Introducción:

QUÍMICA BIOLÓGICA
TRABAJO DE LABORATORIO Nº 1:
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
DOCENTES: Dante Maugeri, Griselda N. Noé y Valeria Conforte
Introducción:
Descripción de los métodos más utilizados:
1) Espectrofotometría UV:
a) Absorbancia a 280 nm
La mayor parte de las proteínas poseen un pico de absorción máxima a 280 nm. Los
grupos responsables de tal característica son los aminoácidos aromáticos (Tirosina y
Triptofano).
Las proteínas poseen coeficientes de extinción molar (E280nm) que puede variar de
acuerdo a su composición aminoacídica entre 0,4-1,5. Como aproximación se puede
considerar que una unidad de absorbancia se corresponde con una concentración (C)
de 1mg/ml de proteinas:
Abs280nm . E280nm = C, si
E280nm se considera = 1
Abs280nm = 1 mg/ml
Si la solución de proteínas contiene DNA y/o RNA se introduce un error en la
medición, dado que estos absorben a 280 nm.
b)
Absorbancia a 205-210 nm
A dicha longitud de onda absorbe la unión peptídica, por lo tanto es un método más
sensible y no dependiente de los aminoácidos que componen la proteína en estudio.
La limitación de esta técnica esta dada por que la mayoría de los buffers utilizados
también absorben a esa longitud de onda.
1
2)
Método de Lowry:
La técnica se basa en la reducción de una mezcla de ácidos que forman el
reactivo cromógeno de Folin-Ciocalteau por la oxidación de los aminoácidos
aromáticos de las proteínas.
Se utiliza cobre como catalizador de la reacción ya que este último forma un
quelato con la estructura peptídica que facilita la transferencia de electrones a la mezcla
cromogénica de ácidos, produciendo una o más especies reducidas las cuales tienen un
característico color azul con una λmáx 745-750 ηm y una λmin a 405 ηm.
Al producirse dicha reacción hay un cambio en el color de la muestra que puede
ser cuantificado determinando la absorbancia a 660nm. Dentro de determinados rangos
de concentración de proteínas existe una relación lineal entre C y la Abs660nm. A
concentraciones altas de proteínas la linealidad se pierde y por lo tanto este método no
será adecuado para determinar la C real.
El rango adecuado es de entre 5 a 100 microgramos de proteína.
Existe una amplia lista de sustancias (como buffers, detergentes, lípidos, etc.)
que interfieren con este ensayo y por lo tanto afectan la determinación de la C real. La
solución a este problema se consigue diluyendo la muestra, y asi la cantidad de
interferente o por precipitación de las proteínas y resuspensión en un buffer sin
interferentes.
3)
Método de Biuret:
El principio de este ensayo es similar al de Lowry, siendo un método más rápido
y menos engorroso. Bajo condiciones alcalinas, sustancias conteniendo dos o más
uniones peptídicas forman un complejo púrpura con sales de cobre. No se utiliza en este
ensayo el reactivo de Folin-Ciocalteau. Tiene muy pocos agentes interferentes (uno de
ellos es el sulfato de amonio). Es un método menos sensible que el de Lowry por lo que
requiere mayor cantidad de muestra.
El rango adecuado usando 1 ml final es de 0,1 a 1 mg de proteínas.
4)
Método de Bradford:
método por unión de colorantes
En condiciones adecuadas los grupos ácidos o básicos de las proteínas pueden
interaccionar con grupos orgánicos de determinados colorantes para dar lugar a
precipitados con un color característico.
Para el ensayo de Bradford se utiliza el colorante Coomassie Brillant Blue G250. Se basa en la conversión de la forma leuco del colorante (marrón-naranja) a una de
2
color intensamente azul cuando los grupos aniónicos del colorante interaccionan con los
grupos amino de las proteínas.
Dicha reacción se mide por absorbancia a 595nm y también existe una relación
lineal dentro de determinadas concentraciones de proteínas.
Este método es muy rápido y sensible y se puede trabajar en un rango de 20 a 140
microgramos de proteína para el ensayo estándar y de 1 a 50 microgramos para el
microensayo.
Materiales y Métodos:
• Espectrofotómetro y cubetas adecuadas
• Estándar de proteínas con concentración conocida: 1mg/ml de Seroalbúmina bovina
(BSA)
• Muestras de concentración desconocida (muestras incógnitas)
• Ensayo de Biuret:
La fórmula del reactivo de Biuret es la siguiente:
2,25g de tartrato de sodio y potasio (PM 282,22); 0,75g de sulfato cúprico x 5 H2O (PM
249,68); 1,25g de ioduro de potasio (PM 166,0), todo disuelto en este orden en 100 ml
de NaOH 0,2M. Llevar a volumen a 250 ml con agua destilada.
Método:
Añadir a 0,1 ml de muestra 0,9 ml de reactivo. Mezclar y dejar a temperatura ambiente
20 minutos. Leer a 550 nm e interpolar en una curva estándar.
• Ensayo de Bradford:
Reactivo de Bradford: 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 se disuelven en 50
ml de etanol y 100 ml de ácido fosfórico al 85%. Se ajusta el volumen a 1 litro con agua
y se filtra. Estable por 2 meses.
Microensayo: las muestras se llevan a 800 microlitros con agua, se agrega 0,2 ml de
reactivo de Bradford, se agita y se deja 5 min a temp ambiente.
Leer a 595 nm e interpolar en una curva estándar.
3
TRABAJO PRÁCTICO
Objetivos:
Determinar la concentración de proteínas presentes en distintas muestras
mediante el método de Biuret y el de Bradford utilizando curvas de calibración
adecuadas. Caracterizar aminoácidos presentes en una muestra mediante una
cromatografía radial en papel.
1º Parte:
Curva estándar y muestra incógnita utilizando el ensayo de Biuret:
A) Preparación de la curva estándar:
1) Se parte de una solución de albúmina bovina de concentración 10 mg/ml.
Calcular la cantidad que se debe añadir de esta solución tal que por tubo se tengan 0
(blanco), 2, 4, 6, 8 y 10 miligramos de proteína para realizar el ensayo según fue
explicado en materiales y métodos. La siguiente tabla sirve de guía:
mg de BSA
μl
0
0
2
4
6
8
10
(c.s.p = cantidad suficiente para)
H2O (μl)
1000
c.s.p 1000
c.s.p 1000
c.s.p 1000
c.s.p 1000
c.s.p 1000
Biuret (ml)
9
9
9
9
9
9
2) Mezclar e incubar 20 min a Tº amb.
3) Leer Abs a 660nm.
NOTA: Llevar a cero el espectrofotómetro con agua.
mg de BSA
Abs 550 nm
(corregida)
4
0
2
4
6
8
10
0
4) Graficar Absorbancia en función de mg de proteína (pendiente de la curva)
teniendo en cuenta solo los puntos que entran en el rango lineal. (¿Por qué ?).
B) Averiguar la concentración de la muestra incógnita:
Cada grupo recibirá una solución de proteínas de concentración desconocida.
Efectuar la determinación en simultáneo con la curva estándar e interpolar esos datos en
dicha curva para averiguar la concentración. Corregir por el factor de dilución si fuera
necesario.
2º Parte:
Curva estándar y muestra incógnita para el micro-ensayo de Bradford:
A) Preparación de la curva estándar:
Se realizará una curva estándar similar a la realizada para Biuret pero teniendo en
cuenta que el rango óptimo para el ensayo es diferente. Utilizar como guía la siguiente
tabla:
μg de BSA
0
2
4
7
10
25
μl
0
H2O (μl)
800
c.s.p 800
c.s.p 800
c.s.p 800
c.s.p 800
c.s.p 800
Bradford(μl)
200
200
200
200
200
200
Abs 595nm
Luego de agregar el reactivo de Bradford agitar e incubar a Tº amb 5’.
Leer Abs a 595nm
Graficar Absorbancia en función de μg de proteína, calcular la pendiente de la curva.
B) Averiguar la concentración de la muestra incógnita:
5
Realizar diluciones de la muestra y extrapolar esos datos en la curva estándar para
averiguar la concentración.
3º Parte:
Cromatografía radial de aminoácidos (en papel)
Varios factores son importantes en la separación de sustancias por cromatografía en
papel; entre ellos hay que citar la partición, la adsorción y en algunos casos, el intercambio
iónico. El tipo de fenómeno principal que promueve la separación es la partición continua
líquido-líquido entre la fase estacionaria adsorbida sobre el papel (agua) y el solvente (fase
móvil) que lo atraviesa movido por fuerzas de capilaridad. Pero el papel no es un soporte
totalmente inerte y debido a eso hay cierta intervención de los fenómenos de adsorción e
intercambio iónico en el proceso separativo.
El soluto se mueve en la dirección de flujo del solvente a una velocidad que está
determinada por su afinidad por la fase acuosa estacionaria o por la fase orgánica móvil no
polar. Además influyen en la velocidad de migración: el peso molecular, tipo de papel
empleado, tamaño y saturación de la cámara, temperatura, etc.
Se han ideado muchas técnicas para llevar a cabo la cromatografía en papel. La
cromatografía circular tiene muchas ventajas para el trabajo rutinario de laboratorio,
especialmente la simplicidad del aparato necesario, la velocidad de desarrollo y el poder
comparar al mismo tiempo distintas muestras. Con este propósito se han usado distintas
técnicas; en la que se usará en este T.P. se dispone el papel de filtro horizontalmente y de él
cuelga una especie de mecha que sirve como capilar para el solvente y que está conectada
con el centro del papel.
Placa de Petri
Disco de papel
Solvente
Mecha
Objetivo de la experiencia
Separar los componentes de una mezcla de aminoácidos por cromatografía radial
sobre papel.
Materiales y reactivos
1) Disco de papel Whatman N°1, de 12,5 cm de diámetro.
2) Caja de Petri
6
3) Mecha (hilo de algodón)
4) Solución de tirosina 0,05%
5) Solución de leucina 1,0%
6) Solución de arginina 1,0%
7) Solvente de desarrollo: butanol normal: NH3 28% (v/v):etanol 96° (10:4:3 v/v)
8) Micropipetas
9) Revelador: solución al 0,2% de ninhidrina en acetona.
Procedimiento
Determinar el centro del disco de papel y trazar un círculo de aproximadamente 2,5
cm de diámetro a partir del centro, usando lápiz de grafito. Con lápiz y regla dividir el
papel en cuadrantes.
Hacer un pequeño agujero o un corte en el centro del papel para insertar la mecha,
de unos 5 cm.
En el borde del disco escribir el nombre del operador y en cada cuadrante: Tyr, Leu,
Arg y mezcla.
1. Siembra
Usando una micropipeta limpia para cada solución tirar una línea con la misma a lo
largo de la circunferencia antes trazada ( o verter el contenido en su centro) con
aproximadamente 0,02 ml, de forma que a cada lado de las líneas que separan los
cuadrantes queden unos 0,5 cm sin solución. Dejar secar las aplicaciones.
2. Colocación del solvente
Preparar el solvente de desarrollo y colocar cantidad suficiente para que alcance en
el compartimiento inferior una altura aproximada de 1 cm.
3. Colocación del papel
Sobre la caja de Petri que contiene el solvente se apoya el papel de modo que la
mecha se sumerja en el solvente y se cierra la caja.
4. Desarrollo
El desarrollo se hace a temperatura ambiente hasta que el solvente llegue al borde
de la caja de Petri.
5. Secado del papel
Sacar el papel, marcar el frente del solvente y secar en estufa a 55-60°C.
6. Revelado
7
Se impregna el papel con la solución de revelador. Se deja secar al aire (bajo
campana) y luego en estufa a 55-60°C durante aproximadamente 15 minutos (hasta
aparición de las manchas).
Calcular los Rf a partir del centro de cada zona. Comparar los de la muestra incógnita
con los patrones.
Rf = distancia desde el centro de la mancha al origen
distancia desde el frente del solvente al origen
Informe:
•
•
•
•
•
Realizar una breve descripción de cómo se llevó a cabo el TP, mostrar las curvas
estándares y explicar cuáles fueron los puntos que se consideraron al trazar la
recta y averiguar su pendiente.
Averiguar la concentración de proteínas presente en las muestras incógnitas.
Detallar brevemente conclusiones respecto a la especificidad, simplicidad,
linealidad, sensibilidad y limitaciones de los métodos desarrollados.
Determinar el Rf de las soluciones estándares y de las muestras problemas.
Discutir cualquier dificultad o resultado inesperado que se pudo haber
presentado.
Lecturas recomendadas:
Bradford, M.M. (1976) Analytical Biochem. 72, 248-254.
Gornall, A.G.; Bardawill, C.J.; David, M.M. (1949) J.Biol. Chem. 177, 751-766.
Peterson, G.L. (1979) Analytical Biochem. 100, 201-220.
8