Unidad9. Principios de Ingeniería Genética Aplicaciones de

Unidad9. Principios de Ingeniería Genética
Aplicaciones de Biología Molecular
• Aislamiento, análisis y manipulación de ácidos
nucleicos
• Generación de moléculas de DNA recombinante
• Ingeniería Genética
AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA)
Lisis celular y de núcleos en el caso de eucariontes (para DNA)
(detergentes, proteasas, cambios de presión)
Separación del DNA del resto de los componentes celulares
(principalmente proteínas). Desnaturalizantes de proteínas,
solventes (fenol-cloroformo)
Repetir la extracción. Eliminación del fenol.
Formación de sal de ácido nucleico y precipitación con etanol o
isopropanol
Disolver el DNA (Se concentra)
Análisis del DNA
Análisis de Ácidos Nucleicos por Espectrofotometría
Espectro de
absorción de DNA
ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Estimación de la
concentración de A.N. por
espectrofotometría
Separación en geles de agarosa (1–4%)
A260 = 1
Migran al ánodo
Electroforesis horizontal.
50 µg/ml DNA dc
Tinción con bromuro de etidio
33 µg/ml DNA cs
Intercala entre las bases del DNA
40 µg/ml RNA
Forman complejos fluorescentes
También se mide la
relación de abs.
A260/ A280 => 1.8-2.0
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Herramientas para el análisis de DNA.
Enzimas de restricción y sus sitios de corte
• Son purificadas de bacterias
LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN CORTAN DEJANDO
EXTREMOS COHESIVOS “STICKY”
DNA de un plásmido
digerido con EcoRI
DNA genómico
digerido con EcoRI
•Las enzimas de restricción son
endonucleasas
•Rompen en sitios específicos del
DNA
Extremos son compatibles
•Reconocen secuencias
palíndromicas específicas de 4; 6
o 8 pb
•Algunas generan extremos
romos y otros extremos cohesivos
en el DNA al que cortan
Se aparean las bases de los extremos cohesivos y la DNA ligasa
forma el enlace fosfodiéster entre la G y la A en ambas cadenas
VECTORES DE CLONACIÓN: PLÁSMIDOS
INSERCIÓN DE DNA FORÁNEO EN UN PLÁSMIDO (VECTOR)
Corte del DNA con enzimas de restricción
Ligación del DNA foráneo con una DNA ligasa, incorporándolo al vector
Plásmido
DNA de interés
Tratamiento con
enzima de restricción
Fragmentos de DNA con
extremos cohesivos
compatibles
Mezclar los
fragmentos en
presencia de una
DNA ligasa
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CONSTRUCCIÓN DE UNA
BIBLIOTECA GENÓMICA
TÉCNICAS DE HIBRIDIZACIÓN DEL DNA
DESNATURALIZACIÓN-RENATURALIZACIÓN
Digestión
con enzimas
de restricción
Una biblioteca de DNA genómico
es un conjunto de fragmentos
de DNA de un organismo y
empaquetados en
vectores (plásmidos), que son
mantenidos en células
bacterianas.
DNA fragmentado
y clonado en plásmidos
DNA de
doble hélice
Desnaturalización:
se genera DNA de
cadena sencilla
Renaturalización:
se forma DNA
duplex
Introducción de los
plásmidos en bacterias
BÚSQUEDA DE UN GENE EN LA BIBLIOTECA GENÓMICA o DE cDNA
SÍNTESIS DE cDNA y construcción de una biblioteca
de cDNA
Selección del tejido
Membrana de nylon o nitrocelulosa
Incubación con
las sonda y
lavado
Colonias con el
plásmido de
interés
Sonda: DNA de
cadena sencilla
marcado con 32P
Hibridar con oligo-dT
Síntesis de cDNA con
una transcriptasa
reversa
Caja Petri con
colonias de
bacterias
Eliminación del RNA
Se hace una réplica
de las colonias en la
membrana
Lisis de las
bacterias y
desnaturalización
del DNA con
NaOH
Extracción de RNAm
Exposición a un
film fotográfico.
Detección de
colonias con el
plásmido de
interés.
Las transcriptasas
reversas son
enzima virales.
Sintetizan DNA
usando RNA como
molde
Síntesis de la segunda
cadena de DNA
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Transferencia en Southern
Desarrollo de la Técnica de Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR)
Thermus aquaticus
Taq
DNA Polimerasa
Great Fountain Geyser,
Yellowstone. Manantial
Temperatura 55-80°C
El número de copias del fragmento de DNA aumenta
exponencialmente
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La reacción de PCR tiene múltiples
aplicaciones
• Detección de alelos mutantes caracterizados.
• Búsqueda de alelos mutantes no conocidos.
• Identificación de microorganismos patógenos.
– Caracterización de cepas del virus de la influenza
• Aislamiento de moléculas de DNA genómico y de
cDNA (Clonación de genes)
• Secuenciación de DNA
• Generación de mutantes puntuales.
• Estudiar la expresión génica.
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La era genómica. Secuenciación de DNA
La era genómica. Secuenciación de DNA
SECUENCIACIÓN DE DNA
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Secuenciación de Genomas
Aplicaciones de Biología Molecular
Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en
la longitud de fragmentos de restricción)
Diagnóstico genético. PCR
Producción de proteínas recombinantes en bacterias
Plantas genéticamente modificadas. Plantas transgénicas
Terapia génica
Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en la
longitud de fragmentos de restricción)
Este es el fundamento de pruebas de paternidad.
A lo largo del genoma de cada individuo hay diferencias sutiles en la
secuencia del DNA. Estos cambios son de una sola base.
Estos cambios pueden generar la formación de un sitio de
reconocimiento para enzimas de restricción por lo que el patrón de
corte de una enzima de restricción para cada individuo va a ser
único.
Individuo 1
Homocigoto
Individuo 2
Homocigoto
heterocigoto
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Esta prueba también se utiliza en peritaje forense para obtener
la “huella genética”
Mancha de
Sangre
Se utiliza la
técnica de
Southern
blot
Sonda de DNA
marcada se une
específicamente
El DNA se extrae
de las células
sanguíneas
Southern blot
La membrana se lava y se revela
para detectar bandas de
interacción DNA-DNA
Digestión del DNA con
enzimas de restricción
Los fragmentos de DNA se
separan por electroforesis
El patrón de DNA se
compara con el de
“sospechosos”
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