Microinjerto de la fracción vásculo-estromal, células madre MICROINJERTO DE LA FRACCIÓN VÁSCULO-ESTROMAL, CÉLULAS MADRE: Las células madre son células no especializadas que tienen dos propiedades que las definen: • Capacidad de diferenciarse en otras células (‘potencia’): Totipotentes Pueden formar todos los tipos celulares. Pueden crecer y formar un organismo completo, tanto los componentes embrionarios (como, por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y los tejidos que darán lugar al saco vitelino), como los extraembrionarios (como, por ejemplo, la placenta) Pluripotentes No pueden formar un organismo completo, pero sí cualquier otro tipo de célula correspondiente a los tres linajes embrionarios: endodermo, ectodermo y mesodermo. Multipotentes Pueden generar todo los tipos celulares de su misma capa o linaje embrionario. Unipotentes También llamadas células progenitoras, son células madre que tienen la capacidad de diferenciarse en un solo tipo celular. • Capacidad de autoregenerarse CÉLULAS MADRE DEL TEJIDO ADIPOSO BASES BIOLÓGICAS: 2001: aislamiento de las Processed Lipoaspirate Cells (PLA). Dándose situaciones de osificación del TA, la responsabilidad no corresponde a células residentes (preadipocitos unipotentes) Zuk PA, Zhu M, Mizuno H et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng., 2001, 7:211-228. Las PLA debían ser células multipotentes, capaces de diferenciarse (y después proliferar) en líneas celulares mesodérmicas: adipógenas, condrógenas, osteógenas, miógenas, angiógenas, tejido conectivo (fibroblastos), etc. Son células multipotentes omnipresentes y fáciles de obtener vs células embrionarias: ¡limitaciones éticas o políticas, compatibilidad inmunológica, teratogenicidad! -hasta 5000 veces más que en médula ósea (0’001-0’01% en médula ósea vs 5% en grasa abdominal). Células madre mesenquimales de tejido adiposo – 10 días (Dr. J.M. Lasso). “In vitro” pueden diferenciarse en: fibroblastos, células adiposas, óseas, neurales, cartílaginosas, musculares, cardiovasculares, hematopoyéticas, angiogenéticas, etc. En la actualidad, son la principal herramienta de trabajo en investigación de ingeniería tisular. Más de 3800 resultados en Medline cuando se busca “adipose derived stem cells”, junio 2014. 1 Microinjerto de la fracción vásculo-estromal, células madre TERMINOLOGÍA: A pesar de los grandes avances que se realizan en la actividad clínica, todavía no existe un acuerdo claro acerca de la nomenclatura utilizada para describir las células progenitoras del estroma del tejido adiposo, lo cual genera confusión en los foros científicos. Los términos Células Estromales Derivadas del Tejido Adiposo (Adipose Tissue-Derived Stromal Cell: ADSC), Células de la Fracción Vascular de la Grasa (Adipose StromalVascular Cell Fraction: SVF) y Células Regeneradoras Derivadas de la Grasa (AdiposeDerived Regenerative Cells: ADRCs) corresponden a células obtenidas inmediatamente después de la digestión del tejido adiposo por colagenasas. Por el contrario, los términos Células Provenientes del Lipoaspirado (Processed Lipoaspirate Cells: PLA) y Células Madre Derivadas del Tejido Graso Adherentes al Plástico (Plastic-Adherent Adipose-Derived Stem Cells: ASCS) describen a aquellas CM obtenidas después de cultivar las anteriormente mencionadas. Como término unificador, podemos referirnos a estos tipos celulares como Células Madre Derivadas del Tejido Adiposo (Adipose-Derived Stem Cells: ASCs) de acuerdo con el Consenso de la Sociedad Internacional de la Tecnología Aplicada a la Grasa (International Fat Applied Technology Society Consensus); sin embargo, las propiedades de las células frescas sin cultivar distan bastante de las que presentan las que han sido sometidas a cultivos, siendo estas últimas células, en principio, de menos calidad en la reconstrucción de tejidos. La Sociedad Internacional para la Terapia Celular (International Society for Cell Therapy: ISCT) define los siguientes criterios mínimos para ser consideradas ASCs: 1. Adherencia al plástico en condiciones estándar de cultivo. 2. Fenotipo positivo (>95%): CD105, CD73, CD90. Fenotipo negativo (<2%): CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79α o CD19, y HLA-DR. 3. Diferenciación in vitro en osteoblastos, adipocitos y/o condroblastos (demostrado por tinción de cultivo celular in vitro). La aceptación y generalización del uso de estos mínimos criterios por los científicos ayudaría a estandarizar protocolos usados en la obtención de células y en la caracterización de cada tipo celular, con lo cual aseguraríamos una progresión más eficiente de los estudios preclínicos y clínicos (ver Tabla en siguiente diapositiva). FACTORES DE CRECIMIENTO: Las células madre del tejido adiposo segregan sus propias hormonas (adipoquinas: leptina, adiponectina, angiotensinógeno, etc.) y sus propios factores de crecimiento (citoquinas). Angiogénesis. colagenogénesis (matriz intercelular) > supervivencia 2 Microinjerto de la fracción vásculo-estromal, células madre Kilroy GE, Foster SJ, Wu X, Ruiz J, Sherwood S, Heifetz A, Ludlow JW, Stricker DM, Potiny S, Green P, Halvorsen YD, Cheatham B, Storms RW, Gimble JM. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and proinflammatory factors. J Cell Physiol. 2007 Sep;212(3):702-9. Ji Suk Choi, Hyun-Jin Yang, Beob Soo Kim, Jae Dong Kim, Jun Young Kim, Bongyoung Yoo, Kinam Park, Hee Young Lee, Yong Woo Cho. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. Journal of Controlled Release. Volume 139, Issue 1, 1 October 2009, Pages 2–7. El tejido adiposo aspirado contiene factores de crecimiento (bFGF, IGF, PDGF y VEGF) que permanecen (a temperatura ambiente) hasta 5 días. FGF induce neovascularización y aumenta la supervivencia del trasplante. VEGF aumenta la angiogénesis y su expresión aumenta en hipoxia. PDGF estimula la proliferación de y aumenta la supervivencia del trasplante. preadipocitos, es quimiotáctico ANGIOGÉNESIS: Todo parece indicar que los lóbulos de grasa se nutren a través de pequeños pedículos vasculares. El tejido trasplantado debe revascularizarse en 48 horas, siendo alimentado en ese tiempo por materiales que difunden a través del medio que le rodea. El material que no subsiste es compactado y digerido por los macrófagos, y finalmente sustituido por tejido fibroso y estructuras quísticas. El TA trasplantado es isquémico (la resorción directa podría ser >80%), pero afortunadamente contiene células precursoras de las células endoteliales >> formación de vasos sanguíneos. En condiciones de hipoxia, los genes proangiogénicos están sobreexpresados; esta sobreexpresión se recupera cuando la vascularización y la oxigenación se regularizan Hipoxia relativa del implante >> conversión de las ASC (adipose tissue-derived stem cells) en células endoteliales >> angiogénesis + revascularización >> - supervivencia del implante - revascularización del área implantada (evidencia clínica) Resulta clave la ‘interface’ entre el tejido adiposo trasplantado y el ‘adjacent recipient site tissue’. El conjunto de estas células, se conoce como células regenerativas derivadas del tejido adiposo o fracción vascular estromal, caracterizadas por su capacidad para generar nuevo tejido adiposo y vasos sanguineos, así como producir factores de crecimiento que ayuden a sobrevivir a los adipocitos y a la formación de la red vascular. 3 Microinjerto de la fracción vásculo-estromal, células madre SUPERVIVENCIA Y ASPIRACIÓN: • El rendimiento celular con una presión de -350 mmHg, asistida o no, es mayor que el obtenido con -700 mmHg. SUPERVIVENCIA Y TEMPERATURA: Se evalúa la degeneración de la grasa y la supervivencia de adipocitos y ASC’s en muestras centrigugadas (2400G - 5 minutos) a 1-2-4-24 horas a temperatura ambiente, a 1-2-3 días a 4oC 1 a 1 mes a -80ºC. La evaluación se hace valorando la oil-ratio, la presencia de GPDH (glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, enzima intracelular) y el porcentaje de ADSC’s. Hasta las 4 horas a temperatura ambiente hay un aumento progresivo de la oil-ratio y de la GPDH; es muy significativo a las 24 horas. A temperatura ambiente, las ASC’s se mantienen hasta las 4 horas y a las 24 horas casi han desaparecido. A 4ºC se mantienen hasta las 24 horas y luego se reducen. Conclusión: La transferencia debe realizarse en menos de 4 horas; si el material se enfría a 4 º C se dispone de 24 horas La supervivencia de las ASC’s mejora con la adición de polivinilpirrolidona (PVP al 10% en medio PBS o DMEM (Dulbecco ́s modified Eagle’s medium) CÉLULAS MADRE y ENVEJECIMIENTO: OBSERVACIONES • En ratones, el número de ASC por gramo de TA disminuye con la edad, pero no su capacidad de diferenciación (multipotencialidad). Aceleran la reparación de heridas. • Liberación de FC: basic fibroblast GF (bFGF), keratinocyte GF (kGF), HGF y VEGF. Proliferación, migración y activación de fibroblastos > colágeno tipo I. La hipoxia incrementa estos fenómenos. Las ASC podrían tener un efecto antioxidante y reductor de arrugas. Algunos estudios en animales han mostrado una reducción de arrugas inducidas por radiación UVB. 4 Microinjerto de la fracción vásculo-estromal, células madre CÉLULAS MADRE y OBESIDAD La obesidad disminuye el porcentaje de ASC residentes en el tejido adiposo subcutáneo. Las ASC de individuos obesos presentan una alteración de su capacidad proliferativa, multipotencial y angiogénica. Las ASC de pacientes obesos mórbidos presentan una menor tasa de proliferación que las de individuos no obesos. La obesidad disminuye la capacidad de diferenciación de las ASC a célula adipocítica y célula endotelial. La obesidad incrementa la expresión del factor antiangiogénico TSP1 en las ASC. Las ASC de pacientes obesos inhiben la capacidad de formar redes tubulares por parte de las células HUVEC en comparación con las ASC de individuos no obesos. La obesidad modifica el transcriptoma (porción del genoma transcrito a ARN mensajero) de las ASC, promoviendo un fenotipo menos indiferenciado, más adipogénico y más proinflamatorio CÉLULAS MADRE y EFECTO ANTIFIBRÓTICO • De forma paracrina, las ASC podrían tener un efecto antifibrótico. • Por si mismas o por su influencia en el entorno aumentan la red vascular: esta influencia paracrina reduce los TGFβ y con ello la diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos. DUDAS/REFLEXIONES • ¿FRESCO o CULTIVADO? Las ASCs pueden sufrir una transformación maligna cuando se realizan más de 4 pases prolongados. Este fenómeno implica que las células frescas pueden ser más seguras que las que han sido cultivadas. Rubio D, García-Castro J, Martín MC, et al.: "Spontaneous human adult stem cell transformation". Cancer Res. 2005;65:3035. • MANIPULACION / ESTERILIDAD El procedimiento ha de efectuarse en condiciones de extrema esterilidad. • INMUNOGENICIDAD / ANTIGENICIDAD J.M. Lasso y otros han observado que las clases I y II del complejo mayor de histocompatibilidad del sistema HLA se expresan en solo el 1% de ASCs; se ha hipotetizado sobre que estas células podrían comportarse como células donantes universales y, por tanto, podrían ser usadas para trasplantes autólogos y alogénicos. Otra propiedad interesante de estas células es su capacidad de producir un efecto inmunosupresor, lo que podría ser utilizado para control de la enfermedad injerto contra huésped. 5 Microinjerto de la fracción vásculo-estromal, células madre OTRAS CÉLULAS MADRE TEJIDO CONECTIVO (por ejemplo DERMIS) - Ventajas: Todavía más fáciles de ‘recolectar’. Pequeños volúmenes de extracción > rentabilidad suficiente Ausencia de sangre: menos inflamación y menos fagocitosis. • Que corresponden a la estirpe mesenquimal. • Que no corresponden a la estirpe hematopoyética. Numerosos trabajos científicos han demostrado que en los tejidos sólidos (p.e. piel) las células con mayor capacidad regenerativa se encuentran en un subgrupo llamado «side population» (población lateral); este grupo se caracteriza por unas dimensiones celulares específicas (por debajo de 50 micrones) y por una alta expresión de marcadores de regeneración. Usando el criterio morfológico de tamaño, seleccionando sólo los elementos inferiores a 50 micrones, podemos identificar un grupo de células en el que el porcentaje de elementos regenerativos (células madre) corresponde al 80% del total. INVESTIGACIÓN Dr. Riccardo D’Aquino Dr. Antonio Graziano Especialidades a las que puede ir dirigido: Cardiología, Neurocirugía, Maxilofacial y odontología, cirugía ortopédica y traumatología, Cirugía Plástica, dermatología y Otros Resultados de la citofluorimetría (a 1 mes de siembra) Laboratorio de Manipulación Celular – Servicio de Inmunohematología y Medicina Transfusional – Fundación Policlínico San Mateo – Pavía (Italia): Viabilidad = 92% Células CD90+ = 52% / CD105+ = 82% / CD11b+ = 45% CD11b dim = 43% CD73+ = 82% / CD146+ = 36% CD146 dim = 49% / CD31+ = 2% / CD80+ = 3% Células CD45+, CD14+, CD34 y CD133 = 0% Confirmación de que las células obtenidas corresponden a la estirpe mesenquimal; por contra, los marcadores de la estirpe hematopoyética son negativos. Lo expresan las Muse Cells (Multi-lineage Stress Enduring Cells) un nuevo tipo de células madre pluripotentes, muy resistentes y no carcinogénicas. Residen en tejidos mesenquimales como la médula ósea, el tejido adiposo o la dermis. Son capaces de generar células de las tres estirpes (exodermo, mesodermo y endodermo) de forma espontánea o bajo estimulación por citoquinas. No son teratogénicas; esto puede ser debido a su baja actividad telomerasa, a diferencia de las iPS derivadas de fibroblastos humanos. 6 Microinjerto de la fracción vásculo-estromal, células madre PROTOCOLO REGENERA • Selección zona dadora (¡no fotoenvejecida - vascularizada!) • Preparación campos • Desinfección • Anestesia tópica o local periférica (¡no isquemia!), sin adrenalina • Obtención del material tisular con punch de 2 mm • Eliminar tejido epidérmico • Fragmentar si fuera preciso Colocar en Rigeneracons sobre el filtro previamente ‘humedecido’ con SF (no sobre la hélice) y añadir 1’2 ml de SF (a temperatura ambiente) ó PRP (propuesta personal). Introducir en Rigenera; 1 ó 2 ciclos (1 ó 2 minutos). Retirar material con jeringa. Recuperación estimada: 50.000 – 100.000 stem cells (x 1 ml). Utilizar en los 30 minutos siguientes >> aislado, enriqueciendo el injerto de tejido adiposo o en combinación con productos sanitarios (AH, AA’s), factores de crecimiento plaquetario sin activar. Se pueden realizar 1, 2 ó 3 sesiones, en intervalos de 30-40 días, según respuesta clínica. INDICACIONES EN MEDICINA Y CIRUGÍA ESTÉTICA Y DERMATOLOGÍA • Envejecimiento cutáneo (arrugas, atonía cutánea, etc.), complemento a tratamientos dermocosméticos (láser, IPL, peelings, dermarroller, etc.), lipoimplante, alopecia, estrías, fibrosis, quemaduras, cicatrices, úlceras, radiodermitis, esclerodermia, vitíligo, etc. 7