Síntesis de histonas en Trypanosoma cruzi.

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SÍNTESIS DE HISTONAS EN Trypanosoma cruzi
VALERIA SABAJ y NORBEL GALANTI
Laboratorio de Biología Molecular, Departamento de Biología Celular y Genética.
Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
Las historias constituyen el ejemplo clásico de
proteínas cuya síntesis se efectúa en forma acoplada a la
replicación del DNA. Con el paso del tiempo, sin embargo,
gracias a resultados obtenidos en tejidos en reposo
proliferativo en que se determinó la existencia de
síntesis de ciertas variantes de histonas, se ha dividido a
los genes de histonas de acuerdo a su capacidad de
expresión en: a) variantes replicativas (aquellas cuya
expresión se encuentran acoplada a la replicación del
DNA), y b) variantes de reemplazo (aquellas cuya expresión es independiente de la replicación del DNA).
El Trypanosoma cnizi, agente productor de la
enfermedad de Chagas, es un eucarionte muy antiguo.
Su biología, como es lógico suponer, difiere en aspectos
sustanciales de la de eucariontes superiores. Algunas
características destacables son: la existencia de
transplicing, mecanismo mediante el cual una región 5'
común se une a diferentes mensajeros de genes
nucleares; los genes mitocrondriales están sujetos a un
mecanismo de edición del mensaje, capaz de modificar
hasta en un 50% el transcrito original; durante la división
celular, la envoltura nuclear permanece intacta; y por
último, la cromatina de T. cruzi no condensa a
cromosomas durante la mitósis, más aún, en esta etapa
parece aumentar su decondensación. Las histonas de
T. cruzi, por otra parte, también presentan características
peculiares; las secuencias aminoacídicas de estas
proteínas difieren sustancialmente de la de sus
homologas en eucariontes superiores. Es así como la
histona H4, prototipo de proteína conservada
evolutivamente, muestra una divergencia de un 50% en
su extremo aminoterminal. Dados estos antecedentes
sobre la biología de T. cruzi, en especial de su cromatina,
y la escasa información que existe sobre síntesis de
histonas en eucariontes primitivos, resulta de interés el
estudio de la síntesis de estas proteínas cromosomales
en relación a la replicación del DNA en T. cruzi.
En primer lugar, se comparó la síntesis de histonas y la
de DNA en células en activa proliferación (5 días de
cultivo) y
en células en bajo grado de proliferación (14 días de
cultivo). Para esto, se incubaron las células en presencia de
3
H - tímida, en el caso de la medición de replicación de
3
DNA y de H -usina en el caso de la medición de síntesis
de histonas. Se trabajó con células permeabilizadas
mediante shock hipotónico, dado el pobre ingreso de
aminoácidos en células intactas. Las células incubadas
con timidina se procesaron para la medición de
radiactividad en DNA, mientras que en las incubadas con
Usina, se realizó extracción de histonas y se midió la
radiactividad total en ellas. Los resultados muestran una
mayor incorporación tanto de tímida (10 veces) como de
lisina (4 veces) en células de 5 días de cultivo que en las
de 14 días. Al trabajar con un cultivo asincrónico, sin
embargo, no es posible aseverar la existencia de un
total acoplamiento entre ambos procesos.
Por el motivo anterior, se determinó tanto la síntesis
de histonas como la de DNA en células sincronizadas
con hidroxiurea (HU). Luego de liberado el bloqueo con
HU, se tomaron alícuotas de células a distintos tiempos
(0,6,12 y 24 horas) y se midió en ellas la incorporación de
3
3
H timidina en DNA y de H - lisina en histonas. Los
resultados mostraron a las O horas (24 horas en
presencia de HU) una pobre incorporación de timidina en
DNA y una baja incorporación de lisina en histonas. A las
6 horas, la replicación de DNA aumenta bruscamente,
así como la síntesis de histonas. A las 12 horas ambas
actividades permanecen altas, y a las 24 horas,
disminuyen notablemente. Un claro acoplamiento se
observó, entonces, entre ambos procesos.
Interesante de estudiar resultó el hecho que a las O
horas, cuando la incorporación de timidina en DNA era
casi nula, se observó cierto nivel de incorporación de
lisina en histonas, para esto, se separó a las histonas
medíante electroforesis y se realizó una fluorografía del
gel. Con esto se puso en evidencia una activa síntesis
de histona H1 a las 0 horas (en ausencia de replicación
de DNA), y la ausencia de síntesis de histonas del núcleo
nucleosomal a este tiem-
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po; a las 6 horas, se observó un aumento de la síntesis
de histona H1 y el comienzo de la de histonas
nucleosomales; a las 12 horas, la síntesis de histonas H1
y nucleosomales se encontraba activa; a las 24 horas, la
síntesis de histona H1 disminuyó en forma importante y la de
histonas nucleosomales desapareció.
Por último, se estudió la relación entre replicación del
DNA y síntesis de histonas en tripomastigotes, la forma
naturalmente no replicativa del parásito. En estas células
no se detectó replicación del DNA, como era de esperar,
como tampoco síntesis de histonas. Resultado en
conflicto con el obtenido en células sincronizadas, que
pudiera pensarse se debe al hecho de utilizar un
agente extraño a la célula (hidroxiurea). Sin embargo,
hay que recordar que los tripomastigotes representan
una forma celular diferenciada, lo que implica la expresión
de todo un conjunto diferente de genes. A nivel de
histonas, podría implicar la pérdida de la
expresión de genes de histona H, independientes de
la replicación del DNA.
En resumen, hemos establecido la existencia de dos
poblaciones diferentes de histonas; en primer lugar, una
fracción de histona H1 cuya síntesis es independiente
de la replicación de DNA y en segundo lugar, otra
fracción de H1 y la totalidad de las histonas del núcleo
nucleosomal, cuya síntesis se encuentra acoplada a la
replicación del DNA. Mostramos también, una
diferencia entre epimastigotes sincronizados y
tripomastigotes en cuanto a acoplamiento entre síntesis
de histonas y replicación de DNA, careciendo estos
últimos de la fracción de histona H1 cuya síntesis no es
acoplada a la replicación de DNA. Sugerimos que esta
diferencia está dada por la ausencia de expresión de
genes de H1 independientes de la replicación de DNA.
Financiado por SAREC y Fondecyt-Chile.