopático (50–
70%). El cultivo deberá examinarse en busca de indicios de ECP no específico, turbidez del medio o cambio en
el pH. Se congela y descongela el cultivo tres veces, se recoge la suspensión y se centrifuga a 600 g durante
20 minutos. Puede requerirse un segundo pase para producir una cantidad de virus suficiente para obtener un
lote productivo (para producir suficiente cantidad para 106 dosis se requiere la producción de cinco frascos de
175 cm2).
Se repite el procedimiento y el producto obtenido de cada uno de los frascos numerados por separado se mezcla
también por separado con un volumen igual de hidrolizado estéril de lactoalbúmina al 5% frío y sacarosa al 10%,
y se transfiere a frascos numerados por separado para su conservación a –20°C. Antes se toman 0,2 ml de cada
frasco para un control de esterilidad, y una muestra adicional de 0,2 ml para la titulación del virus. Se toman
mezclas de 2 ml formadas por las muestras de 0,2 ml tomadas de los diez frascos. Debe conservarse un registro
escrito de todos los procedimientos para todos los lotes de vacunas.
Las vacunas inactivadas se producen normalmente a partir de cepas de campo de capripoxvirus sin atenuar, que
han crecido en cultivos de tejidos como se ha descrito anteriormente, inactivadas con formaldehído al 0,03%, y
mezcladas con un volumen igual de alhidrogel como adyuvante. Ya no se considera adecuado el formaldehído
para la inactivación de otras vacunas víricas debido a que su modo de acción no puede garantizar que sea
totalmente eficaz para la inactivación de todos los virus vivos. Este extremo no ha sido completamente
investigado para capripoxvirus.
3.
Control durante el proceso
Células: Las células se obtendrán a partir de testículo o riñón de un cordero joven y sano de un rebaño libre de
prurigo lumbar de una raza de ovejas lanares. Las células deben observarse durante el cultivo en busca de
pruebas de efecto citopático y de células con morfología normal (predominantemente fibroblásticas).
Normalmente se pueden llevar a cabo con éxito hasta diez pases de estas células. Cuando estas se utilicen para
la producción de vacunas, se realizarán paralelamente cultivos control sin infectar, y se mantendrán al menos
durante un pase más para su posterior observación. Se revisarán para determinar la presencia de cepas de virus
no citopáticos de la diarrea vírica bovina o de la enfermedad de la frontera mediante técnicas de
inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa. Si resulta posible, se hará una preparación de células y una criba
antes de la producción de la vacuna, y se guardará un stock en DMSO estéril (dimetilsulfóxido) en nitrógeno
líquido (alícuotas de 1–2 ml conteniendo 20 × 106 células/ml). El suero utilizado en el medio de crecimiento debe
estar libre de anticuerpos contra capripoxvirus o de contaminación con pestivirus.
Virus: El virus de inóculo y la vacuna final deben titularse en tubos de cultivos celulares o en placas de
microtitulación. Las muestras de vacunas deben examinarse para la presencia de virus ajenos, incluyendo cepas
de pestivirus citopáticas y no citopáticas, y deben mezclarse con suero inmune contra capripoxvirus con un título
alto que haya dado resultado negativo con relación a los anticuerpos contra pestivirus, con el fin de impedir que
el virus vacunal mismo interfiera con la prueba. El material de la vacuna puede mantenerse a –20°C hasta que se
completen todas las pruebas de esterilidad y de titulación, y entonces se liofilizará en alícuotas de 1 ml en viales
suficientes para 100 dosis. El producto vacunal diluido con hidrolizado de lactoalbúmina y sacarosa tendrá un
título mínimo de log10 4,5 DICC50 por mililitro después de la liofilización, equivalente a una dosis de campo de
log10 2,5 DICC50. Se lleva a cabo una titulación posterior en cinco viales de la preparación liofilizada, elegidos al
azar para confirmar el título.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas para determinar la esterilidad y la ausencia de contaminación de los materiales biológicos
pueden encontrarse en el capítulo 1.1.9.
b)
Inocuidad y eficacia
En una unidad animal de nivel de contención alto, se confinan cuatro ovejas y cuatro cabras de sensibilidad
conocida a los capripoxvirus, y se recogen muestras de suero. Se reconstituyen cinco viales elegidos al
azar de la vacuna liofilizada en 1 ml de PSB estéril cada uno, y se mezclan. Se inoculan por vía
intradérmica una oveja y una cabra con 0,2 ml de la vacuna concentrada. La vacuna restante se diluye
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Capítulo 2.7.14. — Viruela ovina y viruela caprina
20 veces con PBS estéril y se inoculan dos ovejas y dos cabras subcutáneamente con 0,2 ml – la dosis de
campo recomendada. Los animales control son la oveja y la cabra restantes. Los animales se examinan
clínicamente a diario y se registra su temperatura rectal. Al cabo de 21 días después de la vacunación, se
toman nuevas muestras de sangre a los ocho animales y se ensayan mediante inoculación intradérmica con
una cepa virulenta conocida de capripoxvirus. Se anota la respuesta clínica durante los 14 días siguientes.
Los animales control desarrollarán los síntomas típicos de la viruela caprina, mientras que no deberá haber
reacción local o sistémica en los vacunados, excepto una reacción de hipersensibilidad tardía, que
desaparecerá a los 4 días. Se tomarán nuevas muestras de suero 30 días después de la vacunación. Las
muestras de suero del día 21 se examinan para observar si se produce seroconversión en cuanto a las
enfermedades víricas seleccionadas que podrían haber contaminado la vacuna, y las muestras del día 0 y
30 se comparan para confirmar la ausencia de anticuerpos contra pestivirus.
Se prueba también la vacuna totalmente reconstituida en ratones y cobayas. Se inoculan dos cobayas con
0,5 ml por vía intramuscular en la pata trasera, y dos cobayas y seis ratones intraperitonealmente con
0,5 ml y 0,1 ml respectivamente. Como controles sin inocular se conservan dos cobayas y cuatro ratones.
Los animales se observan durante tres semanas, se sacrifican de forma humanitaria y se lleva acabo un
examen post mórtem. No deberá haber evidencia de patología debido a la vacuna.
c)
Pruebas de potencia
Es suficiente con menos de 1 DICC50 de la cepa 0240 para inmunizar a una oveja o una cabra. Sin
embargo, deben realizarse pruebas de potencia para otras cepas de capripoxvirus si no se conoce la dosis
mínima inmunizante. Esto se lleva a cabo mediante la comparación del título de un virus de prueba virulento
y el de los animales control por inoculación en los costados de los animales vacunados. Después de la
vacunación, se afeita la lana o el pelo del costado de al menos tres animales y de tres controles. Se
preparan diluciones logarítmicas decimales del virus prueba en PBS estéril, y se inoculan por vía
intradérmica seis de estas diluciones (0,1 ml por inóculo) a lo largo de la longitud del flanco; inoculando
adicionalmente cuatro réplicas de cada dilución verticalmente de arriba hacia abajo también en el flanco. Es
posible que se desarrolle una inflamación edematosa en los 24 sitios de inoculación en los animales de
control, aunque preferiblemente habrá poca reacción o ninguna en los cuatro sitios de los inóculos más
diluidos. Dentro de las 24 horas los animales vacunados desarrollarán una reacción de hipersensibilidad
inicial en los puntos de inoculación que disminuirá rápidamente. Pueden desarrollarse pequeñas zonas de
necrosis en el punto de inoculación del virus problema más concentrado. La mácula/pápula se mide entre 8
y 10 días después del desafío. El título del virus problema se calcula para los animales vacunados y para
los animales de control; se toma como evidencia de protección una diferencia en el título logarítmico >log10
2,5.
d)
Duración de la inmunidad
La inmunidad de las ovejas y de las cabras a los virus de campo virulentos después de la vacunación con la
cepa 0240 dura más de 1 año, y la protección contra la infección generalizada después de la vacunación
intradérmica dura al menos tres años, y es eficaz durante toda la vida. La duración de la inmunidad
producida por otras cepas vacunales se establecerá en las ovejas y en las cabras mediante la realización
de ensayos controlados en unas condiciones en las que no haya posibilidad de que las cepas de campo de
capripoxvirus interfieran los resultados.
Las vacunas inactivadas proporcionan una inmunidad de menos de un año y, por las razones expuestas al
comienzo de esta sección, no confieren inmunidad a la forma de capripoxvirus normalmente asociada con
la transmisión natural.
e)
Estabilidad
Las preparaciones de la vacuna de la viruela caprina adecuadamente liofilizadas, en particular aquéllas que
incluyen un protector como la sacarosa y el hidrolizado de lactoalbúmina son estables más de 25 años
cuando se guardan a –20°C, y 2–4 años si se hace a 4°C. Hay pruebas de que son estables a temperaturas
más altas, pero no se tiene constancia de experimentos controlados a largo plazo.
Las vacunas inactivadas deben conservarse a 4°C, y su período de validez está normalmente fijado en
1 año.
f)
Conservantes
Aparte de un protector, como la sacarosa y el hidrolizado de lactoalbúmina, no se requieren conservantes
para la preparación del liofilizado.
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Capítulo 2.7.14. — Viruela ovina y viruela caprina
g)
Precauciones (riesgos)
No existen precauciones, aparte de las descritas anteriormente, en relación con la esterilidad y la ausencia
de agentes extraños. La cepa vacunal 0240 no se empleará en razas bovinas de Bos taurus.
El capripoxvirus no infecta a los humanos.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Las pruebas de inocuidad deben llevarse a cabo sobre el producto final de cada lote, como se describe en
la sección C.4.b.
b)
Potencia
Una vez que se haya determinado la potencia de una cepa concreta que se esté utilizando para la
producción de vacunas, en relación con la dosis mínima que se requiere para proporcionar inmunidad, no
es necesario repetir la prueba de potencia sobre el producto final de cada lote, si se ha determinado el título
del virus.
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* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la viruela ovina y la viruela caprina (véase el cuadro de la
parte 3 de este Manual de animales terrestres o consúltese la lista más actualizada en la página web de la OIE:
www.oie.int).
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