Enfermedades de almacenamiento de glucógeno

Utilidad del análisis de gota seca
en hiperCKemias
Dr. Cristóbal Colón Mejeras
Unidade de Diagnóstico e Tratamento das Enfermidades Conxénitas do Metabolismo
Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela
Prevalencia conocida en cribado neonatal
1978-2013. Un caso por cada x RN vivos
Patología
Hipotiroidismo Congénito (CH)
Fibrosis Quística (CF)
Fenilcetonuria (PKU)
Déficit Acil-CoA-deshidrogenasa cadena
media (MCAD)
Leucinosis (MSUD)
Acidemia Metilmalónica (MMA)
Acidemia Glutárica Tipo I (GA I)
Déficit de Biotinidasa (BIOT)
Galactosemia (Def. gal-1-P-uridiltransferasa GALT)
Prev.
Patología
2.472 Déficit 3-OH Acil-CoA Deshidrogenasa
cadena larga (LCHAD)
10.763
Acidemia propiónica (PA)
12.222 Déficit Acil-CoA-deshidrogenasa cadena
muy larga (VLCAD)
18.962
Tirosinemia tipo I (TYR I)
32.591
Citrulinemia (CIT)
40.260
Homocistinuria Clásica (HCY)
40.633
Deficiencia Primaria de Carnitina (CUD)
68.087 Déficit de 3-OH-3-Metilglutaril-CoA
Liasa (HMG)
68.442
Acidemia isovalérica (IVA)
Prev.
71.107
94.809
142.214
228.139
284.428
284.428
284.428
284.428
284.428
Polímeros ramificados de glucosa
• Son la vía más antigua de almacenamiento
universal de energía en las células y
probablemente se sitúe ya en los albores del
origen de la vida celular.
• Dos formas claramente diferenciadas:
– Glucógeno en animales.
– Almidón en plantas.
Glucógeno
• Es la principal vía de almacenamiento de
carbohidratos pero no llega al 1% de la
energía almacenada en nuestro organismo, ya
que ésta es la función del tejido adiposo.
• Sin embargo, es la principal fuente de energía
para los músculos.
• Y es crucial para la homeostasis, pues es
determinante para el balance glucémico.
Dónde se encuentra el glucógeno
• Hígado en donde puede
haber 400 g de
glucógeno
• Músculo esquelético con
1200 g de glucógeno
• Cerebro, en los astrocitos
• Pulmones fetales, en los
neumocitos tipo 2
(responsables de la
producción de
surfactante).
Glucogénesis
Enzima ramificante
que crea una nueva
rama cada 10-14
glucosas
Glucogenina (GYG1 GYG2)
que inicia la
polimerización de la
glucosa y se encuentra en
el núcleo del polímero
Glucógeno sintasa
que une los
monómeros de
glucosa
Glucógeno
Häggström, Mikael. "Medical gallery of Mikael Häggström 2014". Wikiversity Journal of Medicine 1 (2).
DOI:10.15347/wjm/2014.008. ISSN 20018762.
Glucogenolisis
Glucógeno-fosforilasa
α1-4 Transglicosilasa
Glucogenolisis
α 1-6 glicosidasa
GLUCÓGENO
LISOSOMA
α-1,4 y α-1,6
glucosidasa
(GSD II)
Enzima ramificante
Enlaces α 1-6
(GSD IV)
Glucógeno sintasa
Enlaces α 1-4
(GSD 0)
GLUCOSA-1-P
Glucosa-6-fosfatasa
(GSD Ia)
Transportador Glucosa-6-fosfato
(GSD Ib, c, d)
Lactato
Fructosa-6-P
Fosforilasa hepática
(GSD VI)
Fosforilasa muscular
(GSD V)
Enzima desramificante
(GSD IIIa, b, c)
Glicerato 2-P
Fosfoglicerato
mutasa 2 (GSD X)
Gliceraldehido 3-P
Dihidroxiacetona-P
Fosfofructoquinasa
(GSD VII)
Glucosa
Piruvato
GLUCOSA-6-P
Fosforilasa quinasa
(GSD IXa1, a2, b, c, d)
Lactato
deshidrogenasa
(GSD XI)
Aldolasa A
(GSD XII)
Fructosa-1,6-BP
75 años de Enfermedad de Pompe
1932 Joannes Cassianus Pompe (Holanda) describe la enfermedad en
un bebé de 7 meses que fallece por hipertrofia cardiaca idiopática
1955 Christian René de Duve (Bélgica) describe los lisosomas
1963 Henri-Géry Hers (Bélgica) describe la deficiencia de la enzima
α-1,4 glucosidasa como causa de la enfermedad
1986-1988 Frank T. Martiniuk (USA) y Arnold J.J. Reuser (Holanda),
consiguen la estructura del gen que codifica el enzima y describen
numerosas mutaciones
2001 Néstor Chamoles describe técnica analítica en gota seca
2006 FDA aprueba Tratamiento enzimático sustitutorio
CRIBADOS
Retraso en el diagnóstico clínico en la
Enfermedad de Pompe
5
35
4,7
30
3
2
1
Primeros
síntomas
Diagnóstico
Edad media (años)
Edad media (meses)
4
2
33
25
24
20
15
10
5
0
n=168 niños
Kishnani et al. J Pediatr 2006; 148:671-676
0
n=255 niños y adultos
Winkel et al. J Neurol 2005; 252:875-884
Herramientas diagnósticas en Pompe
• Cardiacas
– Rx. RM
– EKG
– Eco
• Pulmonares
–
–
–
–
Espirometría
Rx, RM
Pulsioximetría
Estudios del sueño
• Musculares
– EMG
– Test de fuerza muscular
Diagnóstico Analítico de Pompe
• Creatina kinasa sérica (CK)
• Alanina, aspartato aminotransferasa (ALT/AST)
y lactato deshidrogenasa (LDH)
• Glucosa tetrasacárido urinaria (Glc4)
• Biopsia muscular: invasiva
• Técnicas moleculares: paneles genéticos
• Medición actividad α-glucosidasa
Medición de actividad α-glucosidasa
– Fibroblastos: Se requiere biopsia de piel. Los cultivos
de fibroblastos tardan 4 semanas y hay que añadir el
tiempo de 3 días para medir la actividad αglucosidasa.
– Linfocitos. Los neutrófilos tienen una α-glucosidasa
adicional (maltasa-glucoamilasa) y por eso no valen
los leucocitos. Necesario procesar la muestra fresca y
enviar en hielo o congelada los linfocitos aislados.
– Gota de sangre seca. Menos invasiva. Si urge, el
resultado está en 2 días. Puede ser empleada para
cribado neonatal.
Calidad de la muestra
Ejemplos de muestras inválidas
Estado de la Muestra
75% motivos de repetición
• Obtención:
– Mal impregnadas
– Sobreimpregnadas
– Empleo de alcohol
• Manipulación:
– No secar al sol ni con una fuente de calor*
– Efecto “cromatográfico” por secado inadecuado
– Contaminación con heces, bacterias, hongos etc.
• Retraso en el envío y/o recepción de las muestras
en la Unidad
*Waite, KV et al. 1987 Clin. Chem. 33 (6): 853-855.
Influencia de anticoagulante en gota
seca de sangre impregnada en papel
2,10
sin aditivo 2,06
2,05
heparina 2,04
citrato 2,01
2,00
1,95
EDTA 1,93
1,90
1,85
alfa-galactosidasa
Reacción enzimática con sustrato
marcado
Factores que afectan a la actividad
enzimática
Temperatura
pH
Concentración del sustrato (saturación)
Concentración del enzima (defecto
enzimático)
• Inhibición enzimática
•
•
•
•
Determinación directa
– La más fiable, mejor sobre leucocitos o
fibroblastos. Ejemplo: Enf. de Fabry
– Más rápida sobre gota seca.
Enfermedad de Fabry
• Una enzima implicada: alfa-galactosidasa A.
• N-acetilgalactosamina como inhibidor de la
alfa-galactosidasa B.
• Se intentan reproducir la condiciones
fisiológicas a pH 4,4, 37ºC durante 20 horas.
• Se detiene la reacción cambiando a pH 10 y en
donde la 4MU se vuelve fluorescente.
• Medición directa sobre una recta de 4MU
Ejemplo determinación enzimática
Cont.
Fluorescencia nmol
pmol
Muestra Fluorescencia Fluor-blanco pmol umol/L/h
S3
50282
0,855
855
LS-14024
25408
19603
331,39
5,2
S3
46127
0,855
855
LS-14026
11649
10120,5
171,09
2,7
S4
28490
0,428
428
LS-14028
1932
158,5
2,68
0,0
S4
28490
0,428
428
C.LOW
1703
100
1,69
0,0
S5
15681
0,214
214
S5
14164
0,214
214
S6
7453
0,107
107
S6
7538
0,107
107
S7
3855
0,053
53
S7
3923
0,053
53
S8
2095
0,027
27
S8
2041
0,027
27
Concentración 4MU
60000
40000
20000
y = 56,089x + 1769,2
R² = 0,9886
0
0
200
400
600
800
1000
Determinación indirecta
– Cuando existe superposición de diversos enzimas.
Ejemplo: Enf. de Pompe
Alfa-glucosidasas
• 4 enzimas glucosidasas implicadas:
– Alfa-glucosidasa lisosomal (GAA) que es la que nos interesa
medir y se activa a pH 3,5-6,0. Residuo Trp
– Dos alfa-glucosidasas que se activan a pH 7,0-7,5.
– Maltasa-glucoamilasa (MGA) que se activa a pH 3,0-8,0
superponiéndose a todas las anteriores. Residuo Tyr
• Se intentan reproducir las condiciones fisiológicas
trabajando a pH 3,9 y 6,5, incubando 24 h a 37°C.
• Se intenta inhibir la MGA con una molécula por la que
tiene más apetencia que la GAA, la acarbosa.
• Medición compleja: 8 por muestra sobre recta de 4MU.
Resultados Pompe
• Una actividad glucosidasa total baja en medio ácido orienta hacia
cualquiera de estas interpretaciones (no excluyentes):
– Que la muestra es inadecuada (mal impregnada, degradación enzimática,
empleo de EDTA, leucopenia, …)
– Que estamos ante un posible caso de E. Pompe.
– Se trata de una muestra con baja actividad glucosidasa, pero clínicamente
normal.
• Una actividad glucosidasa neutra baja orienta hacia cualquiera de
estas interpretaciones (no excluyentes):
– Que la muestra es inadecuada (mal impregnada, degradación enzimática,
empleo de EDTA, leucopenia, …)
– Se trata de una muestra con baja actividad glucosidasa, pero clínicamente
normal.
• Una actividad
excluyentes):
glucosidasa
ácida
inhibida
baja
indica
(no
– Que la muestra es inadecuada (mal impregnada, degradación enzimática,
empleo de EDTA, leucopenia, …)
– Que estamos ante un posible caso de E. Pompe.
Interpretación Pompe
Resultados alfa-glucosidasa
0%
20%
40%
60%
Inicio infantil
80%
100%
70
60
50
Inicio juvenil
40
30
Inicio adulto
20
10
0
Muestras con Historial Clínico
Pediátrico
0%
20%
40%
60%
80%
100%
50
45
40
Hiper CKemia
35
30
25
20
15
10
5
0
Long-Term Prognosis of Patients with Infantile-Onset Pompe Disease Diagnosed by
Newborn Screening and Treated since Birth
Chien, Yin-Hsiu et al. The Journal of Pediatrics ,2015. Volume 166 , Issue 4 , 985 - 991.e2
Resultados motores y de supervivencia de los pacientes que fueron diagnosticados por
NBS en comparación con los diagnosticados clínicamente. En rojo los casos del cribado
(NBS); en verde los casos diagnosticados clínicamente tratados y en azul los casos no
diagnosticados clínicamente y no tratados (historia natural). A, curva de supervivencia de
Kaplan-Meier ajustada por edad. B, curva de supervivencia de Kaplan-Meier de pacientes
sin soporte ventilatorio
Conclusiones ensayo en DBS Pompe
• Muestra:
– Fácil de obtener
– Transporte por correo y a temperatura ambiente (bajos costes de
envío)
– Gran estabilidad de la muestra si es correcta y luego se conserva en
nevera.
• Técnica analítica:
–
–
–
–
–
–
–
Preparación sencilla en el laboratorio
Técnica reproducible
Requiere poca muestra y esto es importante en neonatos
Muestra es menos infecciosa
Coste relativamente barato
Los casos graves son fácilmente detectables
¡OJO! Las formas del adulto e intermedias pueden resultar falsos
negativos.
Muchas gracias