PRECIPITACIÓN

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UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFÍA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR Y FARMACOLOGÍA
PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
2009
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Profesor: Rocío Inga Peña
INTRODUCCION
Una de las técnicas más precisas para la determinación de la concentración de proteínas en solución
es mediante espectrofotometría a longitud de onda de 280nm (luz ultravioleta) utilizando cubetas de
cuarzo.
Por otro lado, existen varios métodos colorimétricos que también permiten medir la concentración de
proteínas en solución. La elección del método depende de la naturaleza de la proteína, de otros
componentes presentes en la muestra problema, de la rapidez y sensibilidad deseada.
OBJETIVO: Determinar la concentración de proteínas en muestras problema mediante tres métodos
colorimétricos que frecuentemente se utilizan para medir concentraciones de proteínas: Biuret, Lowry
y Bradford,
Método Biuret
Compuestos que tienen dos o más uniones peptídicas (péptidos y proteínas) al reaccionar
con el reactivo de Biuret (sulfato de cobre alcalino) se forma un complejo de color púrpura. Este
color es el resultado de la coordinación de los átomos de nitrógeno del enlace peptídico con el Cu+2.
La intensidad del color y la cantidad de producto depende de la concentración de proteínas. Este
método es reproducible pero poco sensible. El rango de sensibilidad de este método es de 0,25 –
200 mg de proteínas por mL de solución, y el tiempo que toma realizar la prueba es de aprox 20-30
min.
Método de Lowry
Es un método más sensible que el de Biuret pudiendo detectar muy bajas concentraciones (hasta
5 ug). El principio de la detección es el mismo que el de Biuret con la diferencia en que se utiliza un
segundo reactivo: la solución de Folin– Ciocalteau (fosfomolíbdato-fosfotungstato) en un medio
cúprico alcalino, el cual se le agrega para incrementar la intensidad del color. Este incremento en la
intensidad se debe a la reducción del reactivo Folin– Ciocalteau por los residuos de tirosina y
triptofano presentes en las proteínas. El producto coloreado de la reacción es leída en un
espectofotómetro a 750 nm.
Método de Bradford
Es un método basado en el uso del colorante Azul brillante de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue
G-250), el cual se une a las proteínas en una solución ácida causando un cambio en la longitud de
onda de absorción máxima del colorante, de 465nm a 595nm. Para la determinación de la
concentración de proteínas se realiza la lectura a 595nm.
Este método presenta varias ventajas :
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- Rapidez, ya que la reacción es bastante rápida (menos de 5 minutos) y el producto se mantiene
estable hasta por 1 hora.
- Alta sensibilidad, ya que se puede detectar cantidad de proteínas de 1 a 20 ug.
- Pocas sustancias que interfieren con la reacción: detergentes Tritón-X100 y Dodecil sulfato de
sodio (SDS).
Su principal desventaja (al igual que Lowry) es la variación significativa entre diferentes proteínas.
El método de Bradford es el actualmente uno de los más utilizados en los laboratorios.
PROCEDIMIENTO:
Para cada uno de los métodos se preparará una curva estándar utilizando la solución Stock del
Albúmina sérica bovina (BSA) siguiendo los volúmenes determinados en cada una de las tablas.
NOTA : Las soluciones stock de BSA para el método de Biuret es de mayor concentración
que la solución stock que se utilizará para los métodos de Lowry y Bradford.
A. Método de Biuret:
Concentración de BSA Stock = 28mg/ml.
1.- Preparar 9 tubos de ensayo según la tabla a continuación:
Blanco
Curva estándar
M1
M2
1
2
3
4
5
6
100
90
80
60
40
20
0
50
50
Std 28mg/ml (l)
0
10
20
40
60
80
100
0
0
Muestra (l)
0
0
0
0
0
0
0
50
50
Agua (l)
2- Agregar 1,5 ml del reactivo de Biuret y mezclar por agitación.
3- Incubar por 10 minutos a 37ºC.
4- Leer en el espectrofotómetro a 540 nm.
5- Anotar los resultados y graficar.
B. Método de Bradford:
Concentración de BSA Stock = 1 mg/ml.
1.- Preparar 8 tubos eppendorf según la tabla a continuación:
Blanco
Curva estándar
Muestra X
1
2
3
4
5
6
1000
995
990
980
960
920
900
950
Std 1mg/ml (l)
0
5
10
20
40
80
100
0
Muestra (l)
0
0
0
0
0
0
0
50
Agua (l)
2- Colocar en un tubo de ensayo 800 uL de cada mezcla.
3- Adicionar 200 uL del Reactivo de Bradford concentrado, mezclar por agitación.
4- Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos.
5- Leer en el espectrofotómetro a 595nm.
6- Anotar los resultados y graficar.
3
C. Método de Lowry:
Concentración de BSA Stock = 1 mg/ml.
1.- Preparar 9 tubos de ensayo según la tabla a continuación:
Blanco
Curva estándar
M3
M4
1
2
3
4
5
6
168
158
148
128
88
48
8
68
68
Std 1mg/ml (l)
0
10
20
40
80
120
160
0
0
Muestra (l)
0
0
0
0
0
0
0
100
100
Agua (l)
2- En un frasco de vidrio color ambar prepare 16.5 ml de Reactivo 1:
Mezclar 50 volúmenes de Reactivo A (carbonato de sodio al 2%, NaOH 0.4%), mas 1 volumen de
Reactivo B (sulfato de cobre pentahidratado al 0.5%, tartrato sodio potasio tetrahidratado 1%).
3- Adicionar 1650 l del Reactivo 1 a cada uno de los 9 tubos.
4- Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos.
5- Agregar 165 l del Reactivo 2 (Fenol Folin-Ciocalteu).
6- Dejar reposar 10 min a temperatura ambiente.
7- Mezclar por agitación. Dejar reaccionar 30 minutos a temperatura ambiente.
8- Leer en el espectrofotómetro de 750 nm.
9- Anotar los resultados y graficar.
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es la concentración de proteína en la muestra problema?
2. Indicar diferencias o similitudes que pueda observar entre las curvas estándar realizadas con
cada método.
3. Los valores de concentración obtenidos para las muestras de suero representan a la
concentración de albúmina o a la concentración total de proteínas?
4. Con los ensayos realizados en la presente práctica, podría usted diferenciar la concentración de
Hemoglobina de Albúmina en suero? Propondría cambiar usted las longitudes de onda? Si___
No___ Por qué?
5. Podría asegurar usted que el valor obtenido para la concentración de proteínas en la muestra de
suero utilizada es real? Si___ No____ Por qué?
6. ¿Qué paso previo propondría usted para obtener un dato preciso de la concentración de
proteínas en suero?
7. (2 ptos) Usted ha realizado un experimento de cuantificación de proteínas, obteniendo los
resultados para la curva estándar que se muestran en el siguiente cuadro. Grafique la curva
estándar e indique cuál es el valor de la absorbancia que presentará una proteína problema que
se encuentra a una concentración de 35 mg/ml.
mg/ml BSA
0
10
20
40
60
proteína problema
Absorbancia
0
0.220
0.281
0.590
0.774
???