ACCIÓN BACTERICIDA DE BACTERIAS - Alimentos Hoy

Recibido 25/04/2010, Aceptado 03/05/2010, Disponible online 25/04/2012
ACCIÓN BACTERICIDA DE BACTERIAS ACIDOLACTICAS CONTRA
LISTERIA MONOCYTOGENES SEROTIPO 4b.
María Consuelo Vanegas L, Lina María González G, Aida Juliana Martínez, María Carolina
Vives H, Stefany Alejandra Arévalo M.
[email protected]., [email protected]
Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos (LEMA), Departamento de Ciencias
Biològicas, Universidad de Los Andes, Cra 1 # 18ª – 70, J 209 Tel: 3394949 (ext 2792), Fax:
3394949 (ext 3339). Bogotá, Colombia.
RESUMEN
Listeria monocytogenes un patógeno emergente transmitido por alimentos, de gran
importancia a nivel mundial por su alta mortalidad. En Colombia esta bacteria no es de
notificación obligatoria, pero se ha encontrado en una gran variedad de alimentos listos para
el consumo. El 98% de los brotes por listeriosis se han asociado al serotipo 4b. Las bacterias
acidolácticas han sido utilizadas en la industria como biocontroladores de bacterias
causantes de deterioro o de patógenos. En este estudio se evalúo la capacidad listericida de
Lactobacillus sp (Lac 185 y Lac 276) y Bifidobacterium sp (Bif 013 y Bif 023), aisladas de
heces de neonatos y leche materna. Ochenta y cuatro cepas de Listeria monocytgenes
grupo 4b aisladas diferentes fuentes como alimentos, muestras clínicas, ambientes y
animales.Adicionalmente se evaluó el efecto antagonista sobre tres cepas de referencia
(L.monocytogenes ATCC19115, L.inocua ATCC 33090 y L.ivanovii ATCC 19119). Se
encontraron zonas de lisis alrededor de los inóculos de las cepas de Lactobacillus y
Bifidobacterium en 55 de los 84 ensayos de difusión en placa. Los Lactobacillus presentaron
una actividad listericida similar a la de las cepas de Bifidobacterium.
Palabras clave: Bifidobacterium, Lactobacillus, Antagonismo, L.monocytogenes 4b.
ABSTRACT
Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen of great importance worldwide for its high
mortality rates. In Colombia this bacterium is not notifiable, but it has been found in a wide
variety of ready to eat food. 98% of listeriosis outbreaks have been associated with 4b
serotype. Lactic acid bacteria (LAB) have been used in industry as a biocontrol of spoilage
bacteria or pathogens. In this study we evaluated the ability of Lactobacillus (Lac 185 and Lac
276) and Bifidobacterium sp (Bif 013 and Bif 023) isolated from neonatal feces and breast
milk to inhibit L.monocytogenes. Eighty-four strains of L.monocytgenes 4b serotype isolated
from different sources such as food, clinical samples, animals, food procesing environments
and three reference strains (L.monocytogenes ATCC19115, L. inocua ATCC 33090 and
L.ivanovii ATCC19119) were evaluated.
Lysis zones were found around the inoculum of Lactobacillus and Bifidobacterium in 55 of 84
plate diffusion tests. Lactobacillus showed similar listericidal activity than Bifidobacterium.
Keywords: Bifidobacterium, Lactobacillus, Antagonistic activity, L.monocytogenes 4b
Vol 21, No 25 (2012), Revista Alimentos Hoy - 90
INTRODUCCIÓN
Las bacterias acidolácticas (BAL) son
gram positivos de forma bacilar o cocoide,
considerados benéficas para la salud
humana, son utilizadas como probióticos o
aditivos alimenticios, reconocidas como
seguras por la USA Federal Drug
Administration (FDA). Son de gran
potencial biotecnológico, por lo cual se
utilizan como iniciadores en procesos
fermentativos para alimentos destinados al
consumo humano, bebidas alcohólicas y
productos
para
animales
(Reseña:
Lactobacillus spp.:Importantes promotores
de actividad probiótica, antimicrobiana y
bioconservadora). Las BAL utilizadas
como cultivos bioprotectores, pueden ser
considerados aditivos que además de
aumentar la inocuidad microbiológica de
los
alimentos
porque
reducen
el
crecimiento
de
patógenos
y
microorganismos deteriorantes, confieren
características organolépticas deseables.
(Holzapfel et al., 1995).
Como se mencionó anteriormente, esta
clase de bacterias controlan el desarrollo
de microorganismos patógenos presentes
en materia prima o contaminantes en la
línea de producción (Alvarado et al.,
2009).La capacidad antimicrobiana de las
BAL se atribuye a
la producción de
metabolitos
secundarios
como
bacteriocinas, ácidos orgánicos, peróxido
de hidrógeno, acetaldehído y otros
compuestos como acetato, etanol, CO2,
formato y succionato a partir de
carbohidratos fermentables (Fernandez et
al., 2002, Alvarado et al., 2009).
Otro autores han argumentado que el
mecanismo de interacción entre las
bacterias acidolácticas y los miembros de
la microbiota o patógenos oportunistas en
el intestino es muy similar al modelo de
exclusión competitiva en mamiferos, en el
cual el factor determinante es la
adherencia al epitelio intestinal, el
desplazamiento es físico y la competencia
es por el espacio (Velraeds et al. 1996).
La bioconservación, definida como la
extensión de la vida útil de los alimentos
utilizando su microbiota o metabolitos, es
un proceso que aprovecha la capacidad
de la microbiota autóctona para inhibir el
crecimiento y actividad perjudicial de
microorganismos deteriorantes o agentes
patógenos.
Los
procesos
de
bioconservación utilizados en la industria
involucran la utilización de cultivos
protectores y sustancias producidas por
algunas bacterias.
Múltiples ensayos
desarrollados a nivel mundial, dan como
resultado
el
uso
de
consorcios
bacterianos, extractos, productos de la
fermentación de bacterias acidolácticas
(Pediococcus acidilactici, Mezcla de
cultivos ácido-lácticos y extracto de
especias,
Cultivo
de
Lactobacillus
curvatus, Fermentado de Lactobacillus
curvatus) y metabolitos como la enterocina
AS-48 producida por Enterococcus
faecalis (Sanchez et al., 2008), para el
biocontrol
de
patógenos
como
L.monocytogenes, S. typhimurium y E.coli
en productos frescos como vegetales,
hortalizas, pescado y productos cárnicos
listos para el consumo (Trias et al., 2008;
Andersen et al., 1995). El IPLA, Instituto
Productos Lácteos de Asturias, ha
identificado
sustancias
enzimáticas
bacterianas con acción antimicrobiana
sobre S.aureus, a partir de un virus
bacteriófago, dichos metabolitos serán
probados como bioconservantes para
productos lácteos y derivados (Consumer
19 de Marzo de 2009). Alguno reportes
indican, que aunque la capacidad
antagonista
de
los
organismo
bioprotectores depende de la bacteria con
la cual compiten (Trias et al., 2007, Stern
et al., 2006), se ha documentado una
efectividad del 100% en contra de Listeria
monocytogenes, un patógeno, transmitido
al hombre por el consumo de alimentos
contaminados (Schmid et al., 2005;
Vol 21, No 25 (2012), Revista Alimentos Hoy - 91
Unnerstad and Helle.2001), que se
considera responsable del 80% de los
casos de listeriosis humanas, a este
respecto, estudios han documentado que
dentro de los serotipos más comúnmente
asociados a brotes epidémicos se
encuentra el 4b (Doumith et al., 2004),
sevorar
altamente
virulento
que
actualmente se sabe circula en nuestro
país y es ubicuo en plantas de
procesamiento y alimentos (Doumith et al.,
2004).
En Colombia, se ha reportado una alta
frecuencia alimentos contaminados con
L.monocytogenes, tales como quesos,
leches, alimentos listos para el consumo y
cárnicos (Rueda, 2005; Vanegas et al,
2006). Sin embargo son muy pocos los
estudios epidemiológicos disponibles,
fundamentalmente
porque
esta
enfermedad no es de notificación
obligatoria ni a nivel clínico ni en la
industria de alimentos (Crespo et al.;
1999)
El objetivo de este estudio, fue la
determinación de la capacidad Listericida
de Lactobacillus sp y Bifidobacterium sp
aislados de microbiota humana, en contra
cepas
colombianas
de
Listeria
monocytogenes serotipo 4b, los cuales
podrían tener aplicación como prebióticos
o bioconservantes de alimentos.
MATERIALES Y METODOS
Cepas: Las cepas de Lactobacillus sp
(Lac 185, LAC 276) y las cepas de
Bifidobacterium sp (Bif 013 y Bif 026)
empleadas en este estudio, fueron
aisladas de leche materna y heces de
neonatos, en investigaciones previas. Las
acido lácticas fueron recuperadas en caldo
Man Rogosa and Sharpe Broth (MRS
Broth) (Scharlau, España) y sembradas en
agar Man Rogosa y Sharpe (MRS)
(Sharlau, España) e incubadas a 30 ºC por
3 días sin agitación y en atmósfera rica en
CO2 (Gonzales, 2008). Las cepas fueron
conservadas a corto plazo en tubos
inclinados de MRS y a largo plazo en MRS
con 30% de glicerol. Fue empleada la
cepa de referencia Bifidobacterium breve
ATCC 15700 como cepa control.
Ochenta y un (81) cepas de Listeria
monocytogenes serotipo 4b (Tabla 1),
aisladas de diferentes fuentes (50 cepas
aisladas de alimentos, 21 asilamientos
clínicos humanos donados por la
Secretaria de Salud de Bogotá D.C., 8
cepas ambientales y 2 cepas de animales
(LMO 200, LMO 201), previamente
serotipificadas molecularmente por el
Laboratorio de Ecolología Microbiana y de
Alimentos LEMA (Vanegas et al., 2009),
además
de
L.monocytogenes
ATCC19115, L. inocua ATCC 33090 y
L.ivanovii
ATCC
19119,
fueron
reconstituidas e incubadas a temperatura
permisible por 24 horas en Caldo BHI
(Brain
Heart
Broth
–Difco)
y
posteriormente, sembradas en tubos de
SPC (Estándar Plate Count AgarScharlau) para su mantenimiento a 8°C.
Determinación
de
la
capacidad
antagonista: El efecto de inhibición de
cada una de las cepas de Lactobacillus sp
y Bifidobacterium sp aisladas contra cada
una de las Listerias serovar 4b y las 3
cepas de referencia de Listeria (ATCC), se
llevó a cabo con la metodología de la gota
y difusión en doble capa, descrito por
Botina., 2008 brevemente, 5 µL de cada
uno de los cultivos overnight de las cuatro
cepas (2 cepas de Lactobacillus sp y 2
cepas de Bifidobacterium sp) crecidas en
caldo Man Rogosa and Sharpe (MRS)
(Sharlau, España) por 3 días, fueron
fijadas por 3 horas sobre placas de petri
con 10 mL de Plate Count Agar (SPC)
(Scharlau, España). Posteriormente, se
adicionaron 9 mL del mismo medio de
cultivo inoculado con 10 µL de cada una
de las 87 cepas de Listeria crecidas en
Vol 21, No 25 (2012), Revista Alimentos Hoy - 92
caldo BHI (Difco, USA) por 24 horas. Cada
ensayo fue incubado a temperatura óptima
durante 48 horas. El efecto inhibitorio fue
medido acorde con la presencia de halos
de inhibición alrededor de los inóculos de
las cepas de Lactobacillus sp y
Bifidobacterium sp.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
El efecto inhibitorio de las cepas de
Lactobacillus sp y Bifidobacterium sp, fue
determinado de acuerdo a la presencia de
halos de inhibición alrededor de los
inóculos bacterianos (Fernandez et al.,
2003).
Los
Lactobacillus
presentaron
una
actividad listericida similar a la de las
Bifidobacteras. La actividad bactericida de
Lac 185 y Lac 276 fue del 51.2% (43
cepas) y 53.6% (45 cepas) de las Listerias
monocytogenes
grupo
4b
respectivamente,
resultados
que
concuerdan con los obtenidos por Gilliland
y Speck (1997) quienes reportaron las
propiedades
antibacteriales
de
Lactobacillus en contra de bacterias Gram
positivas como L.monocytogenes, lo
anterior también fue reportado por
Hechard y colaboradores quienes aislaron
cepas de leche de cabra y evidenciaron
que éstas también eran capaces de inhibir
bacterias como Listeria y S.aureus, dicha
capacidad listericida ha sido atribuida a la
producción de compuestos como ácidos
orgánicos, peróxidos, bacteriocinas o a la
sinergia entre ellos. (Gilliland et al., 1997,
Hechard et al., 1990)
El comportamiento presentado por las dos
cepas de Lactobacillus sp aisladas de
leche materna es muy parecido, pues en
términos generales Lac185 y Lac276
inhibieron a las mismas cepas de
L.monocytogenes (Tabla 1).
Los porcentajes obtenidos con las cepas
de Bifidobacterium sp (Bif 013 y Bif 023)
aislados de heces de neonatos, fueron del
46.4% (39 cepas) y 44.0% (37 cepas),
esto puede ser atribuido a la capacidad
antimicrobial del acido láctico y acético
derivado del metalismo de la glucosa en
bacterias de este género (Klein et al;
1998). El 18.0% de las Listerias serotipo
4b (15 cepas: 7 de alimentos, 5 de clínica,
1 de animales y 1 de ambientes) fueron
inhibidas por todas las cepas de
Lactobacillus sp y Bifidobacterium sp,
resultados que concuerdan con los datos
existentes acerca de la actividad listericida
de algunas géneros bacterianos como
Leuconostoc sp (Harding and Shaw 1990),
Carnobacterium sp (Jack et al. 1995,
Enterococcus sp (Kawamoto et al. 2002,
Ennahar et al. 1999) y Lactobacillus sp
(Katla et al. 2002) este último, muy
estudiado por su uso como agente
antilisterial debido a la producción de
bacteriocinas (Nielsen et al., 1990; Berry
et al., 1991; Vignolo et al., 1996; Bredholt
et al.,1999; Matagaras et al., 2002; Juven
et al., 1998; Devlieghere et al., 2004). No
hubo inhibición para 33 cepas de Listeria
monocytogenes 4b, lo que implica que
están circulando cepas resistentes de este
patógeno
a
la
acción
de
los
antimicrobianos producidos por estas BAL.
Respecto al comportamiento de las
cepas de referencia, se obtuvo que
Listeria monocytogenes (LMO 369,) y
Listeria ivanovii (LMO 368), fueron
sensibles a las 4 cepas de BAL probadas,
mientras que L.innocua (LMO 367) solo
fue inhibida por Lac 185 (Tabla 2.), llama
la atención el hecho de que la cepa de B.
breve ATCC 15700, no inhibió a ninguna
de las 3 cepas de referencia (LMO367,
LMO368 y LMO369 (Tabla 2).
Vol 21, No 25 (2012), Revista Alimentos Hoy - 93
Tabla 1. Resultados del ensayo de antagonismo entre las cepas de Lactobacillus sp,
Bifidobacterium sp y Listeria monocytogenes serotipo 4b de aislamientos colombianos.
CEPAS
LMO 037, LMO 038, LMO
042, LMO 094, LMO 135,
LMO 176, LMO 177, LMO
179, LMO 186, LMO 188,
LMO189, LMO 200, LMO
357, LMO 364, LMO 365
LMO 06, LMO 026, LMO
027, LMO 133, LMO 134,
LMO 181, LMO 191, LMO
193, LMO195, LMO 356,
LMO 360, LMO 362, LMO
363
LMO 035, LMO 036, LMO
049, LMO 069, LMO 164
LMO 07
LMO 190
LMO 172
LMO 077
LMO 063, LMO 175, LMO
178, LMO 361,
LMO 355
LMO 359
LMO 362
LMO 206
LMO 031
LMO 182, LMO 183, LMO
201, LMO 358
LMO 202
LMO 010, LMO 011, LMO
018, LMO 019, LMO 039,
LMO 040, LMO 043, LMO
044, LMO 052, LMO 055,
LMO 067, LMO 076, LMO
079, LMO 095, LMO 111,
LMO 113, LMO 117, LMO
162, LMO 184, LMO 185,
LMO187, LMO 192, LMO
194, LMO 204, LMO 307,
PRESENCIA DE HALO DE
INHIBICIÓN
LAC LAC
BIF
BIF ATCC TOTAL
185
276
013
023 15700 CEPAS
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
15
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
13
5
1
1
1
1
4
1
1
1
1
1
4
1
33
Vol 21, No 25 (2012), Revista Alimentos Hoy - 94
LMO 312, LMO 315, LMO
319, LMO 323, LMO 327,
LMO 351, LMO 352, LMO
354,
TOTAL
% Cepas inhibidas
43
51,2
y solo tuviera el potencial para inhibir al
26.2% (22 cepas) de las Listerias serovar
4b colombianas, lo anterior puede ser
explicado por qué las bacteriocinas de
clase II, son muy eficientes eliminando las
cepas bacterianas pero usualmente no
dejan marcas visibles de inhibición
(Ennahar et al., 1999). A nivel
comparativo, vale mencionar que los
aislamientos colombianos (LAC185, LAC
276, BIF 013 y BIF 023) presentaron
45
53,6
39
46,4
37
44,0
22
26.2
84
mayor capacidad listericida que la cepa de
referencia pues esta ultima solo fue capaz
de inhibir al 26.2% (22 de las 84) de
Listerias serovar 4b, resultado que
evidencia la presencia de características
diferenciales entre las cepas colombianas
y la referencia. Se debe continuar
estudiando y caracterizando la genética y
fisiología de de estas cepas para que
puedan ser utilizadas como agentes
antimicrobianos a gran escala.
Tabla 2. Resultados del ensayo de antagonismo entre las cepas de Lactobacillus sp,
Bifidobacterium sp y las Listerias de referencia ATCC.
CEPAS
L. monocytogenes
ATCC19115
L. ivanovii ATCC 19119
L. innocua ATCC 33090
PRESENCIA DE HALO DE
INHIBICIÓN
LAC LAC
BIF
BIF ATCC
185
276
013
023 15700
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)
(+)
(+)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(-)
Vol 21, No 25 (2012), Revista Alimentos Hoy - 95
CONCLUSIONES
Se determinó que el efecto antagónico de
las cepas aisladas de leche materna (LAC
185 y LAC276) es mayor que el de las
Bifidobacterias (BIF 013 y BIF 023)
aisladas
de
neonatos
lactantes.
Adicionalmente las Listerias serotipo 4b
aisladas de alimentos procesados y origen
clínico son altamente sensibles a los
agentes antibacteriales segregados por las
bacterias lácticas.
Todas las cepas evaluadas en este
estudio tiene potencial como agentes
bioprotectores, sin embargo, LAC 185
presentó una actividad listericida superior
a la de las demás cepas probadas y tuvo
la capacidad inhibir cepas de Listeria 4b
aisladas tanto de alimentos, como
animales y ambientes.
AGRADECIMIENTOS
Doctor Cotrino por la donación de las
cepas de L.monocytogenes aisladas de
animales (LMO 200 y LMO 201)
empleadas en este estudio.
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