metodo para la produccion de semillas hibridas utilizando la

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
C12N 15/82 (2006.01)
C12N 15/29 (2006.01)
A01H 5/00 (2006.01)
ESPAÑA
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11 Número de publicación: 2 263 200
51 Int. Cl.:
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 98907657 .5
86 Fecha de presentación : 27.02.1998
87 Número de publicación de la solicitud: 0972058
87 Fecha de publicación de la solicitud: 19.01.2000
54 Título: Método para la producción de semillas híbridas utilizando la esterilidad condicional femenina.
30 Prioridad: 03.03.1997 US 39527 P
73 Titular/es: Syngenta Participations AG.
Schwarzwaldallee 215
4058 Basel, CH
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
01.12.2006
72 Inventor/es: Harper, Stacy, Marie;
Crossland, Lyle, Dean y
Pascal, Erica
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto
ES 2 263 200 T3
01.12.2006
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Método para la producción de semillas híbridas utilizando la esterilidad condicional femenina.
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Campo de la invención
La presente invención se refiere a la producción de semillas híbridas en plantas. En particular, la invención se
refiere a un método de producción de semillas híbridas que usa como un progenitor del híbrido una planta transformada con un gen quimérico que, cuando se expresa en la estructura reproductora femenina, produce una proteína que
cataliza la conversión de una protoxina aplicada exógenamente en una toxina, haciendo así ineficaz la fertilización.
También se incluye en la invención el uso de las plantas femeninas-estériles condicionales en combinación con plantas
androestériles (masculinas-estériles) condicionales para producir más eficientemente semillas híbridas, genes quiméricos útiles para la invención, plantas transgénicas que comprenden los genes quiméricos, y nuevos promotores útiles
para la expresión en las estructuras reproductoras femeninas de una planta.
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Fundamento de la invención
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La heterosis en plantas de cultivo ha recibido una considerable atención a causa de su marcado efecto en la mejora
del rendimiento. La mayor productividad al cruzar diferentes cepas de maíz se observó por primera vez a finales del
siglo XIX y después se desarrolló siguiendo procedimientos genéticos sistemáticos. El método habitual para criar
maíz híbrido es establecer muchas líneas puras, hacer cruces y determinar qué híbridos son más productores en una
localidad dada.
El éxito del maíz híbrido hizo que los criadores de plantas explorasen la existencia y la magnitud del vigor híbrido en otras muchas especies de interés económico. En general, los híbridos mostraron mayores rendimientos en
comparación con las variedades no híbridas. Los híbridos son normalmente más eficientes en el uso de factores de
crecimiento y dan un mayor rendimiento por unidad para factores de crecimiento tales como agua y fertilizante. Bajo condiciones adversas, los híbridos son generalmente superiores a los cultivos parentales o progenitores, con un
comportamiento más estable en una gama amplia de ambientes. Con los híbridos, hay uniformidad en el producto y
madurez que frecuentemente facilita la recolección y hace aumentar el valor del producto en el mercado. El híbrido
puede combinar también caracteres que son difíciles o imposibles de combinar de otra forma. Esto es particularmente
cierto para muchos híbridos interespecíficos e intergenéricos. La conclusión general de la investigación es que el vigor híbrido, un fenómeno común en las plantas, es de magnitud suficiente para garantizar la explotación comercial si
pueden desarrollarse las técnicas apropiadas.
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El vigor híbrido ha sido reconocido como un fenómeno generalizado en plantas y animales durante muchos años.
Los híbridos comerciales se usan ahora con profusión en muchos cultivos, incluyendo maíz, sorgo, caña de azúcar y
girasol. Otros cultivos en grandes superficies, como el trigo, la cebada y el arroz, se desarrollan aún principalmente
como variedades puras. Se están llevando a cabo investigaciones en estos y otros cultivos que permitan el uso extendido
de híbridos comerciales en el futuro, pero el principal factor limitante en el desarrollo de nuevos cultivos híbridos es
la carencia de métodos para la producción económica de semillas de híbridos en estos cultivos.
Tradicionalmente, la producción de semillas de híbridos en gran escala se lleva a cabo plantando filas o bloques
separados de líneas parentales femeninas y las líneas parentales masculinas para polinizarlas. Solamente se recolecta
la semilla producida en las filas parentales femeninas. Para asegurarse de que esta semilla es una semilla híbrida
no contaminada con semilla autofecundada, han de establecerse métodos de control de la polinización en las plantas
parentales femeninas para asegurar que las semillas formadas de ellas es el resultado de la polinización cruzada y no de
la autopolinización. Los mecanismos de control de la polinización conocidos son generalmente mecánicos, químicos
o genéticos.
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La eliminación del polen fértil del progenitor femenino puede realizarse por emasculación manual en algunas especies tales como el maíz, una especie monoica. Tal eliminación de polen fértil se consigue arrancando o cortando
la inflorescencia masculina (borla) de las plantas de la población parental femenina. Este simple procedimiento previene la auto-fertilización desborlando mecánicamente las plantas femeninas antes de desprender el polen para evitar
la autofecundación. Sin embargo, la mayoría de las plantas de cultivo de interés tienen órganos masculinos y femeninos funcionales dentro de la misma flor, que hacen impracticable la emasculación. Incluso cuando es practicable,
esta forma de producción de semillas híbridas es extremadamente laboriosa y por tanto costosa. Para eliminar la laboriosa operación de eliminación de la inflorescencia masculina (desborlamiento) que es necesaria para prevenir la
autofertilización en cruces de híbridos, en algunas se han usado especies factores genéticos que producen esterilidad
masculina.
La esterilidad masculina (androesterilidad) en el progenitor femenino puede ser controlada por genes nucleares o
por un sistema citoplásmico-genético. La esterilidad masculina genética se controla por genes nucleares en los que
los alelos para la esterilidad son generalmente recesivos respecto a los alelos para la fertilidad. La esterilidad masculina genética se presenta en muchas especies. Normalmente, es controlada por un único gen recesivo que debe ser
homocigótico para producir esterilidad masculina. Los criadores que usan la esterilidad masculina genética para la
producción de semillas de híbridos desarrollan normalmente una línea femenina fenotípicamente uniforme que segrega 50% de individuos estériles masculinos (androestériles) y 50% de fértiles masculinos (androfértiles). La semilla
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para estas líneas aumenta en el aislamiento recolectando la semilla de plantas homocigóticas para el gen de esterilidad
masculina que son polinizadas por plantas heterocigóticas para el gen de esterilidad masculina, y por tanto androfértiles. Para producir una semilla híbrida comercial con esterilidad masculina genética, el 50% de las plantas femeninas
androfértiles han de ser arrancadas del terreno tan pronto como pueda identificarse su fertilidad. El trabajo asociado
con esta operación de separación de las plantas fértiles de las plantas femeninas ha restringido en gran medida el uso
de la esterilidad masculina genética en la producción de semillas híbridas. Hay diversos problemas asociados con este
sistema para producir semillas híbridas comerciales. En primer lugar, no es posible eliminar plantas fértiles de las
plantas masculinas-estériles deseadas en la población femenina. Las plantas androestériles genéticas han de mantenerse emparejándolas con individuos androfértiles. La mitad de las plantas Fl de tal cruce serían estériles, pero las demás
plantas serían fértiles. Así, las plantas androfértiles no deseadas en la población femenina pueden diseminar polen y
reducir la eficacia del progenitor masculino deseado.
El éxito del uso de la esterilidad masculina citoplásmica para la producción comercial de semillas híbridas requiere un citoplasma androestéril estable, una fuente adecuada de polen y un sistema efectivo para conseguir el polen
del progenitor masculino para la hembra femenina-estéril. También, el sistema citoplásmico-genético de esterilidad
masculina requiere tres líneas para producir un único híbrido cruzado: la línea A (androestéril), la línea B (mantenedor androfértil) y la línea R (androfértil con genes restauradores). Los cruces de tres vía producidos con esterilidad
masculina citoplásmica-genética implicaron el mantenimiento y la producción de cuatro líneas, una línea A y B de un
endógamo, y endógamos androfértiles de las otras dos.
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Además, el tizón sureño del maíz causado por Helminthosporium maydis, Raza T, que atacaba gravemente a
todos los híbridos de maíz con citoplasma T androestéril citoplásmico, demostró la vulnerabilidad de una industria de
producción de semillas híbridas basada en una única fuente de citoplasma androestéril. Para el maíz híbrido, la mayor
parte de los productores de semillas han vuelto a la emasculación manual o mecánica y a la polinización anemófila
(realizada por el viento).
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También pueden producirse semillas híbridas mediante el uso de productos químicos que bloquean o matan la
formación de polen viable. Estos productos químicos, llamados gameticidas, se usan para conferir una androesterilidad
transitoria. Sin embargo, el coste y la disponibilidad de los productos químicos, y la fiabilidad de las aplicaciones,
limitan la producción de semillas híbridas mediante el uso de gameticidas.
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También se han descrito métodos moleculares para la producción de semillas híbridas. Tales métodos transforman
plantas con construcciones que contienen DNA antisentido y otros genes que son capaces de controlar la producción
de polen fértil en las plantas. Tales plantas regeneradas son funcionalmente androestériles y se usan para la producción
de semillas híbridas por cruce con polen de plantas androfértiles. Las principales deficiencias de estos planteamientos
surgen del hecho de que el gen de la esterilidad masculina construido por ingeniería genética, tanto si es un antisentido o RNAsa, puede mantenerse solamente en estado heterocigótico. Son fundamentalmente igual que androestériles
genéticos naturales por cuanto han de mantenerse por cruce con líneas androfértiles isogénicas. Esto es lo más problemático en el terreno del cruce de híbridos en el que la superficie es grande y el rendimiento es crítico. El progenitor
hembra heterocigótico, del que solamente un 50% será androestéril, ha de ser plantado en filas próximas al progenitor
masculino donante de polen y han de eliminarse el 50% de los progenitores femeninos fértiles. Esto se hace más fácil
en estériles masculinos genéticos construidos por ingeniería genética porque puede unirse un gen de resistencia a un
herbicida al gen de la esterilidad masculina, y puede usarse la pulverización del herbicida para eliminar las plantas
fértiles, pero aún supone que las filas de progenitor femenino han de ser plantadas a doble densidad con el fin de conseguir el mismo rendimiento por unidad de superficie de este sistema. Esto producirá alguna pérdida de rendimiento
debida a la competencia. La pulverización de herbicida también supone una pérdida de rendimiento ya que las plantas resistentes nunca son inmunes en un 100% al herbicida, y los costes de pulverización del producto químico son
considerables.
Un inconveniente de estos sistemas de producción de semillas híbridas tradicionales es la necesidad de plantar
filas o bloques separados de las líneas parentales masculina y femenina. La distancia física entre las plantas donantes
de polen masculino y receptoras de polen femenino tiene por resultado una transferencia de polen menos eficiente,
deficiente construcción determinada de la semilla en el parental femenino, la necesidad de dedicar más terreno de
producción a las plantas donantes de polen, y menos rendimiento de semillas híbridas por unidad de superficie del
terreno. Este inconveniente es especialmente agudo en especies de cultivo tales como el trigo que liberan pequeñas
cantidades de polen, y el polen no es transportado eficazmente por el viento. Los métodos tradicionales de producción
de semillas híbridas, cuando se aplican al trigo, han precisado dedicar de un tercio a dos tercios del terreno de producción a plantas donantes de polen masculinas (Johnson y Schmidt, Adv. Agronomy 20: 199-233 (1968); Wilson,
Plant Breeding Reviews 303-309 (1989)). El resultado es que el coste de producción de semillas híbridas de trigo es
demasiado elevado para mantener una industria a pesar de la disponibilidad de técnicas de producción de semillas
híbridas y la heterosis probada.
Para conseguir un sistema de producción de semillas híbridas más económico para trigo y otros cultivos, es necesario acercar las plantas parentales masculinas y femeninas para efectuar una transferencia del polen más eficiente.
En vez de estar en bloques separados de filas de forma que pueden recolectarse las semillas de solamente las plantas
parentales femeninas, las plantas parentales masculinas y femeninas necesitan ser interplantadas en las mismas filas,
lo que significa que las plantas están separadas por unos centímetros en vez de estarlo por unos metros. Dado que sería
impracticable recolectar semillas de solamente los progenitores femeninos cuando están tan estrechamente espaciadas
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para hacer progenitores, es necesario prevenir la formación de semillas viables en las plantas parentales masculinas
además de prevenir la formación de polen viable en las plantas parentales femeninas.
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Un método para prevenir la formación de semillas viables es el uso de plantas femeninas-estériles. La esterilidad
femenina de origen natural ha sido descrita en varios cultivos (Honma y Phatak, Journal of Heredity 55: 143-145
(1964); Sniezdo y Winiarczyk, Protoplasma 187: 31-38 (1995); Justus y Meyer, Journal of Heredity 54: 167-168
(1963); Hanna y Powell, Journal of Heredity 65: 247-249 (1974); Brown y Bingham, Crop Science 24: 1207-1208
(1984)), pero hay problemas para mantener estas líneas y no se usan comercialmente. Se ha descrito un método para
construir un gen dominante de esterilidad femenina (EP 412.006 A1 (1990); Goldman et al., EMBO Journal 13: 29762984 (1994)), pero también aquí el mantenimiento de una línea femenina-estéril que contenga este gen es problemático
debido a la incapacidad para crear una línea homocigótica para el gen de la esterilidad femenina. Se ha descrito un
método de mantenimiento y uso en la producción de semillas híbridas de este gen de esterilidad femenina (EP 402.270
(1990)). Sin embargo, requiere la introducción de un gen de esterilidad femenina, un gen restaurador de un primer gen
de esterilidad masculina, un segundo gen de esterilidad masculina y dos genes de resistencia a un herbicida en una
compleja serie de transformaciones secuenciales para crear la línea parental masculina estéril-femenina, y requiere
la introducción del primer gen de esterilidad masculina, un gen restaurador del gen de esterilidad femenina y un
gen de resistencia a un herbicida en una serie compleja de transformaciones secuenciales para crear la línea parental
femenina androestéril. El tratamiento con herbicida se necesita para seleccionar los genotipos correctos en cada ronda
de multiplicación de la línea, y para producir la semilla híbrida el terreno de producción necesita ser tratado con uno de
los herbicidas para eliminar genotipos indeseables que son el resultado del procedimiento. Aunque el anterior sistema
podría proporcionar la ventaja económica de interplantar las líneas masculina y femenina, es demasiado complicado
para tener utilidad comercial.
En consecuencia, existe una necesidad de un método simple y económico para la producción de semillas híbridas.
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Sumario de la invención
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La presente invención proporciona un método para la producción de semillas híbridas, que comprende producir una
planta femenina-estéril condicional que comprende un promotor femenino-preferencial unido operativamente a una
secuencia de codificación que codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina en una toxina, en donde
dicho promotor femenino-preferencial se elige entre el grupo que consiste en un promotor aislable del clon pSH64,
que tiene el número de entrada NRRL 8-21920, un promotor aislable del clon pCIB 10302 que tiene la secuencia
expuesta en SEC ID Nº: 2, y un promotor aislable del clon X2-1, que comprende los nucleótidos 1-1093 de la SEC ID
Nº: 14, interplantar la planta femenina-estéril condicional con una planta androestéril, inducir la esterilidad femenina
aplicando la protoxina a la planta femenina-estéril condicional, y producir las semillas híbridas. En una realización
de la invención preferida, la planta es normalmente auto-polinizada o bien es normalmente sometida a polinización
cruzada. En realizaciones preferidas de un modo particular, la planta se elige entre el grupo consistente en maíz,
trigo y cebada. También se proporcionan por medio de la presente invención semillas híbridas producidas por el
método.
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La invención proporciona además una casete de expresión que comprende un promotor femenino-preferencial elegido entre el grupo que consiste en un promotor aislable del clon pSH64, que tiene el número de entrada NRRL 821920, un promotor aislable del clon pCIB 10302 que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 2, y un promotor aislable del clon X2-1, que comprende los nucleótidos 1-1093 de la SEC ID Nº: 14, unida operativamente a una
secuencia de codificación que codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina en una toxina. Una
realización preferida comprende un promotor femenino-preferencial unido operativamente a la secuencia de codificación del gen argE. Una realización particularmente preferida comprende el promotor femenino-preferencial del
clon PSA64 o bien del clon PCIB1032 unido operativamente a la secuencia codificadora de argE. Otras realizaciones de secuencias codificadoras útiles en la invención son las obtenidas del gen de la monoxigenasa P450sul , y el
gen pehA.
También se proporcionan por medio de la invención plantas que comprenden una casete de expresión de la invención que comprende el promotor femenino-preferencial unido operativamente a una secuencia codificadora que
codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina en una toxina, y semillas de tales plantas.
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También se describe en el presente texto el uso de una protoxina en un método para inducir fertilidad femenina
en una planta, que comprende un promotor femenino-preferencial unido operativamente a una secuencia codificadora
que codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina en una toxina, e inducir esterilidad femenina
aplicando la protoxina a la planta.
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También se describe en el presente texto el uso de la secuencia codificadora del gen argE en un método para producir semillas híbridas en el que la secuencia codificadora de argE esta unida operativamente a un promotor femeninopreferencial que, cuando se expresa, cataliza la conversión de una protoxina en una toxina, induciendo así esterilidad
femenina.
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Descripción detallada de la invención
Definiciones y nomenclatura
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La expresión “estructura reproductora femenina”, como se usa en el presente texto, significa aquellas partes de una
planta que componen el carpelo, o gineceo (un término establecido de antiguo, usado en relación con el gineceo es
“pistilo”). El carpelo de una flor de una planta incluye, pero sin limitarse a ellos, estigma, estilo, ovario y células o
tejidos que comprenden el estigma, estilo y ovario. Un promotor “femenino-preferencial”, como se usa en el presente
texto, significa un promotor que tiene actividad transcripcional solamente o principalmente en una o más de las células
o tejidos de una estructura reproductora femenina de una planta.
“Casete de expresión”, como se usa en el presente texto, significa una secuencia de DNA capaz de dirigir la
expresión de un gen en células vegetales, que comprende un promotor unido operativamente a una región codificadora
de aminoácidos que está unida operativamente a una región de terminación. El gen puede ser quimérico, lo que
significa que al menos un componente del gen es heterólogo con respecto a, al menos, otro componente del gen. El gen
puede ser también de origen natural, pero que ha sido obtenido de una forma recombinante útil para la transformación
genética de una planta.
“Protoxina”, como se usa en el presente texto, significa una sustancia química con una fitotoxicidad mínima que
puede ser activada por la acción de una enzima para producir un producto de reacción que es tóxico para las células
de la planta o que interrumpe las funciones de las células de la planta de manera suficiente para retrasar, suprimir o
prevenir el crecimiento, el desarrollo o la actividad metabólica normales. El producto de reacción tóxico se denomina
en el presente texto como “toxina”. En la invención, la protoxina se aplica de forma exógena a la planta, lo que puede
realizarse por cualquier medio que facilite la absorción foliar, la absorción por la raíz, el contacto directo con las partes
de la planta señaladas o el movimiento sistémico de una a otra parte de la planta.
“Fertilidad femenina”, como se usa en el presente texto, significa que las estructuras reproductoras femeninas de
una planta son capaces de soportar la formación de semilla viable cuando se polinizan con polen funcional o viable.
“Esterilidad femenina”, como se usa en el presente texto, significa que las estructuras reproductoras femeninas de una
planta no son capaces de soportar la formación de semilla viable cuando se polinizan con polen funcional o viable.
“Esterilidad femenina condicional”, como se usa en el presente texto, significa que se produce esterilidad femenina
cuando se realiza la aplicación exógena de una protoxina que es posteriormente activada por una enzima para dar lugar
a un producto de reacción tóxico. “Esterilidad masculina” (androesterilidad), como se usa en el presente texto, significa
que las estructuras reproductoras masculinas de una planta son incapaces de producir polen viable o funcional.
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Control de la fertilidad femenina en las plantas
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Uno de los aspectos ventajosos de la presente invención es su uso en el control de la formación de semillas
viables en plantas bajo condiciones de campo, controlando la fertilidad femenina. La fertilidad de la hembra puede
controlarse obteniendo una planta transgénica que comprende una secuencia de nucleótidos quimérica o recombinante
que codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina en una toxina, que cuando se expresa bajo el
control de un promotor femenino-preferencial proporcionará las estructuras reproductoras femeninas incapaces de la
formación de semillas viables al tener lugar la aplicación exógena de la protoxina. Se dice que las plantas transgénicas
son condicionales para la esterilidad femenina porque la aparición de esterilidad femenina está condicionada por la
presencia de la protoxina. La conversión de una protoxina en una toxina en las estructuras reproductoras femeninas
podría evitar la formación de semillas viables por medio de varios mecanismos, dependiendo de cuándo y en qué
células o tejidos está activo el promotor femenino-preferencial. Esto incluye, pero sin limitarse a ello: 1) interrupción
en el desarrollo normal del pistilo de forma que el pistilo deja de ser competente para permitir la fertilización, 2)
inhibición del crecimiento del tubo polínico por la toxina convertida, 3) interrupción del desarrollo de gametos viables,
y 4) interrupción del desarrollo de la semilla después de la fertilización.
En una realización de la presente invención, se aplica exogénicamente una protoxina a plantas transgénicas bajo
condiciones de campo, y la conversión de la protoxina en toxina tiene lugar en la estructura reproductora femenina.
La formación de semilla viable se evita por la acción de la toxina en la estructura reproductora femenina.
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Secuencias de codificación y protoxinas útiles en la invención
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Las secuencias de codificación útiles para la invención incluyen, pero sin limitarse a ellas, cualquier secuencia que
codifique una proteína capaz de convertir una protoxina en una toxina. Estas secuencias de codificación pueden ser de
origen homólogo o heterólogo.
En una realización preferida, la secuencia de codificación del gen argE está unida operativamente a un promotor
femenino-preferencial. La expresión de este gen quimérico en una planta transgénica tiene por resultado esterilidad
femenina condicional en presencia de la protoxina N-acetil fosfinotricina (N-acetil PPT). El producto génico del gen
argE es la N-acetil-L-ornitina desacetilasa de E. coli, que tiene una amplia especificidad para la hidrólisis de sustratos
del tipo R1 -CO-NH-CH((CH2 )-R2 )-COOH. Como resultado de esta actividad, el producto génico de argE cataliza la
conversión de la protoxina acetil-fosfinotricina en la toxina fosfinotricina (PPT) (Kiete et al., The Plant Journal 9:
809-818 (1996)).
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En otra realización preferida, la secuencia de codificación procedente del gen para la monooxigenasa P450sul ,
CPY105A1, está unida operativamente a un promotor femenino-preferencial. Esta expresión tiene por resultado esterilidad femenina condicional en presencia de una protoxina de sulfonamida. La monooxigenasa P450sul de Streptomyces
griseolus, cuando se dirige al cloroplasto, media la N-desalquilación del compuesto de sulfonil urea R7402 (2-metiletil-2,2-dihidro-N-[(4,6-dimetoxipirimidin-2-il)aminocarbonil]-1,2-benzoiaotiazol-7-sulfonamida-1,1-dióxido, y lo
convierte en una toxina (O’Keefe et al., Plant Physiology 105: 473-482 (1994)).
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En otra realización preferida, la secuencia de codificación del gen pehA está unida operativamente a un promotor femenino-preferencial, y esta expresión tiene por resultado esterilidad femenina condicional en presencia de la
protoxina, gliceril glifosato. El producto génico del gen pehA de Burkholderia caryophili PG2982 es una fosfonato
monoéster hidrolasa que cataliza la conversión de la protoxina gliceril glifosato en la toxina glifosato (Dotson et al.,
Plant Journal 10: 383-392 (1996)).
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Cualquier secuencia codificadora que codifique una enzima que catalice la conversión de una protoxina en una
toxina puede ser usada en la presente invención, siempre y cuando esté operativamente unida a un promotor femeninopreferencial de la presente invención.
Promotores útiles en la invención
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Para poner en práctica la presente invención, es deseable que las anteriores secuencias de nucleótidos que codifican
una enzima que cataliza la conversión de una protoxina en una toxina estén operativamente unidas a una secuencia
reguladora 5’ que dirige su expresión de una manera que es preferencial para las estructuras reproductoras femeninas
de una planta. La especificidad de la expresión asegura que el efecto de la enzima expresada se ejerza solamente en
aquellos tejidos o células que son necesarios para la formación de semillas viables y no sean perjudiciales para la
planta más allá de su influencia sobre la fertilidad.
Los genes femenino-preferenciales útiles para especies vegetales específicas pueden ser clonados aislando nuevos
materiales de transcripción expresados en tejidos femeninos, usando técnicas conocidas por los expertos en este campo.
Esto implica aislar el RNA de tejidos femeninos tales como el estigma del maíz o los pistilos del trigo, y cribar
diferencialmente por técnicas tales como display diferencial, sustracción de cDNA elegido por PCR o hibridación
sustractiva, y construcción de una genoteca sustractiva de cDNA para aislar clones de cDNA que son preferencialmente
expresados en los tejidos femeninos y no en otras partes de la planta tales como hojas, raíz o inflorescencia masculina.
La especificidad para el tejido de estos cDNAs clonados puede confirmarse mediante análisis Northern. Las secuencias
promotoras para clones femenino-preferenciales pueden obtenerse entonces usando los nuevos cDNAs aislados como
sondas para el cribado de la genoteca. Pueden aislarse clones genómicos que contienen secuencias reguladoras 5’
y 3’ que se necesitan para la expresión en tejido femenino. Estas secuencias pueden usarse para construir casetes
de expresión para la expresión de genes quiméricos de una manera femenina-preferencial. Véanse, por ejemplo, los
ejemplos descritos en el presente texto.
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Otros elementos reguladores útiles en la invención
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La región reguladora 5’ de la casete de expresión puede incluir también otras secuencias potenciadoras. Se han
encontrado numerosas secuencias que potencian la expresión de un gen en plantas transgénicas. Por ejemplo, se sabe
que varias secuencias guía no traducidas derivadas de virus potencian la expresión. Específicamente, se ha demostrado
que secuencias guía procedentes del virus del mosaico del tabaco (TMV, la secuencia “W”), el virus del moteado
clorótico del maíz (MCMV) y virus del mosaico de la alfalfa (AMV) son eficaces para potenciar la expresión (p. ej.
Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990). Otras guías
conocidas en la técnica incluyen, pero sin limitarse a ellas:
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Guías de picornavirus, por ejemplo guía EMCV (región no codificadora 5’ de la encefalomiocarditis) (Elroy-Stein,
O., Fuerst, T. R., y Moss, B. PNAS USA 86: 6126-6130 (1989));
Guías de potivirus, por ejemplo guía de TEV (Tobacco Etch Virus) (Allison et al. (1986); guía de MDMV (virus
del mosaico enano del maíz); Virology, 154: 9-20);
55
Guía de la proteína de unión de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak, D. G., y Sarnow,
P., Nature, 353: 90-94 (1991);
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Guía no traducida del mRNA de la proteína de la envoltura del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4),
(Jobling, S. A., y Gehrke, L., Nature, 325: 622-625 (1987);
Guía del virus del mosaico del tabaco (TMV), (Gallie, D. R. et al., Molecular Biology of RNA, páginas 237-256
(1989); y
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Guía del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel, S. A. et al., Virology, 81: 382-385 (1991). Véase
también Della-Cioppa et al., Plant Physiology, 84: 965-968 (1987).
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Se ha demostrado que varias secuencias de intrones potencian la expresión cuando se añaden a la región reguladora
5’, en particular en células monocotiledóneas. Por ejemplo, se ha encontrado que los intrones del gen AdhI del maíz
potencian de forma significativa la expresión del gen del tipo silvestre bajo su promotor cognado cuando se introducen
en células de maíz (Callis et al., Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987)).
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Además de los promotores, también se dispone de una variedad de terminadores transcripcionales 3’ para su uso
en la presente invención. Los terminadores transcripcionales son responsables de la terminación de la transcripción
y la correcta poliadenilación del mRNA. Terminadores transcripcionales apropiados son aquellos que se sabe que
actúan en plantas e incluyen el terminador CaMV 35S, el terminador tml, el terminador de la nopalina sintetasa, el
terminador rbcS E9 del guisante y otros conocidos en la técnica. Estos pueden usarse tanto en monocotiledóneas como
en dicotiledóneas.
Transformación de plantas
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Las casetes de expresión de la presente invención pueden ser introducidas en la célula vegetal de varias maneras
conocidas en la técnica. Los expertos en la técnica apreciarán que la elección del método podría depender del tipo
de planta, es decir monocotiledóneas o dicotiledóneas, señalada para la transformación. Los métodos adecuados para
transformar células vegetales incluyen, pero sin limitarse a ellos, microinyección (Crossway et al., BioTechniques 4:
320-334 (1986)), electroporación (Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606 (1986), transformación
mediada por Agrobacterium (Hinchee et al., Biotechnology 6: 915-921 (1988)), transferencia de genes directa (Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984)), y aceleración de partículas balísticas usando dispositivos disponibles de
Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin y BioRad, Hercules, California (véanse, por ejemplo, Sanford et al., patente de
EE.UU. nº 4.945.050 y McCabe et al., Biotechnology 6: 923-926 (1988)). Véanse también Weissinger et al., Annual
Rev. Genet. 22: 421-477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5: 27-37 (1987) (cebolla); Christou
et al., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988) (soja); McCabe et al., Bio/Ttechnology 6: 923-926 (1988)) (soja); Datta et
al., Bio/Technology 8: 736-740 (1990) (arroz); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4305-4309 (1988) (maíz),
Klein et al., Bio/Technology 6: 559-563 (1988) (maíz); Klein et al., Plant Physiol. 91: 440-444 (1988) (maíz); Fromm
et al., Bio/Technology 8: 833-839 (1990) (maíz); y Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990) (maíz); Svab et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530 (1990) (cloroplasto del tabaco); Koziel et al., Biotechnology 11: 194200 (1993) (maíz); Shimamoto et al., Nature 338: 274-277 (1989) (arroz); Christou et al., Biotechnology 9: 957-962
(1991) (arroz); solicitud de patente europea EP 0 332 581, Horn et al. (dáctilo aglomerado y otras Pooideae); Vasil et
al., Biotechnology 11: 1553-1558 (1993) (trigo); Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993) (trigo); Wan y
Lemaux, Plant Physiol. 104: 37-48 (1994) (cebada).
Un conjunto de realizaciones particularmente preferidas para la introducción de las casetes de expresión de la
presente invención en el maíz mediante bombardeo de microproyectiles se describe en el documento U.S. nº de serie
08/008.374, incorporado al presente texto como referencia en su totalidad. Una realización adicional preferida es el
método de transformación del protoplasto para el maíz, como se describe en la solicitud de patente europea EP 0 292
435, así como en la patente de EE.UU. nº 5.350.689. Un conjunto de realizaciones particularmente preferidas para la
introducción de las casetes de expresión de la presente invención en el trigo mediante bombardeo con microproyectiles,
puede encontrarse en la patente de EE.UU. nº 5.610.042.
La transformación de plantas puede realizarse con una única molécula de DNA o con múltiples moléculas de
DNA (es decir, co-transformación), y ambas técnicas son adecuadas para ser usadas con las casetes de expresión de
la presente invención. Se dispone de numerosos vectores de transformación para la transformación de plantas, y las
casetes de expresión de esta invención pueden usarse junto con cualquiera de estos vectores. La selección del vector
dependerá de la técnica de transformación preferida y la especie objetivo de la transformación.
Se dispone de muchos vectores para la transformación usando Agrobacterium tumefaciens. Estos llevan típicamente al menos una secuencia extrema del T-DNA e incluyen vectores tales como pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res.
(1984)). En una realización preferida, las casetes de expresión de la presente invención pueden ser insertadas en el
vector binario pCIB200 o bien en el pCIB2001 para su uso con Agrobacterium. Estas casetes vector para la transformación mediada por Agrobacterium fueron construidas de la manera siguiente. Se creó pTJS75kan mediante digestión
con NarI de pTJS75 (Schmidhauser y Helinski, J. Bacteriol. 164: 446-455 (1985)) que permite la escisión del gen de
la resistencia a la tetraciclina, seguida por la digestión de un fragmento AccI de pUC4K que lleva un NPTII (Messing
y Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)). Se ligaron enlazadores XhoI al fragmento EcoRV de pCIB7 que contiene los extremos de
T-DNA izquierdo y derecho, un gen quimérico nos/nptII seleccionable vegetal y el polienlazador pUC (Rothstein et
al., Gene 53: 153-161 (1987)), y el fragmento digerido con XhoI fue clonado en pTJS75kan digerido con SalI para
crear pCIB200 (véase también el documento EP 0 332 104, ejemplo 19). El pCIB200 contiene los siguientes sitios de
restricción de polienlazador únicos: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI y SalI. El plásmido pCIB2001 es un derivado de
pCIB200 que fue creado mediante la inserción en el polienlazador de sitios de restricción adicionales. Sitios de restricción únicos en el polienlazador de pCIB2001 son EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI
y StuI. El pCIB2001, además de contener estos sitios de restricción únicos, tiene también selección por kanamicina
vegetal y bacteriana, extremos de T-DNA izquierdo y derecho para la transformación mediada por Agrobacterium, la
función trfA derivada de RK2 para la movilización entre E. coli y otros hospedadores, y las funciones OriT y OriV
también de RK2. El polienlazador pCIB2001 es adecuado para la clonación de casetes de expresión en plantas, que
contienen sus propias señales reguladoras.
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Un vector adicional útil para la transformación mediada por Agrobacterium es el vector binario pCIB10, que
contiene un gen que codifica la resistencia a la kanamicina para la selección en plantas, secuencias del extremo derecho
e izquierdo de T-DNA e incorpora secuencias procedentes del plásmido de amplia gama de hospedadores pRK252
que le permiten la replicación tanto en E. coli como en Agrobacterium. Su construcción se describe en Rohstein et al.,
Gene 53: 153-161 (1987). Se han construido varios derivados de pCIB10 que incorporan el gen para higromicina B
fosfonotransferasa descrito por Gritz et al., Gene 25: 179-188 (1983). Estos derivados permiten la selección de células
de plantas transgénicas en solamente higromicina (pCIB743) o en higromicina y kanamicina (pCIB715, pCIB717).
Se han emprendido métodos que usan una forma de transferencia génica directa o bien transferencia mediada
por Agrobacterium normalmente, pero no necesariamente, con un marcador seleccionable que puede proporcionar
resistencia a un antibiótico (p. ej. kanamicina, higromicina o metotrexato) o un herbicida (p. ej. fosfinotricina). Sin
embargo, la elección del marcador seleccionable para la transformación de la planta no es crítica para la invención,
a menos que la expresión de esta resistencia y su actividad bioquímica interfiera con la elección de la conversión de
protoxina en toxina elegida para ser usada en la creación de fertilidad condicional.
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Para ciertas especies vegetales, pueden preferirse diferentes marcadores de selección de antibióticos o herbicidas.
Los marcadores de selección usados rutinariamente en la transformación incluyen el gen nptII que confiere resistencia
a la kanamicina y antibióticos relacionados con ella (Messing y Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature
304: 184-187 (1983)), el gen bar que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White et al., Nucl. Acids Res.
18: 1062 (1990), Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625-631 (1990)), el gen hph que confiere resistencia al
antibiótico higromicina (Blochinger y Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4: 2929-2931), el gen dhfr, que confiere resistencia
al metotrexato (Bourouis et al., EMPO J. 2: 1099-1104 (1983)), el gen de la manosa fosfato isomerasa, que permite la
selección en manosa como fuente de carbono (EP 530 129, WO 94/20627).
Uno de tales vectores útiles para las técnicas de transferencia directa de genes en combinación con la selección
mediante el herbicida Basta (o fosfinotricina) es pCIB3064. Este vector está basado en el plásmido pCIB246, que comprende el promotor CaMV 35S en fusión operativa con el gen GUS de E. coli y el terminador transcripcional CaMV
35S, y se describe en la solicitud publicada PCT WO 93/07278, incorporada al presente texto como referencia. Un gen
útil para conferir resistencia a la fosfinotricina es el gen bar procedente de Streptomyces hygroscopicus (Thompson
et al., EMBO J. 6: 2519-2523 (1987)). Este vector es adecuado para la clonación de casetes de expresión en plantas, que contienen sus propias señales reguladoras. Sin embargo, debe observarse que el uso de bar como marcador
seleccionable puede interferir con la operación de la presente invención si también puede expresarse en estructuras
reproductoras femeninas. Este problema puede solucionarse mediante el uso de promotores que controlan la expresión
en los cultivos de células o tejidos usados para transformación, pero no tienen por resultado la expresión del gen bar
en estructuras reproductoras femeninas.
Otro vector de transformación es el vector pGL2 (Shimamoto et al., Nature 338, 274-276 (1989)) que contiene
el gen de la higromicina fosfotransferasa (hpt) de Streptomyces ligado operativamente al promotor 35S y secuencias
terminadoras de 35S.
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Un vector de transformación adicional es pSOG35, que utiliza el gen de E. coli de dihidrofolato reductasa (DHFR)
como marcador seleccionable que confiere resistencia al metotrexato. Se utilizó PCR para amplificar el promotor 35S
(∼800 pb), intrón 6 procedente del gen Adh1 del maíz (∼550 pb), y 18 pb de la secuencia guía no traducida de GUS
procedente de pSOG10. Un fragmento de 250 pb que codifica el gen de dihidrofolato reductasa tipo II de E. coli fue
también amplificado mediante PCR y estos dos fragmentos de la PCR fueron ensamblados con un fragmento SacI-PstI
procedente de pBI221 (Clonetech) que comprendía el esqueleto del vector de pUC19 y el terminador de la nopalina
sintetasa. El ensamblaje de estos fragmentos generó pSOG19 que contiene el promotor 35S en fusión con la secuencia
del intrón 6, la guía GUS, el gen de DHFR y el terminador de nopalina sintetasa. El reemplazo de la guía GUS en
pSOG19 con la secuencia guía del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) generó el vector pSOG35. pSOG19
y pSOG35 llevan el gen derivado de pUC para la resistencia a la ampicilina y tienen sitios HindIII, SphI, PstI y EcoRI
disponibles para la clonación de secuencias extrañas.
Producción de semillas híbridas usando esterilidad femenina condicional
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Para producir semillas híbridas no contaminadas con semillas producidas por auto-polinización, han de establecerse métodos de control de la polinización para impedir la autopolinización del progenitor femenino y asegurar la
polinización cruzada por el progenitor masculino. Este se realiza normalmente por métodos mecánicos, androesterilidad genética o agentes de hibridación química (CHAs). Por ejemplo, en el maíz, la práctica corriente es la eliminación
mecánica de la inflorescencia del progenitor femenino (o semilla), que es un procedimiento que requiere mucho tiempo y trabajo. En el trigo, el control de la fertilidad por medios mecánicos no es práctico a escala de producción de
semillas, y no están comercialmente establecidas fuentes genéticas de esterilidad masculina. Los métodos de producción de semillas híbridas basados solamente en el control de la polinización requieren que los bloques de plantas
parentales masculinas estén separados físicamente de los bloques de plantas parentales femeninas, ya que las plantas
parentales masculinas producirán semillas de la autopolinización. El uso de la presente invención en la producción de
semillas híbridas ofrece las ventajas de la fiabilidad y la facilidad de uso y, lo más importante, permitirá interplantar
plantas parentales masculinas y femeninas, con el resultado de una transferencia de polen más eficiente, la necesidad
de menos plantas parentales masculinas y una producción más económica de semillas híbridas.
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Para producir semillas híbridas usando la presente invención, se requiere una planta parental transgénica que exprese una enzima que catalice la conversión de una protoxina en una toxina de manera femenina-preferencial. La
obtención de plantas transgénicas que poseen este genotipo se describió anteriormente. Las plantas transgénicas que
contienen los genes quiméricos o recombinantes de la presente invención pueden hacerse homocigóticas y mantenerse
indefinidamente usando métodos normales para la cría de plantas.
Para la producción de semillas híbridas de acuerdo con la presente invención se requiere también una planta parental que sea androestéril. La esterilidad masculina es el fracaso o incapacidad para producir polen viable o funcional.
La esterilidad masculina puede resultar de interrupciones que conducen a la no formación de polen o a la carencia de
capacidad funcional en el polen cuando se ha formado. Por consiguiente, o no se forma el polen o, si se forma, éste es
no viable o bien es incapaz de realizar una fertilización efectiva bajo condiciones normales.
Se conocen muchas fuentes de esterilidad masculina para ser usadas en la producción de semillas híbridas (Kaul,
Male Sterility in Higher Plants, Springer Verlag (1988)). Los genes de la esterilidad masculina citoplásmica de origen
natural y su uso han sido descritos para el maíz (Levings, Science 250: 942-947 (1990), trigo (Toriyama et al., Jpn.
J. Breed. 43: 517-524 (1993)), tabaco (Gerstel et al., Genetics 89: 157-169 (1978)), centeno (Steinborn et al., Theor.
Appl. Genet. 85: 822-824 (1993)), girasol (Crouzillat et al., Plant Mol. Biol. 16: 415-426 (1991)), soja (Davis, patente
de EE.UU. nº 4.763.441 (1988)), Brassica (Grelon et al., Mol. Gen. Genet. 243: 540-547 (1994)), zanahoria (Kitagawa
et al., Sex. Plant Reprod. 7: 41-50 (1994)), sorgo (Chen et al., Plant Mol. Biol. 28: 799-809 (1995)), arroz (Kadowaki
et al., Mol. Gen. Genet. 224: 10-16 (1990)) y cebada (Kaul y Singh, Cytobios 66: 71-85 (1991)).
También es conocida la construcción de genes de esterilidad masculina quiméricos o recombinantes. Se ha demostrado que un gen que codifica una β-1,3-glucanasa, cuando se expresa a partir de un promotor activo solamente en las
células del tapete de la antera, produce esterilidad masculina en plantas transgénicas (Worrall et al., Plant Cell 4: 759771 (1992)). Se ha demostrado que un gen que codifica un gen mitocondrial atp9 no editado del trigo produce esterilidad masculina cuando se expresa a partir del promotor CaMV 35S constitutivo en plantas transgénicas (Hernould et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2370-2374 (1993)). Se ha demostrado que un gen que codifica una enzima RNAsa
produce esterilidad masculina cuando se expresa a partir de un promotor activo solamente en células del tapete de la
antera en plantas transgénicas (DeBlock et al., Planta 189: 218-225 (1993); EP 344.029; Mariani et al., Nature 347:
737-741 (1990)). Se ha demostrado que la expresión de un RNA antisentido complementario a un gen crítico para la
formación de polen produce esterilidad masculina en plantas transgénicas (EP 513.884).
Adicionalmente, hay otros muchos promotores androespecíficos que son bien conocidos en la técnica y que podrían
ser utilizados en la construcción de genes quiméricos de esterilidad masculina. Estos incluyen secuencias promotoras
para la expresión en el polen, el tapete u otras estructuras en la antera. Los ejemplos de promotores androespecíficos
incluyen, pero sin limitarse a ellos, el promotor LAT52 (Twell et al., Dev. 109: 705-13 (1989)), el promotor A127 del
tomate (Dotson et al., Plant J. 10, 383-392 (1996)), el promotor Zmg del maíz (Hamilton et al., Sex. Plant Reprod. 2:
208-212 (1989)), el promotor CDPK del maíz (Guerro et al., Mol. Gen Genet. 224: 161-168 (1990)), los promotores
ant32 y ant43D específicos de la antera descritos en la patente de EE.UU. nº 5.477.002, que se incorpora al presente
texto como referencia en su totalidad. Adicionalmente, pueden clonarse secuencias promotoras para cDNAs específicos de la antera aislando las correspondientes secuencias de DNA genómico y definiendo las regiones reguladoras del
promotor, por ejemplo aislando secuencias promotoras para p450 específico del tubo polínico de la orquídea (Nadeau
et al., Plant Cell 8: 213-239 (1996)) y el Bcp1 de Arabidopsis (Xu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 2106-2110 (1995)).
Del mismo modo, genes nuevos que son androespecíficos pueden ser aislados por diversas técnicas tales como display
diferencial, hibridación sustractiva y escrutinio diferencial de genoteca de cDNA. Una vez identificados, pueden aislarse las correspondientes secuencias genómicas y caracterizarse las regiones promotoras, y estas secuencias se usan
entonces como regiones promotoras para construir casetes de expresión expresadas de una forma androespecífica.
Los anteriores genes artificiales de esterilidad masculina tienen el inconveniente de que su acción es incondicional
y dominante. Una vez creada la planta transgénica, es siempre androestéril, haciendo que el mantenimiento de las
líneas de plantas sea difícil, y haciendo imposible crear una verdadera línea homocigótica de plantas de cría.
Se ha descrito otra categoría de genes de esterilidad masculina en la que el fenotipo de la esterilidad masculina
es condicional. En esta categoría, la fertilidad masculina se interrumpe solamente después de la aplicación de una
protoxina química. En un ejemplo de esterilidad masculina condicional, se ha descrito un gen que codifica una Nacetil-L-ornitina desacetilasa que cataliza la conversión de la protoxina N-acetil-L-fosfinotricina en la toxina herbicida L-fosfinotricina (Kriete et al., Plant Journal 9: 809-818 (1996); EP 531.716 A2 (1992)). Las plantas transgénicas
que expresan este gen en las células tapetales de la antera se hicieron androestériles solamente cuando se las trató
con la protoxina N-acetil-L-fosfinotricina. En otro ejemplo de esterilidad masculina condicional, se ha descrito un
gen que codifica un citocromo bacteriano P450 que cataliza la conversión de una protoxina R7402 de sulfonilurea
en una toxina herbicida (WO 91/03561; O’Keefe et al., Plant Physiology 105: 473-482 (1994)). Las plantas transgénicas que expresan este gen en las células tapetales de la antera se hicieron androestériles solamente cuando se
las trató con la protoxina R7402. En otro ejemplo de esterilidad masculina condicional, se ha descrito un gen que
codifica una fosfonato monoéster hidrolasa que cataliza la conversión de la protoxina gliceril glifosato en la toxina
herbicida glifosato (Dotson, et al., Plant J. 10: 383-392 (96)). Las plantas transgénicas que expresan este gen en las
células tapetales de la antera se hicieron androestériles solamente cuando fueron tratadas con la protoxina glicerol
glifosato.
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Cualquiera de las fuentes de esterilidad masculina descritas anteriormente o conocidas en la técnica podría emplearse en la presente invención. Esto incluye cualquier sistema genético androestéril de origen natural o transformando un
gen quimérico o recombinante en la línea parental femenina de interés.
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Como se describe en el presente texto, la formación de semillas viables se evita en la planta con esterilidad femenina condicional (planta parental masculina) como resultado de la conversión de la protoxina en la toxina en las
estructuras reproductoras femeninas, y la producción de polen se evita en la planta androestéril (planta parental femenina). Para obtener semillas híbridas, la semilla homocigótica del progenitor masculino y el progenitor femenino son
interplantadas en un campo de producción, permitiendo así la eficiente transferencia de polen. En un ejemplo de uso
de la presente invención para producir semillas híbridas, el progenitor femenino es androestéril por cualquier medio
y el progenitor masculino se modifica por ingeniería genética para sea femenina-estéril en presencia de una apropiada protoxina aplicada exógenamente. Después de la aplicación de la protoxina en el momento apropiado durante el
desarrollo de la planta, la única producción de semillas viables será el resultado del polen del progenitor masculino
(femenino-estéril) que fertiliza los óvulos del progenitor femenino (androestéril). En el modo preferido de usar la
presente invención, el progenitor femenino es modificado por ingeniería genética para ser androestéril al aplicarle una
protoxina, mientras que el progenitor masculino se modifica por ingeniería genética para que sea femenina-estéril en
presencia de la misma protoxina. Para producir semillas híbridas, las dos líneas parentales son interplantadas, y después de la aplicación de la protoxina en el momento adecuado durante el desarrollo de la planta solamente se obtienen
semillas híbridas. Por estos medios puede producirse cualquier semilla híbrida que se desee.
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Para producir semillas híbridas de trigo, el progenitor masculino se modifica por ingeniería genética para que
tenga esterilidad femenina en presencia de una protoxina apropiada aplicada exógenamente y el progenitor femenino se
modifica por ingeniería genética para que sea androestéril en presencia de la misma protoxina. Ambas líneas parentales
transgénicas se hacen homocigóticas y la semilla se multiplica mediante prácticas estándar de la industria. Para la
producción de semillas híbridas, la semilla homocigótica de las líneas parentales masculina y femeninas modificadas
por ingeniería genética son interplantadas a una determinada relación de masculinas a femeninas para asegurar una
eficiente polinización. En un momento apropiado durante el desarrollo de la planta, la protoxina se aplica al campo de
producción. Después de la maduración de la semilla, se recolecta el campo de producción entero, dando sólo semillas
híbridas.
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Ejemplos
Los ejemplos que siguen describen con más detalle los materiales y métodos usados para llevar a cabo la invención,
y los resultados consiguientes.
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Ejemplo 1
Plantas de tabaco que son condicionales para la esterilidad femenina
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Se construyó el plásmido pSH58, que contiene el promotor ∆S13 (-339 a -79 del promotor SLG13 fusionado con
-46 a +8 del promotor CaMV 35S, Dzelkalns et al., Plant Cell 5: 855-863 (1993)) y se fusionó con el gen argE (SEC
ID Nº: 3) en el marco de lectura traduccional correcto. El promotor ∆S13 es un promotor femenino-preferencial.
El gen argE se obtuvo del DNA genómico de E. coli mediante reacciones PCR con cebador 5’-TATCTAGAC
CAGAGGTGTGTCAACAAATGAA-3’ (SEC ID Nº: 5) y cebador 5’-CGTCTAGATTGCGGCACTGGAGTTTC-3’
(SEC ID Nº: 6). El fragmento resultante fue clonado en pGEM-TA (Stratagene) y se confirmó la secuencia correcta.
Usando una serie de etapas de PCR y subclonación, se puso una secuencia de consenso traduccional en plantas y un
sitio BamHI secuencia arriba del sitio de inicio de la traducción de argE usando cebadores de PCR, 5’ CGCGGATCC
TAAACAATGAAAAACAAATTACCGCC-3’ (SEC ID Nº: 7) y GCGCCTAGGGCTTAATGCCAGCAAAAATCC-3’
(SEC ID Nº: 8). Este producto se fusionó después secuencia abajo del promotor ∆S13 en el plásmido pSH13 (promotor
∆S13 en sk bluescript) y el terminador transcripcional nos se añadió 3’ al gen de β-glucuronidasa (GUS). Esta casete
∆S13-argE-nos se ligó después como fragmento EcoRI en pCIB200 que contiene extremos de T-DNA y un marcador
seleccionable vegetal funcional, resistencia a la kanamicina. Este plásmido se designó como pSH58.
El plásmido pFA100 se construye de una manera similar a pSH58, que se vio antes, excepto que el gen argE (SEC
ID Nº: 3) reemplaza al gen GUS en Stig1-GUS (Goldman et al., EMBO J. 13: 2976-2984 (1994)) en el marco de
lectura traduccional correcto usando las enzimas de restricción apropiadas. La fusión STIG1-argE se liga después
en un vector tal como pCIB200 que contiene extremos de T-DNA, secuencias de terminación 3’ y un marcador
seleccionable vegetal funcional tal como la resistencia a la kanamicina. El promotor Stig1 es un promotor femeninopreferencial.
Discos de hojas de tabaco se transforman como se describe en Horsch et al., Science 227: 1229-1231 (1985)
con pSH58. La presencia de los transgenes integrados se confirma mediante PCR. El análisis Northern del RNA
hecho a partir de tejido femenino se usa para confirmar la expresión específica del tejido del gen argE en las plantas
transgénicas. Estas plantas son autofecundantes y tienen el fenotipo de la esterilidad femenina condicional. La semilla
T1 se recoge después de la autopolinización. El transgén condicional femenino en pFA100 se introduce también en el
tabaco usando procedimientos similares.
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Ejemplo 2
Plantas de tabaco que son condicionales para la esterilidad masculina
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El plásmido pSH60 se construyó con el promotor TA29 (Kriete et al., Plant J. 9: 809-818 (1996)) fusionado
con el gen argE. El promotor TA29 fue clonado a partir del tabaco mediante PCR usando los cebadores 5’-AACTG
CAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3’ (SEC ID Nº: 9) y 5’-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAA
AAC-3’ (SEC ID Nº: 10). Mediante una serie de pasos de subclonación, el fragmento TA29 fue fusionado secuencia
arriba de argE que contiene la secuencia de traducción de consenso vegetal, como se describe en el Ejemplo 1, y
un terminador transcripcional nos añadido 3’ al gen argE. La casete TA29-argE-nos fue clonada entre extremos de
T-DNA en el plásmido pSGCGF1 que contiene también el marcador seleccionable vegetal higromicina. El plásmido
resultante se designó pSH60.
Discos de hojas de tabaco se transformaron como se describe en Horsch et al., Science 227: 1229-1231 (1985)
con pSH60. La presencia de los transgenes integrados se confirma mediante PCR. El análisis Northern del RNA
hecho a partir de tejido femenino se usa para confirmar la expresión específica del tejido del gen argE en las plantas
transgénicas. Estas plantas son autofecundantes y tienen el fenotipo de la esterilidad masculina condicional. La semilla
T1 se recoge después de la autopolinización.
Discos de hojas de tabaco se transforman también con pGK73, que contiene una casete de expresión del gen
argE bajo el control del promotor TA29 (Kriete et al., Plant J. 9: 809-818 (1996)) como se describe en Horsch et
al., Science 227: 1229-1231 (1985). La presencia de los transgenes integrados se confirma mediante PCR. El análisis
Northern del RNA hecho a partir de anteras se usa para confirmar la expresión específica del tejido del gen argE en las
plantas transgénicas. Estas plantas son autofecundantes y tienen el fenotipo de la esterilidad masculina condicional.
La semilla de la generación T1 se recoge después de la autopolinización.
Ejemplo 3
El tratamiento químico de plantas de tabaco transformadas confiere esterilidad específica del tejido
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35
40
Las semillas de la generación T1 de plantas tanto femeninas-estériles condicionales (transformadas con pFA100)
como plantas androestériles condicionales (transformadas con pGK73) se plantan en el terreno. Una vez que las plántulas han crecido hasta un tamaño suficiente, el tejido foliar se analiza mediante PCR en relación con la presencia del
transgén argE. Las plantas positivas para la PCR se transfieren al invernadero. Estas plantas son totalmente fértiles en
ausencia de protoxina aplicada exógenamente. Un subconjunto de las plantas femeninas-estériles condicionales y un
subconjunto de las plantas androestériles condicionales son tratados con la protoxina acetil-PPT durante las etapas de
crecimiento. Como resultado de la conversión preferencial de la protoxina en toxina, las plantas androestériles condicionales tratadas se hacen androestériles y las plantas femeninas-estériles condicionales tratadas se hacen femeninasestériles. Las plantas no tratadas permanecen completamente fértiles. El polen de las plantas femeninas-estériles tratadas se recoge y se usa para polinizar los pistilos de plantas androestériles tratadas, que son las plantas parentales
femeninas. La fertilización tiene lugar y se produce la semilla híbrida en la planta androestéril.
Ejemplo 4
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65
Obtención de clones de DNA de nuevos genes expresados preferencialmente en la estructura reproductora femenina
del maíz
Un fragmento de cDNA específico del estigma fue primeramente identificado usando el kit de substracción de
cDNA PCR-Select de Clontech (nº de catálogo Chlontech K 1804-1). PoliA mRNA fue aislado del estigma de maíz
en desarrollo, inflorescencia completa, tejidos foliar y de la raíz de la línea pura de maíz CG00526 (Stratagene, nº de
cat. 200348). Los cDNAs fueron sintetizados a partir de poliA mRNA de cada tejido y divididos en “cDNA tester”,
en este caso representado por los cDNAs del estigma, y “cDNA driver” compuesto por iguales cantidades de cDNAs
de inflorescencia masculina, hoja y raíz. La sustracción de cDNA y la amplificación por PCR se llevaron a cabo
como se describe en el manual del usuario. Los productos de la PCR fueron subclonados en un vector de clonación
TA, pCRII (Invitrogen, nº de cat. K2000-1). Cada subclón fue escrutado en relación con la especificidad del tejido
en transferencias Northern con 5 µg de mRNA total del tejido del estigma, inflorescencia masculina, hoja y raíz del
maíz. El clon B200i, de 145 pb de longitud, mostró expresión específica para el estigma. El fragmento de cDNA
específico del estigma de B200i fue usado para escrutar una genoteca de cDNA de estigma en desarrollo. La genoteca
de cDNA del estigma fue construida usando poliA mRNA aislado de estigmas tomados de espigas de 18 cm de largo,
siguiendo los procedimientos detallados en el kit Zap cDNA Gigapack II Gold Cloning de Stratagene (nº de cat.
200402 de Stratagene). Los clones que se hibridan con la sonda B200i fueron elegidos para el análisis de la secuencia.
Un clon, de 772 pb de tamaño, contenía la secuencia de la sonda B200i. Este clon, B200i4-2, se usó como sonda en
transferencias Northern que contienen 1 µg de poliA mRNA de tejido de estigma, inflorescencia masculina, hoja y raíz
del maíz. La expresión se detectó solamente en el estigma. La secuencia del clon de cDNA B200i4-2 se expone en la
SEC ID Nº: 1.
Con el fin de aislar la correspondiente región genómica, el cDNA de B200i4-2 se usó como sonda para escrutar una
genoteca de maíz Mo17 (Stratagene). Se aislaron clones lambda que se hibridaban intensamente con la sonda B200i411
ES 2 263 200 T3
2. Se usó análisis Southern y cartografiado de restricción para identificar los fragmentos genómicos que contienen la
secuencia respectiva de cDNA con las regiones 5’ y 3’. Se aisló un fragmento Bam HI de ∼6,5 Kb de uno de los clones
lambda positivos y se subclonó en Bluescript SK+ (Stratagene), y se le designó pSH64.
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15
El clon B200i4-2 genómico, pSH64, que contiene las regiones reguladoras 5’ y 3’, fue analizado mediante análisis
de secuencia. También se usó barrido informatizado para identificar los elementos promotores putativos. La secuencia
de la región reguladora 5’ y 3’ del gen femenino-preferencial contenido en el clon genómico pSH64 se expone en la
SEC ID Nº: 11. El clon pSH64 fue depositado bajo los términos del Tratado de Budapest el 27 de febrero de 1998 en
el Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North
University Street, Peoria, Illinois 61604, EE.UU., y se le asignó el número de entrada NRRL B-21920.
Se construye un gen quimérico que se expresa de manera preferencial en estructuras reproductoras femeninas
de la forma siguiente. La región reguladora 5’ de 431 pb de B200i fue amplificada a partir de pSH64 mediante PCR usando los cebadores 5’-AAAACTGCAGGAATTCACTGCTGAGGGAGCGA-3’ (SEC ID Nº: 12) y 5’GCGGGATCCTTCTTGCTGTAGTCCTCGACCACG-3’ (SEC ID Nº: 13), y clonada como fragmento PstI-BamHI
en pSOG10 que contiene GUS fusionado con las secuencias de terminación de nos. La casete B200i-GUS-nos fue
después subclonada como fragmento EcoRI en pSH64 digerido con EcoRI, poniendo efectivamente GUS-nos secuencia abajo de la región reguladora B200i de longitud completa (nucleótidos 1-3790 de SEC ID No: 11). Este plásmido
fue designado pSH70.
20
25
La región reguladora B200i de pSH70, como se describió anteriormente, fue clonada como fragmento BglIIBamHI en BS-KS (Stratagene) y la región reguladora 3’ de B200i procedente de pSH64 se añadió secuencia abajo
como fragmento EcoRV (nucleótidos 4427-6397 de SEC ID Nº: 11). Este plásmido fue designado pSH73. El plásmido
pSH74 fue construido mediante una digestión parcial con BamHI de pSH73 y ligando en un fragmento de DNA que
contiene argE (del Ejemplo 1) en el sitio BamHI, poniendo efectivamente argE entre las regiones reguladoras 5’ y 3’
de B200i.
Ejemplo 5
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Obtención de clones de cDNA de nuevos genes expresados preferencialmente en el estructura reproductora femenina
del trigo.
Un fragmento de cDNA específico del pistilo fue aislado de trigo UC703 usando el método de display diferencial
de mRNA de Genhunter (nº de act. de Genhunter M502) como se describe en el protocolo del kit. Los cebadores usados
para identificar el fragmento de cDNA específico del pistilo fueron AP-18 y T12 CA. El fragmento fue subclonado en
un vector de clonación pGEM-TA (nº de cat. de Promega A362A) y se llamó P26. El clon P26 fue usado como sonda
en transferencias Northern que contienen 5 µg de mRNA total del tejido del pistilo, antera, hoja y raíz del trigo,
y se confirmó la especificidad del tejido. Se construyó una genoteca de cDNA del pistilo de trigo usando pistilos
aislados del trigo UC703 siguiendo los procedimientos indicados en el kit Zap cDNA GigaPack II Gold Cloning de
Stratagene (nº de cat. de Stratagene 200402). Los clones que se hibridan con la sonda P26 fueron seleccionados para
análisis de secuencia. Un clon, P26-A4, era de 881 pb de longitud y contenía la secuencia de P26 de 203 pb. Las
transferencias Northern que contenían 5 µg de mRNA total de cuatro etapas de desarrollo de los pistilos, A) inicio, B)
brote, C) maduro, D) fertilizado, así como de antera, hoja y raíz, fueron hibridadas con la sonda P26-A4 de 881 pb. La
expresión predominante del pistilo fue detectada en el pistilo, con mucho menos expresión detectada en la raíz.
45
50
Un segundo fragmento de cDNA específico del pistilo fue también aislado del trigo UC703 usando procedimientos
similares a los anteriores. Este fragmento fue subclonado en un vector de clonación pGEM-TA (nº de cat. Promega
A362A) y se le llamó P19. El clon P19 fue usado como sonda en transferencias Northern que contienen 5 µg de mRNA
total del tejido de pistilo, antera, hoja y raíz del trigo y se confirmó la especificidad por el tejido. Se construyó una
genoteca de cDNA del pistilo del trigo como se describió antes. Los clones que se hibridan con la sonda P19 fueron
seleccionados para análisis de la secuencia. Un clon, el P19-QA, tenía una longitud de 649 pb y contenía la secuencia
P19. Las transferencias Northern que contenían 5 µg de mRNA total de cuatro etapas de desarrollo de los pistilos, A)
inicio, B) brote, C) maduro, D) fertilizado, así como antera, hoja y raíz, fueron hibridadas con la sonda 649 P19-QA.
Se demostró que la expresión era preferencial para el pistilo.
55
Ejemplo 6
Obtención de clones genómicos de nuevos genes expresados diferencialmente en estructuras reproductoras femeninas
del trigo e identificación de la región promotora
60
65
Para aislar la correspondiente región genómica, se usó el cDNA de P26-A4 como sonda para cribar una genoteca
genómica custom de trigo UC703 preparada a partir de plántulas de 2 semanas de edad. La genoteca se construyó
mediante digestión parcial con MboI del DNA genómico total y la subsiguiente ligación de la fracción de 8-22 kb de
tamaño con DNA de lambda EMBL3 digerido con BamHI (nº de cat. Clontech CS1013j). Se aislaron los clones de
lambda que se hibridaban fuertemente con la sonda P26-A4. Se usó análisis Southern y cartografiado de restricción
para identificar fragmentos genómicos que contienen la respectiva secuencia de DNA con regiones 5’ y 3’. Se aisló
un fragmento XbaI de 5,5 kb de uno de los clones lambda positivos y fue subclonado en Bluescript SK+ (Stratagene).
Este se designó pCIB10302.
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El clon de P26-A4 genómico, pCIB10302, que contiene las regiones reguladoras 5’ fue analizado por análisis
de secuencia. También se usa barrido por ordenador para identificar elementos promotores putativos. Además, las
regiones 5’ se cartografían mediante enzimas endonucleasas de restricción y el sitio de inicio de la transcripción se
determina mediante RACE PCR y métodos de protección de RNAsa. La secuencia de la región reguladora 5’ del gen
femenino-preferencial contenido en el clon genómico P26-A4 se expone en la SEC ID No: 2.
Para aislar la correspondiente región genómica, se usó el cDNA de P19 como sonda para cribar una genoteca
genómica de trigo UC703 “custom” preparada a partir de plántulas de 2 semanas de edad como se describe en el
Ejemplo 6. Se aislaron clones lambda que se hibridaban intensamente con la sonda P19. Se usó análisis Southern y
cartografiado de restricción para identificar fragmentos genómicos que contienen la secuencia respectiva de cDNA
con las regiones 5’ y 3’. Se aisló un fragmento XhoI de ∼8 Kb de uno de los clones lambda positivos y se subclonó en
Bluescript SK+ (Stratagene), y se le designó X2-1.
El clon P19 genómico que contiene las regiones reguladoras 5’ y 3’, fue analizado mediante análisis de secuencia.
También se usó barrido informatizado para identificar los elementos promotores putativos. Además, las regiones 5’ y
3’ fueron cartografiadas mediante enzimas de restricción de endonucleasa. La secuencia de la región reguladora 5’ del
gen femenino-preferencial contenido en el clon genómico X2 se expone en la SEC ID Nº: 14.
Ejemplo 7
20
Construcción de genes quiméricos que se expresan de manera preferencial en estructuras reproductoras femeninas
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Se construyó el plásmido pFA200 enlazando operativamente, empleando métodos estándar conocidos en la técnica,
los siguientes componentes: 1) las regiones reguladoras de P26, como se describen anteriormente (nts 1-3987), 2) un
fragmento de DNA que contiene el gen argE construido por ingeniería genética con los sitios de restricción apropiados
para fusionarse con el ATG del marco de lectura abierto de argE en marco con el sitio de inicio de la traducción (ATG
a nt 3987) del fragmento P26, fusionando así la región reguladora secuencia arriba de P26 con argE y 3) un vector
que contiene secuencias de terminación 3’ que son funcionales en plantas. La expresión de argE bajo el control del
promotor P26 expresará el producto génico de argE preferencialmente en la estructura reproductora femenina de la
planta.
Las regiones reguladoras 5’ de P19 (nucleótidos 1-1093 de la SEC ID No: 14), corte con PstI, un sitio de una enzima
de restricción que se encuentra justo secuencia arriba de las secuencias P19 en el plásmido X2-1, y NcoI (nucleótido
1088 de SEC ID No: 14) en el ATG de P19, se ligaron al corte pSOG15 con PstI y NcoI (pSOG15 contiene el gen
GUS y el terminador nos con un sitio PstI 5’ respecto del gen GUS y NcoI en el ATG del gen GUS). Este plásmido se
designó pXB1.
Se construyó el plásmido p19arg enlazando operativamente, empleando métodos estándar conocidos en la técnica,
los siguientes componentes: 1) las regiones reguladoras de P19, como se describen anteriormente, 2) un fragmento
de DNA que contiene el gen argE construido por ingeniería genética con los sitios de restricción apropiados para
fusionarse con el ATG del marco de lectura abierto de argE en marco con el sitio de inicio de la traducción (ATG
en1090 de la SEC ID No: 14) del fragmento P19, fusionando así la región reguladora secuencia arriba de P19 con
argE y 3) un vector que contiene secuencias de terminación 3’ que son funcionales en plantas. La expresión de argE
bajo el control del promotor P19 expresará el producto génico de argE preferencialmente en la estructura reproductora
femenina de la planta.
La expresión transitoria de genes en estructuras reproductoras femeninas se determinó por suministro a tejidos
intactos. Tejido floral del trigo (pistilos y anteras) se puso en placa en medio de Murashige y Skoog que contiene
15% de maltosa. El DNA de pXB1 o pSH70 fue precipitado sobre partículas de oro de tamaño micrométrico usando
procedimientos estándar. Se disparó sobre dos placas diana con 20 pistilos y anteras por diana 2 o 3 veces con el
dispositivo de helio DuPont Biolistcs® usando una presión de descarga de 75 atmósferas. Las placas son disparadas
con un tamiz de malla 80 puesto entre la plataforma portadora y la diana. Las dianas se pusieron en la oscuridad a 26C
durante 16 horas después del bombardeo antes de que los tejidos fueran transferidos a mezcla de desarrollo de GUS
(100 mg de X-gluc en 200 ml de fosfato sódico 0,05M pH 7) durante 2 a 24 horas a 37ºC. Los genes GUS en pXB1
y pSH70 produjeron actividad de GUS en los pistilos. Ensayos de transformación transitoria de pSH70 en tejido de
estigma de maíz demostraron la expresión de GUS en los tejidos femeninos.
Ejemplo 8
60
65
Transformación del trigo con un gen quimérico que codifica una proteína que cataliza la conversión de una protoxina
en una toxina de una manera femenina-preferencial
Embriones inmaduros (de 0,75 a 1,0 mm de longitud) de genotipo UC703 se ponen en placa en medio de Murashige
y Skoog que contiene 3 mg/l de 2,4-D y 3% de sacarosa. Después de aproximadamente 4 horas los embriones se ponen
en placa con el lado del eje del embrión hacia abajo, en placas que contienen medio de Murashige y Skoog con 15%
de maltosa, 3% de sacarosa y 3 mg/ml de 2,4-D cubierto con una lámina (slab), soportada con un papel de filtro,
de agarosa que contiene los mismos componentes. Se dejan plasmolizar los embriones durante 2-3 horas antes del
bombardeo.
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Se precipita DNA de pFA200 y pSOG35 sobre partículas de oro de tamaño micrométrico usando procedimientos
estándar. Se dispara sobre cuatro placas diana con 20 embriones por placa dos veces con el dispositivo de helio
DuPont Biolistics® usando una presión de descarga de 75 atmósferas. Las placas son disparadas con un tamiz de
malla 80 puesto entre la plataforma portadora y la diana. Las dianas se ponen en la oscuridad a 26C durante 24 horas
después del bombardeo antes de que las láminas con los embriones se pusieran sobre placas que contienen medio de
Murashige y Skoog con 3 mg/ml de 2,4-D y 3% de sacarosa. Los embriones individuales se retiran de las láminas y se
ponen directamente en medio fresco de la misma composición después de otras 48 horas.
Aproximadamente 6 semanas después del suministro del gen, el tejido respondedor se pone en medio de Murashige
y Skoog con 3 mg/L de 2,4-D y 3% de sacarosa con 0,2 mg/L de metotrexato durante un periodo de 3 semanas. Después
se pone el tejido en un medio de regeneración que comprende medio de Murashige y Skoog con 1 mg/L de ribósido de
zeatina y 1 mg/L de metotrexato. Al cabo de 2 semanas, las plántulas en regeneración se ponen en recipientes estériles
llamados “GA7s” con sales de Murashige y Skoog de fuerza media, 2% de sacarosa, 1 mg/L de NAA y 4 o bien 8
mg/ml de metotrexato.
15
20
25
En otro ejemplo, embriones inmaduros (de 0,75 - 1,0 mm de longitud) del genotipo UC703 se procesan como se
describió anteriormente, excepto que se usa medio de Murashige y Skoog que contiene 2 mg/l de 2,4-D. Después de
aproximadamente 4 horas, los embriones se ponen en placa con el lado del eje del embrión hacia abajo, en placas que
contienen medio de Murashige y Skoog con 15% de maltosa, 3% de sacarosa y 2 mg/ml de 2,4-D cubiertas con una
lámina (slab) de agarosa, soportada con un papel de filtro, que contiene los mismos componentes. Se dejan plasmolizar
los embriones durante 2-3 horas antes del bombardeo.
El DNA de pFA200, pSH74 o p19arg, junto con pUbi-Hyg que contiene el promotor de ubiquitina del maíz unido
operativamente al gen de la higromicina fosfotransferasa, se precipita sobre partículas de oro de tamaño micrométrico
usando procedimientos estándar. Se dispara sobre cuatro placas diana con 20 embriones por placa dos veces con el
dispositivo de helio DuPont Biolistcs® usando una presión de descarga de 75 atmósferas. Las placas son disparadas
con un tamiz de malla 80 puesto entre la plataforma portadora y la diana. Las dianas se ponen en la oscuridad a 26C
durante 24 horas después del bombardeo antes de que las láminas con los embriones se pusieran sobre placas que
contienen medio de Murashige y Skoog con2 mg/ml de 2,4-D y 3% de sacarosa.
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Aproximadamente 3 semanas después del suministro del gen, el tejido respondedor se pone en medio de Murashige y Skoog con 3 mg/ml de 2,4-D y 3% de sacarosa. Después se pone el tejido en un medio de regeneración que
comprende medio de Murashige y Skoog con 3% de sacarosa, 5 mg/L de GA3, 1 mg/L de NAA y 20 mg/L de higromicina. Al cabo de 2 semanas, el tejido en regeneración se transfiere en medio que comprende medio de Murashige y
Skoog con 3% de sacarosa y 20 mg/L de higromicina. Al cabo de 2 semanas las plántulas en regeneración se ponen
en recipientes estériles llamados “GA7s” con sales de Murashige y Skoog de fuerza media, 2% de sacarosa, 1 mg/L
de NAA y 4 y 20 mg/L de higromicina.
Se extrae el DNA del tejido foliar de las plantas derivadas de la transformación y se realiza la PCR para ver la
presencia de los genes marcadores seleccionables dhfr o hyg y el gen argE. Las plantas positivas para la PCR se
envían al invernadero para su propagación. Durante las etapas de floración, se recogen los pistilos de cada planta
transgénica y se hace el RNA a partir de este tejido. La expresión de argE se confirma por análisis Northern. Las
plantas se autofertilizan y se recogen las semillas.
Ejemplo 9
Construcción de genes quiméricos que se expresan de una manera preferencial en estructuras reproductoras masculinas
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60
El plásmido pGK73 se usa como punto de partida. Las secuencias de terminación TA29-argE-3’ se retiran como
una casete del vector de transformación de Agrobacterium y se ligan en pBluescript KS+ usando las enzimas de
restricción apropiadas. El plásmido resultante se denomina pMA200.
El promotor específico de la antera, B6, se construyó a partir del plásmido, pSGBNE1, que contiene un clon
genómico de 3 kb subclonado como fragmento EcoRI-NheI de pSGB6g1 (véase la patente de EE.UU. nº 5.470.359).
Un fragmento ApaI/XbaI de 1558 pb fue clonado blunt en Bluescript (KS) en el sitio SmaI. Se construyó una fusión
traduccional con el gen argE como se describió anteriormente en el Ejemplo 2. El plásmido resultante se denomina
pSH68.
El promotor específico del polen Zmg, un fragmento HindIII-PpuMI de 1 kb de Zmg13 (Hamilton et al., Sexual
Plant Reproduction 2, 208-212 (1989)) fue clonado a partir de pCIB391 en bluescript como fragmento HindIII-SmaI.
La región de terminación de la transcripción nos fue añadida como fragmento amHI-XbaI. La secuencia de codificación para argE como fragmento BamHI (del Ejemplo 1) fue después ligada en el sitio BamHI, poniendo efectivamente
argE entre el promotor de Zg y las secuencias de terminación nos. Este plásmido se denomina Zmgarg.
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Ejemplo 10
Transformación de trigo con un gen quimérico que se expresa de manera masculina-preferencial
5
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Los plásmidos pUbi-Hyg, que contienen el promotor de ubicuitina del maíz unido operativamente al gen de la
higromicina fosfotransferasa, y pMA200 o pSH68 o pZmgarg se usan como secuencias recombinantes para la transformación de embriones inmaduros de trigo como se describe en el Ejemplo 8. Las plantas son regeneradas y se usa
PCR para confirmar la presencia del transgen argE. las plantas transgénicas se transfieren al invernadero. Durante las
etapas de floración, se recogen las anteras y se hace RNA a partir de este tejido, y se confirma la expresión de argE
por análisis Northern. Las plantas se auto-fertilizan y se recogen las semillas.
Ejemplo 11
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Transformación de maíz con un gen quimérico que codifica una proteína que cataliza la conversión de una protoxina
en toxina de una manera femenina-preferencial
Se obtiene callo de Tipo I a partir de embriones cigóticos inmaduros de genotipo CG00526 usando técnicas de
cultivo estándar. Para el suministro de genes, se preparan aproximadamente 300 mg del callo de Tipo I desmenuzando
con una hoja de bisturí, aclarando 3 veces con medio de cultivo estándar que contiene 18% de sacarosa, y se ponen
inmediatamente en un medio de cultivo semisólido que también contiene 18% de sacarosa. Al cabo de unas 4 horas,
el tejido es bombardeado usando el dispositivo PDS-1000/He Biolistic de BioRad. Uno de los plásmidos pFA200,
pSH74 o p19arg, junto con pSOG35, es precipitado en partículas de oro de 1 µm usando el protocolo estándar de
BioRad. Aproximadamente 16 horas después del suministro del gen el callo se transfiere a medio de cultivo estándar
que contiene 2% de sacarosa y 2 mg/L de metotrexato. El callo se subcultiva en selección durante 8 semanas, después
de lo cual los callos supervivientes y en crecimiento se transfieren a medio de regeneración estándar para la producción
de plantas. Se obtienen las plantas y se les dan números de evento. Las plantas de cada evento se analizan por PCR
para observar la presencia del gen argE y las plantas positivos para la PCR de transfieren al invernadero. Durante la
floración, se colectan las espigas, se hace RNA de este tejido y se confirma la expresión de argE por análisis Northern.
Alternativamente, las plantas de maíz transgénico se obtienen por bombardeo con microproyectiles de embriones
inmaduros. Las espigas del genotipo CG00526 se autopolinizan y se obtienen embriones cigóticos inmaduros aproximadamente 10 días más tarde. Aproximadamente ochocientos cuarenta embriones cigóticos inmaduros se dividen
entre 14 placas diana diferentes que contienen un medio capaz de inducir y soportar la formación de callo embriogénico. Los embriones cigóticos inmaduros se transfieren inmediatamente al mismo medio, pero conteniendo 12%
de sacarosa. Al cabo de 5 horas, los embriones cigóticos inmaduros se bombardean con, pFA200, con pSH74 o con
p19arg, junto con pSOG35, usando el dispositivo PDS-1000/He de BioRad. Los plásmidos se precipitan en partículas
de oro de 1 µm de acuerdo con el procedimiento publicado de BioRad, como se describió antes. Las partículas se suministran usando una presión de descarga de 105 atmósferas de helio. Se dispara dos veces sobre cada placa diana con
el plásmido y el preparado de partículas de oro. El agente de selección, metotrexato, se aplica a razón de 2 mg/L el día
del suministro del gen y se aumenta hasta después de aproximadamente un mes. El callo embriogénico así obtenido se
regenera en presencia del agente de selección metotrexato. Se obtienen las plantas y se les dan números de evento. Las
plantas de cada evento fueron ensayadas mediante PCR para observar la presencia del gen argE y las plantas positivas
para la PCR se transfieren al invernadero. Durante la floración, se recogen las espigas, se hace el RMA a partir de este
tejido y se confirma la expresión de argE por análisis Northern.
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Ejemplo 12
Transformación de maíz con un gen quimérico que codifica una proteína que cataliza la conversión de una protoxina
en una toxina de manera masculina-preferencial
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55
Los plásmidos pMA200 o pSH68 o pZmgarg y pSOG35 se usan como secuencias recombinantes para la transformación de embriones inmaduros de maíz como se describe en el ejemplo 11. Las plantas se regeneran y se usa
PCR para confirmar la presencia del transgén argE. Las plantas transgénicas se transfieren al invernadero. Durante las
etapas de floración, se recolectan las espigas macho, se prepara el RNA a partir de este tejido y la expresión de argE
se confirma por análisis Northern. Las plantas se auto-fertilizan y se recolecta la semilla.
Ejemplo 13
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65
Transformación de cebada que codifica una proteína que cataliza la conversión de una protoxina en una toxina de
una manera femenina-preferencial
Se cosechan espigas de cebada (cv Golden Promise) con embriones inmaduros de aproximadamente 1,5 a 2,5
mm de tamaño, se esterilizan en superficie en lejía (hipoclorito sódico al 5,25%) al 15% (v/v) durante 10 minutos,
y se aclaran cinco veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se disecan de las cariopsis jóvenes y se bisecan
longitudinalmente. Se ponen en placa en un medio de inducción de callo (Wan y Lemaux, Plant Physiology 104:
37-48 (1994)) que contiene sales básicas de Murashige y Skoog suplementadas con 30 g/L de maltosa, 1 mg/L de
tiamina-HCl, 0,25 g/L de mio-inositol, 1 g/L de hidrolizado de caseína, 0,69 g/L de prolina, 2,5 mg/L de dicamba, y
se solidifican mediante 3,5 g/L de Phytagel® (Sigma).
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20
25
Para el bombardeo de los embriones, estos son incubados con el lado del escutello hacia arriba en la oscuridad a 2428ºC, durante 1 a 3 días. El día de la transformación, los embriones se ponen en el centro de una placa petri (100 x 15
mm) formando un anillo. El DNA de los plásmidos pFA200 o pSH74 o p19arg, junto con pUbi-hyg, se precipita sobre
partículas de oro de 0,6 o 1,0 µm (BioRad) siguiendo el manual de DuPont Biolistic Particle Delivery Systems. Se
dispara una vez sobra cada placa de embriones con una pistola de helio DuPont PDS-1000 a una presión de descarga
de 75 atmósferas. Después del bombardeo, los embriones se transfieren a un medio fresco de inducción de callo con
el lado del escutelo hacia abajo. De tres a siete días después del bombardeo, los embriones se transfieren a un medio
para selección (medio de inducción de callo más 10 mg/l de higromicina) durante aproximadamente 14 días. El callo
derivado se rompe en trozos más pequeños y se mantiene separado. En posteriores subcultivos, el callo se transfiere
a un medio fresco de selección con 20 mg/l de higromicina aproximadamente cada 21 a 28 días. Después de 2-3
subcultivos, el callo superviviente se transfiere a un medio FHG (Hunter, Ph. D. Thesis, Wye College, Universidad de
Londres, Ashford, Kent, 1988) suplementado con 1-3 mg/L de 6-bencil-aminopurina y 10-20 mg/l de higromicina para
la regeneración de la planta. Las plantas se regeneran a 23-25ºC bajo luces fluorescentes. Los brotes verdes/plántulas
emegidos se transfieren a un medio libre de hormonas basado en sales básicas de Murashige y Skogg en una placa
Petri de 25 mm x 100 mm. Las plantas se transfieren a un recipiente Magenta GA7 para posterior desarrollo cuando
alcanzan un tamaño de 2 a 3 cm.
Para el bombardeo del callo, los embriones se incuban con el lado dele scutelo haca abajo en la oscuridad a 2428ºC durante al menos 10 días. El día de la transformación, los callos embriogánicos procedentes de los embriones
cultivados se cortan en tozos pequeños y se ponen en el centro de una placa petri. El suministro de DNA y las
subsiguientes etapas de regeneración de las plantas son idénticas a las descritas en el bombardeo de los embriones.
Se analizan las plantas mediante PCR para observar la presencia del transgén, y las que son positivas se pasan al
invernadero. Durante las etapas de floración, se recogen los pistilos y se prepara el RNA a partir de este tejido. La
expresión de argE se confirma mediante análisis Northern. Las plantas se autofertilizan y se recogen las semillas.
Ejemplo 14
30
35
Transformación de cebada con un gen quimérico que codifica una proteína que cataliza la conversión de una protoxina
en una toxina de una manera masculina-preferencial
Los plásmidos pMA200 o pSH68 o pZmgarg y pUbi-Hyg se usan como secuencias recombinantes para la transformación de embriones inmaduros de cebada y callos como se describe en el Ejemplo 13. Las plantas se regeneran
y se usa PCR para confirmar la presencia del transgén argE. Las plantas transgénicas se transfieren al invernadero.
Durante las etapas de floración, se recolectan las anteras y se prepara el RNA a partir de este tejido y la expresión de
argE se confirma por análisis Northern. Las plantas se auto-fertilizan y se recolecta la semilla.
Ejemplo 15
40
45
50
55
El tratamiento químico de las plantas transformadas confiere esterilidad condicional
Las semillas de la generación T1 de plantas transformadas con pFA200 o pSH74 o p19arg (que confieren esterilidad femenina condicional) y plantas transformadas con pMA200 o pSH68 o pZmgarg (que confieren esterilidad
masculina condicional) se plantan en tierra. Una vez que las plántulas han crecido a un tamaño suficiente, se analiza
el tejido foliar mediante PCR para observar la presencia del transgén argE. Las plantas positivas para la PCR se pasan
al invernadero. Estas plantas son enteramente fértiles. Un subconjunto de plantas que contiene pFA200 o pSH74 o
p19arg y un subconjunto que contiene pMA 200 o pSH68 o pZmarg se tratan con la protoxina acetil-PPT durante las
etapas de crecimiento. Las plantas transformadas con pMA200 o pSH68 o pZmarg (se necesitan homocigotos para
la construcción de promotor de polen pZmgarg) son androestériles como resultado de la conversión del acetil-PPT
en PPT en las estructuras reproductoras masculinas. Las plantas transformadas con pFA200 o pSH74 o p19arg son
femeninas-estériles como resultado de la conversión del acetil-ppT en PPT en las estructuras reproductoras femeninas.
Las plantas no tratadas transformadas con pFA200 o pSH74 o p19arg y pMA200 o pSH68 o pZmarg son entramente
fértiles.
Ejemplo 16
Producción de semillas híbridas de trigo usando plantas transgénicas que convierten una protoxina en una toxina en
estructuras reproductoras femeninas
60
65
Plantas de trigo transgénico de los Ejemplos 8 y 10 fueron transformadas con pFA200 o pSH74 o p19arg (que
confieren esterilidad femenina condicional) y pMA 200 o pSH68 o pZmgarg (que confieren esterilidad masculina
condicional) se crían como líneas de plantas homocigóticas para cada uno de los transgenes y la semilla se multiplica
mediante prácticas estándar. Las semillas homocigóticas de plantas que contienen pFA200 o pSH74 o p19arg y plantas
que contienen pMA 200 o pSH68 o pZmgarg son interplantadas a una relación de progenitores masculinos a femeninos
suficiente para asegurar una eficiente transferencia de polen. En un momento apropiada durante el desarrollo de las
plantas, se aplica al campo la protoxina acetil-PPT. después de la maduración de las semillas, se cosecha la producción
entera del campo, dando solamente semillas híbridas.
16
ES 2 263 200 T3
REIVINDICACIONES
1. Un método para la producción de semillas híbridas que comprende:
5
10
(a) producir una planta femenina-estéril condicional que comprende un promotor femenino-preferencial unido
operativamente a una secuencia de codificación que codifica una enzima que cataliza la conversión de una
protoxina en una toxina, en donde dicho promotor femenino-preferencial se elige entre el grupo que consiste en un promotor aislable del clon pSH64 que tiene el número de entrada NRRL B-21920, un promotor
que comprende la secuencia expuesta en SEC ID No: 2, y un promotor que comprende los nucleótidos 1 a
1093 de SEC ID No: 14
(b) interplantar la planta femenina-estéril condicional con una planta androestéril;
15
(c) inducir esterilidad femenina aplicando la protoxina a la planta femenina-estéril condicional; y
(d) producir semillas híbridas.
2. El método según la reivindicación 1ª, en el que dicha planta es una planta normalmente auto-polinizada.
20
3. El método según la reivindicación 1ª, en el que dicha planta es una planta normalmente polinizada cruzada.
4. El método según la reivindicación 2ª, en el que dicha planta normalmente auto-polinizada es trigo.
25
5. El método según la reivindicación 2ª, en el que dicha planta normalmente auto-polinizada es cebada.
6. El método según la reivindicación 3ª, en el que dicha planta normalmente polinizada cruzada es maíz.
30
7. El método según la reivindicación 1ª, en el que dicho promotor femenino-preferencial es un promotor aislable
del clon pSH64 que tiene el número de entrada NRRL B-21920.
8. El método según la reivindicación 1ª, en el que dicho promotor femenino-preferencial es un promotor que
comprende la secuencia expuesta en SEC ID No: 2.
35
40
9. El método según la reivindicación 1ª, en el que dicho promotor femenino-preferencial es un promotor que
comprende los nucleótidos 1 a 1093 de SEC ID No: 14.
10. El método según la reivindicación 1ª, en el que dicha secuencia codificadora que codifica una enzima que
cataliza la conversión de una protoxina en una toxina se obtiene a partir de un gen elegido entre el grupo consistente
en el gen argE, el gen de la monoxigenasa P450sul y el gen pehA.
11. El método según la reivindicación 10ª, en el que dicha secuencia codificadora se obtiene del gen argE.
12. El método según la reivindicación 1ª, en el que dicha protoxina es acetil-fosfinotricina.
45
50
55
60
13. Las semillas híbridas producidas por el método según la reivindicación 1ª, que comprenden el promotor femenino-preferencial unido operativamente a una secuencia codificadora que codifica una enzima que cataliza la conversión
de una protoxina en una toxina.
14. Una casete de expresión que comprende un promotor femenino-preferencial, elegido entre el grupo consistente
en un promotor aislable del clon pSH64 que tiene el número de entrada NRRL B-21920, un promotor que comprende
la secuencia expuesta en SEC ID No: 2, y un promotor que comprende los nucleótidos 1 a 1093 de la SEC ID No:
14, unido operativamente a una secuencia codificadora que codifica una enzima que cataliza la conversión de una
protoxina en una toxina.
15. La casete de expresión según la reivindicación 14ª, en la que dicha secuencia codificadora se obtiene a partir
de un gen elegido entre el grupo consistente en el gen argE, el gen de la monoxigenasa P450sul y el gen pehA.
16. La casete de expresión según la reivindicación 15ª, en la que la secuencia codificadora se obtiene a partir del
gen argE.
17. La casete de expresión según la reivindicación 14ª, en la que la secuencia codificadora se obtiene a partir del
gen de la monoxigenasa P450sul .
65
18. La casete de expresión según la reivindicación 14ª, en la que dicha secuencia codificadora se obtiene a partir
del gen pehA.
17
ES 2 263 200 T3
19. La casete de expresión según la reivindicación 14ª, en la que dicho promotor femenino-preferencial es aislable
del clon pSH64 que tiene el número de entrada NRRL B-21920 y la secuencia codificadora de interés se obtiene a
partir del gen argE.
5
20. La casete de expresión según la reivindicación 14ª, en la que dicho promotor femenino-preferencial comprende
la secuencia expuesta en SEC ID No: 2 y la secuencia codificadora de interés se obtiene a partir del gen argE.
21. La casete de expresión según la reivindicación 14ª, en la que dicho promotor femenino-preferencial comprende
los nucleótidos 1 a 1093 de SEC ID No: 14 y la secuencia codificadora de interés se obtiene a partir del gen argE.
10
22. Un promotor femenino-preferencial aislable del clon genómico pSH64 que tiene el número de entrada NRRL
B-21920.
15
23. El promotor femenino-preferencial según la reivindicación 22ª, en el que dicho promotor comprende los nucleótidos 1 a 1390 de SEC ID No: 11.
24. Un promotor femenino-preferencial que comprende la secuencia expuesta en SEC ID No: 2.
25. Un promotor femenino-preferencial que comprende los nucleótidos 1 a 1093 de SEC ID No: 14.
20
26. Una planta que comprende la casete de expresión según la reivindicación 14ª.
27. Una planta que comprende la casete de expresión según la reivindicación 16ª.
25
28. Una planta que comprende la casete de expresión según la reivindicación 19ª.
29. Una planta que comprende la casete de expresión según la reivindicación 20ª.
30. Una planta que comprende la casete de expresión según la reivindicación 21ª.
30
31. La semilla de la planta según la reivindicación 26ª pero que comprende la casete de expresión según la reivindicación 14ª.
35
32. La semilla de la planta según la reivindicación 27ª pero que comprende la casete de expresión según la reivindicación 16ª.
33. La semilla de la planta según la reivindicación 28ª pero que comprende la casete de expresión según la reivindicación 19ª.
40
34. La semilla de la planta según la reivindicación 29ª pero que comprende la casete de expresión según la reivindicación 20ª.
35. La semilla de la planta según la reivindicación 30ª pero que comprende la casete de expresión según la reivindicación 21ª.
45
50
55
60
65
18
ES 2 263 200 T3
19
ES 2 263 200 T3
20
ES 2 263 200 T3
LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
5
(i) SOLICITANTE: Crossland, Lyle D
Harper, Stacy M
(ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Método de producción de semillas híbridas usando esterilidad femenina
condicional.
10
(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 14
(iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
(A) DESTINATARIO: Novartis Corporation - Patent and Trademark Dept.
15
(B) CALLE: P.O. Box 12257
(C) CIUDAD: Research Triangle PArk
(D) ESTADO: NCNY
20
(E) PAIS: EE.UU.
(F) CP: 22057
(v) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
25
(A) TIPO DE MEDIO: disco blando
(B) ORDENADOR: IBM PC compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
30
(D) SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, versión 1.30
(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
(A) NUMERO DE SOLICITUD: US TBA
(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 27-FEB-1998
35
(C) CLASIFICACIÓN:
(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
(A) NUMERO DE SOLICITUD: US (prov)
40
(viii) INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:
(A) NOMBRE: Pace, Gary M
(B) NUMERO DE REGISTRO: 40.403
45
(C) REFERENCIA/Nº DE EXPEDIENTE: CGC 1915/Reg
(ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
(A) TELEFONO: 919-541-8582
50
(B) TELEFAX: 919-541-8689
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
55
(A) LONGITUD: 772 pares de bases
(B) TIPO: ácidos nucleicos
(C) CADENAS: simple
60
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
65
(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “secuencia de cDNA para transcrito femenino-preferencial designado
B200i4-2”
(iii) HIPOTÉTICA: no
1
ES 2 263 200 T3
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 1:
5
10
15
20
25
30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
35
(A) LONGITUD: 4126 pares de bases
(B) TIPO: ácidos nucleicos
(C) CADENAS: simple
40
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: no
45
(ix) CARACTERISTICA:
(A) NOMBRE/CLAVE: TATA_signal
(B) POSICIÓN: 3864
50
(ix) CARACTERISTICA:
(A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature
(B) POSICIÓN: 3912
55
(D) OTRA INFORMACION: /función = “sitio de inicio de la transcripción”
(ix) CARACTERISTICA:
(A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature
(B) POSICIÓN: 3983
60
(D) OTRA INFORMACION: /función = “sitio ATG usado para fusiones traduccionales”
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 2:
65
2
ES 2 263 200 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3
ES 2 263 200 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 3:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
65
(A) LONGITUD: 2070 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
4
ES 2 263 200 T3
(C) CADENAS: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
5
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: no
(ix) CARACTERISTICA:
10
(A) NOMBRE/CLAVE: CDS
(B) POSICIÓN: 211 ... 1362
(D) OTRA INFORMACION: /producto = “N-acetilornitinasa”
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 2:
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5
ES 2 263 200 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
6
ES 2 263 200 T3
5
10
15
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 4:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 384 aminoácidos
20
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
25
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 4:
30
35
40
45
50
55
60
65
7
ES 2 263 200 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 5:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 31 pares de bases
45
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
50
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: desc/ = “cebador para argE”
(iii) HIPOTÉTICA: No
55
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 5:
TATCTAGACC AGAGGTGTGT CAACAAATGA A
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 6:
60
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 26 pares de bases
65
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
8
31
ES 2 263 200 T3
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: desc/ = “cebador para argE”
5
(iii) HIPOTÉTICA: No
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 6:
CGTCTAGATT GCGGCACTGG AGTTTC
26
10
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 7:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
15
(A) LONGITUD: 35 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
20
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: desc/ = “cebador para argE”
(iii) HIPOTÉTICA: No
25
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 7:
CGCGGATCCT AAACAATGAA AAACAAATTA CCGCC
30
35
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 8:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 31 pares de bases
35
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
40
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: desc/ = “cebador para argE”
(iii) HIPOTÉTICA: No
45
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 8:
GCGCCTAGGC GCTTAATGCC AGCAAAAATC C
50
31
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 9:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 27 pares de bases
55
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
60
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: desc/ = “cebador para TA29”
(iii) HIPOTÉTICA: No
65
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 9:
AACTGCAGCT TTTTGGTTAG CGAATGC
27
9
ES 2 263 200 T3
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 10:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
5
(A) LONGITUD: 35 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
10
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: desc/ = “cebador para TA29”
(iii) HIPOTÉTICA: No
15
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 10:
CAGACTAGTT TTAGCTAATT TCTTTAAGTA AAAAC
20
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 11:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
25
(A) LONGITUD: 6596 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
30
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: No
35
(ix) CARACTERISTICA:
(A) NOMBRE/CLAVE: promotor
(B) POSICIÓN: 1 ... 3790
(C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
40
(D) OTRA INFORMACION: /función= “Región reguladora 5’ de B200i4-2”
/evidencia= EXPERIMENTAL
(ix) CARACTERISTICA:
45
(A) NOMBRE/CLAVE: misc_signal
(B) POSICIÓN: 4427 ... 6397
(C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
50
(D) OTRA INFORMACION: /función= “Región reguladora 3’ para B200i4-2”
/evidencia= EXPERIMENTAL
(ix) CARACTERISTICA:
(A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature
55
(B) POSICIÓN: 3789 ... 3791
(D) OTRA INFORMACION: /función= “Inicio de la traducción ATG”
(ix) CARACTERISTICA:
60
(A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature
(B) POSICIÓN: 4402 ... 4404
(D) OTRA INFORMACION: /función= “Parada de la traducción”
65
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No:11:
10
35
ES 2 263 200 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
11
ES 2 263 200 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
12
ES 2 263 200 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
13
ES 2 263 200 T3
5
10
15
20
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 12:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
25
(A) LONGITUD: 32 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: simple
30
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: desc/ = “cebador para B200i”
35
(iii) HIPOTÉTICA: No
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 12:
40
AAAACTGCAG GAATTCACTG CTGAGGGAGC GA
32
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 13:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
45
(A) LONGITUD: 33 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: simple
50
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: desc/ = “cebador para B200i”
55
(iii) HIPOTÉTICA: No
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 13:
GCGGGATCCT TCTTGCTGTA GTCCTCGACC ACG
60
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 14:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
65
(A) LONGITUD: 1093 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
14
33
ES 2 263 200 T3
(C) CADENA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
5
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: No
(ix) CARACTERISTICA:
10
(A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature
(B) POSICIÓN: 1090 ... 1092
(C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
15
(D) OTRA INFORMACION: /función= “Inicio de la traducción ATG”
/evidencia= EXPERIMENTAL
(ix) CARACTERISTICA:
(A) NOMBRE/CLAVE: promotor
20
(B) POSICIÓN: 1 ... 1093
(C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
(D) OTRA INFORMACION: /función= “Región reguladora 5’ de P19”
/evidencia= EXPERIMENTAL
25
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 14:
30
35
40
45
50
55
60
65
15