Biofísica de canales iónicos Los sensores de la vida
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Biofísica de canales iónicos Los sensores de la vida Antonio Alcaraz Laboratorio de Biofísica Molecular Universitat Jaume I de Castellón 2 ÍNDICE Canales iónicos como Biosensores Canales iónicos • Introducción a la Biofísica • Canales iónicos: Qué son y cómo se estudian • Caracterización de canales iónicos anchos: el poro bacterial OmpF poro bacterial OmpF • Canales iónicos como Biosensores 3 BIOFÍSICA Física Biología Bi fí i Biofísica Química Estructura Estructura molecular Función fisiológica •Intenta entender sistemas biomoleculares y explicar la función biológica en términos de estructura molecular, organización estructural, y comportamiento dinámico en los diversos niveles de complejidad 4 BIOFÍSICA Biofísica: Diversidad y complejidad Biofísica: Diversidad y complejidad ‐10 •iones (~ 0 1 nm 10 •iones (~ 0.1 nm = 10 m) ‐9 • pequeños ácidos grasos y azúcares (~ 1 nm = 10 m) Macromoléculas: proteínas, polisacaridos, etc (5 proteínas polisacaridos etc (5‐10 10 nm) nm) •Macromoléculas: •almidones (> 1000 nm) •moléculas de ADN: más de 10.000.000 nm = 1 cm de largo, pero sólo 2 nm de ancho Watson, JD and Crick, FHC Molecular Structure of Nucleic Acids Nature, April 25, 1953 5 BIOFÍSICA Biofísica: Diversidad y complejidad Biofísica: Diversidad y complejidad Gran número de sistemas con un comportamiento dinámico 6 •¿Qué podemos medir, calcular, modelizar o representar que sea útil a los biólogos o médicos? los biólogos o médicos? •¿Qué ¿Qué tipo de preguntas se tipo de preguntas se hace la biofísica? 7 BIOFÍSICA •¿Son la física y la biología mundos tan separados? mundos tan separados? Electrofisiología: Un nexo entre Física y Biología Experimento de Galvani Pila de Volta 8 BIOFÍSICA FÍSICA, BIOLOGÍA Y MEDICINA: Una larga relación histórica Medicina Estática. Elasticidad y resistencia de materiales Ortopedia Di á i Dinámica M i i t d l Movimiento del corazón ó Dinámica de fluidos Presión sanguínea, sistema vascular Tensión superficial Tensión superficial Acción capilar Acción capilar Sonido y acústica Estetoscopio, ultrasonidos, microscopio acústico Electricidad Bioelectricidad, transporte de iones en membranas M Magnetismo ti R Resonancia magnética i éti Luz y óptica Microscopía con luz, terápia con laser, fibra óptica p Calor y Termodinámica Balance y transferencia de calor Teoría cinética y Mecánica Estadística Teoría cinética y Mecánica Estadística Movimiento Browniano, ósmosis, difusión de gases 9 COR RRELACIO ON FÍSIC CA‐MED DICINA Física Medicina Física Atómica y Espectroscopía "Chemical shift" in NMR imaging, lasers Física Molecular Microscopía electrónica, estructura proteínas Rayos UV e IR Dermatología, Tratamiento de la piel Rayos X Radiología, tomografía Mecánica Cuántica Microscopio de difracción de electrones Relatividad Visualización por Radiación Sincrotrón Cristalografía Estructura de proteínas Física del Estado Sólido y semiconductores í i d l d ólid i d Bioinformática, gammagrafía i i f ái fí Física Nuclear Radioisótopos, medicina nuclear, radioterapia Radioactividad Tomografía por emisión de positrones (PET) Tomografía por emisión de positrones (PET) Partículas elementales Terapia con Piones Aceleradores, ciclotrones, etc. Aceleradores, ciclotrones, etc. Tumores, enfermedad de Hodgkin Tumores, enfermedad de Hodgkin Astronomía y Astrofísica Helio, tratamiento de asma (obsoleto) 10 COR RRELACIO ON FÍSIC CA‐MED DICINA Física BIOFÍSICA FÍSICA, BIOLOGÍA Y MEDICINA ¿Sólo aplicaciones ? ¿Y las explicaciones? Hermann von Helmholtz ( (1821‐1894) ) Vitalismo Biofísica W. Nernst, M. Planck, A.V. Hill, B. Katz, D. Goldman, A. L. Hodgkin, A. F. Huxley E. Neher, B. Sackman, F. Crick, J. D. Watson, R. Feynman, etc. Físicos de primer nivel se han interesado por la Biología 11 “Tres de las cuatro fuerzas conocidas son irrelevantes para la mayoría de procesos esenciales de la biología celular. La cuarta (fuerza electrostática) ha sido ignorada por la mayoría de biólogos hasta hace bien poco” SS. McLaughlin. The electrostatic properties of membranes McLaughlin The electrostatic properties of membranes Annu. Rev. Biophys. Chem. 1989. 18: 113 ‐ 136 “La deducción matemática casi no se ha 50 m aproximadamente utilizado en biología. La razón no ha sido que el sistema sea tan simple que pueda ser explicado sin matemáticas, sino todo lo contrario. Los sistemas biológicos son demasiado complicados it bi ló i d i d li d para ser accesibles a un tratamiento matemático completo” matemático completo E. Schrödinger. What is life? 1944 12 BIOFÍSICA FÍSICA, BIOLOGÍA Y MEDICINA Biofísica – Estructura de Proteinas •¿Cómo es posible que los polímeros lineales de sólo 20 aminoácidos diferentes se puedan plegar en proteínas con estructuras tridimensionales precisas y funciones biológicas específicas? Insulina Hemoglobina PTPN22 “House’s protein” 13 BIOFÍSICA ¿Qué tipo de preguntas se hace la Biofísica? BIOFÍSICA Biofísica ‐ Neurofisiología •¿Cómo se consigue que ondas sonoras, fotones, olores, sabores, tacto, sean d t t d detectados por un cierto órgano y i t ó convertidos en impulsos eléctricos que proveen el cerebro de la información sobre el mundo externo? Biofísica ‐ Bioenergética •¿Cómo convierte una célula de un músculo la energía química de la hidrólisis de ATP en fuerza mecánica y movimiento? 14 •¿Cómo consigue la membrana celular, una barrera de lípido impermeable a moléculas solubles en agua, transportar selectivamente tales moléculas por su interior no polar? Moléculas anfipáticas Moléculas anfipáticas ΔG ci βi = = e RT ~ 10-30 ci V. A. Parsegian. Nature 221 (1969) 844‐846 15 BIOFÍSICA Biofísica: Mecanismos de transporte Biofísica: Mecanismos de transporte aislados” que permiten que los iones y otros solutos se muevan a través de membranas impermeables Constituyen la base molecular del sistema nervioso, regulan el transporte selectivo de iones y macromoléculas, comunican las células para formar t jid f i tejidos funcionales y pueden transportar toxinas letales l d t t t i l t l 16 CAN NALES IÓ ÓNICOS Canales iónicos : proteinas con pequeños “agujeros CAN NALES IÓ ÓNICOS 17 CAN NALES IÓ ÓNICOS 18 19 CAN NALES IÓ ÓNICOS • canales activados por voltaje • canales activados por ligandos • canales mecanosensibles CAN NALES IÓ ÓNICOS 20 De las membranas biológicas a los sistemas modelo in vitro g Bicapas Soportadas Vesículas í l Bicapas Planas Bicapas Ancladas Picture: F. Giess 21 ELEC CTROFISSIOLOGÍA A Investigando la función: Model Systems ELEC CTROFISSIOLOGÍA A Método para formar bicapas planas de lípido MONTAL M M, MUELLER P FORMATION OF BIMOLECULAR MEMBRANES FROM LIPID MONOLAYERS AND A STUDY OF THEIR ELECTRICAL PROPERTIES PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA 69 (12): 3561-3566 1972 Times Cited: 1077 22 ELEC CTROFISSIOLOGÍA A 12 A Inserción de una única proteina: I ó ú ~ 1 pA = 10-12 Resolución de eventos a escala molecular !! Concentraciones típicas c = 10‐14 M 23 ELEC CTROFISSIOLOGÍA A Laboratorio de Biofísica Molecular de la Universitat Molecular de la Universitat Jaume I 24 esencialmente mediante técnicas de reconstitución Curvas I‐V Curvas I‐V Voltage Gating Selectividad 25 ELEC CTROFISSIOLOGÍA A La caracterización funcional de los canales iónicos se hace casi esencialmente mediante técnicas de reconstitución Transporte de Sustrato Análisis de ruido Cinética Análisis de ruido ‐ 26 ELEC CTROFISSIOLOGÍA A La caracterización funcional de los canales iónicos se hace casi CAN NAL Omp pF Estudio de un sistema modelo: el canal OmpF Canal para físicos: Poca relevancia fisiologica, pero… pero estructura conocida a 2.4 Å, poco selectivo, transporte multiiónico regulado por interacciones electrostáticas. Permite el uso de tratamientos contínuos Poisson‐Nernst‐Planck í P i N Pl k 27 CAN NAL Omp pF Outer membrane protein F p in Escherichia Coli Reconstituido en membranas lipídicas Reconstituido en membranas lipídicas OmpF forma canales triméricos Cada monómero tiene forma de reloj de arena, y es débilmente selectivo a cationes a pH neutro 28 CAN NAL Omp pF Ionización de Residuos : Ionización de Residuos : ¿Qué residuos estan cargados a un pH dado? pKa pKa tabulados para disolución libre (1) Entorno dieléctrico (2) Interaction entre cargas p parciales y entre resíduos y diferentes Los cálculos involucran a 1020 resíduos, de los cuales 302 son ionizables 29 -42 Alcaraz, M. Aguilella‐Arzo, E. Nestorovich, V.M. Aguilella, S. M. Bezrukov. Biophysical Journal 87 (2004) 943 CAN NAL Omp pF + 177 30 - 129 Alcaraz, M. Aguilella‐Arzo, E. Nestorovich, V.M. Aguilella, S. M. Bezrukov. Biophysical Journal 87 (2004) 943 CAN NAL Omp pF + 159 31 Débil selectividad de OmpF • El proceso de permeacion involucra un elevado número de iones correlacionados (típicamente unos 20 a 1 M KCl) • La escala temporal necesaria para obtener promedios significativos de las propiedades iónicas en el poro reduce el número de posibles cálculos Im & Roux, Journal of Molecular Biology 322 (2002) Tieleman & Berendsen, Biophysical Journal 74(1998) Danelon, Winterhalter et al. Biophysical Chemistry 104 (2003) 32 CAN NAL Omp pF • Dificultades Computationales Primera aproximación: modelos de BAJA resolución Un modelo simple contínuo : ecuaciones Poisson‐Nernst‐Planck e J i Di ci ( z ) qi ci ( z ) ( z ) kT Nernst‐Planck s ( z ) f ( z ) eN A qi ci ( z ) Poisson i e ci ( z ) cibulk exp qi ( z ) V bulk kT Equilibrio Donnan en las interfases 33 CAN NAL Omp pF •Modelo Modelo teórico que permita conocer el comportamiento del sistema en teórico que permita conocer el comportamiento del sistema en diferentes condiciones de concentración, pH, tipo de electrolito, etc pH 12 Measured reversal potential -0.4 04 20 -Erev (mV)) -0.2 0 0.0 0.2 -20 0.4 (calculated) charge -40 2 4 6 8 10 overall e effective ch harge (M) 40 pH 7 CAN NAL Omp pF pH 2 12 pH M. Aguilella‐Arzo, J. J. García‐Celma, J. Cervera, A. Alcaraz, V.M. Aguilella. Bioelectrochemistry, 70 (2007) 320 34 Ccis / Ctrans = 3 25 Ccis / Ctrans = 1.5 40 20 30 |Erev| (mV) -Errev (mV) CAN NAL Omp pF Ccis / Ctrans = 10 50 20 15 10 10 0 5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 1 / 0.1 M KCl 0.1 / 1 M KCl 0 5 KCl cis concentration (M) 10 15 20 25 30 Concentration Ratio 10 40 1 M KCl 1,0 0.1 M KCl 0,5 0,0 0,2 0 anion-s selective |Erev| (mV) 1 0,5 catiion-selective 20 2 nA Conductance e (nS) 5 -20 -0,5 -1,0 mV -200 -100 -200 0 100 200 -100 0 100 200 0 1 M cis / 0.1 M trans 0.1 M cis / 1 M trans 2 Applied voltage (mV) M. Aguilella‐Arzo, J. J. García‐Celma, J. Cervera, A. Alcaraz, V.M. Aguilella. Bioelectrochemistry, 70 (2007) 320 4 6 8 10 pH 35 Reversal Po otential (mV) 40 MgCl2 30 20 Selectivo a aniones Selectivo a aniones CaCl2 10 0 -10 NaCl Selectivo a cationes -20 -30 30 KCl -40 5 10 15 20 Concentration Ratio ¿Inversión de la carga? Alcaraz, A., E. Nestorovich, M.L. López, E. García‐Giménez, S.M. Bezrukov and V.M. Aguilella. Biophysical Journal 2009. 96, 56‐66. 36 CAN NAL Omp pF No solo caracterización biofísica ‐> “Hot topics” en Física Doble capa eléctrica – Helmholtz, Gouy‐Chapman, Stern 37 CAN NAL Omp pF INVERSION DE LA CARGA Overcharging = Charge Reversal = Charge inversion cargas interfaciales atraen contraiones en exceso de su propia carga nominal + _ + + + _ GOUY‐CHAPMAN _ _ + _ OVERCHARGING El objeto en su conjunto es neutro, pero la carga de los contraiones parece ser mayor que la propia carga de la supercie 38 CAN NAL Omp pF INVERSION DE LA CARGA Overcharging = Charge Reversal = Charge inversion Descrito yya en 1940,, p pero despues p en: • vesículas lípido • coloides •monocapas Langmuir • membranas nanofiltracion • polielectrolites flexibles • nanoporos de estado sólido • nanoporos poliméricos •Canales iónicos ?? Lyklema, J. 2006. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. 291:3‐12 Grosberg, A. Yu., T. T. Nguyen, and B. I. Shklovskii. 2002. Review of Modern Physics 74:329‐345. Faraudo, J., A. Travesset. 2007. J. Phys. Chem. C 111:987‐994. 39 CAN NAL Omp pF INVERSION DE LA CARGA 1 nm Asp ‐ D Glu ‐ E b R132 D113 R82 Cys ‐ C D113R R42 D113C E117R E117C E117 OmpF-WT OmpF-CC OmpF-RR *Charge: Net charge compared to WT OmpF Charge* g Erev (mV) in 1/0 1 M KCl in 1/0.1 M KCl Erev (mV) in 1/0 1 M CaCl2 in 1/0.1 M CaCl Selectivity In ersion Inversion WT OmpF 0 ‐25.4 ± 0.8 22.1 ± 0.7 Yes CC +2 ‐23.8 ± 0.8 30.1 ± 1.1 Yes CC‐MTSES 0 ‐50.1 ± 0.7 ‐ 6.7 ± 1.0 No RR +4 31.9 ± 1.0 35.4 ± 1.7 No Protein E.García‐Giménez et al. Physical Review E 81 (2010) 021912. 40 CAN NAL Omp pF a a= SATU URACIÓN N DIELÉCTTRICA DEEL AGUA εw = n 2 + a L bE , L x = coth x 1/ x E 7N 0 μ n 2 + 2 3 73 1/ 2 ε0 , 73 1/ 2 b= μ n2 + 2 6kT 2 Fc eV sinh V 0 kT M. Aguilella‐Arzo, A. Andrio, V.M. Aguilella and A. Alcaraz. Phys. Chem. Chem. Phys. 11 (2009) 358. h Ch Ch h (2009) 3 8 41 OTROS PROYYECTOS – Departamento de Bioquímica. p q Universidad Complutense de Madrid. análisis de las proteínas que forman parte del surfactante pulmonar. – Unidad de Biofísica del centro mixto Universidad del País Vasco‐ CSIC: formación de canales iónicos por proteínas apoptóticas de tipo í ói d i Bax. – Departamento de Microbiología. Departamento de Microbiología Universidad de Santiago de Compostela: Estudio conjunto del poro bacterial PorA/C1 de la poro bacterial PorA/C1 de la bacteria Neisseria Meningitidis. 42 Los canales iónicos juegan en biología un papel análogo al d l de los transistores en la electrónica, usando unos principios i l l ó i d i i i físicos similares cumple funciones de amplificador, oscilador, conmutador o rectificador conmutador o rectificador 43 BIOSSENSOR RES Canales iónicos: los sensores de la vida Canales iónicos: los sensores de la vida Detección de Detección de partículas 5 – 15 Å 44 BIOSSENSOR RES Molecular Coulter counter BIOSSENSOR RES Detección de iones metálicos, moleculas orgánica e incluso biomoléculas que son demasiado grandes para entrar en el poro 45 BIOSSENSOR RES 46 University of Illionis at UC Electrophoretically driven Electrophoretically‐driven translocation of a 58‐ nucleotide DNA strand through the transmembrane pore of alpha‐hemolysin. 47 BIOSSENSOR RES Al k ij Ak i Aleksij Aksimentiev and Klaus Schulten ti d Kl S h lt BIOSSENSOR RES Ion channels as biosensors 48 moléculas sintéticas similares 49 BIOSSENSOR RES Los canales iónicos pueden diferenciar entre metabolitos naturales y BIOSSENSOR RES Translocacion Antibióticos 50 51 BIOSSENSOR RES Diodo Líquido q biológico g controlado mediante el pH p 40 0.7 Reverssal potential (mV V) Cation tra ansport number, t+ 0.8 0.6 0.5 0.4 20 10 0.3 0 02 0.2 40 0.1 1 30 ccis/ctrans 20 RP (mV) 30 0.1 10 1 10 100 ccis/ctrans pH 2/7 ++ - - 10 0 -10 pH 2 pH 3/7 -20 pH 12 -30 -40 0 01 0,01 01 0,1 1 10 100 ccis/ctrans E. García‐Giménez, A. Alcaraz, V.M. Aguilella and P. Ramírez. J. Membr. Sci. 331 (2009) 137. 52 BIOSSENSOR RES Diodo Líquido q biológico g con selectividad direccional BIOSSENSOR RES 53 NAN NOPORO OS 54 recoge conocimientos de la Biología, Química y Física. • Complejidad y Diversidad: de la estructura atómica a la función biológica •Instrumentación: Desarrollo de técnicas experimentales pioneras •Modelización: Necesidad de combinar diferentes niveles de resolución •Aplicación: Los canales iónicos se usan como “biosensores” para ,p q ,p y p detectar iones, pequeñas moléculas, proteinas y diversos polinucleotidos •Oportunidad: canales iónicos y nanotecnología 55 CON NCLUSIO ONES • Interdisciplinariedad: La Biofísica es una disciplina amplia y diversa, que AGR AG RADECIM GRADEC MIENTOS IMIENTO OS S Laboratorio de Biofísica Molecular. Universitat Jaume I, Castellón Vicente M. Aguilella Elena García‐Giménez M. Lidon López M. Lidon López Andreu Andrio Marcel Aguilella Arzo María Queralt‐Martín Laboratory of Physical and Structural Biology, NICHD. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland. USA Sergey M. Bezrukov Ekaterina Nestorovich Departamento de Termodinámica Universitat de Valencia Departamento de Termodinámica. Universitat de Valencia Salvador Mafé Javier Cervera José A. Manzanares Departamento de Física Aplicada. Universitat Politècnica de Valencia Patricio Ramírez 56 AGR GR RRUPO BI ADECIM MIENTOS OFÍSICA A CASTEL S LLÓN http //www gm uji es/ http://www.gm.uji.es/ 57
