Sistema FAS-II

Aplicación de los microarrays de DNA al
estudio de la resistencia a isoniazida en
Mycobacterium tuberculosis
PNAS, 22: 12833-12838 (1999)
Tuberculosis
•
La tuberculosis es una enfermedad crónica infecciosa causada
por Mycobacterium tuberculosis. A pesar del desarrollo de
vacunas y fármacos, continua siendo una importante causa de
mortalidad.
•
Tuberculosis y SIDA son las principales causas de muerte por
enfermedades infecciosas (3 millones/año).
•
Se estima que hay 7 millones de nuevos casos por año.
•
La infección por HIV incrementa la mortalidad por tuberculosis al
disminuir la resistencia.
Mycobacterium tuberculosis
•
Después de varias décadas de retroceso debido al desarrollo de
fármacos efectivos, la incidencia de la tuberculosis comenzó a
incrementar a mediados de los 80.
•
Una causa del aumento de la tuberculosis es la aparición de
cepas de M. tuberculosis resistentes a antibióticos.
•
El creciente problema de la resistencia a fármacos combinado
con la incidencia global de esta enfermedad pone en evidencia
la urgente necesidad de nuevas terapias antituberculosas.
•
La pared de M. tuberculosis, cuya integridad resulta esencial
para la viabilidad de la bacteria, proporciona toda una batería de
potenciales dianas para el desarrollo de nuevos fármacos.
Mycobacterium tuberculosis
•
La primera línea de defensa contra la mayor parte de las
infecciones bacterianas incluye a los macrófagos, células del
sistema inmune que fagocitan a las bacterias y las atacan con
agentes químicos y bioquímicos.
•
El stress oxidativo es parte de la defensa natural del huésped a
la infección bacteriana.
•
Excepcionalmente, M. tuberculosis está adaptado a sobrevivir
dentro del macrófago: parte de esta adaptación se debe a su
pared celular que tiene una baja permeabilidad.
•
La bacteria también realiza cambios sustanciales en los perfiles
de expresión génica, para adaptarse al estado fisiológico del
macrófago (bajo pH y stress oxidativo).
Isoniazida (INH)
•
Un fármaco primario utilizado en la prevención y tratamiento de la
tuberculosis es la isoniazida (hidracida del ácido isonicotínico).
•
La isoniazida ataca a M. tuberculosis al interferir en la síntesis de
la pared celular, sin la que la bacteria no puede sobrevivir.
•
Evidencias genéticas y bioquímicas indican que las dianas de la
isoniazida incluye enzimas que participan en la biosíntesis de
ácidos micólicos (principales componentes de la pared celular):
• InhA, enoil ACP reductasa
• KasA, β-cetoacil ACP sintasa
•
Las micobacterias presentan una pared celular muy compleja con
abundancia de lípidos (algo excepcional en bacterias Gram +).
Pared celular de M. tuberculosis
Ácidos micólicos
•
Los ácido micólicos son α-alquil-β-hidroxiácidos grasos de cadena
larga (60-90 átomos de carbono) y son los lípidos mayoritarios de
la pared celular de micobacterias.
•
Los ácidos micólicos están compuestos de una cadena α de
ácidos grasos lineales saturados de tamaño intermedio (R1=C24C26), y una cadena larga (R2>C50) de ácido meromicólico.
•
La isoniazida bloquea múltiples componentes del sistema FAS-II
(sistema de la ácido graso sintasa tipo II) que se requieren para
la completa extensión de la cadena de ácido meromicólico.
Sistema FAS-II
•
En la biosíntesis de las cadenas acil (R1 y R2) de los ácidos
micólicos intervienen dos sistemas:
• El sistema FAS-I que lleva a cabo la síntesis de novo de
ácidos grasos y genera precursores de 14-26 carbonos.
• El sistema FAS-II actúa sobre los productos de FAS-I
unidos a AcpM (acyl carrier protein), elongándolos para
generar ácidos grasos de 24-56 carbonos.
•
A continuación, los ácidos meromicólicos son modificados: un
meromicolato se condensa con un ácido graso para dar un βoxomicolato, que se reduce para formar el ácido micólico.
Sistema FAS-II
Sistema FAS-II
•
El sistema FAS-II es dependiente de AcpM (acyl carrier protein).
•
Aunque el mecanismo preciso de toxicidad de la isoniazida no ha
sido descrito, la acción inhibidora de la isoniazida en forma activa
(INH*) parece ser el resultado del efecto sobre tres dianas en el
sistema FAS-II: InhA, KasA y AcpM.
•
Por un lado la isoniazida se une al NADH en el sitio activo de
InhA (enoil ACP reductasa dependiente de NADH).
•
Pero además forma un complejo ternario al unirse
covalentemente con las enzimas KasA (β-cetoacil ACP sintasa
encargada de la elongación de los ácidos grasos) y la AcpM (acyl
carrier protein).
Sistema FAS-II
Resistencia a isoniazida
•
Después de la absorción por la bacteria, la isoniazida se tiene que
convertir a una forma activa (INH*).
•
La enzima catalasa KatG efectua la activación de la isoniazida y
está posiblemente implicada en la resistencia antibiótica. Su
función natural es eliminar peróxidos en situaciones de stress
oxidativo.
•
La isoniazida es el fármaco más utilizado entre el arsenal de
fármacos antituberculosos y al que más frecuentemente emerge
la resistencia.
•
La resistencia a isoniazida emerge frecuentemente debido a
mutaciones que inactivan KatG.
Detección mediante microarrays de cambios
en los perfiles de expresión génica
•
La era post-genómica en la investigación y diseño de nuevos
fármacos antituberculosos se inició a partir de la secuenciación
del genoma de M. tuberculosis H37Rv.
•
Esto hizo posible el primer abordaje genómico a la biología de
este patógeno y al estudio de la resistencia a fármacos.
•
Objetivo: Examinar cambios en la expresión génica de cepas de
M.tuberculosis susceptibles y resistentes durante la exposición a
fármacos (isoniazida y etionamida).
•
Aunque previamente se habían realizado estudios bioquímicos
que implicaban a algunas proteínas en la resistencia, se llevó a
cabo un estudio general para identificar el mayor número de
posibles dianas para fármacos antituberculosis.
Detección mediante microarrays de cambios
en los perfiles de expresión génica
•
La etionamida está relacionada estructuralmente con la isoniazida
y se utiliza como antibiótico de segunda linea.
•
A diferencia de la isoniazida, no tiene el requerimiento de la
activación mediada por KatG.
•
Isoniazida y etionamida inhiben la biosíntesis de ácidos micólicos
y tienen como dianas las mismas enzimas del sistema FAS-II.
•
Hipótesis: la etionamida genera un perfil similar de respuesta
génica que la isoniazida en M. tuberculosis.
Microarray de DNA de M. tuberculosis H37Rv
•
Amplificación con primers específicos de cada ORF, tamaño de
los amplicones: 200-1000 bp.
•
Impresión robótica en portas recubiertos de polylisina.
•
Control DNAs: DNA genómico total y DNA ribosómico.
•
Construcción de 3 series de microarrays:
• Version completa: 3.834 ORFs del total de 3.924 ORFs (97%).
• Versiones reducidas: 203 ORFs seleccionadas conteniendo
genes que codifican enzimas lipogénicas o lipolíticas (29%).
Perfiles de expresión génica con un Microarray de DNA
Preparar Microarray
Clones DNA
Purificar
productos
PCR
Impresión
robótica
Aislar RNA y marcaje
Muestra A
Aislar
RNA
Muestra B
Aislar
RNA
Marcaje con Cy5
Marcaje con Cy3
Mezclar, hibridar sondas y analizar datos
Hibridación
microarray
Lavado
Analizar datos
Proceso para el análisis de microarrays de DNA
Cepa M. tuberculosis con fármaco
Cepa M. tuberculosis sin fármaco
Crecimiento
Tratamiento con fármaco:
INH o Etionamida
en medio 7H9
Aislamiento RNA
Marcaje con Cy3-dUTP
Marcaje con Cy5-dUTP
Combinar los dos cDNAs
Hibridación, 63°C, 4-6 h
Lavado
Escaneado
Proceso para el análisis de microarrays de DNA
•
Cultivos líquidos de M. tuberculosis en fase de crecimiento
exponencial.
•
Toma de muestras bacterianas a intervalos definidos durante las
8 primeras horas de tratamiento con el fármaco.
•
Marcaje cDNAs:
• Inicio de tratamiento: t = 0, marcaje con Cy3
• Resto de intervalos(20 min, 40 min, 1 h, 4 h, 8 h):
marcaje con Cy5
•
Para cada intervalo de tiempo, los dos cDNAs marcados
(Cy3/Cy5) se mezclaron e hibridaron con el microarray de DNA de
M. tuberculosis H37Rv.
Detección mediante microarrays de cambios
en los perfiles de expresión génica
•
M. tuberculosis 1254: cepa sensible a isoniazida y etionamida.
•
Microarray de DNA version completa (3.834 ORFs).
Detección mediante microarrays de cambios
en los perfiles de expresión génica
•
La exposición a isoniazida aumenta significativamente la
transcripción de dos clases de genes que codifican proteínas
fisiológicamente relevantes para el modo de acción del fármaco:
•
A. Genes implicados en la síntesis de la pared celular, incluyendo
un cluster de 5 genes (Rv2243-Rv2247) que codifica componentes
del sistema FAS-II y fbpC (trehalosa dimicolil transferasa).
•
B. Genes implicados en procesos de respuesta a los efectos
tóxicos del fármaco: efpA, fadE23, fadE24 y ahpC que codifica la
alkil-hidroperóxido reductasa.
•
La etionamida genera un perfil similar de respuesta génica que la
isoniazida en M. tuberculosis 1254.
Detección mediante microarrays de cambios
en los perfiles de expresión génica
•
Microarray de DNA version reducida
(203 ORFs) de M. tuberculosis 1254.
•
Tratamiento isoniazida a 4 h.
•
Posiciones B13-16: cluster de genes
FAS-II (Rv2244-Rv2247).
Posiciones P2-P3: DNA control premarcado con Cy3 y Cy5.
Posiciones A1, P1 y P16: DNA
genómico.
Posiciones A4-A10: DNA ribosómico.
•
•
•
Detección mediante microarrays de cambios
en los perfiles de expresión génica
•
M. tuberculosis 4309A:
• resistente a isoniazida
• sensible a etionamida.
•
M. tuberculosis 4309A no presenta un perfil de expresión génica
dependiente de isoniazida.
•
El tratamiento de M. tuberculosis 4309A con etionamida produce
un perfil de expresión génica similar al de la cepa 1254 tratada con
isoniazida: inhibición del sistema FAS-II.
Detección mediante microarrays de cambios
en los perfiles de expresión génica
Tratamiento isoniazida
•
Tratamiento etionamida
Microarray de DNA version reducida (203 ORFs) de M. tuberculosis 4309A.
Perfil de expresión génica temporal de M. tuberculosis 1254
en presencia de isoniazida
(„) - inhA
(‹) - fas
(o) - kasA
(∆) - fadE24
(+) - ahpC
(⃞) - efpA
Confirmación de los perfiles de expresión génica de
M. tuberculosis 1254 en presencia de isoniazida
•
•
•
El análisis de microarrays muestra que la expresión de inhA y fas no
cambia en presencia de isoniazida:
InhA, enoil ACP reductasa dependiente de NADH del sistema FAS-II
Fas, sistema FAS-I
•
Para comprobar los resultados obtenidos en los experimentos de
microarrays, se realizaron experimentos de RT-PCR: comparación de
la abundancia de transcritos kasA, efpA y ahpC en M. tuberculosis sin
tratamiento y tratada con isoniazida.
•
La expresión inducida por isoniazida de estos genes se confirmó
mediante RT-PCR.
Confirmación de los perfiles de expresión génica de
M. tuberculosis 1254 en presencia de isoniazida
Perfiles de expresión génica en presencia de isoniazida
•
La inducción de estos genes se detecta desde los 20 minutos después
del tratamiento con isoniazida.
•
Por tanto, la inhibición del sistema FAS-II se detecta rápidamente y
provoca una respuesta a nivel transcripcional.
•
Las células de M. tuberculosis tratadas con isoniazida reconocen los
efectos del fármaco, y se activan mecanismos de respuesta mediante
un aumento de la expresión de estos genes para tratar de compensar
las actividades reducidas.
•
Como consecuencia del tratamiento con isoniazida, no se producen
ácidos micólicos y ocurre una acumulación de precursores, ácidos
grasos saturados (C24-C26), y una reducción de ácidos micólicos.
Perfiles de expresión génica en presencia de isoniazida
•
La acumulación de ácidos grasos saturados (C24-C26)
probablemente refleja la etapa de la síntesis de ácido
meromicólico que es interrumpida por la acción de la isoniazida.
•
La acumulación de precursores está asociada con un incremento
de la producción de KasA y AcpM.
•
La inducción de estos genes es la consecuencia de un
mecanismo de retroregulación que detecta el desequilibrio de
precursores y la reducción de ácidos micólicos.
•
También es probable que la isoniazida induzca genes que
codifican otros componentes relacionados de la ruta biosintética
de ácido micólico.
Perspectivas
•
La investigación y desarrollo de fármacos antituberculosis es un
reto continuado.
•
Los resultados de microarrays de DNA confirman las
observaciones de estudios bioquímicos e indican nuevos genes
directamente implicados en los procesos inhibidos por isoniazida.
•
Los resultados derivados de este tipo de estudios con microarrays
de DNA pueden definir nuevas dianas para fármacos y sugieren
nuevos métodos para identificar componentes que inhiben estas
dianas.