III Encuentro 1 - Fundacion para la Cultura del Vino

Patronato de la Fundación
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Vinos de los Herederos del Marqués de Riscal
INFORME TÉCNICO
Fermentación maloláctica (FML)
Edita FUNDACIÓN PARA LA CULTURA DEL VINO
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Presidente: Magín Raventós
Vicepresidente: Guillermo de Aranzábal
Gerente: Emilio Castro Medina
Todos los derechos reservados:
© Fundación para la Cultura del Vino
Traducción: Teresa Sans Morales
Diseño: Unaluna Publicidad
Madrid 2006
Fermentación
Maloláctica
Índice
7
7
9
19
23
31
33
41
47
31
53
53
55
59
I. Introducción a la fermentación maloláctica
(FML): las bacteria lácticas y su mecanismo.
1. Historia de la bacteria maloláctica en el vino
2. La práctica de la fermentación maloláctica
3. Bacterias lácticas y fermentación maloláctica
II. Requerimientos y factores de la fermentación
maloláctica
1. Necesidades nutricionales
2. Factores medioambientales
3. Guía para resolver problemas
-aplicación prácticaIII. Incidencias organolépticas, color y efectos al
realizar la fermentación maloláctica
1. Estudios sobre la pérdida de color
2. Percepción del consumidor de defectos
organolépticos del vino por una fermentación
maloláctica sin control
69
3. Efectos de los contaminantes microbiológicos
inducidos por la fermentación maloláctica
descontrolada en el vino
77
4. Incidencia cualitativa de la siembra de
bacteria en los vinos tintos
85
85
87
97
117
125
127
125
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación
maloláctica
1. Los tipos de vino y el momento óptimo para la
inoculación. Cómo controlar el proceso.
2. Fermentación maloláctica en barrica.
3. Fermentación maloláctica: cuándo y cómo
V. La Microoxigenación
1. Microoxigenación y fermentación maloláctica
I
I. Introducción a
la fermentación
maloláctica
(FML): las
bacterias lácticas
y su mecanismo.
Índice
9
9
19
23
I.1. Historia de la bacteria maloláctica en el vino
Sybille Krieger
Lallemand
19
I.2. La práctica de la fermentación maloláctica
23
I.3. Bacterias lácticas y fermentación maloláctica
Didier Theodore
Lallemand
Aline Lonvaud-Funel
Faculte d´enologie. Universite Victor Segalen
Bordeaux 2
H
I.1. Historia de
la bacteria
maloláctica en
el vino
Dra. Sibylle KRIEGER
Lallemand
1.1 Taxonomía de las bacterias lácticas
del vino
1.2 Ecología y desarrollo de las
bacterias lácticas
1.3 Factores que influyen en la
supervivencia y desarrollo de las
bacterias lácticas en el vino
1.4 Influencia de la fermentación
maloláctica en la composición del
vino
1.5 Alteración del vino por las bacterias
lácticas
1.6 Control de la fermentación
maloláctica
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
n 1837, en su libro titulado “A
Short Education on Suitable
Treatments of Vinificated
Juices,” 1 Freiherr von Babo describió el fenómeno de una “segunda”
fermentación en los vinos jóvenes,
que comenzaba con un incremento
de las temperaturas al final de la primavera (normalmente cuando florecían las viñas). Esta “segunda” fermentación liberaba CO2 y originaba una turbidez renovada en los vinos nuevos.
Von Babo relacionó esta actividad con
la “fusión de la grasa” de la fermentación alcohólica. Recomendó un trasiego inmediato a una barrica nueva, con adición de
SO2, clarificación y reducción de la temperatura,
seguido de un segundo trasiego y estabilización con
otra adición de SO2.
E
I.1. Historia de la bacteria maloláctica
en el vino
Durante los estudios sobre las alteraciones del vino
que llevó a cabo en 1866, Louis Pasteur aisló las primeras bacterias del vino e inició sus “Études sur le
vin”2. También se le puede atribuir la autoría de la opinión general de que todas las bacterias presentes en
el vino son organismos perjudiciales. La reducción de
ácidos observada en el vino se seguía relacionando
con la precipitación del ácido tártrico, aunque en
1891, Hermann Müller-Thurgau3 ya había postulado
que la reducción de ácidos podía ser resultante de la
actividad bacteriana. Koch4 y Seiffert5 confirmaron su
teoría en 1898 y 1901 respectivamente. En 1913, con
su histórica investigación sobre la bacteria del ácido
láctico (bacterias lácticas) en el vino6, Müller-Thurgau
y Osterwalder, explicaron la degradación bacteriana
del ácido málico en ácido láctico y CO2 mediante la
fórmula:
C4H6O5 = C3H6O3 + CO2
Bautizaron el fenómeno con el nombre de “desacidificación biológica” o “fermentación maloláctica,” y atribuyeron la responsabilidad del mismo a la Bacterium
gracile. En la década de 1950, la aplicación de nuevos
métodos enzimáticos ayudó a explicar las reacciones
enzimáticas que se producen durante la degradación
del ácido málico7. La aplicación de métodos analíticos
más perfeccionados por Radler8, Peynaud9, Beelman10
y Kunkee11 permitió comprender mejor las complejas
demandas de nutrientes de las bacterias lácticas del
vino, pues la degradación de ácido málico por sí sola
sólo proporciona una ventaja energética menor a las
cepas bacterianas12.
9
I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.
1.1 Taxonomía de las bacterias lácticas del vino
Desde estos primeros hallazgos, la investigación
sobre las bacterias lácticas ha mejorado. Se ha revisado el nombre de Bacterium gracile, que hace tiempo
se utilizaba a menudo como nombre del organismo
que causaba la fermentación maloláctica. Los resultados alcanzados por Vaughn13 y Radler8 han demostrado que las bacterias lácticas presentes en el mosto de
uva y en el vino pertenecen al género de
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y, más
recientemente, Oenococcus14. Muchas bacterias lácticas distintas pasaban al mosto y al vino desde la
superficie de las bayas, los vástagos, las hojas, el suelo
y el material de bodega. No obstante, debido al
medio sumamente selectivo que constituyen los
diversos mostos y vinos, sólo unos pocos tipos de
bacterias lácticas son capaces de desarrollarse en el
vino15, 16, 17. La descripción general siguiente es válida
para todas las bacterias lácticas del vino:
Gram-positiva;
No móvil y no esporulada;
Anaerobios facultativos;
Metabolismo quimioorganotrófico - Necesitan
un medio rico y azúcares fermentables;
• Temperatura óptima para su desarrollo comprendida entre 20° y 30°C.
Además de sus formas coccideas (redondas) o cilíndricas, el metabolismo homo o heterofermentativo
del azúcar constituye un criterio decisivo para su clasificación. Las bacterias homofermentativas producen
ácido láctico a partir de la glucosa y/o fructosa. Las
bacterias lácticas heterofermentativas producen dióxido de carbono, etanol y ácido acético, así como
ácido láctico, a partir de los mismos hidratos de carbono. Los lactobacilos pueden poseer ambos tipos
de metabolismo de los hidratos de carbono, y se dividen en tres grupos:
Grupo 1: Homofermentativos estrictos – Este
grupo nunca se ha detectado en el vino.
Grupo 2: Heterofermentativos facultativos – Una
molécula de glucosa se convierte en dos moléculas de ácido láctico. Las pentosas fermentan
en ácido láctico y ácido acético.
Grupo 3: Heterofermentativos estrictos – Fermentan la glucosa en ácido láctico, ácido acético, etanol y CO2. Las pentosas fermentan en
ácido acético y ácido láctico.
•
•
•
•
En la tabla siguiente se resume el metabolismo de los
hidratos de carbono de las bacterias lácticas corrientes en el mosto y el vino.
Tabla 1.
Metabolismo de hidratos de carbono de las bacterias lácticas
Grupo
Fermentación Azucar
Heterofermentativa facultativa
Grupo 2
Especies
Lactobacillus casei
Lactobacillus plantarum
Lactobacilli
(células forma ovalada)
Heterofermentativa estricta
Grupo 3
Homofermentativa
Lactobacillus brevis
Lactobacillus hilgardii
Pediococcus damnosus
Pediococcus pentosaceus
Cocci
(células redondas)
Heterofermentativa
Esta clasificación está sujeta a modificaciones debido
a los progresos de la identificación de nuevos aislamientos bacterianos a partir del vino, así como a los
avances de las técnicas de biología molecular utilizadas para identificar los aislamientos. Por ejemplo, en
1995 Dicks et al.14 han demostrado que la
Leuconostoc oenos se diferenciaba de otra especie
de Leuconostoc no sólo por su crecimiento en
medios ácidos, su necesidad de un factor de crecimiento de zumo de tomate y su esquema de fermentación de los hidratos de carbono, sino también por la
10
Leuconostoc oenos
Oenococcus oeni)
hibridación ADN/ADN y por los análisis digitales de
los esquemas proteínicos celulares solubles. Los estudios filogenéticos, en especial los que incluyen
secuencias 16S y 23S ARNr, han permitido identificar
un sublinaje diferenciado, Leuconostoc oenos, que es
independiente y distinto de otras especies de
Leuconostoc así como de otras bacterias lácticas en
general. Este sublinaje es genotípicamente homogéneo y constituye un grupo diferenciado de
Leuconostoc oenos. Por consiguiente, se le ha asignado un nuevo género llamado Oenococcus oeni.
Informe Técnico
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1.2 Ecología y desarrollo de las bacterias lácticas
Como se ha mencionado más arriba, en las uvas18 se
encuentran recuentos reducidos (inferiores a 100
células/g) de bacterias lácticas; en cambio, los recuentos de bacterias acéticas y de levaduras son mucho
más altos. Las bacterias lácticas aparecen en las hojas
y en los tallos de los racimos de la vid, y también se
pueden encontrar en el material de bodega. Estudios
realizados en varios países indican que la Oenococcus
oeni es la especie predominante en la realización de
la fermentación maloláctica en el vino, aunque la
composición de las bacterias lácticas presentes en el
mosto de uva al principio de la fermentación alcohólica está dominada por cepas de Lactobacillus. La
Pediococcus se encuentra principalmente después
de la fermentación maloláctica (FML) así como en los
vinos con un pH más alto. Normalmente, los vinos
con un pH inferior a 3.5 sólo contienen cepas de
Oenococcus oeni, mientras que los vinos con un pH
superior a 3.5 pueden contener diversas especies de
Pediococcus así como cepas heterofermentativas de
Lactobacillus. El estudio de Wibowo et al.17 identificó
diversas fases de la de vinificación (Fig. 1) en las que
pueden aparecer y desarrollarse distintas especies de
bacterias lácticas. Textualmente, dice así, “Después de
la trituración, por lo general los mostos contienen
poblaciones de bacterias lácticas de 103 a 104
CFU/mL; entre las principales especies presentes en
esta fase figuran Lactobacillus plantarum y
Lactobacillus casei, y, en menor medida, Leuconostoc
oenos [Oenococus oeni] y Pediococcus cerevisiae.
Por lo general, estas especies no se multiplican, y desaparecen durante la fermentación alcohólica, aunque
en contadas ocasiones (alto pH los vinos) se puede
producir una ligera proliferación de algunas especies
indeseables en su mayoría. La sensibilidad al etanol
puede explicar este declive de la viabilidad celular.
Después de un intervalo de estancamiento, cuya
duración depende en buena medida de las propiedades del vino, las células supervivientes empiezan a
multiplicarse y, una vez que han alcanzado la biomasa crítica, se inicia la degradación del ácido málico. La
supervivencia de las bacterias malolácticas después
de terminar la FML depende en buena medida de las
condiciones del vino y del tratamiento aplicado al
mismo. El aporte de dióxido de azufre induce una
pérdida progresiva de viabilidad de estas bacterias,
aunque también es muy importante el pH del vino.
Con un pH bajo, las bacterias lácticas del vino mueren
progresivamente, mientras que con un pH superior a
3.5, la población de bacterias lácticas puede seguir
aumentando. No sólo la Oenococcus oeni, sino también bacterias perjudiciales para el vino, como
Pediococcus y Lactobacillus se pueden multiplicar
hasta alcanzar concentraciones de nada menos que
de 106 a 108 CFU/mL, y por ende, deteriorar el vino. Así
pues, en condiciones de pH elevado, se recomienda
una estabilización temprana del vino.
Figura 1.
Ciclo de desarrollo de las bacterias lácticas en el vino durante la vinificación y crianza
11
I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.
1.3 Factores que influyen en la supervivencia y
desarrollo de las bacterias lácticas en el vino
Los factores que influyen en la supervivencia y multiplicación de las bacterias lácticas en el vino se pueden dividir en las tres categorías siguientes:
• La composición física y química del vino;
• Los factores asociados a la vinificación;
• Las interacciones microbianas entre las bacterias lácticas y otros microorganismos presentes
en el vino.
Comentaremos detalladamente los factores específicos, pero por lo que se refiere a la composición del
vino, el pH es uno de los parámetros más importantes
en la determinación del comportamiento de las bacterias lácticas en el vino, y también ejerce una acción
selectiva sobre las cepas de bacterias lácticas que
estarán presentes en el mismo. El pH del vino contribuye a determinar qué especie bacteriana proliferará,
su viabilidad y la tasa de crecimiento de las bacterias
lácticas, la velocidad de degradación del ácido málico,
y el comportamiento metabólico de las especies bacterianas. El pH crítico en el vino es 3.5, pues por debajo de ese umbral resulta más fácil controlar la microbiología del vino. Aunque es más difícil inducir la FML
con un pH más bajo, sólo las especies de bacterias
lácticas menos perjudiciales son capaces de desarrollarse y de llevar a cabo la FML a esos niveles de pH. El
dióxido de azufre (SO2) inhibe fuertemente el desarrollo de las bacterias lácticas, si bien la sensibilidad de
las bacterias lácticas al SO2 varía. El dióxido de azufre
es más inhibitorio con un pH bajo. El crecimiento y la
realización de la FML por bacterias lácticas se inhiben
progresivamente a concentraciones de alcohol superiores al 6%, siendo el 14% (v/v) el límite superior tolerado por la mayor parte de las cepas. Las bacterias lácticas del vino son mesofílicas, y la temperatura óptima
para su crecimiento está comprendida entre 15° y
30°C. Las temperaturas bajas inhiben fuertemente
tanto la tasa de crecimiento bacteriano como la velocidad de la FML.
cación, existe la posibilidad de una interacción de las
bacterias lácticas con levaduras, hongos, bacterias
acéticas y bacteriófagos, así como interacciones entre
especies y cepas de BAL20. El efecto antagónico de la
levadura se ha explicado por la competencia por los
nutrientes y la producción de sustancias que inhiben
el desarrollo bacteriano, como SO2 o ácidos grasos de
cadena media. Por otra parte, la levadura puede ayudar al desarrollo de las bacterias lácticas en el vino y
estimular la FML. Durante el contacto prolongado de
las lías con el vino, el proceso de autolisis de la levadura libera vitaminas y aminoácidos en el vino. Esto
induce un enriquecimiento en nutrientes, con la subsiguiente estimulación de la fermentación maloláctica. No obstante, Costello21 ha comunicado que el desarrollo de Pediococcus ssp se ve facilitado por la rápida muerte celular de Oenococcus oeni, y en condiciones de pH alto, el desarrollo temprano del
Lactobacillus brevis inhibe completamente el desarrollo de Oenococcus oeni. Recientemente,
Gerbaux31 ha demostrado que las condiciones del
vino que estimulan la FML pueden ser capaces de
inhibir el desarrollo de la levadura Brettanomyces tan
perjudicial para el vino.
Por lo que se refiere a las prácticas de vinificación, la
clarificación del mosto y del vino puede eliminar gran
parte de las bacterias lácticas y reducir asimismo la
incidencia del desarrollo bacteriano y su efecto sobre
la calidad del vino19. Durante la clarificación, se suprimen algunos nutrientes y partículas en suspensión
que estimulan el desarrollo bacteriano. Se ha comunicado que los vinos elaborados por termovinificación
son menos aptos a la fermentación maloláctica. El
momento de la inoculación de las bacterias malolácticas (bacterias lácticas) también influye en la cinética
de la FML. Por lo que se refiere a las interacciones con
otros organismos del vino, los cultivos mixtos de
microorganismos introducen la posibilidad de relaciones antagónicas y sinérgicas, aunque en algunos
casos menores pueden carecer de efecto. En la vinifi12
© Aaron Kohr - FOTOLIA
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1.4 Influencia de la fermentación maloláctica en la
composición del vino
La FML no consiste en una mera descarboxilación
del ácido málico en ácido láctico y CO2. Utilizando el
vino como sustrato de crecimiento, las bacterias
malolácticas eliminan algunos componentes del
vino y producen otras a resultas de su metabolismo.
La actividad metabólica de las bacterias lácticas no
sólo influye en los componentes aromáticos del
vino derivados del fruto y de la fermentación alcohólica22, sino que además confiere estabilidad biológica al producto final. Por norma general, se fomenta el desarrollo de bacterias lácticas cuando se
necesita la FML para reducir la acidez del vino. La
reducción de la acidez es beneficiosa para la calidad
del vino elaborado en regiones vitícolas frías, porque las bayas presentan naturalmente altas concentraciones de ácidos orgánicos. Las preferencias
actuales de los consumidores de todo el mundo se
inclinan por los vinos afrutados de acidez moderada, lo cual conlleva que la reducción de los ácidos
se ha convertido en un aspecto importante para la
producción de vinos en los climas más fríos. Este
Fermentación Maloláctica
hecho, combinado con los cambios de sabor positivos asociados al desarrollo de bacterias lácticas en
el vino, hace de la FML un proceso deseable para
casi todos los vinos tintos y para ciertos tipos de
blancos. Ahora bien, el desarrollo de bacterias lácticas en el vino debe estar rigurosamente controlado
para garantizar que se desarrollen bacterias lácticas
deseables que no produzcan sabores desagradables ni compuestos que encierren peligro para la
salud humana. En la mayor parte de los casos, es
importante lograr que la FML concluya rápidamente, para ahorrar tiempo de proceso y conseguir una
estabilidad temprana del vino. En ningún caso se
debería confiar en las cepas indígenas de bacterias
lácticas para realizar la FML.
Aparte de producir ácido láctico como principal producto final del catabolismo del azúcar23, se sabe que
las bacterias lácticas producen otros compuestos con
incidencia aromática, entre ellos el acetaldehído, el
ácido acético, el diacetilo, la acetoína, y el 2,3-butanodiol. El diacetilo, la acetoína y el 2,3-butanodiol son
producto del consumo bacteriano de ácido cítrico, y
tienen una incidencia considerable en el perfil aromático del vino. A bajas concentraciones, estos compuestos parecen aportar complejidad al aroma del
vino. A concentraciones superiores a 5 mg/L, el diacetilo puede resultar dominante, y conferir al vino un
claro sabor a mantequilla/avellana. Dependiendo del
pH y de la oxidación-reducción potencial del vino, el
ácido acético puede ser otro metabolito producido a
partir de la degradación de ácido cítrico por bacterias
lácticas. También se han comunicado mayores concentraciones de esteres volátiles, de etilactato, y graduaciones alcohólicas más altas en los vinos sometidos a la FML24. Henick-Kling25 ha descrito las contribuciones aromáticas de las cepas individuales de bacterias malolácticas.
1.5 Alteración del vino por las bacterias lácticas
La FML no siempre es beneficiosa, y puede causar
alteraciones indeseables en las propiedades organolépticas del vino. Como se ha mencionado más arriba,
son varias las especies de bacterias lácticas que pueden realizar la FML. Cuando la FML se produce con un
nivel de pH inferior 3.5, la suele inducir la bacteria
Oenococcus oeni y es menos probable que genere
olores indeseables, aunque algunas cepas indígenas
tienen la capacidad de hacerlo. Los olores indeseables
a mantequilla, leche, queso, metal y tierra, así como
cantidades excesivas de ácido acético suelen ir asociados a fermentaciones malolácticas desarrolladas
en vinos con un pH superior a 3.5 y realizadas por
pediococci o lactobacilos. Las bacterias lácticas producen aminas biógenas mediante la descarboxilación
de aminoácidos. Se cree que la histamina, derivada de
la descarboxilación de la histidina, provoca una reacción en individuos sensibles si el vino tiene una concentración superior a 0.1 mg/L. Se considera que, de
13
I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.
las diversas bacterias lácticas, Pediococcus sp. y
Lactobacillus brevis son las que más histamina producen26. Estos dos géneros se suelen hallar en vinos con
un pH superior a 3.5. Por consiguiente, la síntesis de
aminas biógenas parece ser importante únicamente
en los vinos con un pH elevado. Si sabe que hay presentes cepas bacterianas capaces de producir aminas
biógenas, el productor de vino debe inocular un cultivo maloláctico iniciador seleccionado por su capacidad de sustituir a las bacterias lácticas indígenas. Las
bacterias tienen una ligera capacidad de formar histaminas, y sólo durante su fase de crecimiento activo.
No obstante, se ha demostrado26 que incluso una flora
bacteriana no proliferante puede desarrollar cantidades considerables de histamina. Por lo tanto, se debe
eliminar la población bacteriana de un vino mediante
la adición de SO2 seguida de una clarificación nada
más terminar la FML; esto es especialmente importante en los vinos con un pH alto. También se pueden
producir alteraciones organolépticas indeseables a
raíz del metabolismo de bacterias lácticas indígenas,
como por ejemplo coloraciones parduscas, cambios
de color y viscosidad.
1.6 Control de la fermentación maloláctica
Impedir la FML:
Si no se desea la FML, hay que impedir el desarrollo de
bacterias lácticas en el mosto y en el vino mediante la
eliminación o desactivación de las bacterias presentes en dichos medios. Aunque en ocasiones puede
resultar difícil inducir la FML, impedir el desarrollo de
bacterias lácticas es igualmente difícil. Dependiendo
del pH, la adición de 50-100 mg/L de SO2 debería destruir más del 90% de las bacterias viables presentes. El
efecto del SO2 depende de la acidez del vino: el SO2
es más eficaz con los niveles de pH más bajos. Por
consiguiente, en vinos con un alto pH, hay que considerar la utilización de una combinación de SO2 con
lisozimas o la utilización de lisozimas solas. Para la
inhibición de la FML se puede utilizar todos los factores contrarios a los empleados para favorecer su desarrollo. Por lo tanto, los parámetros que permiten inhibir la FML son los siguientes:
•
•
•
•
Maceración mínima;
pH bajo;
Bajas temperaturas;
Trasiego y clarificación precoz.
Inducción de la FML:
Los análisis químicos y sensoriales han demostrado
que las bacterias lácticas influyen en la calidad del
vino no sólo a través de la propia FML, sino también a
través de otras actividades metabólicas. Si se desea la
FML y la producción bacteriana de compuestos aromáticos, el productor de vino puede propiciar el crecimiento de bacterias lácticas manteniendo condicio14
nes favorables al desarrollo y la supervivencia de las
bacterias, como temperaturas más cálidas, adición
mínima o nula de SO2, y retraso del trasiego. También
se puede llevar a cabo una inoculación cruzada con
vinos que ya están experimentando la FML. No obstante, los métodos más eficaces y recomendables son
o bien la inoculación en el vino de cepas de bacterias
malolácticas preparadas en laboratorio o adquiridas
en el comercio, o el paso del vino sobre bacterias
malolácticas activas inmovilizadas. Las bacterias lácticas más recomendables para realizar la FML son las
cepas de Oenococcus oeni, porque pueden crecer en
vinos con pH bajo y pueden degradar el ácido málico
sin producir sabores y olores indeseables ni metabolitos peligrosos. Además, no degradan los componentes del vino necesarios para la calidad y estabilidad
del mismo, como son el ácido tartárico, el etanol o el
glicerol19. El crecimiento de la Oenococcus oeni será
lento en los vinos con un pH inferior a 3.1 y, dependiendo de otros factores inhibidoress del desarrollo
así como de la densidad celular inicial, el inicio y la
culminación de la FML se puede retrasar considerablemente. En las condiciones de crecimiento más elevadas, es decir con un alto pH, las especies
Lactobacillus y Pediococcus pueden realizar la FML.
La opinión de que dichas especies producen vinos
menos aceptables que aquellos en los que se ha desarrollado la Oenococcus oeni está generalmente
aceptada27. En algunos vinos, se puede provocar el
fracaso de la FML por la inoculación de un vino que ya
está experimentando la FML. Las principales desventajas de este planteamiento son que hay que disponer de un vino adecuado, y que las bacterias contenidas en el vino inóculo pueden no ser adecuadas para
su desarrollo en el vino en donde se inoculan. Y lo que
es más importante, no se conocen bien las características de dichas bacterias. El reconocimiento creciente
de la influencia de la FML en la calidad del vino ha llevado a los productores de vino a buscar un mayor
control sobre la intervención y el resultado de la FML.
La inoculación de cultivos iniciadores definidos, cuidadosamente seleccionados en la naturaleza, reduce
el potencial de alteración por otras bacterias lácticas
y/o bacteriófagos, garantizando con ello el rápido inicio de la FML, un mayor control de la producción de
compuestos aromáticos, sabores y olores en el vino28.
Se han desarrollado cultivos iniciadores a base de
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diversas bacterias lácticas, y en su mayor parte se
comercializan en forma liofilizada o congelada, aunque también se venden algunos cultivos líquidos.
Estas cepas se han seleccionado a partir de la FML
espontánea por su buena cinética fermentativa, sus
resultados en condiciones restrictivas en el vino, y sus
propiedades organolépticas deseables. Estas cepas
toleran las difíciles condiciones de crecimiento y
supervivencia imperantes en el vino y no producen
metabolitos peligrosos. No producen compuestos
aromáticos que puedan incidir negativamente en la
calidad del vino, sino que, por el contrario, aportan
contribuciones organolépticas positivas al sabor del
vino. Hasta hace poco, la mayor parte de estos cultivos iniciadores requerían una fase de aclimatación o
reactivación
en
condiciones
controladas29.
Normalmente, su reactivación se llevaba a cabo en
mosto de uva sin SO2, que se diluía en una proporción
de 1:1 con agua y/o vino. Se ajustaba el pH del mosto
diluido a un nivel de 3.6 o superior, y se añadían
nutrientes bacterianos a una concentración de 0.05%
w/v. Por lo general, la reactivación llevaba al menos
24 horas, y se evitaba el choque térmico mediante el
desarrollo de las células a una temperatura que no
difiriera en más de 10°C de la temperatura del vino al
que se iba a añadir el iniciador.
Desde hace poco se comercializan asimismo cultivos
iniciadores para la inoculación directa de las bacterias
en el vino. Estos cultivos iniciadores se han preaclimatado durante su proceso de producción para que
sobrevivan a su incorporación a un medio hostil en el
vino sin que disminuya el recuento de células viables
ni se produzca la subsiguiente pérdida de actividad
maloláctica. Estas preparaciones de bacterias malolácticas se pueden añadir directamente al vino, o se
pueden rehidratar en agua durante un breve periodo
de tiempo antes de su adición al vino. El objeto de la
fase de rehidratación consiste en conseguir una
mejor distribución de las bacterias al añadirlas al vino.
Las bacterias malolácticas se pueden inocular en las
fases siguientes de la fermentación alcohólica:
•
•
•
•
Simultáneamente a la inoculación de levadura;
Durante la fermentación alcohólica;
Hacia el final de la fermentación alcohólica;
Después de la fermentación alcohólica.
El mejor momento para la inoculación de bacterias
lácticas sigue siendo objeto de discusión. En Burdeos
(Francia) la opinión consiste en recomendar la inoculación de bacterias lácticas nada más terminar la fermentación alcohólica, para evitar el riesgo de producir ácido acético y D-ácido láctico, la llamada “piqûre
lactique”(picado láctico)30. En ocasiones, la FML que se
produce durante la fermentación alcohólica puede
provocar una interrupción de la fermentación alcohólica. La investigación no ha confirmado unánimemente los resultados franceses referentes al desarrollo de
una alta concentración de ácido acético, al antagonismo con la levadura o a la interrupción de la fermentación alcohólica que se han asociado al desarrollo precoz de bacterias lácticas. Se ha abogado por la inoculación de la levadura junto con bacterias lácticas porque se creía que las bacterias tenían más posibilidades de crecer y aclimatarse en ausencia de etanol.
Para controlar con éxito el proceso de vinificación, es
importante comprender los mecanismos reguladores
que rigen el desarrollo y el metabolismo de las bacterias malolácticas en el vino. Es importante seleccionar
la cepa más adecuada, elegir el momento más favorable para la inoculación, garantizar que la cepa de bacterias lácticas correcta domine la FML y que la FML
culmine en un plazo de tiempo predecible (Fig. 2).
Figura 2.
FML controlada
15
I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.
Referencias
1. von Babo, Freiherr. 1837. Die Mängel und
Krankheiten des Weines und deren verbesserung. In:
Kurye Belehrung über die zweckmäßige
Behandlungsart der eingekellerten Weine.
Heidelberg. 59-73.
2. Pasteur, L. 1866. Études sur le vin. París.
3. Müller-Thurgau, H. 1891. Ergebnisse neuer
Untersuchungen auf dem gebiete der Weinbereitung.
Weinbau und Weinhandel. 9:421-428.
14. Dicks, L. M. T., F. Dellaglio, and M. D. Collins. 1995.
Proposal to reclassify Leuconostoc oenos as
Oenococcus oeni gen.,comb. Nov. Int. J. Syst.
Bacteriol. 45:395-397.
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31. Gerbaux, V. Comunicación personal.
17
L
I.2. La práctica
de la
fermentación
maloláctica
Didier THEODORE
Lallemand
2.1 Gestión de la fermentación
maloláctica en bodega
2.2 Determinación del momento de la
inoculación
2.3 Problemas potenciales
2.4 Procedimientos analíticos
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
enococcus oeni, es la bacteria láctica identificada como
la especie responsable de
llevar a cabo la fermentación
maloláctica (FML) en el vino y de hacer
importantes aportaciones a la mejora
de la calidad de éste. Incluso en condiciones ideales, la FML presenta fastidiosas exigencias nutricionales, y se
desarrolla muy lentamente. Por ello no
resulta sorprendente que las condiciones desfavorables para su desarrollo
que presenta el vino puedan hacer
sumamente difícil que se inicie y complete la FML. Para que se inicie la FML,
las poblaciones bacterianas deben alcanzar una concentración mínima de 106 CFU/mL, y las condiciones
físicas del vino hacen difícil que se cumpla este requisito.
O
I.2. La práctica de la fermentación
maloláctica
2.1 Gestión de la fermentación maloláctica en
bodega
Los factores más importantes que influyen en el desarrollo bacteriano en el vino son el alcohol, el SO2, la
temperatura y el pH. Las bacterias empiezan a presentar signos de inhibición del desarrollo con una concentración de alcohol del 10% aproximadamente. La
concentración de SO2 libre se debe mantener lo más
baja posible, para evitar que inhiba aún más el desarrollo y la supervivencia de las bacterias lácticas. Las
bacterias lácticas se multiplican a temperaturas comprendidas entre 18° y 20°C, pero su crecimiento se ve
fuertemente restringido a temperaturas inferiores. Las
bacterias se desarrollan en una horquilla de pH de 3 a
4, observándose un crecimiento más abundante con
un pH de 4 que con un pH de 3. La FML se produce
más fácilmente con un pH más alto que con un pH
más bajo, si bien la presencia de un pH más alto
puede favorecer el desarrollo de cepas de bacterias
lácticas que pueden tener un fuerte impacto negativo en la calidad del vino. Es necesario relacionar el
efecto de cada uno de estos parámetros en la FML
con el de los parámetros restantes, pues no ejercen su
influencia individualmente, sino que ésta depende de
la suma de todos los factores. Por consiguiente, se
puede estimar que el vino no es un medio conducente sin esfuerzo al desarrollo de microorganismos. Para
superar las tensiones naturales del medio que es el
vino, con objeto de garantizar el desarrollo de las bacterias lácticas y una FML completa en éste, se recomienda añadir un cultivo bacteriano iniciador. La bacteria Oenococcus oeni es el organismo de elección, y
es preferible añadir una cantidad concentrada de
dicho organismo. Cuando se añade dicho organismo
en cantidades suficientemente importantes, éste se
ve obligado a crecer y multiplicarse en las condiciones del vino, lo cual significa que la FML comenzará
sin tener que esperar a que se desarrolle un número
19
I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.
de células suficientemente importante. Existen cultivos comerciales de bacterias lácticas aptos para su
inoculación en el vino. Estos cultivos están disponibles en estado líquido, congelado, o deshidratado por
congelación. Algunos de los cultivos deshidratados
por congelación han sido adaptados biofísicamente
para resistir los rigores del medio del vino, y se pueden añadir directamente al vino sin necesidad de
pasar por una fase de activación. Los demás tipos de
cultivo iniciador requieren fases de activación y multiplicación previas a su introducción en el vino. Este
proceso exige pasar por varias etapas planificadas, y
conlleva mucho trabajo. Si se realiza correctamente,
normalmente garantiza una FML completa, incluso
en los vinos más difíciles, pues los cultivos lácticos iniciadores han sido seleccionados por su resistencia a
las condiciones adversas del vino. Cuando se utilizan
cultivos que se pueden inocular directamente en el
vino, o que sólo requieren una fase de desarrollo, la
intención es inocular una población bacteriana mínima de 106 CFU/mL sin depender del desarrollo de las
bacterias lácticas del propio vino para alcanzar dicha
concentración.
La investigación ha demostrado que cuando se comprenden las interacciones entre la levadura de fermentación y la bacterias lácticas, la inoculación de un
cultivo maloláctico iniciador en diversos momentos
de la fermentación alcohólica puede dar buenos
resultados. Ahora bien, dependiendo de los procesos
de vinificación utilizados – microoxigenación, termovinificación o maceración prolongada – la FML se
puede retrasar hasta el final de la fermentación alcohólica. En esos casos, los responsables pueden ser la
adición de SO2, la clarificación del vino y los regímenes de refrigeración.
En presencia de vinos con un elevado pH, puede
resultar beneficioso una adición precoz de lisozima,
una enzima específicamente dirigida a las bacterias
Gram+. Si se controla estrictamente el momento del
aporte, la adición ulterior del cultivo maloláctico iniciador deseado se puede llevar a cabo más tarde. La
introducción de iniciadores de cultivo maloláctico
comerciales ha permitido a los vinificadores integrar
mejor sus procesos de vinificación gracias a la gestión
de la FML.
La investigación ha permitido conocer mejor la nutrición bacteriana y la influencia del vino en el desarrollo
de bacterias lácticas y la nutrición de las levaduras
durante la fermentación alcohólica. Se ha demostrado
que las levaduras con grandes necesidades nutricionales durante la fermentación alcohólica agotan rápidamente los factores de crecimiento del mosto necesarios para el desarrollo de la bacteria láctica justo
cuando se desea la FML. El fenómeno se puede producir en todos los mostos de uva, pero resulta especialmente problemático en las uvas de varietales con un
contenido de nutrientes naturalmente bajo. Esta
investigación ha desembocado en la recomendación
de añadir nutrientes bacterianos después de la fermentación alcohólica con objeto de ayudar a la iniciación y culminación de la FML. Es imprescindible garantizar una nutrición adecuada y suficiente de los hongos de fermentación así como de las bacterias lácticas.
2.2 Determinación del momento de la inoculación
Es imperativo inocular el vino con un cultivo maloláctico iniciador que presente una concentración de
población de 106 CFU/mL para garantizar una presencia de células bacterianas suficiente para degradar el
ácido málico. Si la fermentación alcohólica se inicia y
concluye rápidamente, la degradación del ácido málico por la bacterias lácticas no suele provocar una acidez volátil (AV) extrema. Cuando se observan cantidades excesivas de AV, éstas suelen ser consecuencia de
la presencia y crecimiento de bacterias indígenas, con
toda probabilidad introducidas en el vino debido a
una combinación de condiciones sanitarias deficientes y elevado pH del vino. Estas bacterias indígenas se
desarrollan en el vino utilizando el azúcar como fuente de energía, y produciendo ácido acético.
20
© Aaron Kohr - FOTOLIA
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
2.3 Problemas potenciales
A veces, en lugar de mejorar el vino, las bacterias lácticas pueden provocar cambios indeseables. Durante
la FML ocurrida naturalmente y sin control, realizada
por cepas indígenas de Lactobacillus y Pediococcus,
se puede producir una alteración de las propiedades
organolépticas del producto. Concretamente, se
puede formar un exceso de AV o de diacetilo. Además
de velar los sabores afrutados primarios del vino,
estos compuestos también pueden aportar caracteres indeseables a su aroma. Por ejemplo, los AV son
irritantes para la nariz y provocan un sabor agrio. El
diacetilo puede aportar un sabor almendrado o
características que pueden evocar el caramelo, la
levadura e incluso el pelo de animal mojado. Los aromas y sabores indeseados generados por el desarrollo de organismos de putrefacción pueden producir
características similares al yogur ácido, la mantequilla
rancia y el sudor. En los vinos tintos, los fenoles volátiles pueden producir olores a establo, y en los blancos,
los mismos componentes pueden provocar la aparición de olores a antiséptico. Esos olores pueden ir
acompañados de amargor y de taninos metálicos en
el paladar. La proliferación incontrolada de microor-
ganismos indeseados puede generar compuestos
secundarios, entre ellos, alergenos tales como aminas
biógenas (histamina, putrescina y cadaverina), y compuestos potencialmente cancerígenos como el carbamato de etilo y la ocratoxina A.
2.4 Procedimientos analíticos
La acción más obvia de la FML es la descaboxilación
del ácido málico del vino, y siempre provoca una disminución de la acidez total y un incremento del pH.
La forma más fácil de seguir el avance de la FML consiste en realizar análisis químicos para detectar la desaparición del ácido málico. A continuación se describen algunos de los métodos más utilizados.
• Cromatografía en papel
Es una técnica cromatográfica cuantitativa utilizada
para realizar un seguimiento visual de la desaparición
del ácido málico. No es precisa, pero sí fácil de utilizar
en bodega.
• Técnicas enzimáticas
Esta técnica es más compleja y costosa, pero resulta
muy precisa. Utiliza el análisis químico para determinar la concentración absoluta de cualquier ácido
orgánico en el mosto. Durante la FML, el L-ácido málico se convierte específicamente en L-ácido láctico, de
modo que se puede utilizar la medición de la concentración de L-ácido láctico como indicador del inicio
de la FML. Por lo general, cuando la concentración de
L-ácido láctico alcanza 200-300 mg/L, se puede suponer con seguridad que se ha iniciado la FML.
Normalmente, se considera que la FML ha concluido
cuando la concentración de ácido málico baja a valores de entre 100 y 200 mg/L.
• Recuentos microbiológicos
Esta técnica aísla y cuenta el número de bacterias lácticas presentes en el vino. Su tasa de crecimiento es
muy lenta, de modo que puede llevar hasta siete días
determinar el número de Oenococcus oeni viables. La
tasa de crecimiento de bacterias indeseables, como
Lactobacillus y Pediococcus, es más alta, de modo
que el recuento de estos organismos se puede obtener en un plazo de dos días.
• Observación microscópica
Este método se basa en la observación directa de un
vino mediante un microscopio de buena calidad. No
es cuantitativo, pero si lo aplica un técnico con experiencia, proporciona una evaluación rápida y valiosa
de la microflora presente en el vino.
21
B
I.3. Bacterias
lácticas y
fermentación
maloláctica
Aline LONVAUD-FUNEL
Faculté d’enologie. Université victor
segalen bordeaux 2
3.1 Las bacterias lácticas: generalidades
3.2 Principales metabolismos en el vino
3.3 Vías de utilización de ciertos
aminoácidos
3.4 Metabolismos de alteración
3.5 Lugar de las bacterias lácticas en el
ecosistema microbiano de la uvavino
3.6 Conclusión
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
3.1 las bacterias lácticas:
generalidades
as bacterias lácticas (BL) son
microorganismos comunes en
numerosos entornos. Están presentes en gran número de
vegetales y en la leche, y participan en
la elaboración de todo tipo de productos fermentados, bebidas y alimentos.
Las BL del vino son muy parecidas a las
de la sidra, con las que presentan grandes similitudes en cuanto a materia
prima y proceso de elaboración. Por lo
tanto, la especie Oenococcus oeni
desempeña el mismo papel en sendos medios. En
otras bebidas o verduras fermentadas, hay mayor presencia de lactobacilos, lactococos y estreptococos,
que son los encargados de realizar las transformaciones.
I.3. Bacterias lácticas y fermentación
maloláctica
L
- Definición
Las BL son bacterias de coloración Gram positiva. Esta
sencilla prueba de color permite distinguirlas rápidamente de las bacterias acéticas, Gram negativas, que
también están siempre presentes en el mosto y en el
vino. Todas las BL producen ácido láctico a partir de
los azúcares. Cultivadas en un medio que contenga
glucosa y todos los demás nutrientes imprescindibles
para su desarrollo, se multiplican en el mismo acidificándolo intensamente.
- Clasificación
La forma de las células es bien visible tras una prueba
de coloración Gram. Es redondeada en el caso de los
cocos y alargada en el de los bacilos. En el entorno
enológico, existen cocos y bacilos. La vía metabólica
de fermentación del azúcar es el criterio que permite
clasificar a las BL como bacterias homofermentativas
y heterofermentativas. Las primeras producen exclusivamente ácido láctico a partir de la glucosa, y las otras
forman asimismo ácido acético, etanol y CO2 como
principales metabolitos.
Algunas BL se comportan como homofermentativas
en condiciones de cultivo óptimas, pero como heterofermentativas en otras condiciones. Esas bacterias, a
diferencia de las homofermentativas estrictas, fermentan las pentosas por la misma vía que las heterofermentativas. Son heterofermentativas "facultativas".
Hasta ahora, no se ha descrito en el vino ningún lactobacilo homofermentativo estricto. Las especies
identificadas se clasifican entre los cocos y bacilos
heterofermentativos, y los cocos homofermentativos.
23
I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.
Figura 1.
Fotografias de bacterias aisladas del vino, tomadas al microscopio electrónico
Oenococcus oeni
Pediococcus damnosus
Lactobacillus brevis
Especies más comunes de bacterias lácticas del vino
Lactobacilos
Heterofermentativo facultativo
Lactobacillus plantarum -L. casei
Lactobacilos
Heterofermentativo
L. brevis, L hilgardii
Cocos
Homofermentativo
Pediococcus parvulus, P. damnosus
Cocos
Heterofermentativo
L. mesenteroides, O. oeni
- Identificación
Los métodos clásicos de identificación se basan en la
observación de varios caracteres (denominados
caracteres fenotípicos). La clasificación de una cepa se
determina en función del parecido de esos caracteres
con los de las cepas tipo. Las pruebas de identificación se realizan sobre aislamientos puros, es decir
sobre bacterias aisladas tras su cultivo en medio nutritivo gelificado.
Las colonias aisladas se vuelven a poner en cultivo
con glucosa como único azúcar para determinar el
tipo fermentativo (heterofermentación/homofermentación). Después, en las mismas condiciones, se
sustituye la glucosa por otros azúcares diversos, hexosas, pentosas y “osas” varias, que permiten obtener el
perfil bioquímico. En función de su capacidad de
metabolizar tales o cuales azúcares, las bacterias se
clasificarán dentro de una u otra especie. El método
más cómodo de clasificación consiste en utilizar las
galerías "API 50CH" en las cuales se miniaturiza una
cuarentena de pruebas en una misma placa. La identificación se lleva a cabo cotejando el resultado de
todas las pruebas con las claves facilitadas en el
manual de clasificación de Bergeys. Aunque el método sea sencillo, lleva mucho tiempo, pero lo peor es
que a veces los resultados son ambiguos.
En lo sucesivo la identificación se basa en el análisis
del ADN, es decir en el verdadero patrimonio genético de la célula, y no en su reflejo a través de caracteres fenotípicos más o menos fáciles de poner en evidencia. Existen varios métodos disponibles, el más
seguro consiste en secuenciar una parte del genoma
24
muy característico de la especie, correspondiente a
los genes que codifican el ribosoma esencial de la
célula, es decir el ARN 16S. Esta región contiene partes muy conservadas en todas las bacterias de una
misma especie, así como otras variables en función
de las cepas. Basándose en este principio, el método
de PCR permite identificar un aislamiento considerando la región conservada en la especie. Consiste en
estudiar esa región por amplificación genética, eligiendo "inicios" cuya la secuencia es específica de la
especie. La identificación también se puede llevar a
cabo mediante hibridación del ADN con una sonda
específica. Por último, a nivel de la cepa, el método
más seguro consiste en analizar el perfil genético
generado por la hidrólisis del cromosoma bacteriano.
Todos estos métodos se utilizan para identificar cepas
aisladas por cultivo en un medio nutritivo, aunque
también se puede hacer inventario de las bacterias
presentes en una mezcla como el vino o el mosto de
uva, sin cultivo previo. El método (PCR-DGGE) se basa
en la diferencia de migración de ADN 16S en función
de las especies.
Figura 2.
Hibridación de
colonias con la
sonda de ADN
genómico
Oenococcus oeni
Informe Técnico
Fundación para la Cultura del Vino
Figura 3.
Perfil genómico de cepas de O. oeni aisladas en una cuba durante la FML
Fermentación Maloláctica
dentes en la fermentación alcohólica, si la competencia entre levaduras y bacterias se inclina a favor de
estas últimas, o si la fermentación se desacelera o se
interrumpe por otros motivos. En esa situación, se fermentan varios gramos de hexosas por litro, y la acidez
volátil aumenta sensiblemente. Es el llamado picado
láctico. Este incidente es especialmente de temer
cuando tanto el pH de la vendimia como la concentración de los azúcares son muy altos.
- Transformación del ácido málico
3.2 Principales metabolismos en el vino
- Fermentación de los azúcares
Los azúcares son las principales fuentes de energía
para el crecimiento de las bacterias. Dependiendo de
las especies de lactobacilos y de cocos, se fermentan
bien por vía de la glicolisis (homofermentación) bien
por la vía de las pentosas (heterofermentación); sin
embargo, sólo esta última genera el ácido acético que
incrementa la acidez volátil del vino. No obstante, en
una vinificación normal, sin incidentes, cuando se
multiplican las BL, en el medio sólo persisten los azúcares sin fermentar por las levaduras. Por lo general, se
trata de algunas centenas de mg/l de glucosa y de
fructosa, y de las pentosas del zumo de uva (arabinosa, xilosa).
Figura 4.
Distintas vías de fermentación de los azúcares por las BL
Es la reacción principal de la FML. Químicamente,
consiste en la mera descarboxilación del ácido L-málico del vino en ácido L-láctico. Bioquímicamente, es el
resultado de la actividad de la enzima maloláctica,
característica de las BL. Esta transformación tiene un
doble efecto. Por una parte, desacidifica el vino, es
decir eleva el pH, tanto más cuanta más alta fuera la
cantidad inicial de ácido málico. Por otra parte, también suaviza el vino, al hacer desaparecer el sabor
ácido y duro del ácido málico y sustituirlo por el sabor
más suave del ácido láctico.
Esta es la reacción principal que hace que la FML
modifique muy sensiblemente los caracteres organolépticos del vino, y el motivo por el cual la segunda
fermentación resulta especialmente recomendable
para la mayor parte de los vinos tintos y muchos blancos. La duración de la transformación del ácido málico depende de la cantidad inicial de ácido éste y del
nivel de población total de la bacteria que haya conseguido multiplicarse en el vino. Sin embargo, para
una misma biomasa formada, se puede desacelerar
como consecuencia de ciertos inhibidores del vino,
que de momento todavía no están bien identificados.
El pH, el grado alcohólico, la temperatura y la concentración de dióxido de azufre son los principales parámetros que controlan el crecimiento y el nivel de la
población total.
- Degradación del ácido cítrico
Los azúcares residuales son suficientes para suministrar la energía necesaria para el crecimiento de las BL
y permitir la formación de la biomasa que posteriormente lleva a cabo la fermentación maloláctica (FML).
La producción de acidez volátil es siempre muy limitada, y sólo llega a cobrar importancia en caso de inci-
Mientras que, antes de la FML, el vino contiene varios
g/l de ácido L-málico, por lo general sólo contiene
entre 200 y 300 mg/l de ácido cítrico. Ahora bien, aunque su concentración sea baja, el ácido cítrico tiene
una gran importancia, pues su vía metabólica conduce por una parte a ácido acético, es decir a un aumento de la acidez volátil, y por otra parte a las moléculas
acetoínicas, la más importante de las cuales es el diacetilo. Este compuesto aromático, que tiene un olor a
mantequilla, se detecta fácilmente en la cata desde
concentraciones relativamente bajas, del orden de 56 mg/l en los vinos blancos y 8-9 mg/l en los vinos tintos. Por debajo de ese umbral, el diacetilo contribuye
al bouquet del vino y a su complejidad. Por encima,
puede llegar a resultar francamente desagradable. No
obstante, para algunos vinos sí que se busca esa nota
mantecosa.
25
I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.
Figura 5.
Vía de degradación del ácido cítrico por las bacterias lácticas
fuente principal de carbamato de etilo sigue siendo la
urea producida por la levadura durante la fermentación alcohólica.
- Descarboxilación de ciertos aminoácidos
El diacetilo se puede reducir a acetoína debido a las
actividades enzimáticas de las bacterias, y también de
las levaduras, de manera que si se prolonga el contacto del vino con las lías, disminuye su concentración.
Esa puede ser una buena manera de suprimir un
exceso. Por el contrario, el trasiego precoz permite
conservarlo.
La degradación del ácido cítrico es un carácter muy
común de las bacterias del vino, si bien es más lenta
que la del ácido málico. Por ello, a veces al final de la
FML el vino todavía contiene la mayor parte del ácido
cítrico inicial. No obstante, la observación general es
que incluso después de la adición de azufre, la actividad bacteriana continúa y la concentración final del
vino acaba por ser nula. El aumento del ácido acético
observado durante y en ocasiones después de la FML
se debe a esta degradación.
Las BL pueden producir aminas biógenas por la mera
reacción de descarboxilación de los aminoácidos
correspondientes. La histamina y la tiramina son las
principales aminas cuya concentración aumenta
durante y después de la FML. Se forman a partir de la
histidina y de la tirosina respectivamente. Las enzimas
descarboxilasas necesarias para esas transformaciones se han purificado y estudiado en bacterias lácticas
del vino. Son muy frecuentes en los lactobacilos heterofermentativos (L. brevis y L. hilgardii), si bien también se han aislado cepas de O. oeni productoras de
histamina.
Los genes que codifican la histidina y la tirosina descarboxilasas han sido secuenciados y bien localizados
dentro de un conjunto de genes que también incluyen los que codifican las proteínas de transporte que
intercambian el aminoácido y la amina al nivel de la
membrana celular. La capacidad de producir aminas
biógenas es totalmente dependiente de la presencia
de dichos genes. Por lo tanto, si se detectan esos
genes en la población, eso significa que el riesgo de
producción de amina biógena es alto, en caso de que
se multipliquen esas bacterias en concreto.
3.3 Vías de utilización de ciertos aminoácidos
Figura 6.
- Degradación de la arginina
La mayor parte de los lactobacilos del vino y numerosas cepas de O. oeni catabolizan la arginina del vino.
Es uno de los aminoácidos más importantes, y en el
vino, después de la FA, procede sobre todo del metabolismo de las levaduras y de su autolisis.
La vía de degradación es la de la arginina deiminasa.
Consta de tres etapas, catalizadas por tres enzimas
cuyos genes se han caracterizado en la O. oeni. El análisis de un gran número de cepas de esta especie permite concluir que estos genes están situados en una
región del cromosoma presente o ausente en su totalidad, dependiendo de las cepas. Incluye asimismo los
genes que codifican las proteínas de transporte de la
arginina. Como esta vía metabólica suministra energía
a las bacterias, las cepas que poseen todos los genes
tienen una ventaja sobre las demás, algo que puede
resultar importante para su supervivencia o su crecimiento.
A nivel enológico, la consecuencia es la formación de
citrulina, precursor del carbamato de etilo. Sin embargo, las concentraciones formadas son débiles, y la
26
Esquemas de los sistemas de producción de histamina y tiramina
por las BL del vino.
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
A partir de esta observación, se ha desarrollado una
prueba basada en la amplificación de estos genes por
PCR. Si la prueba da positivo antes de la FML, constituye una buena indicación para la utilización de levaduras malolácticas. En efecto, aunque no se pueda eliminar las bacterias indeseables, se puede frenar su
crecimiento mediante una siembra masiva de O. oeni
seleccionadas. Luego, desde el momento en que se
haya degradado el ácido málico, se puede realizar un
sulfitado adecuado que permitirá reducir aún más su
población, y por ende su actividad. Si la prueba de
detección de las bacterias productoras de aminas
biógenas da positivo después de la FML, indica la
necesidad de sulfitar rápidamente y lo más eficazmente posible, pero también de evitar el contacto
prolongado con las lías. Durante la crianza de estos
vinos, será necesario vigilar la microflora láctica.
- Metabolismo de los aminoácidos azufrados
La cisteína y la metionina son metabolizadas por las
bacterias que forman compuestos azufrados diversos,
entre ellos el hidrógeno sulfurado y el metano-tiol,
poco apreciados.
El metabolismo de la metionina está mejor estudiado,
y conduce, además del metanotiol y del sulfuro de
dimetilo, a moléculas más complejas de probada incidencia organoléptica. Las bacterias lácticas del vino
producen estos compuestos, metionol y ácido metil3-sulfanilo propiónico pero la O. oeni es la que los
produce en mayores cantidades. Su concentración
aumenta durante la FML, y podrían figurar entre las
numerosas moléculas aromáticas que participan en el
cambio complejo del aroma de los vinos por influencia de las BL.
Figura 7.
Detección por PCR de las bacterias productoras de amargor en el
vino
-Producción de glucano
Durante la FML, las BL forman exopolisacáridos en el
vino. De momento, todavía no se conocen bien, y
probablemente participan en reacciones con los
demás compuestos del vino. Sin embargo, algunas
sintetizan un glucano muy particular, que tiene la propiedad de incrementar considerablemente la viscosidad del vino, incluso a una concentración relativamente débil. Es la enfermedad de la “grasa” o de los
vinos “ahilados” que en ocasiones sobreviene en cuba
o en barrica, pero también con gran frecuencia en
botella. Hasta ahora, las bacterias aisladas más a
menudo en estos vinos alterados se han identificado
como Pediococcus parvulus o P. damnosus, pero sólo
se trata de cepas concretas de estas especies, bien
adaptadas para crecer en el vino. Esas cepas poseen
un gen particular que codifica una enzima implicada
en la síntesis del glucano. Se pueden detectar con la
prueba PCR apropiada.
Figura 8.
Detección por hibridación ADN/ADN de bacterias de la
enfermedad de la grasa. (Izda. Todas las colonias cultivadas a
partir de una muestra de vino. Drcha. Sólo se revelan las
colonias de la enfermedad de la grasa)
3.4 Metabolismos de alteración
- Degradación del glicerol
El glicerol es un componente fundamental del vino,
formado por las levaduras. La mayoría de las veces no
queda metabolizado después de la fermentación
alcohólica. Sin embargo, algunas cepas de lactobacilos disponen de una vía especial que conduce al 1,3
propanodiol. La primera etapa la cataliza la gliceroldeshidratasa, y produce 3 hidroxi propionaldehído,
que se reduce inmediatamente a 1,3 propanodiol. Sin
embargo, una cantidad muy reducida del aldehído
escapa a la reducción, y forma acroleína, con una
doble incidencia en la calidad del vino: por una parte
desaparece el glicerol, a veces completamente, y por
otra parte, la acroleína, incluso en reducidas cantidades, se combina con los polifenoles del vino y forma
moléculas de sabor amargo. Es la enfermedad del
“amargor”.
Los vinos afectados por la enfermedad de la grasa no
tienen por qué presentar más defecto que su viscosidad. En ese caso, se pueden tratar para recuperarlos.
Una acción mecánica por batido o fragmentación del
vino que permite recobrar una viscosidad adecuada.
Después, la estabilización debe recurrir a procedimientos muy eficaces, como el tratamiento térmico y
la filtración esterilizante, con un sulfitado adecuado
para suprimir cualquier riesgo de desarrollo ulterior
de las bacterias perjudiciales.
27
I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.
3.5 Lugar de las bacterias lácticas en el ecosistema
microbiano de la uva-vino
lleva a cabo por efecto del cambio de composición
del medio. Inicialmente se identifican lactobacilos y
cocos pertenecientes a una decena de especies distintas. Luego, muchos de ellos desaparecen progresivamente, o al menos se vuelven muy minoritarios,
dejando que la O. oeni colonice el medio.
En el mosto de uva, las BL forman parte del complejo
sistema de múltiples especies de levaduras y bacterias. Inicialmente, están presentes en la superficie de
la baya, aunque muchas veces son difíciles de aislar
en la viña. En la vendimia recién recogida, prensada y
encubada, la población de BL es del orden de 102 a
104 UFC/mL. Varía en función de las condiciones
meteorológicas durante los últimos días de la maduración. En realidad, depende de las innumerables
interacciones entre las decenas de especies de otros
microorganismos que colonizan el medio, en la
superficie de la uva, y después en la uva reventada
por el prensado.
No se conocen con precisión los mecanismos de esta
selección. Sean cuales fueren, el hecho es que la O.
oeni se adapta mejor que las demás especies al cambio del entorno. Además de la acidez del medio, estas
bacterias soportan mejor que las demás las posibles
carencias nutritivas y la toxicidad creciente resultante
del metabolismo de las levaduras.
Cuando ha cesado por completo la actividad de las
levaduras o a veces incluso antes, la población de BL,
compuesta principalmente de O. oeni prosigue su
adaptación al medio, y, dependiendo de los factores
limitativos con que se enfrente, desencadena un verdadero crecimiento, que puede ser muy rápido, cuestión de días o semanas. Finalmente, esta biomasa
cobra entidad suficiente para que se observe la
degradación del ácido málico. Ese es el verdadero
comienzo de la FML. Mientras quede ácido málico por
degradar, continúa la actividad, y la biomasa se mantiene elevada. Cuando todo se ha transformado, la
biomasa se elimina por el sulfitado, que pone punto
final al proceso de vinificación. Entonces hay que
estabilizar el vino de cara a cualquier desarrollo microbiano, pues va a empezar la crianza, que en principio
no representa más que transformaciones de tipo fisicoquímico.
En las condiciones habituales de vinificación, que la
mayor parte de las veces suponen un sulfitado de la
vendimia, la población de BL deja muy rápidamente
paso a las levaduras que desencadenan la fermentación alcohólica (FA). En un medio cuya composición
química cambia constantemente y donde todos los
microorganismos luchan por desarrollarse, generalmente las BL consiguen multiplicarse de forma muy
transitoria, tras lo cual entran en regresión hasta el
final de la FA. En ese momento, su población es
mucho más reducida que las de las levaduras, y su
nivel depende en buena medida del pH y del grado
alcohólico del vino. En condiciones difíciles, de pH
relativamente ácido (pH <3,4) y fuerte graduación
alcohólica ( > 13 %) muchas veces la población es
inferior a 102 UFC/mL. Por el contrario, puede rebasar
104 UFC/mL en las condiciones opuestas, sobre todo
si el pH es > 3,5. Esta es la población que deberá multiplicarse para iniciar la FML.
La mayoría de las veces, el sulfitado elimina masivamente la población de O. oeni que ha llevado a cabo la FML
pero no consigue librar totalmente al vino de todas las
bacterias. En ese momento, la microflora puede ser de
nuevo totalmente mixta, y compuesta de diversas especies de lactobacilos y de pediococos además de O. oeni.
El sulfitado reduce la población total, pero algunas
cepas especialmente resistentes a las condiciones cada
vez más hostiles se seleccionan espontáneamente,
pudiendo originar alteraciones bacterianas.
Un fenómeno muy importante que se desarrolla
durante la FA, es la selección de las bacterias de la
especie O. oeni. En la gran mayoría de los casos, las
bacterias de esta especie son las únicas que invaden
el medio después de la FA para realizar la FML. La
selección natural operada entre una mezcla muy
variada de especies de BL presentes en el mosto se
Tabla 1. Recuento de BL durante la vinificación de Cabernet Sauvignon
Recuento de bacterias lácticas durante la vinificación de Cabernet Sauvignon (UFC ml-1)
Especies
3
6
10
18
Leuconostoc mesenteroides
2.9x10
1.7x10
9.6x10
3.2x10
3.4x106
Nd
Pedicoccus damnosus
6.0x102
3.8x104
3.7x104
4.9x103
Nd
Lactobacillus hilgardi
3
4
4
3
4.4x10
Nd
Nd
Nd
Nd
Œnococcus œni
Lactobacillus brevis
Lactobacillus plantarum
Nd
Nd
2
1.1x10
Nd
7.5x10
1
1
3
Nd
4
4.3x10
4
8.0x10
4.0x10
2.0x104
4.5x104
Nd
4
2.0x10
4
3
Nd
Lactobacillus casei
7.7x10
2.0x10
Nd
Nd
Nd
Total
2.5x103
1.7x105
1.5x105
1.8x104
3.4x106
Nd: non détécte
28
Días
0
Informe Técnico
Fundación para la Cultura del Vino
3.6 Conclusión
La vinificación es el resultado de fenómenos espontáneos ligados al crecimiento de las levaduras y bacterias en el vino. Sin embargo, el productor de vino
desea controlar cada vez más completamente los
procesos fermentativos. Elige no sólo el momento de
inicio de las fermentaciones alcohólica y malolácticas,
sino también el tipo de microorganismos encargados
de llevarlas a cabo. Por ello se practica cada vez más
la siembra de levaduras, con un objetivo no sólo de
rapidez y exhaustividad de fermentación de los azúcares, sino también de aporte o de refuerzo de notas
aromáticas concretas en ciertos vinos. Para la FML, la
demanda es idéntica, si bien persisten dificultades de
control del fenómeno. El primer problema es la débil
tasa de supervivencia de las BL en el vino, o incluso en
el mosto en caso de inoculaciones precoces ("inoculación conjunta" con las levaduras). La eficacia de las
Fermentación Maloláctica
levaduras propuestas ha mejorado mucho durante
los últimos años, aunque siguen produciéndose algunos fracasos. El segundo problema, si bien de menor
importancia, es la falta de control sobre el impacto
organoléptico de las cepas implantadas. Si bien es
cierto que las cepas de O. oeni pueden tener una incidencia significativa en los caracteres sensoriales del
vino, muchas veces también resulta imprevisible, y
parece depender mucho del propio vino.
El interés de los productores de vino, de los enólogos,
de los industriales de la fermentación y de los científicos por las BL no deja de acrecentarse. Los progresos
alcanzados tanto en materia de vinificación espontánea como de vinificación controlada por levaduras
malolácticas son buena prueba de ello. Los conocimientos y herramientas de investigación se afinan, y
se aplican a una mejor utilización de la diversidad
natural de la especie O. oeni.
29
R
II.
Requerimientos
y factores de la
fermentación
maloláctica
Índice
33
II.1. Necesidades nutricionales
41
II.2. Fermentación maloláctica en barrica.
47
II.3. Guía para resolver problemas
-aplicación práctica-
33
41
47
Dr. Sibylle Krieger
Lallemand
Piet Loubser
Lallemand
Annamarie kyne
Lallemand
Sigrid Gertsen-Briand
Scott Laboratories
N
II.1.
Necesidades
nutricionales
de la bacteria
maloláctica
Dr. Sibylle KRIEGER
Lallemand
1.1 Hidratos de carbono
1.2 Compuestos nitrogenados
1.3 Vitaminas, minerales y otros
factores de crecimiento
1.4 Ácidos orgánicos
1.5 Disponibilidad de nutrientes
determinada por las prácticas de
vinificación
1.6 Formulación de nutrientes
malolácticos
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Fermentación Maloláctica
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urante mucho tiempo se
creyó que la degradación del
ácido málico en ácido láctico
era la fuente de energía que
permitía el desarrollo de la bacteria
maloláctica (BML) en el vino1. Radler2
refutó esa teoría, al demostrar que en
un medio sintético, la proliferación de
las bacterias lácticas (BL) depende de
la presencia de hidratos de carbono
fermentables. Por lo general, las BL del
vino son conocidas como microorganismos especialmente fastidiosos por
sus complejas necesidades nutricionales. El apartado siguiente presenta las
diversas necesidades nutricionales de las BL del vino
en general, y de la Oenococcus oeni en particular.
D
II.1. Necesidades nutricionales de la
bacteria maloláctica
1.1 Hidratos de carbono
Las condiciones de desarrollo durante la fermentación maloláctica (FML) del vino son muy difíciles para
las BL. Durante la FML, se degradan de 0,4 a 0,8 g/L de
azúcares, consistentes en su mayor parte en glucosa y
fructosa, que son las principales fuentes de energía
para el desarrollo bacteriano3. Radler4 ha calculado
que para la degradación de 1 g/L de ácido málico son
necesarios aproximadamente 0,01 gramos de bacterias, y que 0,1 g de glucosa suministra energía suficiente para producir esta cantidad de biomasa.
Prácticamente todos los vinos contienen estos azúcares en cantidad suficiente para alimentar un desarrollo bacteriano que alcance para garantizar una FML
completa, pero se ha demostrado que la FML se
puede inhibir en los vinos cuyas concentraciones de
glucosa y fructosa suman un nivel inferior a 0,2 g/L5.
La Oenococcus oeni es heterofermentativa y convierte la glucosa en idénticas cantidades de D-ácido láctico, CO2 y ácido acético (o etanol). Casi todas las cepas
de BML fermentan la glucosa y fructosa, y la mayor
parte de ellas prefiere la fructosa a la glucosa, es decir
que son fructofílicas. Cuando se desarrollan a partir de
la fructosa como única fuente de carbono, parte de
este azúcar se convierte en manitol, que produce un
mol adicional de ATP, y débiles concentraciones de
ácido acético. No obstante, si hay un exceso de manitol presente en el vino, se puede producir un problema denominado alteración por manitol. Se caracteriza por un incremento de la producción de ácido acético y la aparición de un sabor agridulce. Este fenómeno se aborda más detalladamente en el capítulo titulado “Defectos organolépticos causados por una FML
descontrolada.”
33
II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica
La mayor parte de las BL del vino son capaces de
degradar las pentosas – arabinosa y xilosa – durante
su crecimiento6. Los compuestos glicósidos presentes
en el vino pueden ser todos ellos substratos para el
desarrollo de BL, y Rosi et al.8 han demostrado el efecto positivo de los polisacáridos producidos por levaduras (manoproteínas) en el inicio y la aceleración de
la FML. La mayor parte de las cepas de la FML deseada, Oenococcus oeni, son capaces de producir -glicosidasas7 y se pueden distinguir de otras cepas de BL
por su incapacidad de fermentar la sacarosa, la lactosa y maltosa.
1.2 Compuestos nitrogenados
Las BL requieren un suplemento extensivo de aminoácidos, purinas, pirimidinas, vitaminas y minerales9, lo
cual significa que el contenido de nitrógeno del vino
puede variar significativamente durante la FML10. Las
necesidades de aminoácidos específicos difieren de
una cepa de BL a otra. La Oenococcus oeni y la
Pediococcus pentosaceus aisladas en el vino pueden
necesitar hasta 16 aminoácidos distintos11, pero no
pueden utilizar fuentes de nitrógeno inorgánicas,
como el fosfato diamonio. La Oenococcus oeni, como
demostraron Fourcassie et al.13, presenta una necesidad absoluta de los aminoácidos arginina, ácido glutámico, triptófano e isoleucina, y necesita otros seis
aminoácidos para su desarrollo óptimo. Lallemand ha
estudiado las necesidades de nitrógeno de cuatro
cepas comerciales de BL y de una cepa de laboratorio
de las BL Oenococcus oeni en colaboración con el
grupo de Jean Guzzo, y comparó los resultados con
otros dos estudios descritos en la literatura13. De un
total de 13 aminoácidos, siete eran imprescindibles
para el desarrollo. El ácido glutámico era imprescindible para todas las cepas de los tres estudios, y la
metionina, serina, fenilamina y tirosina resultaron vitales para la mayor parte de las cepas. La alanina, glicina y prolina ejercen un efecto menor en el crecimiento de la Oenococcus oeni, mientras que la valina, leucina, triptófano, isoleucina, histidina y arginina se pueden describir como en cierta medida imprescindibles,
pues resultan necesarios para la mayor parte de las
cepas de Oenococcus oeni y son necesarios, pero no
imprescindibles, para las demás14. Se han confirmado
las necesidades cuantitativas de cada aminoácido, y
es suficiente una concentración inferior a 2 mg N/L
para garantizar el desarrollo de las BL. Durante la proliferación de la bacteria en el vino, puede disminuir
fuertemente la concentración de varios aminoácidos,
mientras que puede aumentar la de otros5. No se ha
comprobado que la disponibilidad de aminoácidos
pueda ser limitadora del desarrollo2, pues las proteínas y péptidos presentes en el vino también se pueden utilizar como fuente de aminoácidos15. Se ha
demostrado que el desarrollo bacteriano y la FML se
ven estimulados por la presencia de compuestos
nitrogenados derivados de levaduras, como los péptidos y manoproteínas de la pared celular. Todos los
34
medios no sintéticos de cultivo de la BML deben
suministrar extractos de levadura o autolisado de
levadura a los organismos16. Para utilizar estos tipos
complejos de fuente de nitrógeno para su crecimiento, las bacterias tienen que ser capaces de hidrolizarlos a sus subunidades, y de transportarlos a la célula.
Los estudios de secuenciación del genoma de la
Oenococcus oeni realizados por el grupo de Guzzo’s
y la Genome Express Company han revelado la presencia de genes con una capacidad potencial de
codificación de proteasas y peptidasas, así como de
transportadores de aminoácidos y péptidos.
Recientemente, Remize et al.17 han demostrado que
dos fuentes distintas de nitrógeno derivado de la
levadura tienen un impacto distinto, aunque dependiente de la cepa, en el crecimiento de la
Oenococcus oeni.
1.3 Vitaminas, minerales y otros factores de
crecimiento
Además del amino nitrógeno, las BL del vino necesita
un suministro de purinas y pirimidinas o sus derivados. La adenina, xantina, guanina y uracilo tienen un
efecto estimulante sobre el desarrollo de las BL. Varias
vitaminas del grupo B son imprescindibles para el crecimiento, y aparentemente todas las cepas necesitan
ácido fólico y ácido nicotínico2. La necesidad de biotina, riboflavina, ácido pantoténico y piridoxina depende de la cepa. Durante la producción comercial de
cepas de Oenococcus oeni, se puede incrementar el
rendimiento de biomasa añadiendo pantotenato de
calcio, tiamina y piridoxina, a razón de 1 mg/L de cada
sustancia. 18. El descubrimiento de la contaminación
bacteriana de la salsa de tomate indujo la utilización
del zumo e tomate como nutriente en la formulación
de medios de cultivo de la BL19. Amachi20 ha descrito
un “factor zumo de tomate” como un derivado del
ácido pantoténico, y ha demostrado que es estimulador del crecimiento de la Leuconostoc oenos
[Oenococcus oeni]. Zickler21 ha demostrado que el
desarrollo de la BML denominada Bacterium gracile
© Aaron Kohr - FOTOLIA
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Fermentación Maloláctica
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requiere potasio, sodio, magnesio y concentraciones
relativamente altas de iones de manganeso. El manganeso también desempeña un papel vital en calidad
de coadyuvante en la enzimología de la FML realizada
por BL. Por lo general, las concentraciones de todos
estos iones son suficientes para permitir el crecimiento y metabolismo de las BL.
crecimiento inducido por el ácido málico. Aunque
hasta hace poco se consideraba que la conversión de
L-ácido málico en L-ácido láctico y CO2 no produce
energía26, la investigación reciente indica que las células intactas de Oenococcus oeni generan más ATP
cuando se han desarrollado en presencia de L-ácido
málico27.
1.4 Ácidos orgánicos
• Ácido cítrico
Aunque el ácido málico es el ácido más importante
metabolizado por las BL en el vino, ésta también
metaboliza otros ácidos orgánicos, comentados a
continuación.
El ácido cítrico es un componente fundamental del
mosto de uva y del vino, y se puede encontrar en
concentraciones comprendidas entre 0,1 y 0,7 g/L. El
metabolismo del ácido cítrico por Oenococcus oeni
se ha correlacionado con la síntesis del ácido acético,
el diacetilo y la acetoína28. La Oenococcus oeni no es
capaz de desarrollarse a partir del ácido cítrico como
única fuente de carbono y energía. Pero en presencia
de una fuente de energía como la glucosa, mejoran
tanto la tasa de crecimiento específica como la producción de biomasa de la Oenococcus oeni29. La
mejora del crecimiento en presencia de ácido cítrico
se debe, en parte, a un incremento de la producción
de ATP derivada de la fosforilación durante el cometabolismo de la glucosa con el ácido cítrico30. El
ácido cítrico queda completamente metabolizado
en algunos vinos, y en menor medida en otros.
Mayores concentraciones de ácido cítrico31 estimulan
la producción de diacetilo y acetoína por la
Oenococcus oeni, y la máxima concentración de diacetilo se observa al terminar la degradación del ácido
málico32. Durante la FML, la degradación del ácido
cítrico se retrasa con respecto a la degradación de
ácido málico.
• Ácido tartárico
A veces se observan pequeñas reducciones de la concentración de ácido tartárico durante la FML. Lo más
probable es que estas variaciones se deban a modificaciones de la solubilidad del ácido tartárico más que
a una degradación microbiana real16. Sólo se ha comprobado que degraden el ácido tartárico algunas
cepas de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis y Lactobacillus arabinosus22. La degradación del
ácido tartárico siempre va asociada al picado del vino.
• Ácido málico
Los ácidos tartárico y málico son los dos principales
ácidos orgánicos del vino, en especial de los vinos de
climas fríos. El ácido málico está naturalmente presente en su forma L. El D-ácido málico no está naturalmente presente en el mosto de uva, y no lo metaboliza las BL del vino. Varios estudios han demostrado
que el L-ácido málico estimula el crecimiento y la producción de biomasa de Oenococcus oeni23, 24. Durante
el crecimiento con pH bajo, la bacteria degrada ácido
málico a gran velocidad, mientras que los hidratos de
carbono se degradan a poca velocidad. Este fenómeno induce un aumento global del pH, que por sí
mismo permite un incremento de la utilización de los
hidratos de carbono, lo cual explica la observación de
1.5 Disponibilidad de nutrientes determinada por
las prácticas de vinificación
La clarificación de mostos y vinos no sólo puede eliminar físicamente una amplia porción de las BL, sino
que además puede reducir el desarrollo bacteriano
potencial, lo cual incide en la calidad del vino19.
Además, la clarificación elimina nutrientes y partículas
en suspensión que estimulan el desarrollo bacteriano,
con lo cual inciden aún más en la FML. De forma similar, se ha comunicado que los vinos elaborados utilizando el proceso de termovinificación tienen menor
capacidad de permitir la FML. La determinación del
momento de la inoculación de la BL (tratada en otro
capítulo) también influirá en la cinética de la FML.
La disponibilidad resulta afectada por las interacciones entre los microorganismos del vino. Es corriente
esperar que la mezcla de cultivos de microorganismos introduzca la posibilidad de relaciones antagónicas y sinérgicas, si bien, en algunos casos menores, los
distintos microorganismos ejercen poca o ninguna
influencia mutua. En la vinificación, siempre existe la
posibilidad de que se produzcan interacciones entre
las BL y las levaduras, hongos, bacterias acéticas e
35
II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica
incluso bacteriófagos. Es más, también se pueden
producir interacciones entre diversas especies y cepas
de BL20. El efecto antagónico de la levadura sobre las
BL se ha explicado por la competencia por los
nutrientes así como la producción de sustancias que
inhiben el desarrollo bacteriano, como el SO2 o los
ácidos grasos de cadena media. A la inversa, la levadura puede sostener el desarrollo de las BL en el vino
y estimular el avance de la FML. Durante el proceso de
autolisis de la levadura, se liberan vitaminas y aminoácidos en el vino, y el mayor contacto con las lías asociado al proceso enriquece el vino con micronutrientes que estimulan la FML. Costello21 ha comunicado
que una rápida mortandad de células de Oenococcus
oeni sostiene el crecimiento de Pediococcus ssp. En
condiciones de alto pH, el desarrollo precoz de la
Lactobacillus brevis inhibe totalmente el desarrollo
de Oenococcus oeni. Recientemente, Gerbaux
(comunicación personal) ha demostrado que las condiciones del vino que estimulan la FML pueden inhibir el desarrollo de la levadura Brettanomyces nociva
para el vino.
1.6 Formulación de nutrientes malolácticos
La investigación extensiva ha contribuido a un mejor
conocimiento de las necesidades nutricionales de los
cultivos iniciadores malolácticos, las interacciones de
las levaduras con dichos cultivos, y el impacto del
medio del vino en el desarrollo bacteriano y la nutrición de las levaduras durante la fermentación alcohólica. Por ejemplo, se sabe que si una levadura con elevadas necesidades de nutrientes realiza la fermentación alcohólica, en el mosto se agotan rápidamente
los factores necesarios para permitir el desarrollo de
BL. En esas condiciones, es necesario añadir un
nutriente bacteriano33. De forma similar, el aporte de
un nutriente bacteriano es vital en los mostos cuyas
concentraciones de nutrientes son naturalmente
bajas, pues un poco de levadura puede producir niveles excesivos de SO2, que inhiben fuertemente el
desarrollo de BL. Baste decir que siempre es fundamental una nutrición adecuada tanto de la levadura
como de las BL.
En las difíciles condiciones de pH, SO2, alcohol y nitrógeno que se dan en el vino, la utilización de suplementos nutritivos permitirá que la Oenococcus oeni
sobreviva y se multiplique. Una cuidadosa preparación de cultivos de inicio malolácticos y un uso adecuado de las preparaciones de nutrientes diseñadas
para esos cultivos garantizará el rápido inicio de la
FML. Esto se ilustra en la Figura 1, que presenta los
resultados obtenidos a partir de la inoculación de un
cultivo iniciador ML en un vino Chardonnay en presencia o ausencia de una preparación de nutrientes
ML. La cinética de la degradación del ácido málico
correspondiente a cada uno de los tres cultivos iniciadores es mucho más rápida cuando se utiliza el
nutriente, mientras que sólo se degradó un máximo
de 1 g/L de ácido málico cuando se añadieron bacterias en ausencia de suplemento nutricional.
Se recomienda un buen suplemento nutricional de
los cultivos iniciadores ML, y existe un recomendación
similar en relación con la levadura. La nutrición de las
BL es distinta de la de la levadura, y exige un riguroso
control. En casos de escasez de nutrientes en el vino,
la alimentación adecuada del cultivo iniciador ML
puede ser determinante para el éxito de la FML. En
palabras del inmortal Shakespeare, “Ser, o no ser…”
Figura 1.
Tiempo (días)
Alcohol 14,1% v/v, SO2 total 14 ppm, pH 3,38
Inoculación directa con cultivos iniciadores de ML con (+) y sin (-) adición de nutrientes
36
Informe Técnico
Fundación para la Cultura del Vino
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aromabzw.
geschmacksbeeinfl
ussender
Substanzen durch Milchsäurebakterien. Thesis.
University of Hohenheim, Germany.
33. Lallemand Winemaking Update Number 2, 2004.
Informe Técnico
Fundación para la Cultura del Vino
Fermentación Maloláctica
39
F
II.2. Factores
medioambientales
que afectan a la
fermentación
maloláctica
Piet LOUBSER
Lallemand
2.1. Factores bien conocidos
2.2. Factores menos conocidos
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
II.2. Factores medioambientales
que afectan a la
fermentación maloláctica
e suele considerar que la fermentación maloláctica (FML)
consiste simplemente en la
descomposición del ácido málico presente en los vinos tintos y en
algunos blancos, con la emisión de
CO2 que la acompaña, en la formación
de ácido láctico y en una reducción
del contenido ácido total del vino. De
hecho, eso es exactamente lo que
ocurre, pero aunque eso fuera todo lo
que sucede durante la misma, esta
descripción sería una simplificación
excesiva del proceso. La descomposición del ácido málico en ácido láctico
confiere estabilidad microbiológica, y al mismo tiempo, la formación de diversos componentes también
produce un impacto organoléptico. Es posible asimismo que la reducción global de ácidos, junto con el
incremento del pH que la acompaña, dé como resultado mejores vinos, más “suaves” y “redondos”, con
más cuerpo.2, 4, 9, 10, 15, 19
S
En el pasado la FML corría a cargo, en buena medida,
de las poblaciones bacterianas indígenas no siempre
con los resultados deseados. Durante los últimos
años, los vinificadores han pasado a disponer de cultivos bacterianos comerciales muy fiables para inducir
la FML. Estos cultivos no sólo frecen una FML más fiable y con menores riesgos, sino que también aportan
una tremenda contribución al aspecto organoléptico
de los vinos. Estos cultivos bacterianos comerciales se
seleccionan en función de criterios muy estrictos, y
son capaces de funcionar en condiciones sumamente adversas. Tiene un impacto positivo en el perfil
organoléptico de los vinos, y contribuyen a incrementar su plenitud y complejidad.2, 4, 7, 9, 15, 19
En el buen desarrollo de la FML intervienen diversos
factores, algunos de ellos bien conocidos, y otros
menos. Vamos a comentarlos detalladamente para
comprender mejor el proceso y la gestión de la FML.
2.1 Factores bien conocidos que afectan a la
fermentación maloláctica
Entre los factores que determinan una buena FML, los
que mejor se comprenden son el SO2, el pH, el alcohol y la temperatura. Para que se produzca una buena
FML, los valores de estos parámetros químicos deben
coincidir con los niveles que permiten el buen funcionamiento de los cultivos bacterianos.
Es importante recordar que estos factores funcionan
de forma sinérgica, es decir que el efecto total de su
acción conjunta es superior a la suma de sus acciones
individuales. Además, la concentración favorable de
un componente puede compensar la concentración
desfavorable de otro u otros componentes. Aunque
resulta difícil asignar valores exactos a cada compo41
II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica
2.2 Factores menos conocidos que afectan a la
fermentación maloláctica
Varios factores menos conocidos pueden influir en el
desarrollo de la FML. El hecho de que sean menos
conocidos no significa que su impacto sea menos significativo. Entre dichos factores figuran los siguientes:
alcohólica interactúan mejor con ciertas bacterias
para lograr una buena culminación de la FML. En condiciones específicas, algunas cepas de levaduras pueden producir elevadas concentraciones de SO2, que
influyen negativamente en la proliferación y la supervivencia de las bacterias malolácticas. De forma similar, las cepas de levadura que presentan una necesidad desmedida de nutrientes pueden agotar el
medio hasta el punto de eliminar las reservas de
nutrientes disponibles para las bacterias. La aplicación
de una estrategia de nutrición específica para una
bacteria concreta durante las primeras fases de la fermentación alcohólica puede solventar holgadamente
este problema.10, 13, 16, 17
© Aaron Kohr - FOTOLIA
nente, para garantizar una buena FML, es imperativo
atenerse a los parámetros definidos por cada productor de cultivos.2, 4, 17, 18 El cumplimiento de esta regla
quizá sea la consideración más importante para
garantizar el éxito de la FML. En algunos casos, puede
resultar muy difícil producir un vino cuya analítica
cumpla dichos parámetros generales. Los vinos tintos
del Nuevo Mundo cosechados con un alto grado de
madurez, y por consiguiente con altos niveles de
alcohol son un ejemplo típico. En esos casos, es
importante seleccionar la cepa de levadura adecuada
para producir el vino, así como la cepa bacteriana
adecuada para realizar la FML. Incluso cuando todos
los factores químicos cumplen los parámetros deseados, en ocasiones el desarrollo de la FML resulta problemático.13 A continuación pasamos a comentar las
posibles causas de estas anomalías.
• Taninos
• Déficits de nutrientes
La investigación reciente ha demostrado que ciertos
taninos de la uva pueden ejercer una influencia negativa en la bacteria maloláctica, y por consiguiente en
el desarrollo de la FML. De hecho, algunas investigaciones han indicado que ciertos varietales de tinto,
como el Merlot, pueden presentar una gran dificultad
en experimentar una buena FML.12, 18
Los resultados más recientes de Lallemand indican
que los ácidos fenólicos influyen en la proliferación de
ciertas cepas bacterianas en medios de cultivo en
laboratorio. El efecto sobre la estimulación del
desarrollo puede ser positivo o negativo, dependiendo de la especie bacteriana, del ácido fenólico concreto utilizado y de su concentración. Por ejemplo, el
ácido cafeico a 50 mg/L y 100 mg/L provocaba un
efecto positivo sobre la proliferación bacteriana y la
degradación del ácido málico. Por otra parte, el ácido
ferúlico puede afectar negativamente al desarrollo
bacteriano y a la degradación del ácido málico, si bien
depende de la cepa. El efecto inhibitorio más acusado
es el del ácido p-cumárico, y se incrementa con la concentración. Básicamente, estos resultados coinciden
con los comunicados por otros investigadores.9, 10.
En estas circunstancias limitadoras, conviene considerar un nutriente que ayude al proceso de la FML.
• Selección de la cepa de levadura
Hace algún tiempo que se sabe que ciertas cepas de
levadura seleccionadas para conducir la fermentación
42
Para que la FML culmine con éxito, es de la máxima
importancia que las bacterias dispongan de una
nutrición suficiente. El ejemplo siguiente ilustra la función crítica de la nutrición para la FML: se inoculó en
un mosto de Pinotage, el conocido varietal sudafricano, un cultivo maloláctico comercial tras finalizar la
fermentación alcohólica; a los 110 días, sólo se había
metabolizado un 40% de la concentración inicial de
ácido málico. Se examinó el “estado de salud” del vino
mediante un análisis microscópico, y se determinó su
acidez volátil.
Se halló población de Oenococcus oeni correcta y
saludable, lo cual, de hecho, constituía una confirmación del cultivo inicial inoculado. Los niveles de acidez
volátil también eran razonablemente bajos.
Basándose en estos análisis, se añadieron nutrientes
específicos de la bacteria maloláctica. A los once días,
había terminado la FML.11, 14
El concepto de la adición de nutrientes no es sencillo.
La importancia de las buenas prácticas de higiene y la
adición de cultivos malolácticos seleccionados están
estrechamente vinculadas y son vitales para suministrar nutrientes vitales a las bacterias inoculadas.
Es importante garantizar que la FML se produzca
siempre en condiciones higiénicas y con una presencia de SO2 en el vino suficiente para controlar las
poblaciones bacterianas indígenas. Igualmente
importante resulta garantizar que se inocule en el
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
vino el nivel recomendado de un cultivo comercial
definido, con objeto de contar la presencia de suficientes bacterias “buenas” para que la FML culmine
con éxito cuando se añada el nutriente. En realidad,
nunca se recomienda la adición de nutrientes cuando
se confía en las poblaciones de bacterias malolácticas
espontáneas, surgidas naturalmente, para llevar a
cabo la FML. Para mayor información sírvase consultar
el capítulo “Necesidades nutricionales.”
• Compactación de lías
A resultas de la presión hidrostática, las lías presentes
en el fondo de una cuba se pueden compactar hasta
vado que a pesar de que el oxígeno puede influir
negativamente en la FML incluso a concentraciones
reducidas, la micro-oxigenación puede tener un efecto positivo sobre la FML debido a la leve acción de
agitación asociada al propio proceso de micro-oxigenación.8, 17
• Residuos de fungicidas
Algunos residuos de fungicidas y pesticidas, y en
especial de los primeros, pueden tener un efecto
negativo sobre el funcionamiento de la bacteria
maloláctica. Los más perjudiciales son los residuos de
los compuestos sistémicos utilizados con frecuencia
en años húmedos para controlar el hongo de la botritis. En años con una fuerte incidencia de contaminación por botritis hay que tomar precauciones concienzudas. Los vinificadores deben conocer los programas y productos de pulverización utilizados, y
deben ceñirse a los periodos de descanso prescritos
para los diversos productos fungicidas.2, 3
• Concentración inicial de ácido málico
tal punto que las levaduras, las bacterias y los nutrientes quedan “atrapados” y no pueden funcionar correctamente. Se ha observado recientemente que las
cubas de grandes dimensiones pueden estar correlacionadas con un mayor retardo de la iniciación de la
FML. La inhibición del comienzo de la FML en las
cubas más grandes se puede solventar bombeando
el día de la inoculación o el segundo día tras la inoculación de las bacterias.8
La recomendación general consistiría en agitar periódicamente las lías (al menos una vez por semana)
para asegurar que las bacterias y nutrientes se mantengan en suspensión.8, 14
• Actividad residual de las lisozimas
Si se utilizan lisozimas durante la vinificación, los niveles residuales de esta enzima pueden influir en el
tiempo necesario para el desencadenamiento de la
FML. Hay que seguir con atención las recomendaciones del proveedor relativas al momento de adición de
la lisozima y de inoculación del cultivo comercial para
la FML.10 En la mayoría de los casos se recomienda eliminar las lías más gruesas por trasiego.
• Niveles excesivos de oxígeno
Se ha demostrado que la bacteria maloláctica es sensible a los niveles excesivos de oxígeno. Esto significa
que hay que evitar la exposición de las bacterias a
cantidades indebidas de oxígeno tras la terminación
de la fermentación alcohólica. También se ha obser-
Las concentraciones de ácido málico difieren de un
viñedo a otro, y también pueden diferir de un año para
otro en un mismo viñedo. Por ese motivo, junto con
otros factores, la duración de una FML puede diferir de
un año para otro.13, 14 Resulta especialmente difícil
inducir una FML en los vinos con concentraciones de
ácido málico inferiores a 0.8 g/L.8, 10, 13, 14 En estos casos,
se recomienda utilizar cultivos ML iniciadores con una
fuerte actividad de malato-permeasa.
• Ácidos grasos
Una buena FML depende en gran medida de la capacidad del cultivo maloláctico iniciador de alcanzar y
mantener una alta viabilidad celular en el vino. Para
garantizar que así sea, es necesaria la presencia en el
medio de niveles suficientes de ácido oleico. En realidad, en el éxito de la FML influye la capacidad de asimilación del ácido oleico que tienen las cepas bacterianas. Ciertas prácticas, como la clarificación de los
mostos, pueden dar lugar a un vino con carencia de
ácido oleico. En esos casos, el éxito de la FML dependerá en buena medida de las concentraciones de
ácido oleico (C18:19) y de lactobacilo acidófilo cíclico
(C19:C9) presente en la propia cepa bacteriana. Si se
ha inducido la FML utilizando recuentos celulares
muy altos, puede que no se observe este fenómeno.2
Los ácidos grasos de cadena media pueden tener un
impacto negativo en el desarrollo de la FML.
Alexandre et al. (2004) y Edwards et al. (1990) han
indicado que el antagonismo observado entre las
levaduras y las bacterias lácticas se podría explicar
por la producción de ciertos ácidos grasos de cadena
media (C6 a C12) derivados del metabolismo de las
levaduras.1, 6
43
II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica
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Informe Técnico
Fundación para la Cultura del Vino
Fermentación Maloláctica
45
G
II.3. Guía para
resolver
problemas
-aplicación
práctica-
Annamarie KYNE
Lallemand
Sigrid GERTSEN-BRIAND
Scott Laboratories
3.1 Si desea la fermentación
maloláctica
3.2 La fermentación maloláctica se está
desarrollando
3.3 Si no se desea la fermentación
maloláctica
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
l plantearse la realización de la
fermentación
maloláctica
(FML), es necesario tomar en
cuenta numerosos parámetros físicos y medioambientales. De
todos ellos, los más importantes son
los Cuatro Grandes, a saber el pH, el
alcohol, la temperatura y el SO2. Es
importante tener presentes estas cuatro condiciones a la hora de preparar la
inoculación de bacterias malolácticas,
pues actúan sinérgicamente. Por
ejemplo, si en el momento de la inoculación la concentración de alcohol
es alta y el pH es bajo, el efecto combinado resultará en unas condiciones que pueden ser
inadecuadas para permitir el crecimiento y el metabolismo de las bacterias inoculadas. Por norma general, si las condiciones siguientes se dan simultáneamente en el vino, normalmente la FML se producirá
con relativa facilidad:
A
II.3. Guía para resolver problemas
-aplicación práctica-
•
•
•
•
pH superior a 3.2;
SO2 libre inferior a 10 ppm1;
Temperatura superior a 18°C;
Alcohol inferior a 13% (v/v).
La Figura 1. ilustra los efectos interrelacionados de los
Cuatro Grandes parámetros en la facilidad (o dificultad) de la FML. Es importante tomar en cuenta todos
estos factores para decidir el momento del aporte de
bacterias, la cepa de bacterias lácticas que se va a utilizar, y el tipo de cultivo (multiplicación o inóculo
directo) que se va a utilizar. La comprensión del efecto del entorno total en las bacterias permitirá tomar
decisiones informadas con respecto a estas variables.
47
II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica
La guía de resolución de problemas de la FML que se
incluye a continuación ayudará a disipar los misterios
la FML en los diversos casos prácticos de vinificación.
La guía detalla todas las consideraciones necesarias
asociadas a la realización de la FML. También pretende ayudar a diagnosticar y, en su caso, rectificar fermentaciones malolácticas difíciles de controlar. Se
presenta en formato de árbol binario (Sí / No). Por
ejemplo, si desea iniciar una FML, parta de A y prosiga
a partir de ahí siguiendo las instrucciones. Si la FML ya
está en curso, pero surgen problemas, parta de B, y si
no desea una FML, parta de C.
RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS DE LA FERMENTACION
MALOLACTICA
6. Controle la temperatura — el intervalo
óptimo es de 18-22°C — y evite los picos
de calor durante la fermentación, porque
a medida que aumenta la temperatura, el
alcohol resulta cada vez más tóxico para
las bacterias. A temperaturas muy bajas, se
retrasan tanto la fermentación alcohólica
como la FML.
7. Controle las modificaciones del perfil aromático del vino durante la FML mediante
análisis sensoriales rutinarios. Si se interrumpe la fermentación alcohólica o si se
permite el desarrollo de bacterias o levaduras indeseadas, se pueden modificar los
aromas, y pueden aparecer malos sabores.
3.1 Si desea la fermentación maloláctica y
a. Desea controlar la FML por inoculación
i. Al principio de la fermentación alcohólica
1. Utilice una cepa de levadura compatible
con la bacteria láctica.
8. Controle el azúcar, el L-ácido málico y la
acidez volátil porque si el pH es alto, si se
agota el ácido málico la Oenococcus oeni
puede producir ácidos volátiles a partir de
los azúcares. En ese caso, es preferible el
control analítico al control sensorial.
ii. A la mitad de la fermentación alcohólica
2. Elija un cultivo bacteriano de proliferación
o un cultivo de inoculación directa, en
función de las condiciones ilustradas en la
Figura 1.
1. No se recomienda añadir bacterias lácticas en esta fase de la fermentación. La fermentación alcohólica activa sometería a
las bacterias a un estrés excesivo.
3. Considere la conveniencia de añadir de un
complejo nutritivo para la levadura, con
objeto de reducir el riesgo de que se interrumpa la fermentación alcohólica.
4. Tenga en cuenta que la cantidad de SO2
añadida en la trituradora determinará el
momento del aporte del iniciador bacteriano:
• Inferior a 50 mg/L — Inocule las bacterias inmediatamente después de inocular la levadura
• 50 - 65 mg/L — Espere 12 horas después de añadir la levadura para añadir
las bacterias
• Superior a 65 mg/L — No se recomienda la inoculación conjunta de levadura
y bacterias.
Mida el contenido de SO2 libre, pero
controle también el SO2 total porque la Oenococcus oeni es capaz de
liberar SO2 libre del SO2.
5. Tenga en cuenta el pH — recuerde que el
pH superior a 3.5 induce el desarrollo de
organismos que alteran el vino; por debajo de este pH, la Oenococcus oeni pasa a
ser dominante.
48
© Aaron Kohr - FOTOLIA
Informe Técnico
Fundación para la Cultura del Vino
iii. Al final de la fermentación alcohólica
1. Tenga en cuenta el tipo de vino que pretende elaborar, pues su carácter determinará el momento de inducción de la FML:
• Carácter afrutado sin notas mantecosas:
Lógrelo mediante la inoculación simultánea de las bacterias con la levadura, o
añadiendo las bacterias nada más terminar la primera fermentación, cuando
existe una gran población de levadura
disponible para degradar todo el diacetilo que pudiera producirse.
• Si desea obtener notas de diacetilo y
de mantequilla:
Estabilice el vino por filtración o aporte
de SO2 justo al final de la FML, en el
momento en que se agota el ácido
málico, o espere unas semanas después de la primera fermentación, para
dejar morir las células de levadura y evitar que las células de levadura vivas
consuman el diacetilo producido.
2. Elija una cepa de bacterias capaz de tolerar el grado alcohólico, el SO2, y pH del
vino que se va a inocular.
3. Tenga en cuenta que la temperatura ópti-
Fermentación Maloláctica
ma es de 18-22°C. En climas más fríos, las
bajas temperaturas pueden inhibir eficientemente la FML.
4. Controle el SO2 libre después de la fermentación alcohólica y asegúrese de que
sea inferior a 10 ppm. Después de la fermentación alcohólica, puede aumentar la
concentración de SO2 libre si la levadura
es capaz de producir SO2.
5. Determine el grado alcohólico del vino. A
mayor grado alcohólico mayor toxicidad,
por lo que puede resultar necesaria una
adaptación de las bacterias mediante la
utilización de un cultivo de proliferación
en vez de un cultivo de inoculación directa.
b. La FML corre a cargo de bacterias indígenas —
¡NO SE RECOMIENDA!
i. Controle la población bacteriana al menos
una vez por semana, por microscopio o
mediante técnicas de cultivo en placas viables. Es de suma importancia prevenir la
proliferación de bacterias lácticas perjudiciales.
ii. Mantenga una temperatura ideal de 1822°C. Esto incrementará la posibilidad de
que la FML la realicen bacterias indígenas
favorables.
iii. Ajuste y mantenga un pH inferior a 3.5. Los
valores superiores a éste incrementan el
riesgo de que se desarrollen organismos
perjudiciales para el vino.
iv. Controle el azúcar, el L-ácido málico y la acidez volátil. Con un pH alto, la Oenococcus
oeni may puede producir ácidos volátiles a
partir de los azúcares. En ese caso, es preferible el control analítico al control organoléptico.
v. Realice un control organoléptico semanal
para detectar los cambios del perfil aromático del vino y cualquier mal sabor que pudiera desarrollarse.
49
II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica
3.2 La fermentación maloláctica se está
desarrollando
iv. Confirme el método preparación del iniciador bacteriano.
a. Lentamente.
i. Determine si algún cambio introducido previamente en las prácticas de cultivo, como
modificaciones de los tipos o concentraciones de caldos de pulverización aplicados al
viñedo, podrían estar afectando a la FML. Las
pulverizaciones sistémicas aplicadas al final
de la temporada de crecimiento resultan
específicamente tóxicas para la Oenococcus
oeni.
ii. Recuerde que el varietal de uva y las técnicas
de vinificación aplicadas pueden incidir en la
FML. A menudo resulta difícil completar una
FML en los vinos de Chardonnay, Merlot y
Tannat, y también resulta difícil en los mostos
muy clarificados.
iii. Tenga en cuenta los Cuatro Grandes parámetros ilustrados en la Figura 1. ¿Han interactuado y creado un medio difícil para las bacterias? Si es así, elija una cepa bacteriana adecuada que pueda resistir esas condiciones.
iv. Considere la adición de un suplemento nutritivo, ya que puede ser vital y necesaria. Si la
FML se ha iniciado, pero luego se ha frenado
o interrumpido, la situación puede estar indicando una escasez de nutrientes. A menudo,
la carencia de uno o varios nutrientes concretos impide la buena implantación de las bacterias en el vino, causando una reducción de
la viabilidad bacteriana.
v. Puede haber ácidos grasos de cadena media
presentes en el vino, que pueden estar inhibiendo el desarrollo de las bacterias inoculadas. Si se añade un paquete nutritivo completo, se ayuda a reducir el efecto tóxico de
estos ácidos grasos de cadena media.
b. Se ha iniciado, pero no ha culminado
i. Compruebe que no han variado los parámetros críticos de vinificación, tales como la
temperatura, la acidez volátil y el SO2.
ii. Controle analíticamente las concentraciones
de azúcares residuales, acidez volátil y ácido
málico, así como el grado de viabilidad bacteriana.
iii. Compruebe que ha inoculado las bacterias
en las concentraciones recomendadas por el
fabricante.
50
1. Proliferación estándar de células en crecimiento
• Asegúrese de que ha preparado correctamente el inóculo. Sea objetivo, y cerciórese de que ha han seguido todos
los procesos y procedimientos necesarios.
• Determine el material utilizado en la
preparación del iniciador. No utilice
concentrado de uva, pues puede contener concentraciones excesivas de
SO2 libre que provocan una inhibición
de las bacterias.
2. Inoculación directa
• Compruebe si las bolsitas que contienen las bacterias estaban almacenadas
correctamente. Si las bolsitas han estado expuestas a una temperatura excesiva, puede que las bacterias hayan
muerto.
• Cerciórese de que el paquete utilizado
ha permanecido cerrado herméticamente y sólo se ha abierto justo antes
de ser utilizado.
• Compruebe que en la inoculación se
ha utilizado la cantidad correcta de
células. Si no se han añadido suficientes bacterias para alcanzar la dosificación correcta, añada más.
v. Determine si un bacteriófago, es decir un
virus que elimina las bacterias, podría ser responsable de que la FML no haya terminado.
El cultivo microbiológico en placas ayudará a
determinar si ha sido el caso.
3.3 No se desea la fermentación maloláctica
i. Mantenga el vino a una temperatura de 10°C.
ii. Añada lisozimas, a una concentración de
300-500 ppm. Las lisozimas son enzimas que
se desarrollan naturalmente y resultan tóxicas para la mayoría de las bacterias lácticas, si
bien algunas cepas no son sensibles a las
mismas.
iii. Añada 30-50 ppm de SO2. La cantidad real
que hay que añadir depende del pH del vino.
iv. Elimine las bacterias mediante una filtración
por membrana. La filtración con membranas
de 0.45μ retira las bacterias.
Informe Técnico
Fundación para la Cultura del Vino
Fermentación Maloláctica
51
I
III. Incidencias
organolépticas,
color y efectos al
realizar la
fermentación
maloláctica
55
55
59
59
III.1. Estudios sobre la pérdida de
color durante el proceso
maloláctico. Cosecha de
Tempranillo de Rioja 2004
Manuel Ruiz
Ingeniero Técnico en Industrias de
Fermentación
III.2. Percepción del consumidor
bien informado de defectos
organolépticos del vino
provocados por fermentación
maloláctica sin control
Antonio Palacios
Carlos Suárez
Sibylle Krieger
Didier Theodore
Luis Otaño
Francisco Peña
Dr. Ingeniero Agrónomo y Enólogo
69
69
77
77
III.3. Efectos de los contaminantes
microbiológicos inducidos por la
fermentación maloláctica
descontrolada en vino
Jürg Gafner
Astrid Bachmann,
Andrea Frei
Francis Hesford
Naomi Porret
Katharina Schneider
Agroscope
III.4. Incidencia cualitativa de la
siembra de bacteria en los vinos
tintos
Vincent Gerbaux
ITV Francia
E
III.1. Estudios
sobre la
pérdida de
color durante
el proceso
maloláctico.
Cosecha de
Tempranillo de
Rioja 2004
Manuel RUIZ
Ingeniero técnico en industrias de
fermentación
La Semana Vitivinícola,
Nº 3050 (22 enero 2005)
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
III.1. Estudios sobre la pérdida de
color durante el proceso maloláctico.
Cosecha de Tempranillo de Rioja
2004
a demanda de calidad en los
vinos tintos incide en el alto
contenido de color y sensaciones suaves. El proceso maloláctico contribuye a definir una sensación
de suavidad en la boca pero tienen un
tributo en color. Este tributo en color
se estima en un 20-30% como intensidad colorante y en torno al 5% en
valor Índice de Polifenoles totales.
L
Es intención de los enólogos conseguir la suavidad sin perder color y tal
es la intención también de este estudio.
Circunstancia interesante de la cosecha 2004 de
Tempranillo en Rioja es la diversidad de contenidos
de ácido málico en la uva. Mientras una cosecha
estándar oscila entre 3 y 4 gramos por litro de mosto,
en la del año 2004 nos hemos encontrado con variaciones desde 1,8 hasta 5,5 grs/l.
Ante esta situación los técnicos nos hemos preguntado con temor si la pérdida de color puede ser proporcional al ácido málico degradado por las bacterias, lo
cual nos haría suponer peligrosamente que en vinos
de buen color con 13º de alcohol pero con 5 grs/l. de
ácido málico el proceso de color podría ser desastroso.
Para discernirlo hemos planteado una experiencia de
laboratorio a partir de un vino tinto de Labastida que
no había desarrollado aún el proceso maloláctico.
Sus características son:
Grado
13,49
Azúcares
1,84 grs/l.
Ácido málico
2,3 grs/l.
pH
3,53
Acidez volátil
3,53
Acidez total
7,89 grs/l.
Intensidad colorante
13,5
IPT
66
IP
1,6
Agente sembrado: Oenococcus oeni (“Vitilactic F.” Martín Vialatte a través de Dolmar)
55
III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica
Se sembró con bacterias para DML en vino y se distribuyó en cuatro fracciones en erlenmeyer:
Resultados
Muestra
T. Inducción
IC
IPT
IP
A. Málico
Testigo sin DML
-
13,5
66
1,6
2,3
Málico 2,3
12 días
12,8
63
1,5
0,1
Málico 3,0
5 días
13,2
63
1,4
0,1
Málico 4,0
5 días
12,8
64
1,5
0,1
Málico 5,0
8 días
12,9
63
1,5
0,2
IC= Intensidad Colorante.
IPT= Índice de Polifenoles Totales.
IP= Índice Polimerización. Tiempo de Inducción= Nº de días que tarda en iniciar desaparición del ácido málico.
1.- Testigo con 2,3 grs/l. de málico.
2.- Adición de L(-) málico hasta 3 grs/l.
3.- Adición de L(-) málico hasta 4 grs/l.
4.- Adición de L(-) málico hasta 5 grs/l.
Se situó en estufa a 22ºC. y se siguió el proceso DML,
retirando las muestras cuando concluyó el málico y
pasándolas a situación de 10ºC.
La incógnita de planteamiento queda resuelta. La
pérdida de color durante el proceso DML no es proporcional a la cantidad del ácido málico desdoblado.
Pero existen dos derivaciones interesantes. Una,
como conclusión, que expresa que la DML se desarrolla muy bien a nivel de 3-4 grs/l. de ácido málico y mal
para valores inferiores. Que a su vez tendría otra subderivación. ¿Por qué la DML se dificulta con tan sólo 2
grs/l. de málico y el vino en botella es inestable con
0,7 grs/l. de málico?
Como no vemos razón directa en volúmenes se nos
ocurrió pensar que volumen diferente tiene relación
con aireación diferente por relación de superficie libre
del líquido muy diferente. Entonces pensamos en la
influencia redox sobre la pérdida de color en el proceso DML.
Para ello planteamos sobre un vino tinto del 2004 de
San Asensio con 3,6 grs/l. de ácido málico un estudio
DML/redox. Una muestra tal cual con siembra y otra
con siembra pero corregida con aportación de 100
mgs/l. de ácido ascórbico.
El proceso DML en estufa y matraces erlenmeyer con
300cc. de contenido arrojaron la misma velocidad de
fermentación DML pero los resultados finales fueron:
IC
IPT
IP
17
71
1,5
Desarrollada DML
15,4
69
1,4
Desarrollada DML Vit. C.
11,2
63
0,9
Vino Testigo sin DML
56
Y la otra derivación se observa al entender que en
bodega no logramos caídas de IC en el proceso DML
inferiores al 18% y en este ensayo lo hemos conseguido apenas del 5% . Lo diferente es el volumen de
estudio. En bodega de 30.000 litros y en erlenmeyer
de 200 cc.
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
Los resultados son muy ostensibles. Cuando el vino
está reducido el tributo en color de la DML es muy
fuerte.
Esto explica que en la práctica la pérdida de color en
el proceso maloláctico sea inferior cuando se hace en
barrica o cuando se retrasa, ya que estas acciones
suponen atenuar el valor reductor resultante en el
vino después de la fermentación tumultuosa.
Conclusiones
La pérdida de color durante el proceso DML de los
vinos tintos no esta relacionada con la cantidad de
ácido málico de la uva.
El periodo de inducción del proceso DML es corto en
contenidos de 3 a 4 grs/l. de ácido málico y se dilata
para contenidos diferentes.
Y como subderivación de todo esto intentamos en
estudios posteriores, determinar el nivel de oxigenación o redox en milivoltios para desarrollar una DML
sin tributo de color o mínimo y también conocer si
esta desaparición es inicial o final del proceso DML.
La pérdida de color en el proceso maloláctico es proporcional al nivel de reducción del vino.
Bibliografía
M. Ruiz Hernández. “Aportación al estudio de destrucción de antocianos durante la DML de vinos de
Tempranillo”. Sevi nº 2866, 2001.
M. Ruiz Hernández. “Sobre la evaluación del riesgo de
pérdida de color de los vinos tintos jóvenes a través
del proceso DML”. Sevi nº 2787. 2000.
M. Ruiz Hernández. “Sobre los índices de color en
vinos tintos de Rioja de las cosechas 2000 y 2001, a
través del proceso DML”. Sevi nº 2907, 2002.
57
P
III.2.
Percepción del
consumidor
bien informado
de defectos
organolépticos
del vino
provocados por
fermentación
maloláctica sin
control
Antonio PALACIOS*
Carlos SUAREZ*
Sibylle KRIEGER*
Didier THEODORE*
Luis OTAÑO**
Francisco PEÑA***
* Lallemand Península Ibérica
** Universidad de la Rioja, Dto.
Agricultura y Alimentación
***Catador experto ciego absoluto
2.1 Las bacterias en el vino, los peligros
2.2 Las alteraciones
2.3 Las bacterias en el vino, las
contribuciones positivas
2.4 Impacto organoléptico de la
fermentación maloláctica
2.5 Metabolismo de la fermentación
maloláctica
2.6 Materiales y métodos utilizados
2.7 Resultados obtenidos
2.8 Conclusiones
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
l vino es uno de los productos
más antiguos donde los procesos microbiológicos hacen una
contribución importante en la
calidad final del producto. La elaboración del vino es un proceso bien conocido desde hace siglos, no obstante
nuevos desarrollos, especialmente tratamientos biológicos, son cada vez
mas aceptados y utilizados en las
bodegas. Principalmente porque cada
vez mas a menudo, se hace necesario
dar una respuesta a la demanda específica en el mercado de vinos, especialmente de calidad. Para ello es necesario cumplir unos
requisitos:
III.2. Percepción del consumidor bien
informado de defectos
organolépticos del vino provocados
por fermentación maloláctica sin
control
E
• Limitación de los elementos químicos en el perfil organoléptico: lo que supone desarrollar una
optimización de las dosis de SO2 a utilizar y prestar atención a la fase de latencia de la FML de los
vinos.
• Limitación de compuestos con riesgo sobre la
salud: la obtención de vinos higiénicos para el
consumidor, lo que supone que el vino esté
libre o con mínimas concentraciones en aminas
biógenas (especialmente histamina) y de carbamato de etilo.
• Desarrollo y estabilización de la calidad general
del producto a lo largo de su vida comercial. Lo
que supone una estabilización de la calidad aromática y de la expresión polifenólica, tanto la
parte responsable del color como el constituyente tánico del vino.
Otro aspecto interesante del mercado de vinos, es
que los productos con éxito son muy cambiantes en
el tiempo. R. Klein, por ejemplo, citó en 1997: “el gusto
de los consumidores ha cambiado a través de los
tiempos, la mayoría de los consumidores prefieren un
vino blanco afrutado con una acidez moderada”, refiriéndose especialmente a los vinos blancos de moda
actualmente. Por lo que el control de la FML se hace
cada vez más necesario en un mayor tipo de vinos.
59
III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica
2.1 Las bacterias en el vino, los peligros
Uno de los principales problemas que pueden provocar las bacterias en el vino es el aumento de la acidez
volátil. Aunque también un exceso en diacetilo puede
causar la desaparición del afrutado. Ciertas cepas de
bacterias lácticas también pueden hacer aparecer
aromas y gustos indeseables. Otro de los riesgos de la
FML sin control, es la pérdida significativa del color,
bien por actividad enzimática de las bacterias y por el
aumento del pH. También la producción de histamina
y carbamato de etilo, que son nocivos para la salud
humana, están fuertemente influenciados por esta
fermentación. Los agentes causantes de estos problemas son algunas cepas del género Oenococcus y
muchas cepas de los géneros Lactobacillus y
Pediococcus.
2.2 Las alteraciones que pueden aparecer en los
vinos como resultado del metabolismo de
bacterias lácticas son de forma general las
siguientes:
• Picado láctico: aparece en condiciones favorables para el desarrollo de bacterias (fermentaciones ralentizadas o paradas) cuando todavía
hay azúcar en el mosto. Se transforman los azúcares de seis átomos de carbono en etanol, carbónico y ácido acético. En el medio aparece el
isómero D del ácido láctico, mientras que el Lláctico se origina en la FML. Este fenómeno es
provocado por bacterias lácticas.
• Amargor: degradación del glicerol generando
acroleína. Por la combinación de ésta con los
taninos, aparecen sabores amargos muy desagradables en el final de boca.
• Producción de fenoles volátiles: que en el
caso de los vinos tintos son el 4-vinilfenol, 4vinilguayacol, 4-etilfenol y 4-etilguayacol, responsables de “olores a cuadra”, a “sudor de caballo”, etc. La aparición de estos compuestos se
asocia a la acción de algunas cepas de
Pediococcus y Lactobacillus, aunque los microorganismos máximos responsables de estos
defectos organolépticos son levaduras contaminantes del género Brettanomyces y Dekkera.
• Producción de bases heterocíclicas aromáticas,
por parte de algunas cepas de las especies
Lactobacillus heterofermentativos y Oenococcus oeni, asociadas a aromas desagradables
identificados como “gusto a ratón”. Al igual que
el caso anterior, estos defectos también pueden
deberse a la acción de levaduras del género
Brettanomyces/Dekkera.
• Por último, se pueden producir alteraciones que
afectan a la calidad sanitaria del vino. Como es
60
por ejemplo el metabolismo de la arginina por
parte de las bacterias, que da como resultado la
producción de citrulina y carbamil-fosfato. Si
este compuesto reacciona con la urea producida por algunas levaduras durante la fermentación alcohólica, puede dar lugar a carbamato de
etilo, compuesto tóxico para la salud humana y
para el que existe un límite legal distinto según
los países donde se vaya a vender el vino. La
descarboxilación de determinados aminoácidos
da como resultado la presencia en el vino de
diversas aminas biógenas (histamina, putrescina, cadaverina, etc.), que al igual que sucede
con el carbamato de etilo, pueden resultar tóxicas para la salud humana.
2.3 Las bacterias en el vino, las contribuciones
positivas
La contribución positiva más evidente es la disminución de la acidez total del vino, especialmente del
ácido málico. Pero también la producción equilibrada
de etil-lactato, diacetilo y otros compuestos aromáticos es positiva, ya que dan mayor complejidad aromática. El incremento de los aromas varietales, como
se ha demostrado ya por algunos autores, (Gerland,
C., 1999). La reducción de notas vegetativas y la disminución de la astringencia y el amargor final en boca,
es a veces muy notable. En algunos casos, también
aumenta la redondez en boca y la suavidad de los
taninos. Debido al consumo de acetaldehído, que
puede ser muy intenso para algunas cepas (R. Mira de
Orduña, 2001), se reduce la combinación del SO2, lo
que permite rebajar su dosis. Los agentes positivos
son algunas cepas de bacterias lácticas del género
Oenococcus. Por esta razón es tan importante continuar realizando selección de bacterias naturales que
sirvan de inóculos para la obtención de vino de calidad con un mayor control de los procesos biológicos.
2.4 Impacto organoléptico de la fermentación
maloláctica
Los vinos que han realizado la FML suelen tener una
valoración común en cata, encontrándose descriptores positivos; como la mantequilla, nueces, toques de
levadura, miel, vainilla, cuero, tonos vegetativos, especiados, tierra, tostados, más cuerpo y redondez, con
taninos dulces y mayor persistencia en boca. Pero con
FML mal controlada, se puede también terminar con
la aparición de descriptores negativos; como aromas
lácticos intensos, yogurt ácido, aromas de sudor,
tonos mantecosos, presencia de acetatos, amargor
intenso final y el gusto animal en retronasal.
El impacto del diacetilo en el perfil aromático del vino
es muy variable. Dependiendo de la concentración
alcanzada, los aromas aportados pueden ser muy
diferentes. Así con una concentración de 5-14 mg/l,
los aromas dominantes son los de mantequilla, mien-
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
tras que con una concentración de 2-4 mg/l, los aromas presentes son de nueces, caramelo, levadura y
piel mojada. El umbral de percepción es superior en
los vinos tintos que en los blancos, por eso los vinos
tintos soportan mayores concentraciones de diacetilo. Entonces dependiendo del objetivo de vino, interesa o no evitar el consumo del ácido cítrico como
fuente de diacetilo.
ción del ácido málico, tampoco hay degradación del ácido cítrico y hay alta producción de
ácido acético.
2. Fase estacionaria I: no hay utilización del azúcar
por parte de la bacteria, es cuando el ácido
málico se transforma en ácido láctico. No hay
degradación de ácido cítrico, ni producción de
ácido acético.
2.5 Metabolismo de la fermentación maloláctica
3. Fase estacionaria II: no existe degradación del
azúcar, no hay catabolismo del malato, pero la
bacteria aprovecha el ácido cítrico, produciendo ácido acético y diacteilo en exceso. Esta es la
fase que hay que evitar en vinificación mediante tratamientos con SO2 y lisozima.
La evolución de las bacterias en el vino durante la
FML está marcada por tres fases bien diferenciadas
metabólicamente (Figura 1).
1. Crecimiento celular: utilización del azúcar del
medio para obtener energía. No hay degrada-
Figura 1.
Evolución de diferentes metabolitos durante la FML
Crecimiento celular
Fase estacionaria I
azúcar
Fase estacionaria II
biomasa
ac. málico
ac. láctico
ac. cítrico
ac. acético
ac. acético
Tiempo
2.6 Materiales y métodos utilizados
DT: diacetilo en vino tinto, P: putrescina, C: cadaverina,
EF: etilfenol y EG: etilguayacol).
Se cataron 22 vinos en total: dos testigos y 20 vinos
modificados por adición de distintas concentraciones
de diacetilo (vino blanco: 0,1 ppm, 5 ppm, 10 ppm y
en el vino tinto: 0,1 ppm, 10 ppm, 30 ppm), aminas
biógenas volátiles (putrescina y cadaverina en vino
tinto en concentraciones de 1 ppm, 10 ppm, 50 ppm
y 100 ppm) y etilfenoles (2-etil-fenol y 2-etil-guayacol
en vino tinto en concentraciones de 425 μg/l, 800
μg/l y 1000 μg/l), agrupados en 6 series en función
de estos compuestos, (DB: diacetilo en vino blanco,
Dichas muestras se sometieron a un panel de cata formado por 24 consumidores informados previamente
de los riesgos en vinificación de contaminaciones
microbianas que pueden provocar la aparición de
defectos organolépticos mediante un curso breve de
30 minutos. Los resultados se evaluaron mediante un
cuestionario (Figura 2). Estos datos se contrastaron
con la opinión de un catador profesional ciego absoluto.
Figura 2.
Cuestionario utilizado durante la cata
61
III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica
2.7 Resultados obtenidos
Los catadores encontraron con una alta frecuencia
defectos que ellos identificaron mediante descriptores definidos de forma diferente y elegidos libremente por ellos mismos. Lo hicieron de forma más evidente según la concentración del producto añadido
aumentaba, especialmente en los casos de los etilfenoles y el diacetilo, tanto en vino blanco como el
tinto y de forma menos clara cuando los vinos tenían
adiciones de aminas biogénicas (Figura 3). Los defectos más fáciles de identificar fueron los provocados
por las adiciones de etilfenoles y el diacetilo en el vino
blanco.
Figura 3.
Frecuencia de detección de defectos por los catadores
Los defectos encontrados en los vinos con adiciones
de diacetilo son diferentes según se trate de vino
blanco o tinto, también la frecuencia de detección de
defectos identificados cambia. En el vino blanco un
31% de los catadores identificaron un defecto pero
no supieron definirlo. El defecto más frecuente fue
descrito con los descriptores de aromas a mantequilla, queso y cierta tendencia a la oxidación, como si se
tratase de un vino evolucionado. En vinos tintos, la
frecuencia de no identificación aumenta hasta el 43%
y dentro de los identificados, los más comunes son de
mantequilla y tonos almendrados (Figuras 4 y 5).
Figura 4.
Figura 5.
Descriptores en el vino blanco con diacetilo.
Descriptores en el vino tinto con diacetilo.
7%
2% 2%
3%
5%
31%
13%
3%
3%
3%
3%
43%
8%
8%
8%
15%
16%
27%
62
N o id e n t if ic a d o
Ques o
M a n t e q u il la
E v o lu c ió n
O x i d a c ió n
J ab ó n
F e r m e n ta c ió n
V a i n i lla
N o id e n tif ic a d o
A c e ito s o
C ue ro
A g u a s u c ia
M a n te q u il la
V a in il la
R e d u c c ió n
A lm e n d r a a m a r g a
C orcho
Jabón
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
Cuando el vino tinto fue modificado con las adiciones
crecientes de putrescina, no hubo relación entre la
concentración adicionada y mayor identificación de
defectos. Un 30% de los catadores encontraron defecto sin saber identificarlo. Los descriptores más utilizados para describir el defecto fueron de fruta podrida y
sensación de fermentación, aromas rancios y suciedad (Figura 6).
2%
5%
2%
2% 2%
2% 2%
Respecto a los etilfenoles, hay que destacar que la
identificación de problemas resulta mucho más fácil
para los catadores. Existiendo una estrecha relación
entre concentración y aumento de identificación y
descripción del defecto. En el caso del 2-etil-fenol, tan
solo un 7% no encontró adjetivos para describir el
problema. Los más utilizados fueron los de cuadra,
cuero, aromas animales, boñiga, caballo y betún
(Figura 8).
Figura 6.
Figura 8.
Descriptores en vino tinto con putrescina
Descriptores en vino tinto con 2-etil-fenol
5%
2% 2%
30%
2% 2% 2%
4%
7%
35%
12%
7%
12%
19%
9%
21%
12%
N o i d e n t if ic a d o
R a n c io
Q u í m ic o
C á r n ic o
A g u a s u c ia
F r u t a p o d r id a
L ac a
V ó m it o
E v o l u c ió n
J ab ó n
F e r m e n ta c ió n
M a d e r a p o d r id a
M e d ic a m e n to
A n im a l
N o id e n ti f ic a d o
C uadra
C ue ro
A n im a l
B o ñ ig a
C a b a l lo
B e tú n
L aca
M a d e r a m o ja d a
B r e tt
En el caso del 2-etil-guayacol, la frecuencia para
encontrar un defecto aunque sin descripción aumenta hasta el 31%. Los descriptores más utilizados para
identificar el problema fueron de moho, medicamento, aromas a quemado (Figura 9).
Cuando la amina biógena adicionada fue la cadaverina, existe una tendencia a aumentar la identificación
del defecto según aumenta su concentración en el
vino. Un 36 % encontró defecto sin saber identificarlo.
Los descriptores más utilizados por los consumidores
están en relación con aromas cárnicos y avinagrados,
con ciertos tonos sucios (Figura 7).
Figura 9.
Descriptores en vino tinto con 2-etil-guayacol
4%
2% 2% 2% 2%
31%
5%
5%
5%
Figura 7.
Descriptores en vino tinto con cadaverina
7%
18%
17%
4%
4%
4% 2%
2% 2% 2% 2%
36%
N o id e n ti f i c a d o
M oho
M e d ic a m e n t o
Que m ado
M o s ta z a
Form ol
O x i d a c ió n
Yodo
V e rdura
P in tu r a
T ie r r a m o ja d a
Ques o
4%
8%
30%
N o id e n tif ic a d o
G u is o d e c a r n e
V in a g r e
F r u ta p o d r id a
F e r m e n ta c io n
M e d ic in a
C aza
M a n t e q u il la
R e d u c c ió n
Hu m e d ad
A n im a l
F ó s fo r o
En la tabla 1 se presentan vino a vino la frecuencia de
detección de defectos y la intensidad con la que puntuaron los vinos cada uno de los catadores, además
de los adjetivos elegidos por ellos de forma libre.
Dependiendo de la intensidad descrita, se valoró de
forma distinta la frecuencia de detección del defecto.
La intensidad baja puntuó de forma unitaría, la intensidad media 2 veces y la intensidad alta puntuó 3
veces.
63
III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica
Tabla 1.
Tipos de defectos encontrados y grado de intensidad otorgada por los catadores
Muestra
64
Tipo de defecto
Intensidad
Baja Media
Alta
No defecto
1DB
Queso III; Oxidado; No identificado II; Jabón;
Mantequilla
2DB
No identificado III; Oxidado I; Mantequilla III;
***** ****
Evolucionado; Levadura; Queso II; Detergente I
3DB
Lácteo I, No identificado IIIII; Gasolina;
****** ****** ***** *****
Evolucionado III; Mantequilla; Queso III; Vainilla **
1DT
No identificado III; Aceite; Almendra amarga;
Jabón
***** **
2DT
No identificado IIIIII; Aceite; Corcho;
Mantequilla; Almendra amarga; Vainilla; Cuero
***** ******
*
*
3DT
No identificado IIII; Aceite; Corcho; Mantequilla IIII;
****
Reducido; Agua sucia; Almendra amarga; Vainilla I
1P
No identificado III; Químico; Podrido; Fruta
podrida I; Vómito; Laca I
2P
****** ***
*
************
**
Defecto
No Defecto
13
14
37
7
35
5
************
*****
9
17
***********
22
11
36
7
************
**
16
13
No identificado IIII; Rancio; Madera húmeda; Podrido; ******
***** *
*
Fruta podrida; Quitaesmalte; Fermentación I
***********
20
11
3P
Rancio I; Fermentación II; Medicamento;
Cárnico; Barniz; No identificado
************
***
14
15
4P
Evolución; Madera húmeda; No evolucionado; Caballo;
****** ***
Agua sucia; Podrido; Fruta podrida I; Jabón; No identificado *
************
**
13
14
1C
No identificado II; Humedad III; Guiso
***
************
****
13
16
2C
No identificado I; Humedad III; Guiso; Esmalte;
Fósforo; Fermentación I; Mantequilla
****** ***
*
**
************
16
12
3C
No identificado IIIII; Humedad III; Reducción;
Fruta pasada; Vinagre
****** **
*****
*
**********
18
10
4C
No identificado III; Humedad I; Caza I; Vinagre II; ****** ******
*
*
*
Medicina; Fruta pasada; Queso
*********
24
9
1EF
Tronco; No identificado III; Cuero; Animal I;
Cuadra II; Laca; Sudor
***********
24
11
2EF
Cuadra IIIIIII; Betún I; Cuero III; Sudor de caballo;
*
Animal II; Boñiga I
****
57
3
3EF
Cuadra IIIIIIII; Cuero IIIII; Sudor de caballo;
Boñiga III; Animal I; Brett
*
******
***** ******
******
65
0
1EG
No identificado II; Oxidado; Medicina II;
Quemado; Queso; Formol; Moho I; Yodo
***
****** ***** **********
30
10
2EG
No identificado IIIIIII; Oxidado; Medicina I;
****** ****** ****** ***
*
*
Quemado; Moho II; Verdura; Mostaza II; Formol *
42
3
3EG
No identificado IIII; Oxidado; Medicina IIII;
Quemado I; Moho IIII; Pintura; Tierra; Formol
49
2
****** *******
**
****** ****** *******
*
***** ****
***** ***
*
*
*****
***** ***** ***
****
******
****** ***
****
****** ****** **
***
***
Informe Técnico
Fundación para la Cultura del Vino
Para corroborar los datos de cata manifestados por el
panel de catadores formados por consumidores informados de la posible contaminación microbiana
durante la elaboración del vino, se dieron a catar los
mismos vinos a un catador experto. Dicho catador es
un profesional dedicado a la enología ciego absoluto.
Se eligió dicho catador dada su especial habilidad
para la detección de problemas organolépticos en
vinos. Las descripciones organolépticas determinadas
por este catador se encuentran a continuación:
• 1BD: Aromas primarios en nariz, mentolados
muy agradables, caramelo de naranja y fresa.
Aromas almibarados. Tonos lácteos de mantequilla dulce y queso fresco y notas de leche,
también de almendra. Un poco graso a la nariz,
pero agradable por los matices almibarados.
Boca agraz, afrutado, con retronasal de mantequilla.
• 2BD: Aromas nítidos de vainilla y queso semicurado, con percepción de ajo y mantequilla rancia, calzado usado. Por debajo se aprecian las
notas de tomillo y el carácter primario del vino.
Boca más densa y con sensación más dulce que
el anterior. El carácter lácteo vía retronasal es tan
evidente como en nariz, revelándose como de
leche hirviendo y queso de cabra, un poco
sucio.
• 3BD: Nariz intensa con dominancia de la mantequilla, aromas de levadura, miga de pan de
molde, bollo de leche, corteza de pan y grasa de
mantequilla. Tonos de trigo y aromas de oxidación con sensación olfativa de laca. En boca
mantecoso, con recuerdo de tocino, torrezno.
Retronasal muy láctea.
• 1TD: Aromas de sudor a copa parada, queso
fresco, trapo húmedo sucio, leche caliente, nata
fresca de leche grasa. Frutos secos del tipo
piñón y también especiados. En boca untuoso,
con recuerdos a tostado y pan quemado.
Retronasal con crema, resulta licoroso, crema de
whisky.
• 2TD: Aromas de yogurt de frambuesa y vainilla a
la nariz. También madera quemada, parece que
tiene crianza en madera. Aromas de regaliz rojo,
leche hirviendo, crema catalana, azúcar flameada y aromas melosos al mover la copa que se
hacen dominantes. Boca con buena evolución,
retronasal muy láctea y de yogurt natural.
Dominan los lácteos en toda la evolución en
boca.
Fermentación Maloláctica
• 3TD: Aromas de leche hirviendo a copa parada
y de yogurt natural y cuajada con miel. Los aromas lácteos son muy dominantes y tapan todo
lo demás. Boca con dominancia del lácteo que
recuerda la cuajada. Final de boca a café con
leche, moca de café y cacao.
• 1P: Aromas florales y de fresa, carácter especiado con recuerdos de humami. Tonos cárnicos
de sangre con recuerdo a la morcilla, tierra
húmeda y de lombriz. Aromas de salinidad, salitre, recuerdo de cangrejo de playa y marisco,
también de pez fresco vivo recién pescado. En
boca resulta un vino marinero y con dominancia del carácter humami. Percepción de arroz,
paella de marisco de bivalvos.
• 2P: A copa parada intenso melocotón muy
maduro y fruta en almíbar, regaliz rojo, corteza
de árbol. Jersey de lana y algodón. Aromas de
bacalao ahumado y salado, piel de bacalao.
Escamas de pez. En la boca aparecen de nuevo
aromas de arroz pasado. Recuerdo de flor de
levadura muy desagradable, arroz quemado de
paella. Vegetales en putrefacción vía retronasal.
• 3P: Muy especiado al principio, pero se convierte luego en un vino con aromas muy desagradables de aguas fecales y de desecho. Muy desflecado en sus sensaciones gustativas, vomitivo
en boca, retronasal fétida.
• 4P: Intenso y especiado a copa parada. Pétalos
de flor de geranio, yeso húmedo, escayola.
Aromas de corteza de alcornoque húmeda con
moho. Aguas fecales, a cubo de basura, pañal
de niño. En boca recuerda a abono orgánico de
origen animal, a purín de establo de vaca.
• 1C: Nariz con aromas cárnicos y especiados, aromas de sudor humano, axila, cabello recién cortado. Recuerdos de pizarra en la familia de los
minerales, canto rodado. Aromas de pétalo de
rosa muerto, en putrefacción. Recuerda a cucaracha con sensación de blátido al final de la evolución olfativa. En boca muy modificado, muy
cárnico, guiso de ternera con guisantes.
Retronasal de insecticida.
• 2C: Aromas de yeso o cemento húmedo recién
preparado en agua. Aromas de peluquería, con
laca y acetona. Aromas de pozo y agua estancada, sótano húmedo con hongos. Trapo de cocina sucio, parecen mercaptanos por los tonos
azufrados. Boca muy agresiva por la carnosidad
percibida. Retronasal muy pronunciada en hongos y ceniza, muy quemado.
65
III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica
• 3C: Yeso seco en nariz. Aromas muy cocineros,
garbanzo cocido. Carne pasada, mucha humedad, polvo de barrer, suciedad. Sensación de
agua sucia en boca, con tanicidad terrosa y
agresiva. La intensidad del problema se percibe
cada vez más en boca. Retronasal de laca y fijador de pelo.
• 4C: Aroma a pelo humano dominante, peluquín, pelo quemado. Aromas perrunos y de
escoba sucia. Percepción grasa de la acidez
volátil. Pescado encurtido, boquerón en vinagre.
En boca muy agresivo, con recuerdo a polvo de
barrer y productos de peluquería. En retronasal
sale el recuerdo al encurtido con vinagre, conejo o perdiz escabechada.
• 1EF: Aromas de caramelo de fresa a copa parada, sensaciones dulces almibaradas, tonos de
hierba y menta. Recuerdos de levadura descompuesta en mal estado, levadura rancia y de
grasa rancia. Aromas metálicos de clavo de carpintería. Aromas de tierra y agua sucia de alcantarilla y de establo. Boca con taninos muy agresivos, metálicos, recuerdos de hierro mojado,
clavo oxidado. Trapo de fregar.
• 2EF: Aromas de pintura plástica, barniz, papel de
calco, cartón húmedo, butano, plástico sintético, aromas de vacuno, piel de vaca, cuero de
vaca, establo y de boñiga de caballo. Boca con
taninos rebeldes acerados y de hierro muy oxidado, lima. Recuerdos de hojalata y silla de
montar a caballo, piel de zapato y betún.
• 3EF: Sudor de caballo, dominancia de los aromas animales y de betún de zapatos. Sudor
humano, axila humana, muy desagradable. En
boca recuerda a la boñiga de caballo y a hormiguero. Muy agrio, de ácido fórmico, recuerdo a
hormiga.
• 1EG: Aromas afrutados de plátano muy maduro,
cáscara de plátano ya casi descompuesto.
Aromas de yodo, moho, hongo. Aromas de mercromina, anestesia de dentista. Especiado en
boca, clavo y laurel. Muy amargo, con aromas de
almendra amarga.
66
• 2EG: Aromas muy especiados a copa parada,
mucho clavo y laurel, licor de plátano. Aromas
de anestesia líquida intensos, farmacéuticos y
de medicamento, serie empireumática, jarabe,
aspirina efervescente, éter. Champiñón y moho,
paja mojada y heno verde. Tonos de yodo. Muy
medicinal en boca con gusto a jarabe.
Retrogusto de caucho, de corcho descompuesto, corteza de árbol podrida.
• 3EG: A copa parada impresión especiada muy
intensa acompañada de aromas a micelio de
hongo y moho verde. Aromas de ceniza y tierra
mojada. Tonos ahumados, neumático caliente,
goma de coche después de frenar. Gusto a
moho muy perceptible, recuerda al amargor de
flor de levadura asociado con yodo muy dominante.
2.8 Conclusiones
1. Un consumidor bien informado acerca de posibles problemas fermentativos en la vinificación,
es capaz de detectar defectos organolépticos
presentes en el vino asociados a ciertos compuestos químicos originados por una fermentación maloláctica sin control. Los descriptores
empleados y elegidos de forma libre para definir los defectos encontrados en los vinos fueron
similares y concordantes a los empleados por
un catador profesional que analizó las mismas
muestras de vino aromática y gustativamente,
aunque con menor agudeza sensorial y con
menor frecuencia de detección.
2. Entonces los consumidores habituales de vino,
cuando son sometidos a una disciplina de cata
concentrándose en las sensaciones olfativas
percibidas, son capaces de discriminar y distinguir entre vinos correctos y vinos defectuosos,
con aromas impropios causados por problemas
microbianos.
3. Estos defectos organolépticos se pueden evitar
ejerciendo un control de la FML del vino, inoculando una bacteria seleccionada que evite presencia de contaminantes y manteniendo unas
condiciones higiénico sanitarias adecuadas en
bodega durante la elaboración del vino.
Informe Técnico
Fundación para la Cultura del Vino
Bibliografía
Fermentación Maloláctica
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and Oenology . 16-20 January, Melbourne, Australia,
(2000).
67
E
III.3.
Efectos de los
contaminantes
microbiológicos
inducidos por la
fermentación
maloláctica
descontrolada
en vino
Jürg GAFNER*
Astrid BACHMANN
Andrea FREI
Francis HESFORD
Naomi PORRET
Katharina SCHNEIDER
Agroscope
ACW Wdenswil, Swiss Federal Research
Station for horticulture, po box 185,
8820 Wädenswil, Suiza
*Autor corresponsal: [email protected]
3.1 Resumen
3.2 Introducción
3.3 Trastornos por intolerancia a la
histamina
3.4 Prevención de la formación de
aminas biógenas en el vino
3.5 Garantizar la seguridad
microbiológica y la calidad del vino
3.6 Resumen de resultados
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
3.1 Resumen
Las aminas biogénicas que se encuentran en el vino y en otros alimentos
constituyen siempre una indicación de
la presencia de microorganismos indeseables con una gran actividad descarboxilasa, como por ejemplo las bacterias lácticas de las especies
Pediococcus (Pediococcus damnosus,
Pediococcus parvulus, Pediococcus
pentosaceus)
y
Lactobacillus
(Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii). La detección de microorganismos durante la vinificación se suele
hacer al microscopio. Con este método se puede
detectar la aparición de microorganismos indeseables
y prevenir que sigan desarrollándose. Sin embargo, a
menudo esta forma de detección sencilla, relativamente barata y eficaz no resulta suficientemente sensible, pues se pueden formar metabolitos indeseables
a partir de concentraciones de microorganismos inferiores al umbral de detección de un microscopio (que
ronda las 104 células/ml). La utilización de un sistema
de detección basado en PCR cuantitativo, desarrollado
por nuestro grupo, permite detectar la presencia de
levaduras y bacterias por debajo de un umbral de
detección de 100 células/ml, e indicar así el riesgo
potencial de bacterias que forman aminas biogénicas.
Durante la vinificación, la adición de cultivos iniciadores de bacterias Oenococcus oeni impide o retrasa el
desarrollo de Pediococcus ssp. y Lactobacillus ssp. y
por lo tanto la formación de aminas biogénicas.
III.3. Efectos de los contaminantes
microbiológicos inducidos por la
fermentación maloláctica
descontrolada en vino
3.2 Introducción
La descarboxilación del aminoácido histidina tiene
como resultado la formación de histamina, una de las
llamadas aminas biogénicas. De entre todas las aminas biogénicas, la histamina es la más importante en
medicina. Normalmente, esta sustancia se degrada
sin problemas tras la ingesta de alimentos, pero el
número de personas que reaccionan a pequeñas cantidades de aminas biogénicas en los alimentos con
síntomas radicales aumenta constantemente. Este
tipo de patología se llama “Intolerancia a la histamina”.
Las personas aquejadas de esta enfermedad tienen
que observar dietas bajas en histamina. La histamina
se forma durante la biosíntesis normal de las proteínas por los seres humanos, pero también a consecuencia de la actividad bacteriana.
En el vino, la histamina es un contaminante indeseable.
Se forman aminas sobre todo durante la fermentación y
maduración de alimentos como el queso, las verduras,
los embutidos y el pescado. Un alto contenido de histamina en la comida también está correlacionado con la
alteración de la misma; la concentración de histamina
en la comida es, en efecto, signo de frescura y calidad.
69
III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica
Durante el tratamiento de la comida, también es frecuente la formación de aminas biogénicas distintas
de la histamina, como la putrescina, la tiramina, la
cadaverina etc. La presencia concurrente de estas
aminas biogénicas incrementa la toxicidad de la histamina 1 y 5.
Tabla 1.
Contenido de histamina de los alimentos con mayor contenido de histamina 2.
Queso (mg/kg)
Emmental
Bergkaese
Parmesano
Gouda, Edam, Stangenkaese
Tilsiter, Geheimratskaese, Butterkaese
Quesos azules austriacos
Camembert, Brie
Schlosskaese, Romadur
Quargel (queso ácido curado)
Queso fresco, de Burgos
contenido (max)
<10-500 (2’500)
<10-1’200
<10-580
<10-200 (900)
<10-60
<10-80
<10-300 (600)
<10-100
<10-50 (390)
0
Bebidas alcohólicas (μg/kg)
Vino tinto
Vinos tintos austriacos
Vinos blancos austriacos
Vino espumoso
Cava 670
Cerveza
Weizenbier
Cerveza sin alcohol
70
hasta 3’800
60-600 (1’100)
10-120
15-80
20-50
120-300
15-40
Embutido (mg/kg)
Salami <10-280
Otras salchichas curadas
Osso collo, jamón Westfaeler
Carne fresca
<10-100
<10-300
<1
Pescado y derivados (mg/kg)
Pescado fresco
Pescado fresco, estropeado
Productos ultracongelados
Conservas (p.e. atún en lata)
0
hasta 13’000
0-5 (>50)
0-15 (300)
Verduras (mg/kg)
Tomates (ketchup)
Espinacas
Aguacates
Berenjenas
Col fermentada
22
30-60
23
26
10-200
Vinagre (μg/kg)
Vinagre de vino tinto
4’000
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
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3.3 Trastornos por intolerancia a la histamina
En la actualidad ya se sabe mucho sobre los efectos
médicos de la histamina. La mayor parte de las personas con intolerancia no tienen suficiente actividad de
diamina-oxidasa (DAO), una enzima que normalmente está presente en el organismo. Esta enzima convierte las aminas biogénicas como la histamina en
productos inocuos. Los trastornos comienzan después de ingerir un alimento rico en histamina. Los síntomas más importantes son el enrojecimiento de la
piel junto con picores, dolor de cabeza, náuseas, trastornos digestivos, diarrea y trastornos respiratorios.
También aparecen signos típicos de alergia, como
ojos enrojecidos y “goteo nasal”.
La capacidad de degradar la histamina presente en
los nutrientes se reduce drásticamente en los seres
humanos al consumir alcohol, y también como efecto secundario de ciertos fármacos. Ambos inhiben la
actividad de la enzima diamina oxidasa que está presente en el intestino. Por ese motivo, hay que evitar el
consumo conjunto de bebidas alcohólicas (cerveza,
vino, espumosos, destilados etc.) y alimentos con
altas concentraciones de aminas biogénicas.
3.4 Prevención de la formación de aminas
biogénicas en vino
El motivo más frecuente del incremento de la cantidad de aminas biogénicas presentes en los alimentos
son las bacterias de alteración que pueden formar
aminas biogénicas como las histaminas durante el
tratamiento, la maduración o el almacenamiento de
comida deficientemente controlado1 y 5. Las normas
de alimentación suizas estipulan los umbrales de tole-
rancia de histamina en diversos productos alimentarios.
En el caso del vino, el umbral de tolerancia es de 10
mg/L. Para ser considerado sin histamina, un vino no
debe tener una concentración de histamina superior
a 0.5 mg/L. Se sabe que, entre las especies de bacterias lácticas, existen cepas capaces de no formar prácticamente aminas biogénicas, o al menos no niveles
elevados. Más concretamente, las cepas de
Pediococcus ssp.. y Lactobacillus ssp. son capaces de
producir mayores cantidades de histamina en el vino.
La industria alimentaria y la industria del vino han
empezado a utilizar cultivos bacteriológicos iniciadores con propiedades definidas también con respecto
a la formación de aminas biogénicas. La inoculación
de especies y cepas de bacterias lácticas con poca o
ninguna capacidad de formación de aminas biogénicas reduce su incidencia en los alimentos procesados.
Las aminas biogénicas (histaminas) no deberían aparecer en absoluto en los vinos. Sin embargo, durante
la vinificación pueden estar presentes tanto microorganismos indeseables como deseables. Los productores de vino deben asegurarse de que los microorganismos indeseables no tengan ninguna oportunidad.
Mediante la adecuada inoculación de levaduras
Saccharomyces cerevisiae para las fermentaciones
alcohólicas y de bacterias Oenococcus oeni para las
fermentaciones malolácticas, se puede avanzar
mucho hacia la producción de un vino de buena calidad 1 y 5.
En los cultivos iniciadores, se ha controlado meticulosamente la presencia de sustancias metabólicas indeseables.
Tabla 2.
Contenido de aminas biogénicas de los vinos del este de Suiza (1984) 3, 5
Valores medios en mg/L
Aminas biogénicas
151 vinos tintos / 51 vinos blancos (valores máximos)
Histamina
2.0 (20) / 1.5 (10)
Tiramina
2.8 (24.6) / 7.5 (43.8)
2- Feniltilamina
1.7 (9.4) / 1.7 (8.5)
Putrescina
21.4 (200) / 11.1 (>100)
Isoamilamina
8.2 (38.8) / 6.3 (17)
Cadaverina
0.3 (1.2) / 0.1 (0.8)
Los valores mínimos y medios se han observado en los vinos con procesos controlados.
La vinificación sin control microbiano origina los valores máximos
71
III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica
Las investigaciones realizadas durante varios años
han demostrado que la inoculación adecuada de
cepas de Oenococcus oeni durante la vinificación
previene la formación de aminas biogénicas.
Tabla 3.
Contenido de histamina en los vinos sometidos a FML – impacto de los cultivos iniciadores en la mejora de la calidad del vino 4, 5
Cultivos iniciadores de O. oeni utilizados
Contenido de Histamina del vino (mg/L)
Bitec
<1
EQ 54
<1
Viniflora oenos
<1
“espontáneo”
<1
Las demás aminas biogénicas detectadas en el vino presentan concentraciones inferiores a <1 mg/L
3.5 Garantizar la seguridad microbiológica y la calidad en el vino
Durante la vinificación, es fundamental conocer la
composición microbiana del mosto y el vino para
garantizar la calidad del producto final. Existen levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y bacterias
(Oenococcus oeni) deseables, así como levaduras
(Hanseniaspora uvarum y Brettanomyces bruxellensis) y bacterias (Pediococcus ssp. y Lactobacillus ssp.)
indeseables. Nuestro sistema de detección, basado
en PCR cuantitativo, permite diferenciar entre las
especies mencionadas más arriba, y también entre
microorganismos vivos o muertos. Hemos optado
por mantener los genes de levaduras y bacterias. Los
hemos secuenciado, y hemos definido los cebadores
y sondas para PCR. Con nuestro sistema hemos podido diferenciar entre las diversas especies. En los vinos
con mayores concentraciones de aminas biogénicas
hemos encontrado Pediococcus ssp. y Lactobacillus
ssp. No obstante, la concentración de aminas biogénicas formadas y los recuentos celulares determinados no son correlativos. Las aminas biogénicas analizadas en el vino son: histamina, tiramina, putrescina,
cadaverina, 2-feniletilamina, espermina, triptamina e
isopentilamina.
Tabla 4.
Contenido de aminas biogénicas en los vinos (2005, datos inéditos)
Histamina: 8 vinos con >10mg/l, hasta 26.1 mg/l
Tiramina: 11 vinos con >10mg/l, hasta 22.7 mg/l
Putrescina: 18 vinos con >10mg/l, hasta 500 mg/l
Isopentilamina: 6 vinos con 10mg/l, hasta 39.7 mg/l
Cadaverina: n.d. – 7.2 mg/l
Triptamina: n.d. – 11.6 mg/l
2-PE-amina: n.d. – 17.7 mg/l
Espermina: n.d. – 0.9 mg/l
En muchas muestras con bacterias Pediococcus ssp.,
también se encuentran levaduras Brettanomyces bruxellensis. Ya habíamos observado esta incidencia conjunta en estudios anteriores. No obstante, no sabemos cómo interactúan estos dos microorganismos.
En las muestras de vino que contienen ambos micro72
organismos, hemos detectado mayores cantidades
de aminas biogénicas (a partir de Pediococcus ssp.)
así como el sabor desagradable producido por
Brettanomyces, los etilfenoles (a partir de
Brettanomyces bruxellensis).
Como los vinos se filtraron antes de su embotellado,
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
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Tabla 5.
Vino No.
Añada
Histamina1
Tiramina1
Triptamina1
2-Feniletilamina1
Isopentilamina1
Putrescina1
Cadaverina1
Espermina1
4-Etilfenol2
4-Etilguayacol2
4-Etilcatecol2
Contenido de aminas biogénicas y etilfenoles en vinos con sabor a moho generado por Brettanomyces (2005, datos inéditos)
573
2003
3.3
2.4
n.d
0.4
0.4
6.4
1.0
n.d.
607.4
186.8
69.6
574
2002
7.7
6.3
n.d.
0.8
1.0
11.4
1.3
n.d.
1351.3
243.9
226.0
575
2000
10.5
8.8
n.d.
0.4
0.5
15.6
1.1
0.1
1180.3
198.5
183.4
576
1998
11.6
10.5
n.d.
0.7
0.6
17.4
1.3
0.1
1346.8
227.2
213.6
300-600
50
50
Umbral sensorial
1 en mg/L; 2 en Ìg/L
no se pudieron detectar levaduras Brettanomyces ni
bacterias lácticas (Lactobacillus ssp y Pediococcus
ssp.).
Los catadores a menudo describen este sabor desagradable (“a moho”) como medicinal, animal, a calcetín sudado, a establo, a humo, metálico, a tirita y especiado. Mediante la determinación de 4-etilguayacol,
4-etilfenol y 4-etilcatecol, las tres principales sustancias del sabor a “moho” presentes en nuestras muestras, hemos podido observar una buena correlación
entre su concentración y el recuento celular determinado: a mayor número de células, más cantidad de
dichas sustancias se forma. En nuestra bodega hemos
observado un incremento de la alteración del “moho”
desde finales de julio de 2002 hasta finales de septiembre de 2002. Este efecto sensorial está correlacionado con la concentración de las tres sustancias principales, así como con el incremento del recuento
celular en algunos casos a razón de al menos cinco
veces (no se presentan los datos).
3.6 Resumen de nuestros resultados sobre las
aminas biogénicas en el vino
La producción de aminas biogénicas en el vino acompaña la presencia de bacterias lácticas de las especies:
Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus,
Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus brevis y
Lactobacillus hilgardii. Tanto P. damnosus como P.
pentosaceus prefieren las regiones vitícolas de clima
frío, mientras que L. brevis, L. hilgardii y P. parvulus
son más frecuentes en las regiones vitícolas cálidas.
Durante la vinificación hay presencia de una cantidad
suficiente de precursores de la formación de aminas
biogénicas, es decir los aminoácidos.
Hemos desarrollado un sistema basado en la técnica
de PCR cuantitativo para determinar las levaduras y
bacterias presentes en el vino6. Con este sistema,
tenemos la posibilidad de medir la cantidad de bacterias lácticas productoras de aminas biogénicas presente, antes de que empiecen a producir sustancias
indeseables. Este método no incluye un sistema de
enriquecimiento previo.
Hemos analizado al menos un centenar de vinos para
comprobar la presencia de aminas biogénicas en los
mismos, y hemos determinado las especies y recuentos de bacterias lácticas presentes. Los resultados se
pueden resumir brevemente como sigue: Todas y
cada una de las cinco bacterias lácticas pueden ser
responsables de la producción de aminas biogénicas.
Existe poca o ninguna correlación entre el recuento
celular de bacterias lácticas y la concentración de
aminas biogénicas. Hemos observado que, en algunos casos, un recuento de 106 células/ml no desemboca en la formación de aminas biogénicas. No obstante, a veces bastan 103 células/ml para producir
importantes concentraciones de aminas biogénicas.
Normalmente, son suficientes 103 células/ml para la
formación de aminas biogénicas. La formación de
aminas biogénicas parece ser específica de cada
cepa, como ya se había observado en otros estudios.
Además, la formación de aminas biogénicas específicas no se puede correlacionar con una especie concreta de bacterias lácticas (por ejemplo, la putrescina
la forma Pediococcus damnosus).
73
III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica
En el futuro, esperamos transferir nuestro conocimiento del mecanismo de las aminas biogénicas a
otros productos alimentarios que también pueden
presentar mayores cantidades de aminas biogénicas.
Tabla 6:
Alimentos que más a menudo causan efectos adversos relacionados con las aminas biogénicas2
1.
Bebidas alcohólicas (en especial los vinos tintos)
2.
Queso (en especial los quesos duros, como el Emmental)
3.
Chocolate
4.
Salami y otros embutidos
5.
Frutos secos
6.
Tomates
7.
Fresas, cítricos y otros liberadores de histamina
8.
Col fermentada (chucrut)
9.
Espinacas
10.
Pescado
Referencias
1. Bodmer S. und Gafner, J. Histamin in Wein.
Schweizerische Zeitschrift für Obst- und Weinbau, 21,
546-547, 2000.
4. Hoffmann-Boller P., Oettli M., Egli C.M., Albisser S.,
Pulver D., Bill R., Henick-Kling T. and Gafner J. Impact
of molecular biology on the study of the origin of biogenic amines in foods. COST 917 Biogenically active
amines in food; Volume V; 72-75, 2001.
2. Jarisch R. Histamine Intolerance (HTI) – an overlooked disease. COST 917 Biogenically active amines in
food; Volume IV First general workshop; 30-35, 2000.
5. Gafner J. Biogenic amines in wine. Proceedings of
the 13th International Enology Symposium in
Montpellier / France, 95-106, 2002
3. Mayer K. und Pause G. Amingehalte in Ostschweizer
Weinen. Schweizerische Zeitschrift für Obst- und
Weinbau, 123, 303-309, 1987.
6. Gafner, J., Porret, N.A., Uermösi, Ch., Terrataz, A.,
Arvik, T., Sievers, M., Schmid, S., Schneider, K., Hesford,
F.: Frühzeitiges Erkennen von unerwünschten
Mikroorganismen im Wein: Brettanomyces bruxellensis. Proceedings, Intervitis Interfructa Stuttgart 2004,
148-157
74
Informe Técnico
Fundación para la Cultura del Vino
Fermentación Maloláctica
75
I
III.4. Incidencia
cualitativa de
la siembra de
bacteria en los
vinos tintos
Vincent GERBAUX
ITV Francia, Unidad de Beaune
4.1 Control de la fermentación
maloláctica mediante la siembra
bacteriana de los vinos
4.2 Inoculación conjunta levaduras /
bacterias lácticas aplicada a los tintos
“jóvenes”
4.3 Influencia de la siembra bacteriana
en el color de los vinos dePinot Noir.
4.4 La lisozima, posible alternativa para
estabilizar los vinos después de la
FML
4.5 Influencia directa de la siembra
bacteriana en las cualidades
sensoriales de los vinos tintos
4.6 Siembra bacteriana y prevención de
los vinos fenolazos
4.7 Siembra bacteriana y control de los
contenidos de aminas biogénicas.
4.8 Conclusiones
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
a fermentación maloláctica
(FML) influye en la calidad organoléptica de los vinos, en especial en la de los tintos. Las modificaciones cualitativas van mucho más
allá de una mera disminución de la acidez asociada a la transformación del
ácido málico en ácido láctico. En el
caso de los vinos de Pinot Noir, la FML
aumenta la calidad y complejidad olfativas, en especial las vinculadas a los
aromas frutales. En boca, la FML atenúa los sabores astringente, ácido,
amargo y alcohólico (Figura 1).
L
III.4. Incidencia cualitativa de la
siembra de bacteria en los vinos
tintos
Figura 1.
Modificaciones gustativas vinculadas a la realización de la FML en un vino de Pinot Noir.
Vegetal
Caramelizado
Fr. Rojas
Afrutado
Consistencia
Amargor
Alcohol
Acidez
Astringencia
(La línea de base corresponde al mismo vino, sin realización de la FML)
El control de la FML constituye un problema complejo. Cuando el vino es desfavorable al crecimiento de
las bacterias lácticas, la FML sólo se inicia al cabo de
un plazo de tiempo más o menos largo y aleatorio. A
la inversa, la FML se puede producir rápidamente
cuando el vino es favorable, pero ese tipo de vino
también permite el desarrollo de diversos microorganismos, algunos de los cuales pueden originar alteraciones más o menos graves.
4.1 Control de la fermentación maloláctica
mediante la siembra bacteriana de los vinos
La siembra bacteriana de los vinos permite paliar una
flora deficiente o garantizar la presencia de una
población controlada. Esta técnica ha evolucionado
considerablemente desde sus comienzos, hace unos
veinte años. Inicialmente, no se podía inocular las biomasas en el vino sin haberlas sometido a una reactivación previa. A principios de los años 1990, las inves77
III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica
tigaciones sobre la adaptación de las bacterias lácticas a las condiciones hostiles han permitido preparar
biomasas de siembra directa. En comparación con el
de las biomasas "clásicas", el proceso de fabricación
incluye operaciones específicas que permiten una
adaptación previa de las bacterias a las condiciones
que prevalecen en el vino. Gracias a dicha adaptación,
las bacterias lácticas se vuelven tan fáciles de utilizar
como las levaduras secas activas.
El número de preparaciones bacterianas comercializadas aumenta constantemente. Las nuevas biomasas tienen que presentar una mayor eficacia o un
interés especial. El ITV de Francia participa activa-
mente en la selección de cepas de bacterias lácticas
y en el desarrollo de nuevas biomasas, como por
ejemplo: Enoferm Alpha, Lalvin 31 y FML Expertise
S. Ha desarrollado estas bacterias lácticas en colaboración con la sociedad Lallemand. Los numerosos experimentos realizados en Borgoña sobre
vinos del varietal Pinot Noir, así como en otras regiones vitícolas francesas, han permitido comprobar
las aptitudes enológicas de estas biomasas. Así
pues, la FML de un vino de Pinot Noir se puede llevar a cabo en unos 15 días a una temperatura de 18°
C, y en menos de un mes a 14°C de temperatura.
Este segundo resultado permite prescindir de la
calefacción (Figura 2).
Figura 2.
Influencia de la temperatura en la actividad de las bacterias lácticas en un vino tinto.
120
60
30
14°C
18°C
0
Testigo
Lalvin 31
4.2 Inoculación conjunta levaduras / bacterias
lácticas aplicada a los tintos “jóvenes”
Normalmente, el inicio de la fermentación maloláctica sólo es deseable después de que finalice la fermentación alcohólica. Lógicamente, se aconseja pues proceder a la siembra bacteriana en esa etapa. No obstante, también puede ser interesante una siembra
bacteriana más precoz, al principio o en el transcurso
de la fermentación alcohólica, principalmente por los
motivos siguientes:
- Reducir el tiempo de elaboración de los vinos
destinados a ser consumidos jóvenes,
- Evitar la proliferación de bacterias lácticas indeseables procedentes de la flora indígena.
Esta técnica requiere un buen seguimiento enológico
para evitar el riesgo principal, que es el del picado lác78
11°C
75% de la FML a 130 días
90
FML no iniciada al día 220.
Realización de la FML (días)
150
Enoferm Alpha
FML Expertise S
tico. Este riesgo depende de diversos parámetros, en
muy especialmente del nivel de pH (el riesgo es
mayor cuanto más alto es el nivel de pH). En la práctica, el picado láctico no se puede desencadenar hasta
que se ha agotado el ácido málico. El ITV Francia ya ha
trabajado sobre esta técnica hace una decena de
años, con resultados interesantes. El objetivo principal
consistía en simplificar la utilización de las bacterias
lácticas, que por entonces requería una fastidiosa
reactivación antes de su uso. En la actualidad, esta
técnica se aplica con las biomasas bacterianas de
siembra directa.
Los trabajos acometidos hace ya varios años persiguen un mejor conocimiento de los crecimientos y
actividades metabólicos respectivos de las levaduras
y las bacterias lácticas. Los experimentos realizados
con Gamay en Beaujolais (fermentación de vendimia
entera) demuestran que la inoculación conjunta de
levaduras y bacterias permite que la FML se lleve a
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Fermentación Maloláctica
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cabo en un plazo de tiempo acusadamente más
breve que el registrado en los lotes testigo sin siembra. Ahora bien, la utilización de biomasas bacterianas
inicialmente destinadas a su siembra directa en los
vinos una vez finalizada la fermentación alcohólica
puede inducir un desarrollo demasiado rápido de la
FML. Ésta se puede producir en cuestión de días tan
sólo, y por lo tanto culminar mucho antes de que ter-
mine la fermentación alcohólica. En esa situación, el
riesgo de picado láctico es real. Para permitir un
mayor control de esta técnica, el ITV Francia ha trabajado en una nueva formulación de biomasa bacteriana adaptada a la inoculación conjunta de los vinos
tipo “joven” poco o nada sulfitados. El objetivo consiste en hacer coincidir la duración de la FML con la
duración de la fermentación alcohólica (Figura 3).
Figura 3.
Optimizacón de la inoculación conjunta en los vinos tintos de tipo "jóvenes".
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
Co-inoculation Lev. / BL
BL fin FA
Fin de la FA
Trasiego
ac málico(g/l)
Testigo
7
14
Esta nueva formulación “especial inoculación conjunta” saldrá al mercado enológico probablemente en
2006, a un precio reducido comparado con el de las
biomasas destinadas a la siembra directa de los vinos.
Los trabajos demuestran que los vinos acabados elaborados mediante inoculación conjunta no presentan ninguna anomalía analítica. El nivel de acidez
volátil, el color o la concentración de polifenoles son
similares a los obtenidos con la técnica de referencia.
4.3 Influencia de la siembra bacteriana en el color
de los vinos de Pinot Noir
Tradicionalmente, los vinos de Pinot Noir de Borgoña
requieren plazos de tiempo considerables para la realización de la FML. La frescura de las bodegas, la alta
graduación alcohólica así como el nivel de pH, que
puede ser relativamente bajo, explican este fenómeno. El recurso a la siembra bacteriana permite reducir
el plazo de obtención de la FML. En un vino de pinot
noir, sembrado de bacterias lácticas al final de la FA y
mantenido a unos 18°C, la FML culmina rápidamente
(15 días, frente a más de dos meses para el vino sin
sembrar). Paralelamente, se observa una pérdida de
tiempo (días)
21
28
35
intensidad colorante de un 10 a un 15% con respecto
a un vino testigo sin sembrar. El tono de color y los
polifenoles no se modifican, y en las catas analíticas,
los jurados no diferencian significativamente los lotes
sembrados de los lotes testigo por lo que a la calidad
visual se refiere. De todas formas sería interesante
buscar soluciones que permitan reducir esa pérdida
de color observada analíticamente. Los trabajos han
tratado principalmente sobre la temperatura de realización de la FML. La temperatura influye en el crecimiento y la actividad de las bacterias lácticas. Cuanto
más baja es la temperatura (entre 10 y 20°C), más
lenta será la culminación de la FML. A 18°C, los lotes
sembrados de bacterias lácticas pierden más color a
raíz de la FML que los lotes expuestos a una temperatura más baja. A 14°C, y más aún a 11°C, el color
aumenta durante el periodo de latencia más o menos
prolongado previo a la puesta en marcha de la FML.
Sólo disminuirá después de que haya terminado la
FML. El sulfitado de final de la FML aplicado más tardíamente tiene una incidencia más limitada sobre la
pérdida de color que un sulfitado precoz (Figura 4).
Una siembra bacteriana retrasada con respecto al
final de la FA puede provocar el mismo fenómeno. En
79
III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica
Figura 4.
Influencia de la temperatura ambiente en bodega en la evolución del color de un vino de Pinot Noir.
(claridad: inversamente proporcional a la intensidad colorante)
color (claridad)
32
11°C
fin FML + SO2
28
18°C
24
20
16
0
30
60
la evolución del color de los vinos tintos durante la
crianza intervienen fenómenos químicos lentos. En
efecto, los resultados demuestran que el color de los
vinos de Pinot Noir evoluciona en tres fases:
- intensificación entre el trasiego y la puesta en
marcha de la FML,
- estabilización durante la realización de la FML,
- disminución después del sulfitado del final de
la FML y de los siguientes.
Una temperatura fresca en bodega permite prolongar
la primera fase, con lo cual se mantiene intacto el
interés de la siembra bacteriana para garantizar un
desarrollo lento pero controlado de la FML.
4.4 La lisozima, posible alternativa para estabilizar
los vinos después de la fermentación maloláctica
Si no se les aplica un tratamiento de estabilización, en
los vinos tintos la población de bacterias lácticas se
mantiene elevada durante varios meses después de
la terminación de la FML. Por ello, se recomienda estabilizar los vinos sin tardanza. La utilización de SO2 es la
solución habitual. Sin embargo, aunque el efecto del
SO2 sobre las bacterias lácticas es incuestionable, lo
cierto es que este producto no es neutro para el vino.
Ya hemos expuesto más arriba sus consecuencias
sobre el color. El SO2 también puede engendrar pérdidas olfativas y gustativas, pérdida de caracteres fruta-
80
90
120
tiempo (días)
150
180
les, merma de la armonía, incremento del carácter
desecante. En esos casos, la lisozima (proteína extraída de la clara de huevo) puede ser una solución interesante para tratar los vinos al final de la FML con el
propósito de retrasar o reducir la utilización de SO2. La
adición de 250 mg/l de lisozima permite una reducción de la flora bacteriana equivalente a la de un sulfitado a razón de 50 mg/l. También resulta interesante una dosis de lisozima de 125 mg/l (equivalente a
un sulfitado a unos 30 mg/l). En esas condiciones, se
estabiliza la acidez volátil, mientras que en los lotes
sin tratar, ésta aumenta durante las semanas siguientes a la FML. La lisozima ejerce una acción específica
sobre las bacterias lácticas, contrariamente al SO2, que
tiene un amplio espectro de actividad. Por lo tanto, en
caso de utilización de lisozima, conviene vigilar el desarrollo siempre posible de levaduras Brettanomyces,
contra las cuales sigue siendo aconsejable el sulfitado.
Pero a la inversa, la utilización de lisozima puede resultar preferible al sulfitado en caso de conclusión difícil
de la fermentación alcohólica, cuando la FML, en
cambio, ha terminado.
Se ha ensayado la adición de lisozima después de la
FML (200 mg/l) en varios casos, comparándola con un
sulfitado (30 mg/l). Los análisis sensoriales realizados
sobre los vinos acabados demuestran que los lotes
estabilizados con lisozima y que presentan contenidos reducidos de SO2 tienen niveles cualitativos equivalentes o superiores a los sulfitados (Figura 5).
Las aplicaciones prácticas realizadas en Borgoña en
vinos de Pinot Noir criados en barrica de roble confirman estos resultados.
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Figura 5.
Influencia comparada de la utilización de lisozima y de SO2 después de la FML en la calidad de los vinos tintos
SO2 : 30 mg/l
Lyso.: 200 mg/l
12
10
8
6
Bourgogne
Pinot Noir
Touraine
Cabernet Franc
4.5 Influencia directa de la siembra bacteriana en
las cualidades sensoriales de los vinos tintos
Las bacterias lácticas son microorganismos que presentan numerosas actividades metabólicas. Ya se ha
demostrado que algunas de esas actividades afectan
a moléculas aromáticas. Por ejemplo, el metabolismo
del ácido cítrico desemboca en la producción de diacetilo, un compuesto con olor a mantequilla. No obs-
Bordeaux
Merlot
Bordeaux
Cabernet Sauv.
tante, en el medio, que es el vino, la actividad de las
bacterias lácticas se “diluye”en la complejidad del producto.
El seguimiento organoléptico de vinos obtenidos en
condiciones experimentales demuestra que, en
general, no existe ninguna diferencia significativa
entre los vinos testigo y los vinos sembrados de bacterias lácticas (Figura 6).
Figura 6.
Influencia de la siembra bacteriana en las cualidades sensoriales de los vinos tintos
Testigo
Lalvin L31
Enoferm Alpha
4
puntuaciones de 1 a 5
calidad global (sobre 20)
14
3,5
3
2,5
2
Calidad visual
Calidad olfativa
Calidad gustativa
Calidad global
81
III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica
Las condiciones muy controladas favorecen la obtención de vinos testigo (no sembrados) sin defectos, si
bien esto no siempre es así en condiciones prácticas.
4.6 Siembra bacteriana y prevención de los vinos
fenolados
El control de la FML mediante siembra bacteriana
también puede contribuir a preservar el nivel cualitativo de los vinos tintos evitando el desarrollo de
Brettanomyces, la levadura de alteración directamente responsable del carácter fenólico de los vinos. La
siembra bacteriana induce una ejecución más rápida
y homogénea de la FML, lo cual permite plantearse
una estabilización precoz del vino. En esas condicio-
nes, se minimiza el tiempo de que dispondrá
Brettanomyces para desarrollarse y expresar su metabolismo. Esta competencia temporal es decisiva, pues
además, las floras de bacterias lácticas y de
Brettanomyces no desarrollan interacciones sensibles
entre sí. Los resultados obtenidos en Pinot Noir
demuestran que los vinos elaborados aplicando una
siembra bacteriana adecuada tienen un contenido
débil o nulo de fenoles volátiles (niveles siempre muy
inferiores al umbral de percepción). Por otro lado, los
vinos elaborados sin siembra de bacterias lácticas
presentan contenidos de fenoles volátiles más o
menos altos, según de qué vino se trate. Estos resultados se han obtenido en laboratorio, con contaminaciones por Brettanomyces provocadas, y en bodegas
con contaminaciones espontáneas (Figura 7).
Figura 7.
Interés de la siembra bacteriana para la prevención de la aparición de gustos fenolados.
cata (puntuaciones de 1 a 5)
Testigo no sembrado
4
Fenoles volátiles:
1100 µg/l 30 µg/l
3
2
1
Calidad olfativa
Calidad gustativa
El análisis sensorial de los vinos contaminados por esta
vía demuestra que el perjuicio cualitativo asociado a
Brettanomyces es significativo. Los vinos sin sembrar
presentan notas animales desarrolladas, mientras que
los vinos sembrados de bacterias lácticas presentan
un nivel cualitativo global superior. Si la temperatura
de bodega es fresca, la técnica sigue resultando interesante. El metabolismo bacteriano se desacelera, la
FML es más lenta, pero también se desaceleran el crecimiento y la actividad de Brettanomyces. La siembra
bacteriana de los vinos tintos constituye pues una
herramienta interesante para reducir el riesgo de aparición del carácter fenólico.
4.7 Siembra bacteriana y control de los contenidos
de aminas biogénicas
Ciertas aminas biogénicas están directamente vinculadas a la actividad de las bacterias lácticas en los
vinos. La histamina, la tiramina y la putrescina son las
tres aminas biogénicas que pueden evolucionar sig82
Siembra bacteriana
Calidad global
Nota animal
nificativamente durante y después del desarrollo de
la FML. A la histamina y la tiramina se les imputa la
responsabilidad de ciertos casos de alergias alimentarias. En comparación con otros productos alimentarios expuestos a bacterias lácticas, en los vinos
estas moléculas sólo llegan a alcanzar concentraciones bajas, en principio carentes de efectos sobre la
salud. De todas formas, la presencia excesiva de aminas biogénicas en un vino puede constituir un obstáculo para su comercialización. El control de los
contenidos de aminas biogénicas en los vinos está
estrechamente vinculado al control de las bacterias
lácticas. La siembra con biomasas seleccionadas
hace posible ese control. Los vinos cuya FML se ha
controlado mediante siembra bacteriana presentan
contenidos reducidos de histamina, tiramina y
putrescina en comparación con los vinos testigo
con flora indígena. Las biomasas bacterianas comercializadas en el mercado enológico deben pues
incluir ese criterio en sus pruebas de selección
(Figura 8).
Informe Técnico
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Figura 8.
Influencia comparada de la utilización de lisozima y de SO2 después de la FML en la calidad de los vinos tintos
Enoferm Alpha
Lalvin 31
FML Expertise S
contenidos en µg/l
10
8
6
4
2
0
histamina
tiramina
Ahora bien, hay que recordar que la población de
bacterias lácticas se mantiene a un nivel elevado después de la culminación de la FML, sobre todo en los
vinos tintos. Para los vinos de Pinot Noir, naturalmente ricos en aminoácidos, ese periodo es crítico en
relación con la producción de aminas biogénicas. Por
lo tanto se aconseja proceder a una estabilización
microbiológica inmediatamente después de terminar la FML (sulfitado clásico o utilización de lisozimas).
4.8 Conclusiones
El interés de la FML para la calidad de los vinos tintos
está bien reconocido. Por lo general, esta operación
se realiza al principio de la crianza, a la vez que se inician fenómenos químicos y biológicos más o menos
controlados y más o menos interesantes para la calidad del vino. Obviamente, durante esta etapa el vino
no está estabilizado. El color y los compuestos fenólicos evolucionan debido sobre todo a las aireaciones
(trasiego, crianza en barricas…). El sulfitado aconsejado al final de la FML tiende a bloquear o a desacelerar
esta evolución. Por lo tanto, puede resultar interesante prolongar la duración de la FML, por ejemplo rebajando la temperatura de la bodega (en torno a 14°C),
para prolongar ese tiempo de crianza sin SO2.
Sin embargo, la prolongación del plazo de realización
de la FML plantea o puede plantear un problema de
tipo microbiológico. Es corriente que la flora indígena
de los mostos y los vinos contenga microorganismos
perjudiciales. A menudo está presente Brettanomyces, levadura directamente implicada en el carác-
putrescina
ter fenólico. Ciertas cepas de bacterias lácticas producen demasiadas aminas biogénicas. Para restringir la
actividad de los microorganismos perjudiciales, la
solución obvia consiste en la estabilización microbiológica precoz.
Para conciliar estas dos necesidades opuestas, en
especial en los vinos de crianza, la siembra bacteriana constituye una respuesta interesante. En efecto,
permite asegurar la realización de la FML en un plazo
que se podrá modular jugando principalmente con
la temperatura de la bodega. Las biomasas propuestas en la actualidad soportan temperaturas frescas.
En el caso de los vinos destinados a ser consumidos
jóvenes, se puede acelerar el control de la FML utilizando la inoculación conjunta. En ese caso, la FML se
realiza al mismo tiempo que la fermentación alcohólica.
Por último, la estabilización microbiológica de los
vinos después de la FML se puede regular en función del riesgo afrontado. Si es necesario, se puede
combinar un sulfitado clásico con la utilización de
lisozima para crear mejores condiciones al principio
de la crianza, si bien, en ese caso, no se inhibirán las
Brettanomyces ni las bacterias acéticas. En ese caso,
un control microbiológico deberá concretar ese
riesgo.
En la actualidad, el enólogo dispone de numerosas
bazas para controlar la FML y la estabilización microbiológica de los vinos. Estas se deben adecuar a las
situaciones enológicas para aprovechar al máximo
sus efectos beneficiosos.
83
I
IV. Inicio,
desarrollo y
control de la
fermentación
maloláctica
Índice
87
87
97
117
97
117
IV.1. Los tipos de vino y el momento óptimo para la
inoculación. Cómo controlar el proceso.
Dra. Sybille Krieger
Lallemand
IV.2. Fermentación maloláctica en barrica.
José Hidalgo Togores
Dr. Ingeniero Agrónomo y Enólogo
IV.3. Fermentación maloláctica: cuándo y cómo
Antonio Palacios
Carlos Suárez
José María Heras
Sibylle Krieger
Lallemand
L
IV.1 Los tipos
de vino y el
momento
óptimo para la
inoculación.
Cómo
controlar el
proceso
Dra. Sybille KRIEGER
Lallemand Alemania
1.1 Inoculación simultánea de levadura
y bacterias
1.2 Producción de acidez volátil
1.3 Inoculación de cultivos lácticos
iniciadores durante la fermentación
alcohólica
1.4 Inoculación de cultivos lácticos
iniciadores después de la
fermentación alcohólica
1.5 Demora en la inducción de la
fermentación maloláctica
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
a fermentación maloláctica
(FML) se produce en el vino a
resultas de la actividad metabólica de ciertas cepas de bacterias
lácticas adaptadas. Frecuentemente se
considera que la reducción de la acidez
y la modificación del aroma del vino a
raíz de esta segunda fermentación
bacteriana son favorables a la calidad
del vino. La inducción de la FML
mediante la inoculación de cepas
seleccionadas de bacterias lácticas presenta dos ventajas: en primer lugar,
permite un mayor control sobre el
momento y la velocidad de la conversión del ácido láctico, y en segundo lugar influye positivamente en el sabor y la calidad del vino. Los estudios sensoriales demuestran que los compuestos aromáticos producidos por las bacterias lácticas introducen cambios sensibles en las características aromáticas del vino1. Varios estudios demuestran que diversas
cepas de bacterias malolácticas producen efectos sensoriales en los vinos1,2,3,4,5, si bien todavía no se entiende perfectamente la influencia del momento de la adición bacteriana y del nivel de inoculación.
IV.1. Los tipos de vino y el momento
óptimo para la inoculación. Cómo
controlar el proceso
L
1.1 Inoculación simultánea de levadura y bacterias
La opinión generalizada en la región francesa de
Burdeos consiste en recomendar la inoculación de
bacterias lácticas una vez terminada la fermentación
alcohólica, con objeto de evitar la posible producción
de ácido acético y D-ácido láctico, una situación a
menudo denominada “piqûre lactique” (picado láctico)6. En efecto, la FML que se desarrolla durante la fermentación alcohólica puede provocar ocasionalmente la interrupción de la fermentación alcohólica. La
experiencia americana no ha confirmado los resultados franceses que constatan un incremento de la producción de ácido acético, del antagonismo de la levadura, o la interrupción de la fermentación alcohólica
cuando interviene un desarrollo temprano de bacterias lácticas. Se ha abogado por la inoculación de bacterias lácticas porque se entendía que de ese modo,
las bacterias tenían más posibilidad de desarrollarse y
aclimatarse en ausencia de etanol. De ese modo las
bacterias no sufren escasez de nutrientes, ni se ven
expuestas a los efectos tóxicos del alcohol. Beelman y
Kunkee7 han demostrado que, en presencia de azúcares fermentables, la FML no provoca necesariamente
una producción de cantidades excesivas de ácido acético por las bacterias, a condición de que la fermentación de la levadura se inicie y concluya rápidamente1.
En cambio, King y Beelman8 han sugerido que el desarrollo de Oenococcus oeni (anteriormente denominada Leuconostoc oenos) PSU-1 durante la fermentación alcohólica en un sistema de mosto modelo se
puede retrasar a consecuencia de la producción de
87
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
compuestos tóxicos derivados de la levadura distintos
del etanol y del dióxido de azufre. Al comparar las curvas de desarrollo bacteriano en cultivo puro y en cultivo mixto con levadura, han observado que la presencia de levadura de crecimiento rápido es antagónica
del desarrollo bacteriano (Figura 1). Han atribuido la
inhibición del crecimiento bacteriano a la presencia
de metabolitos de la levadura y/o a la eliminación por
la levadura de sustancias importantes para la nutrición
bacteriana. Los datos ilustrados en la Figura 1, indican
que en el cultivo mixto con levadura, el punto de transición de las bacterias de la fase estacionaria a la fase
de crecimiento logarítmico coincide con la fase de
mortandad del ciclo de desarrollo de la levadura. Este
fenómeno puede ser resultado del retorno al sistema
de nutrientes imprescindibles para las bacterias, a
resultas de la muerte y la autolisis de la levadura.
Mediante la comparación de las curvas de crecimiento de la levadura en cultivo puro y en cultivo mixto,
han podido demostrar que la presencia de bacterias
no afecta al desarrollo de la levadura durante la fase
estacionaria. Por el contrario, han observado una tasa
de mortalidad acelerada en la levadura en cultivo
mixto en presencia de un rápido desarrollo bacteriano.
Figura 1.
Desarrollo de la levadura y las bacterias en el vino, en cultivo puro y mixto
9
8
Recuentos de células viables(cfu/ml)
7
6
5
levadura
(cultivo puro)
levadura
(cultivo mixto)
bacteria
(cultivo puro)
bacteria
(cultivo mixto )
4
3
2
1
0
0
2
3
5
8
10
15
20
30
35
40
50
tiempo (días)
Sistema de Mosto/Vino 20 0B8
1.2 Producción de acidez volátil
Un intenso crecimiento bacteriano puede inhibir el
desarrollo de la levadura, lo cual, a su vez, induce la
producción de niveles excesivos de acidez volátil9. En
la Figura 2, Radler22 comunica un consumo de azúcar
de 0.2-2g durante las tres fases de crecimiento ilustradas más abajo. Durante la Fase de crecimiento I, se
pueden producir pequeñas cantidades de ácido acético y D-ácido láctico. Cuando se alcanzan recuentos
celulares de más de 5x106 cfu/ml en la Fase II, comien88
za la degradación del ácido málico, si bien durante
dicha degradación del ácido málico no se produce
ácido acético. La Fase III se caracteriza por la degradación de ácido cítrico y azúcares, acompañada de un
incremento del ácido acético. No obstante, las bacterias sólo empezarán a consumir azúcares cuando
haya terminado la degradación de ácidos orgánicos.
El ácido málico será el primero en consumirse, seguido del cítrico, el fumárico y otros10. En ese punto, la
degradación de azúcares induce un incremento significativo de la acidez volátil.
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Fermentación Maloláctica
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Figura 2.
Metabolismo de azúcares y ácidos orgánicos durante la FML en el vino
azúcares (fructosa)
biomasa
lactato
malato
citrato
acetato
CRECIMIENTO CELULAR
Catabolismo de azúcares
No hay catabolismo de malatos
No hay catabolismo de citrato
Ligera producción de acetato
Ligera producción de lactato
Fase Estacionaria I
No hay catabolismo de azúcares
Catabolismo de malato
No hay catabolismo de citrato
No hay producción de acetato
Producción de lactato
Experimentos realizados por el grupo de investigación de Lallemand han confirmado que durante el
desarrollo de las bacterias lácticas y la FML activa no
se produce ácido acético. En esos experimentos, sólo
se ha observado una producción de ácido acético
cuando ya se ha degradado la mitad del ácido málico
y las bacterias empiezan a utilizar el ácido cítrico. Los
ensayos realizados mediante la inoculación simultánea de bacterias y levadura y su comparación con la
inoculación de bacterias una vez terminada la fermentación alcohólica no han arrojado diferencias de
concentración final de ácido acético, aunque sí han
demostrado en cambio la existencia de una relación
directa entre la degradación de ácido cítrico y un
incremento de la concentración de ácido acético11.
Dependiendo de la disponibilidad de oxígeno y del
potencial de oxidación-reducción del medio, el ácido
cítrico o bien puede ser utilizado como un aceptor de
electrones, con el resultado de una producción de
ácido acético, o se puede degradar en diacetilo. La
subsiguiente reducción de diacetilo en acetoína y 2,3butanodiol también depende del potencial de oxidación-reducción del vino. Se considera que el diacetilo
es un compuesto aromático importante, y que a concentraciones comprendidas entre 0.02 y 2 mg/l,
puede conferir al vino un claro aroma de mantequilla.
El umbral gustativo de la acetoína y del 2,3-butano-
Fase Estacionaria II
No hay catabolismo de azúcares
No hay catabolismo de malato
Catabolismo de citrato
Producción de acetato
No hay producción de lactato
diol es muy superior a las concentraciones que suelen
presentar en el vino. Por lo tanto, no contribuyen al
sabor del vino. Hacen falta nuevos estudios que permitan definir con mayor precisión el efecto del oxígeno y del potencial de oxidación-reducción sobre las
concentraciones finales de final diacetilo y ácido acético en el vino. La FML en presencia de lías siempre
resulta en bajos niveles de diacetilo, debido a que el
poder reductor de la levadura viable transforma el
diacetilo en componentes menos aromáticos. Por
consiguiente, la inoculación conjunta de levaduras y
bacterias en el vino resulta en una menor presencia
de sabores lácticos y de mantequilla, es decir en tipos
de vino con una mayor carga frutal.
Lallemand, en collaboración con la Massey University
de Nueva Zelanda, ha elaborado vino utilizando una
cepa de levadura compatible con las bacterias lácticas (CY3079), y dos cepas de bacterias lácticas, Lalvin
EQ54 y Enoferm ALPHA. Para cada combinación de
levadura/bacteria, se inocularon bacterias malolácticas conjuntamente con la levadura (FA/FML simultánea) o después de terminar la fermentación alcohólica (FA/FML secuencial). El vino se elaboró con uvas
Chardonnay procedentes de un viñedo comercial en
la comarca de Fernhill de la región de Hawke's Bay de
Nueva Zelanda. Se prensó la uva, no se añadió SO2 y
89
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
el vino se estabilizó en frío a 4°C durante 24 horas, tras
lo cual se añadió 300 mg/l de fosfato diamónico. Se
realizaron las vinificaciones por triplicado en garrafones de 25 litros, y el mosto presentaba la analítica inicial siguiente: - 20.70B, pH 3.28 y 10 g/l acidez total cal-
culada como ácido tartárico. Los resultados resumidos en la Tabla 1 demuestran que la FA/FML secuencial siempre producía el resultado de una fermentación maloláctica prolongada comparada con la
FA/FML simultánea.
Tabla 1.
Prolongación de la FML en función de la secuencia de inoculación
FA/FML Simultánea
FA/FML secuencial
Cultivo láctico iniciador EQ54
26 días
74 días (quedaba ácido málico)
Cultivo láctico iniciador ALPHA
19.5 días
68 días
El ácido málico, con una concentración inicial de 5 g/l,
se degradó en unas tes semanas, un lapso idéntico al
periodo necesario para la conversión del azúcar en
alcohol durante la FA/FML simultánea. Si se inoculaban las bacterias lácticas después de la fermentación
alcohólica, la FML resultaba difícil y tardaba bastante
más tiempo en concluir. El tratamiento secuencial utilizando un cultivo láctico iniciador A, resultaba en una
FML incompleta, y quedaba 100 mg/l de ácido málico
en el vino (Tabla 1).
Durante las dos primeras semanas del experimento,
no se apreciaron diferencias significativas en la degradación de glucosa y fructosa al comparar las inoculaciones FA/FML simultánea y secuencial. Sin embargo,
a los, 20 días de terminar la FA/FML simultánea, no
quedaba ni glucosa ni fructosa detectables en el pro-
tocolo de inoculación conjunta, mientras que en las
inoculaciones secuenciales permanecía una concentración global de glucosa y fructosa de 700 mg/L.
Dado que la glucosa y la fructosa pueden servir de
fuentes de carbono y energía para muchos microorganismos, la total ausencia de estos dos azúcares
mejora la estabilidad microbiológica.
La degradación de ácido cítrico difería en los tratamientos mediante inoculaciones FA/FML simultáneas
o secuenciales. En los tratamientos simultáneos, el
ácido cítrico se degradaba más deprisa, y se producía
una cantidad de ácido acético ligeramente superior.
No obstante, las diferencias de concentraciones finales de ácido acético eran reducidas y estadísticamente significativas.
Tabla 2.
Producción de ácido acético (g/L) en función del protocolo de inoculación
FA/FML Simultánea
FA/FML secuencial
Cultivo láctico iniciador EQ54
0.195
0.147
Cultivo láctico iniciador ALPHA
0.187
0.168
El análisis sensorial de los vinos producidos en este
experimento puso de manifiesto diferencias entre los
vinos elaborados con secuencias de inoculación distintas, si bien poca o ninguna diferencia se podía atribuir
a la cepa de bacterias lácticas utilizada. Los vinos elaborados con inoculación conjunta eran más afrutados
que los vinos realizados con inoculación simultánea.
En colaboración con las estaciones de investigación
alemanas sitas en Neustadt y Trier, Lallemand investi90
gó la inoculación simultánea de levadura y bacterias
en vino Riesling. Este experimento estaba concebido
para determinar el impacto de la adición simultánea
de levadura y bacterias lácticas en los aromas del
varietal, así como la producción bacteriana de un
exceso de ácido acético. Los resultados presentados
en la Figura 3, demuestran que la inoculación simultánea de levadura y bacterias no influye en la fermentación de la levadura, y no se forma ácido acético.
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Fermentación Maloláctica
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Figura 3.
Adición simultánea de levadura y bacterias en función de la fermentación alcohólica
200
Azúcares totales (g/l)
160
Simultánea
CY3079
Después de la fermentación alcohólica
CY3079
Simultánea
EC1118
Después de la fermentación alcohólica
EC1118
120
80
40
0
0
2
6
10
14
17
21
24
28
31
35
Días a partir de la inoculación
La inoculación temprana de un cultivo láctico iniciador tenía por resultado una FML mucho más rápida, y
el ácido málico se degradaba en 23 días, comparado
con más de 50 días si la inoculación se realizaba después de la FA Figura 4. El momento de la inoculación
tuvo un impacto importante en el perfil sensorial del
vino. En el caso de la inoculación simultánea, el rápido inicio de la FML permitía una degradación del
ácido málico en las condiciones reductoras genera-
das por las células de levadura todavía activas. En el
experimento de inoculación conjunta, este medio
reductor impedía la formación de aromas lácticos o
de mantequilla, y el vino conservaba los sabores y
aromas típicos de la uva Riesling. Los vinos inoculados
después de la fermentación presentaban los sabores
a mantequilla y nuez típicos de una fermentación
maloláctica, y estaban ausentes los sabores y aromas
de la uva Riesling.
Figura 4.
Adición simultánea de levadura y bacterias en función de la fermentación alcohólica
4
Inoculación después de la
fermentación alcohólica
Ácido málico (g/l)
3
CY3079
sim AF/MLF
EC1118
sim AF/MLF
CY3079
post AF
EC1118
post AF
2
1
0
0
10
20
30
Días
40
50
60
91
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
Estos resultados demuestran que la inducción simultánea de FA/FML da lugar a vinos que terminan antes
la fermentación maloláctica. Los vinos elaborados con
este método tendrán una mayor estabilidad microbiológica porque el dióxido de azufre se puede añadir
en una fase más precoz de la elaboración y además
están ausentes los azúcares glucosa y fructosa. Esta
técnica de inducción simultánea de la FA y la FML ha
resultado muy satisfactoria en los mostos blancos de
pH bajo.
Recientemente, la literatura francesa ha mencionado
la posibilidad de inoculación simultánea12 de la levadura y las bacterias en el mosto de uva. En la región
de Champagne se ha aplicado una variación de esta
técnica para aclimatar los cultivos lácticos “normales”
durante las primeras fases del proceso “pie de cuba”. El
procedimiento utilizado en esta región consta de dos
fases, y consiste en una adición de levadura para evitar la contaminación por Lactobacillus durante la aclimatación de las bacterias lácticas deseadas. Los cultivos bacterianos utilizados en la región de
Champagne no se aclimatan durante su producción,
y por lo tanto no son aptos para su inoculación directa en el vino. Durante el proceso de aclimatación en
dos etapas, la fase 1 de reactivación va seguida de la
fase 2 “pie de cuba maloláctico” durante la cual las
bacterias lácticas se aclimatan lentamente a las difíciles condiciones del vino.
El único inconveniente del procedimiento “pie de
cuba maloláctico” es su dificultad y el tiempo que
lleva, pero la primera fase se tiene que llevar a cabo en
el laboratorio. En 1993 Michel Valade et al.13 han propuesto un protocolo de reactivación bacteriana de
aplicación más sencilla. Han adaptado las bacterias a
concentraciones crecientes cultivándolas en mosto
de uva diluido y enriquecido con nutrientes de bacteria láctica y levadura seca activa, y manteniendo el pH
controlado en una horquilla de 3.2-3.5. Este procedimiento ha sido una simplificación muy de agradecer
de la fase del “pie de cuba maloláctico”. Los autores no
han observado una producción excesiva de ácido
acético y láctico (“picado láctico”), aunque han advertido que este procedimiento de reactivación no es
comparable con la inoculación conjunta del vino. En
la actualidad, los investigadores franceses reconocen
las ventajas de la inoculación simultánea de bacterias
y levadura para la producción de vinos jóvenes diseñados para ser consumidos a los dos meses de la ven-
92
dimia. Este proceso permite a las bacterias lácticas
adquirir tolerancia al alcohol durante la fermentación
alcohólica, a la vez que permite que se inicie la FML
durante el último tercio de la fermentación alcohólica14 y que termine rápidamente al final de la fermentación alcohólica. La utilización de este método favorece una estabilización temprana de los vinos, los
hace aptos para el consumo desde fechas anteriores,
además de reducir la posibilidad de que se desarrollen organismos perjudiciales, como bacterias acéticas y hongos Brettanomyces. Esta técnica, combinada
con una nutrición satisfactoria de la levadura, garantiza una fermentación de levadura sana con una buena
cinética y permite utilizar una cepa de levadura que
ayude a la FML. Es fundamental controlar el pH del
mosto, manteniéndolo a un nivel de 3.5 aproximadamente, pues si se rebasa este techo, los azúcares se
degradan más fácilmente. No obstante, hay que
recordar que la Oenococcus oeni no degradará los
azúcares hasta que no se haya consumido la totalidad
del ácido málico.
1.3 Inoculación de cultivos lácticos iniciadores
durante la fermentación alcohólica
La ventaja de inocular las bacterias durante la fermentación alcohólica se puede explicar por el hecho de
que en esa etapa, la mayor parte del SO2 libre está
ligado por compuestos de carbonilo que se produjeron durante el crecimiento de la levadura, mientras
que la concentración alcohólica aún no ha alcanzado
niveles tóxicos. Sin embargo, en esta etapa es cuando
se pueden dar los niveles más altos de antagonismo
por metabolitos -como el ácido decanoico- inducido
por la levadura15. Rosi et al16 han comunicado una
reducción de la viabilidad bacteriana cuando la inoculación se lleva a cabo a la mitad de la fermentación
alcohólica. Han atribuido dicha reducción a factores
como el agotamiento de nutrientes, la producción de
etanol y una caída del pH provocada por la producción de ácidos. Estos resultados indican además que
si se realiza la inoculación en este momento, la fermentación someterá a las bacterias a un fuerte antagonismo con la levadura, que puede resultar insuperable. La investigación realizada en Lallemand ha confirmado estas observaciones, y ha confirmado la conclusión de que la inoculación a la mitad de la fermentación alcohólica resulta siempre en una acusada
reducción de la viabilidad y actividad bacterianas.
(Figura 5).
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Fermentación Maloláctica
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Figura 5.
Supervivencia de las bacterias lácticas después de la inoculación en distintas fases de la FA
1. 00E+ 08
Recuento de células viables (cfu/ml)
1. 00E+ 07
1. 00E+ 06
1. 00E+ 05
1. 00E+ 04
inoculación
simultánea (1g/hl)
1. 00E+ 03
inoculación a la
mitad de FA (1g/hl)
1. 00E+ 02
inoculación despues
de la FA (1g/hl)
1. 00E+ 01
1. 00E+ 00
0
20
40
60
80
Días
100
120
140
160
1999 Última vendimia Rieslaner Blanco. pH 3.3, Alcohol 12.5% v/v, 130C
1.4 Inoculación de cultivos lácticos iniciadores
después de la fermentación alcohólica
La inoculación al final de la fermentación alcohólica
no plantea el riesgo de descomposición bacteriana
heterofermentativa de los azúcares con el resultante
incremento de la acidez volátil. Este tipo de inoculación tardía evita buena parte de la toxicidad de los
ácidos carboxílicos producidos, pues su concentración disminuye después de la fermentación alcohólica17. El mérito de la inoculación al final de la fermentación alcohólica también se puede relacionar con la
disponibilidad de nutrientes bacterianos originados
por la muerte de la levadura y su autolisis subsiguiente18. No obstante, la exposición a los altos niveles de
etanol presentes en el momento de la inoculación
tardía puede causar un retraso de la FML, en especial
en los vinos producidos en climas cálidos.
Normalmente, las bacterias añadidas después de la
fermentación alcohólica son capaces de alcanzar concentraciones celulares comparables a las de las bacterias inoculadas en el mosto, siempre que las condiciones del vino no sean restrictivas. En caso de limitación
de nutrientes (véase el capítulo sobre Necesidades
Nutricionales) o cuando los parámetros químicos del
vino son limitadores, la adición de un sistema nutriente bacteriano ayuda a la FML. En los casos en que el
grado alcohólico supera un 15.5% v/v, es necesario
aclimatar los cultivos bacterianos iniciadores antes de
su inoculación en el vino. El capítulo práctico de esta
publicación presenta protocolos de aclimatación
especializados.
1.5 Demora en la inducción de la fermentación
maloláctica
Durante los últimos 15 años ha mejorado espectacularmente la calidad de los cultivos iniciadores malolácticos. Los cultivos iniciadores disponibles para su
inoculación directa en el vino son fáciles de manejar y
permiten controlar mejor la fermentación maloláctica. La utilización de estos cultivos lácticos iniciadores
de nueva generación permite tanto un inicio temprano como una rápida terminación de la fermentación
maloláctica. En la región francesa de Burdeos, o en
otras regiones vitícolas que producen principalmente
vinos de Pinot Noir, el desarrollo rápido de la FML es
contrario a las técnicas de vinificación tradicionales,
que siempre han confiado en una FML espontánea en
primavera. La utilización creciente de cultivos iniciadores lácticos de inoculación directa ha inducido una
FML más rápida, pero también ha tenido como resultado una reducción significativa de la pigmentación.
Gerbaux19 ha ilustrado la influencia del inicio temprano y la rápida culminación de la FML en la claridad y
la intensidad del color en los vinos de uva Pinot Noir
los vinos en Figura 6.
93
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
Figura 6.
Influencia de la cinética de la FML en el color del vino de Pinot Noir
30
3,5
28
3
2,5
_____ Claridad (L*)
24
22
2
20
1,5
18
16
_ _ _ _Ácido málico(g/l)
26
1
14
0,5
12
10
0
0
30
60
90
Tiempo (días)
120
150
180
Gerbaux, Enoforum Piacenza, 2005
Ha podido conseguir una mayor estabilización del
color cuando se dan las condiciones siguientes:
1. Aumento del tiempo transcurrido entre el trasiego, o eliminación de las lías de fermentación,
y el comienzo de la FML
2. Reducción de la velocidad de la FML
3. Retraso de la adición de SO2 hasta después de
terminar la FML
Por norma general, las técnicas de vinificación que
inhiben o retrasan la FML- niveles de SO2 más altos,
temperaturas por debajo de 10° C, o la adición de lisozima en cualquier etapa de la vinificación- ayudará a
estabilizar la pérdida de color en los vinos de pigmentación ligera como Pinot Noir o Sangiovese.
Los consumidores de vino de todo el mundo piden
vinos con un color estable, lo cual ha inducido un uso
creciente de la técnica de microoxigenación en la
vinificación. La microoxigenación provoca la formación de pequeñas cantidades de etanal (acetaldehído), lo cual mejora la polimerización de los polifenoles, resultando en una estabilización del color. Por
consiguiente, al terminar la micro-oxigenación, el
94
color del vino tinto se estabiliza, lo cual reduce la pérdida de color achacada a la FML. Se sabe que la microoxigenación retrasará el inicio de la FML, lo cual significa que no se debe intentar la inoculación de bacterias lácticas hasta que haya terminado la microoxigenación. Las bacterias lácticas Oenococcus oeni consumirán acetaldehído, por lo cual serán capaces de rescatar en el vino cantidades residuales de este compuesto. Por ello, la inducción de la FML después de la
microoxigenación tendrá la ventaja adicional de reducir la concentración de acetaldehído.
Cuando se utiliza la microoxidación en climas cálidos
para producir vinos tintos de alto pH, se recomienda
retrasar la inducción de la FML. Para conseguirlo, se
recomienda utilizar lisozimas20 o una combinación de
lisozima y SO2.
En conclusión, probablemente no exista un planteamiento universal para la inducción de la FML por inoculación. Como han indicado Silver y Madej21, el
momento más deseable para la inoculación depende
de todo un abanico de factores de vinificación, los
más importantes de los cuales son la composición del
mosto, la cepa de levadura utilizada para elaborar el
vino, y las técnicas de vinificación.
Informe Técnico
Fundación para la Cultura del Vino
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95
F
IV.2.
Fermentación
maloláctica
en barrica
José HIDALGO TOGORES
Dr. Ingeniero Agrónomo y Enólogo
2.1 Efectos de la fermentación
maloláctica en los vinos.
2.2 Acumulación de polisacáridos de
origen microbiano.
2.3 Pérdidas de color en los vinos
tintos.
2.4 Modificación de los aromas en los
vinos.
2.5 Práctica de la fermentación
maloláctica en barrica.
2.6 Crianza de vinos sobre lías en
depósito.
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Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
e todos es conocido los efectos que sobre los vinos produce la fermentación maloláctica (FML), pudiendo ser
beneficiosos en algunos casos, como
por ejemplo en los vinos tintos que se
destinan a crianza, donde es imprescindible lograr una buena estabilidad
biológica, que garantice su conservación en el tiempo; o bien para otros
vinos, donde la acidez málica puede
ser tan elevada, que la desacidificación
biológica es prácticamente la única
solución posible. En otros casos, este
proceso puede suponer un inconveniente, como por ejemplo en los vinos destinados a
consumo rápido, donde la presencia de ácido málico
puede ser interesante conservar, pues en concentraciones pequeñas, su existencia contribuye a mejorar
las sensaciones gustativas, así como también a mantener un nivel adecuado de acidez y frescura en los
mismos.
D
IV.2. Fermentación maloláctica
en barrica
2.1. Efectos de la fermentación maloláctica en los
vinos.
Las consecuencias positivas o negativas, que la FML
ocasiona en los vinos se resumen en los siguientes
aspectos:
• Importante disminución de la acidez total de los
vinos, que realizada de forma natural mediante
un proceso biológico, en ocasiones puede
superar una desacidificación superior al 50 por
100 de la acidez inicial, producida no solo por la
eliminación total o parcial del ácido málico, si no
también por una mayor insolubilización del
ácido tartárico contenido en el vino. Además,
las propiedades gustativas de los vinos, mejoran
notablemente no solamente por la caída de la
acidez, sino también por la desaparición de un
ácido áspero y astringente como es el málico, y
surgiendo el ácido láctico de gusto más suave y
vinoso.
• Aumento de la acidez volátil en los vinos, en
valores normales de 0,1 a 0,2 gramos/litro, debido a una posible degradación de los azúcares
residuales, o también cuando intervienen bacterias heterolácticas en el proceso, pero sobre
todo, cuando se produce la metabolización del
ácido cítrico natural de la vendimia, generalmente durante la etapa final de la FML y prácticamente cuando ya no existe ácido málico en el
medio, así como también de otros compuestos
existentes en el vino, tales como: ácido tartárico,
glicerina, ácido sórbico, etc.
97
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
• Disminución de la intensidad de color en los
vinos tintos, explicada en parte por una importante modificación de su pH, que puede implicar una modificación molecular de los antocianos, aunque sobre todo se debe a una destrucción de estas sustancias, debido posiblemente a
la hidrólisis de las moléculas de antocianos, producida por el complejo enzimático de las bacterias en la búsqueda de la parte azucarada de
estas sustancias.
• Mayor estabilidad biológica de los vinos, debido
en parte a un empobrecimiento en nutrientes o
factores de crecimiento en el medio, así como
también a una mayor presencia en el medio de
inhibidores microbianos formados por las bacterias lácticas, sustancias conocidas como “bacteriocinas”, que comunican al vino una cierta
inmunidad frente a otras posibles alteraciones
microbianas. Las bacteriocinas son compuestos
de naturaleza peptídica o proteica, habiéndose
descubierto recientemente algunas, tales como:
brevicina, caseicina, nisina, pediocina y leucocina, proponiendo su uso, bien individualizadas o
bien asociadas a otros bactericidas, para la estabilización biológica de los vinos frente a las bacterias lácticas.
98
• Modificación de aromas en los vinos, debido en
parte a una disminución de los aromas varietales, por otra parte a una atenuación o desaparición de algunas sustancias aromáticas formadas
durante la fermentación alcohólica, y por último, a la formación de diferentes ésteres y alcoholes superiores responsables de olores no
siempre agradables.
• Acumulación de polisacáridos en los vinos, procedentes de las levaduras en autolisis, así como
de las propias bacterias lácticas, que por si solas
o bien polimerizadas con los taninos, comunican al vino una agradable sensación untuosa y
de volumen.
• Degradación de los aminoácidos de los vinos
mediante su descarboxilación, produciéndose
unas sustancias tóxicas denominadas “aminas
biógenas”, tales como: la histamina que es una
sustancia alérgena derivada de la histidina, o
bien la ornitina y el carbamato de etilo derivados de la arginina, siendo la primera un inhibidor microbiano y la segunda una sustancia de
supuestas propiedades cancerígenas, o también el 2-acetil tetrahidropiridina de característico “olor a ratón” producido a partir de la lisina, o
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algunas sustancias más derivadas de otros aminoácidos: alanina, tirosina, etc. La existencia en
el vino de estas sustancias perjudiciales para la
salud humana, ha supuesto en los últimos años
el desarrollo de una tecnología suficiente para
impedir su formación en los vinos durante la
FML.
• Eventual formación de polisacáridos exocelula res, producto de determinadas bacterias lácticas, tales como: Pediococcus damnosus y
Lactobacillus brevis, que se recubren de una
sustancia viscosa de glucano derivada de la glucosa, confiriendo a los vinos un aspecto denso y
viscoso, conocido vulgarmente como “ahilado”
o “enfermedad de la grasa”, de consecuencias
desagradables pero poco graves.
Fermentación Maloláctica
propia célula, pues a través de ella se producen todos
los intercambios de nutrientes, asimilación y salida de
sustancias de desecho, así como otras funciones
reproductoras, siendo sede de moléculas responsables de interacciones celulares, como las de carácter
floculante, “killer”, etc., así como conteniendo numerosas enzimas, generalmente hidrolasas, asociadas a
la pared celular o alojadas en el espacio periplasmático. La pared celular confiere a la levadura su forma
característica, generalmente de aspecto redondeado
elíptico.
El desarrollo de la FML en barrica, frente a su ejecución en depósitos de mayor capacidad, no supone
una novedad, pues esta técnica se ha venido realizando desde tiempo inmemorial en determinadas zonas
productoras, pero los conocimientos que hoy día se
tienen sobre la misma, así como las ventajas que de
ella se derivan, hacen que sea una práctica de gran
interés para la elaboración de vinos tintos y blancos
de elevada calidad.
La FML realizada en barrica, mejora especialmente los
siguientes efectos: mayor acumulación de polisacáridos, menor pérdida de materia colorante, y mejora o
modificación del aroma de los vinos, que de forma
ordenada y sin tener en cuenta su importancia se desarrollan a continuación.
2.2. Acumulación de polisacáridos de origen
microbiano.
Las manoproteínas son unos polisacáridos parietales
de los microorganismos, existentes sobre todo en las
levaduras vínicas, cuya presencia en los vinos, les
comunica una serie de importantes mejoras sensoriales, así como también en lo referente a su estabilización. Antes de estudiar estos importantes efectos en
los vinos, para entender mejor la naturaleza de estos
compuestos, es importante conocer su localización
en las paredes celulares de las levaduras, así como
también las funciones que ellas desempeñan.
Durante el desarrollo de una fermentación alcohólica,
la población normal de levaduras que se puede
alcanzar es del orden de 100 x 106 células por ml de
mosto, que suponiendo fueran todas Saccharomyces
cerevisiae de forma elíptica y con unas dimensiones
aproximadas de 5 x 10 Ìm, representaría una superficie del orden de 18 m2 por litro de mosto; siendo este
dato conocido como “superficie de reacción”, a través
de la cual se producen todos los fenómenos vitales de
las células, y que también tiene una gran importancia
en la lisis de las levaduras, así como en la cesión de
polisacáridos al medio.
2.2.1. Estructura de la pared celular de las levaduras.
La pared celular externa de las levaduras representa el
15 a 25 por 100 de su peso seco, siendo una envuelta
de carácter rígido ligeramente elástico, teniendo por
misión asegurar la protección de los elementos que
contiene la célula, principalmente por regulación de
la presión osmótica con el medio exterior, siendo además un órgano dinámico multifuncional, donde se
desarrollan una serie de fenómenos vitales para la
99
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
La pared celular está formada por una pared externa,
así como de una pared interna o membrana plasmática, estando ambas separadas por un espacio periplásmico.
La pared celular externa se compone principalmente
de polisacáridos, destacando en un 60 por 100 los
glucanos, principalmente por β-1,3 glucano de
aspecto fibroso, encontrándose éste siempre asociado a la quitina, y
teniendo por misión la
de mantener la forma y
rigidez de la célula.
Existe un segundo β1,3 glucano de tipo
amorfo, que se asocia a
las manoproteínas, que
asegura la elasticidad
celular, y por fin un tercero β-1,6 glucano,
cuya misión es unir los
diferentes elementos
que forman la pared
celular, como si de un
cemento o cola se tratase.
En consecuencia, la pared celular externa presenta en
su cara exterior una capa de manoproteínas asociadas a una matriz de β-1,3 glucanos amorfos, así como
en su cara interna, otra capa de β-1,3 glucanos fibrosos asociados a pequeñas cantidades de quitina, quedando unidas ambas capas por medio de los β-1,6
glucanos. La rigidez y la forma de la pared celular
depende de los glucanos, mientras que su porosidad
es determinada por las manoproteínas. La composición de la pared celular
depende de las condiciones nutritivas del
medio, así como también de la edad de las
células. El glucano de la
pared celular aumenta
con la riqueza en azúcares del mosto, así como
también con la edad de
las levaduras, siendo del
mismo modo, más rica
en quitina y más pobre
en manoproteínas. La
carencia en mesoinositol
eleva la proporción de
glucanos respecto de las
manoproteínas.
Las manoproteínas se
encuentran en la pared celular externa, representando el 20 a 50 por 100 del peso seco de la pared, estando formadas por moléculas de alto peso molecular,
desde 20.000 hasta 450.000 Dalton, conteniendo
aproximadamente un 90 por 100 de manosa y el 10
por 100 restante de péptidos. Estructuralmente se
encuentran unidas a los glucanos amorfos antes citados, pudiendo ser separados de éstos por hidrólisis
enzimática con β-glucanasas.
Por último, también se encuentra la quitina que, de
forma minoritaria ocupa el 1 a 2 por 100 de la pared
celular externa, encontrándose asociada a los glucanos a los que les comunica rigidez, localizándose en
mayor concentración en los “cráteres” o cicatrices
externas de gemación de las levaduras, donde asegura un cierre perfecto para la pared celular.
100
El espacio periplásmico se sitúa entre la pared celular
externa y la membrana plasmática, donde se encuentran algunas enzimas vitales para las células, destacando la invertasa capaz de desdoblar la sacarosa en
glucosa y fructosa, u otras diversas enzimas (β-glucosidasa, α-galactosidasa, melibiasa, aminopeptidasa,
esterasa, etc.), así como enzimas importantes para el
crecimiento de las levaduras o su gemación: ‚-glucanasas del tipo 1,3 y 1,6 cuya máxima concentración se
encuentran en la fase de crecimiento exponencial de
las levaduras, y que enológicamente tienen un gran
interés por ser responsables de la autolisis de las paredes de las levaduras cuando permanece un vino
sobre sus lías, conservando esta actividad algo más
atenuada meses después de terminar la fermentación
alcohólica.
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Fermentación Maloláctica
Por último, la membrana plasmática situada hacia en
interior de las células, constituye una barrera selectiva
que controla los intercambios entre la levadura y el
medio exterior, siendo por tanto un órgano esencial
para la vida de éstas. Contiene aproximadamente un
40 por 100 de lípidos y un 50 por 100 de proteínas,
mientras que las manoproteínas y los glucanos tan
solo suponen un 5 por 100.
Los principales fosfolípidos de estas membranas son:
la fosfatidil-etanolamina (FE), el fosfatidil-colina (FC) y
el fosfatidil-inositol (FI), que representan un 70 a 85
por 100 del total, existiendo además otros como: la
fosfatidil-serina (FS) y el difosfatidil-glicerol o cardiolipina (FG). Los fosfolípidos son compuestos de 1,2-diacilglicerol y un enlace fosfodiéster que une el esqueleto del glicerol a algunas bases, como colina, inositol,
serina y etanolamina. Los ácidos grasos situados en la
posicón 1 del glicerol son mayoritariamente saturados, mientras que los situados en la posición 2 son
insaturados; teniendo siempre un número par de átomos de carbono en su molécula, siendo los de 16 a 18
los más abundantes, pudiendo estar saturados como
el ácido palmítico y el ácido esteárico, o bien insaturados como el ácido oleico y el ácido linoleico. Según
las condiciones ambientales (oxígeno, temperatura,
etanol, etc.) predominantes en el medio de crecimiento, las levaduras pueden sintetizar ácidos grasos
de cadena mediana (C6 a C12) o de cadena larga (C14
a C18) saturados o insaturados.
Todos los fosfolípidos poseen una parte polar o hidrófila de alcohol fosforilado, y otra no polar o hidrófoba
formada por dos cadenas paralelas de ácidos grasos,
que se estructuran en la membrana en forma de doble
capa, con las cabezas polares situadas hacia el exterior
y unidas por las colas no polares, dentro de las cuales
se encuentran fuertemente asociadas las proteínas
membranarias. La superficie de esta membrana toma
una característica forma ondulada o rizada.
Las proteínas de las membranas o glicoproteínas, tienen un peso molecular entre 10.000 a 120.000 Dalton,
pudiendo ser de tipo intrínseco situadas en el interior
de la doble capa lipídica antes mencionada y asociadas a la parte no polar, o bien de tipo extrínseco ubicadas hacia el exterior de la membrana. Entre estas
proteínas destacan la adenosintrifosfatasa (ATPasa),
teniendo por misión transportar los solutos (azúcares,
aminoácidos, etc.) a través de la membrana plasmática. La fluidez de paso de la membrana depende de la
composición en los ácidos grasos de los fosfolípidos y
la cantidad de esteroles que también contiene.
Cuando las colas de los fosfolípidos están situadas
ordenadas, la membrana se torna más rígida e impermeable, mientras que cuando se desordenan, ésta se
convierten más permeable, dependiendo una u otra
forma de la temperatura del medio fermentativo.
En cuanto a los esteroles, el más importante es el
ergosterol, siendo sintetizados exclusivamente en las
mitocondrias, en condiciones de aerobiosis durante la
fase de crecimiento de las levaduras. Se encuentran
situados en la membrana plasmática y unidos a los
fosfolípidos. La presencia de ergosterol permite la
penetración de los azúcares dentro de la célula, siendo por lo tanto un factor de importancia en el correcto desarrollo de la fermentación alcohólica. Del
mismo modo, el enriquecimiento de los fosfolípidos
membranarios en ácidos grasos insaturados, como
los ácidos oleico y linoleico, favorecen la permeabilidad de la membrana plasmática, y por lo tanto también el intercambio de sustancias con el medio exterior. La presencia de etanol en cantidades crecientes,
en ocasiones también impermeabiliza la pared celular. Por último, la temperatura baja durante la fase de
crecimiento de la levaduras, aumentan el contenido
en ergosterol en la pared celular, y por lo tanto asegura el desarrollo y final de la fermentación. Sin embargo, la temperatura baja reduce la permeabilidad celular, y por lo tanto, limita los fenómenos de intercambio entre el interior y el exterior de las células.
101
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
2.2.2. Autolisis de las levaduras.
El concepto autolisis de las levaduras define la autodegradación enzimática de las distintas partes de las
mismas, que comienza inmediatamente después de
la muerte de las células, cuando cesa su actividad. La
degradación de las membranas de las levaduras,
comprende por una parte la liberación de las enzimas
de hidrólisis acumuladas en el espacio periplásmico
de la pared celular, y por otra la destrucción de los
componentes de las paredes, permitiendo el vertido
de los compuestos autolizados hacia el exterior.
La autolisis comprende tres aspectos diferentes, el primero una liberación de aminoácidos por proteolisis
debido a un efecto de las enzimas proteolíticas contenidas en las mismas levaduras, cuya actividad se ve
bastante reducida por la acidez del vino, pero que
podría ser más importante si el pH del medio fuera
superior. Así a un valor de pH de 3,0 los aminoácidos
liberados durante la autolisis representarían solamente el 13 por 100 del nitrógeno total liberado, mientras
que a un pH de 5,0 supondrían un 60 por 100. El
segundo una formación de compuestos volátiles, que
participan en el aroma de los vinos, los cuales serán
descritos posteriormente. Y el tercero se refiere a la
degradación de las paredes celulares de las levaduras,
produciéndose una fuerte actividad enzimática debida principalmente a la intervención de
β-glucanasas existentes en el espacio periplásmico,
que hidrolizando los glucanos liberan las manoproteínas contenidas en la pared celular externa, según el
mecanismo descrito a continuación. Durante este
proceso se produce un engrosamiento de un 10 por
100 de la pared celular, mientras que el espesor de la
capa polisacarídica, o cara externa de la pared celular,
aumenta del orden de un 26 por 100, empobreciéndose ésta en aminoácidos, enriqueciéndose en hexosas por la actividad enzimática, y aumentando fuertemente la relación manosa / glucosa.
102
La autolisis de las levaduras se desarrolla en las
siguientes etapas: primera, una fase de activación que
desorganizando las endoestructuras celulares libera las enzimas
de hidrólisis contenidas en la
pared celular. Segunda, un desprendimiento de manoproteínas
de cadenas cortas unidas covalentemente al glucano en las
paredes internas de las levaduras. Tercera, una liberación de
manoproteínas de alto peso
molecular procedente de la zona
periplásmica de la célula. Y cuarta, una posible degradación de
estas sustancias liberadas en el
medio, interviniendo enzimas
glucanasas, manosidasas, y proteasas.
La liberación de estos polisacáridos de las paredes de las células
se produce por la acción de enzimas parietales: endo-β-(1→3) y endo-β(1→6) glucanasas, estando localizadas éstas en el espacio periplásmico de las paredes celulares, presentando una
importante actividad durante la fermentación alcohólica, sobre todo en la fase de crecimiento exponencial de las levaduras, y un contendido cada vez más
debilitado durante algunos meses después de la
misma. La autolisis de las levaduras durante la conservación de los vinos sobre sus lías, conduce a una liberación de las manoproteínas fijadas sobre el glucano
de las paredes celulares, así como una hidrólisis parcial de las glucomanoproteínas, siendo estos compuestos resultantes muy solubles en medios acuosos
como es el vino. Las manoproteínas pueden ser
degradadas por enzimas tales como: exo-(1→6)-α-Dmanosa, exo-(1→2)-α-manosa y α-D-manosidasa.
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Las manoproteínas excretadas por las levaduras
durante la fermentación alcohólica, especialmente
durante la fase de crecimiento exponencial, no poseen las mismas propiedades que las formadas por
hidrólisis de las enzimas parietales por la autolisis de
las levaduras, siendo éstas últimas las que poseen
efectos protectores frente a los enturbiamientos proteicos y a las precipitaciones tartáricas, debido a que
poseen una masa molecular cercana a los 30.000
Dalton.
Fermentación Maloláctica
con unas 150 a 250 unidades de manosa muy ramificadas a su vez con otras cadenas laterales de manosa
más cortas de una a tres unidades, unido a la cadena
peptídica sobre la asparagina mediante un enlace Nglicosil y haciendo intervenir dos unidades de N-acetil-glucosamina. Recientemente se ha descubierto
otra cadena lateral de glucomanano, así como también otra cadena de etanolamina-fosfato-manosamanosa-manosa-glucosamina-inositol-fosfolípido,
que se unen del mismo modo a la cadena peptídica
principal.
La autolisis de las levaduras en los
vinos puede ser muy rápida en
medios de pH 4,5 a 5,0 y a temperaturas de 35º a 40º C, mientras que en las
condiciones reales de los vinos, con
valores de pH entre 3,0 a 3,5 y temperaturas inferiores a 15º C, se puede
realizar en un plazo de 2 a 3 meses o
más, intensificándose la autolisis si
periódicamente se agitan las lías,
como se hace con el “bâttonage” en la
crianza de ciertos vinos blancos y tintos en barrica o depósito. La liberación de estos polisacáridos también
puede ser activada, mediante la adición de preparados específicos de
levaduras inactivas ricas en enzimas
glucanasas, o también mediante la
adición de la propia enzima β-1,3 glucanasa sintetizada, cuya tecnología se
tratará posteriormente.
Las bacterias lácticas también son
capaces de ceder al vino compuestos
polisacáridos parecidos a las manoproteínas de las levaduras cuando se
produce su destrucción por autolisis,
ya que estas sustancias también se encuentran en sus
paredes celulares, aunque la cantidad de estos polisacáridos cedidos al medio es muy inferior al procedente de las levaduras. Sin embargo, durante la FML en
presencia de lías o restos de la fermentación alcohólica, las bacterias lácticas son capaces de acelerar la
destrucción de las paredes celulares de las levaduras
contenidas en las lías, debido posiblemente a la
acción de enzimas β-glucanasas formadas por las
bacterias, con el propósitos de proveerse de los factores de crecimiento contenidos en la masa de levaduras muertas: proteínas, aminoácidos, minerales, etc. y
especialmente de los glucanos parietales.
2.2.3. Las manoproteínas: composición y propiedades.
La estructura de las manoproteínas se encuentra formada por una cadena peptídica lineal, llevando por
un lado otras cadenas más cortas de una a cuatro
moléculas de manosa, unidas a la cadena peptídica
por enlaces O-glicosil sobre la serina y treonina, y por
otra parte de un ·-D-manano de alta masa molecular,
Las manoproteínas constituyen el 25 a 50 por 100 de
la pared celular de las levaduras, pudiendo encontrarse en los vinos en cantidades de hasta 100 a 150 mg
/ litro, y de acuerdo con la siguiente composición:
• Manoproteínas mayoritarias en un 80 por 100
del total, que contienen un 90 por 100 de
manosa y un 10 por 100 de proteínas, estando
su masa molecular oscila de 100.000 a 2.000.000
Dalton.
• Glucomanoproteínas minoritarias en un 20 por
100, conteniendo un 25 por 100 de glucosa, 25
por 100 de manosa y 50 por 100 de proteínas,
encontrándose su masa molecular entre 20.000
a 90.000 Dalton.
La presencia de estos polisacáridos en los vinos blancos o tintos, presenta una serie de importantes efectos, que por un lado afectan a las características sensoriales de los vinos, y por otra parte a la estabilidad
de los mismos.
103
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
Mejora gustativa de los vinos.
La presencia de polisacáridos en los vinos aumenta la
sensación de volumen y untuosidad en la boca, apareciendo a veces tonos dulces más patentes en los
vinos blancos.
Del mismo modo, la presencia de las lías reduce el
contenido en taninos elágicos procedentes de la
madera de roble, bien por fijación de estos compuestos sobre la paredes de las levaduras, o bién por su
combinación con las manoproteínas liberadas por las
levaduras; aunque también éstas se pueden unir a los
taninos más simples y reactivos provenientes de vendimia, obteniéndose unos taninos polimerizados,
conocidos como “buenos taninos” o “taninos dulces”,
sensorialmente muy similares a los existentes en las
vendimias de buenas añadas de los grandes vinos. La
autolisis de las levaduras, produce un enriquecimiento del medio en aminoácidos y ácidos nucleicos,
comportándose como sustancias exaltadoras del
sabor, y en consecuencia mejorando la fase gustativa
del vino.
Estabilización de las precipitaciones tartáricas, protei cas y de color.
La presencia de estos polisacáridos en los vinos, proporciona una cierta estabilidad frente a las precipitaciones tartáricas y proteicas, como si de “coloides
protectores” se tratase.
Las manoproteínas formadas por las levaduras
en la fase de fermentación, así como los residuos de arabinogalactanos II procedente de la
hidrólisis de sustancias
pécticas, no tienen efecto alguno sobre la insolubilización de tartratos;
mientras que los ramnogalacturonanos II y las
manoproteínas de autolisis de microorganismos,
son capaces de frenar o
impedir dichas precipitaciones.
Cuando el contenido en ramnogalacturonano II es
inferior a los 30 mg / litro, como en el caso de los vinos
blancos comunes, puede ser un activador de la nucleación de estas sales, pero cuando excede los 100 mg /
litro, como en los vinos tintos o en los blancos fermentados en barrica, se comporta al igual que las manoproteínas, como inhibidor de la nucleación y crecimiento de los cristales de tartratos. Esta propiedad es
de tal interés enológico, que se está estudiando la utilización de manoproteínas “exógenas” para el tratamiento de estabilización de los vinos.
Por otra parte, las arabingalactan-proteínas II y las
manoproteínas, procedentes tanto de las levaduras
de fermentación, como de su autolisis, también presentan un efecto inhibitorio frente a las precipitaciones proteicas de los vinos, así como estabilizante de la
materia colorante en estado coloidal. Estas propiedades protectoras se deben a su carácter fuertemente
hidrófilo, que las hace ser unas sustancias muy solubles y estables en soluciones hidroalcohólicas como
es el vino, e impidiendo la formación de agregados,
algo parecido al efecto producido por otro poliósido
autorizado en el tratamiento de vinos, como es la
goma arábiga, mezcla de arabinogalactanos II y arabinogalactan-proteínas II.
Conservación de aromas varietales en los vinos.
Independientemente de las sustancias aromáticas
que pueden formarse o modificarse durante una FML
en barrica o en depósito, las manoproteínas pueden
secuestrar los aromas varietales en su estructura tridimensional, conservándolos de este modo más tiempo en los vinos.
104
Estos poliósidos son bastante resistentes a las degradaciones enzimáticas, siendo difícilmente metabolizados por los microorganismos del vino, e incluso
tambien las manoproteínas poseen un efecto activador de las bacterias lácticas del género Leuconostoc,
que puede ser interesante para el desarrollo de la
FML, aunque perjudicial para otras posibles alteraciones de los vinos.
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Mejora del color en los vinos blancos.
Por una parte, la fijación de los compuestos fenólicos
oxidables del vino blanco, bien sobre las paredes de
las levaduras, o también con las manoproteínas producida por su autolisis, limitan el sustrato oxidable del
vino, y en consecuencia también su oxidación.
Pero por otra parte, durante la estancia en barrica del
vino sobre sus lías, el oxígeno que penetra a través de
la madera o de las manipulaciones del vino, como los
trasiegos o rellenos, compensa la capacidad reductora
de las lías, evitando de este modo la aparición de olores azufrados desagradables, y al mismo tiempo la oxidación del vino, resultando entonces unos vinos blancos aromáticamente correctos y de una sorprendente
coloración pálida.
Fermentación Maloláctica
de oxidación-reducción es más elevado, pudiendo
entonces oxidarse excesivamente el vino; mientras
que si son usadas, con más de dos a tres años de
edad, el potencial oxidación–reducción desciende,
pudiendo entonces aparecer olores anormales de
reducción producidos por las lías. Una buena norma
puede ser renovar las barricas cada 2 a 3 años, introduciendo un medio o un tercio de barricas nuevas, y
manteniendo el resto de barricas con la edad proporcional.
La estancia sobre lías diminuye la posibilidad del
defecto del “enrojecimiento oxidativo” de los vinos
blancos, caracterizado por la aparición de un tono gris
rosáceo en vinos ligeramente oxidados, no procediendo este color de una posible contaminación de
antocianos, y por lo tanto tampoco puede ser decolorado por el anhídrido sulfuroso o por una modificación del pH, aunque sí por la exposición de las botellas de vino a la luz solar. Los tratamientos de clarificación con caseína o PVPP, tampoco son eficaces. La
sustancia responsable no es conocida, siendo sin
embargo absorbida por las lías de fermentación, o
por el contrario prevenir su aparición con la adición
de ácido ascórbico en la fase previa del embotellado
(100 mg / litro). Existe un test que mide el índice de
sensibilidad al enrojecimiento oxidativo, que consiste
en medir el vino en un espectrofotómetro a 500 nm
de longitud de onda, antes y después de 24 horas de
adicionar agua oxigenada, multiplicando por 100 el
valor diferencial alcanzado. Cuando este valor es
superior a 5, entonces existe un riesgo de enrojecimiento oxidativo en el vino blanco analizado.
2.3. Pérdidas de color en los vinos tintos.
El equilibrio entre la oxidación y reducción se consigue manteniendo el parque de barricas con una edad
adecuada, pues cuando éstas son nuevas, el potencial
Durante la FML se produce una disminución de la
intensidad de color en los vinos tintos, motivada por
un desequilibrio de las moléculas de antocianos debido a una modificación del pH, así como también por
una destrucción de estas sustancias, debido posiblemente a la hidrólisis de las moléculas de antocianos,
producida por el complejo enzimático de las bacterias lácticas en la búsqueda de la parte azucarada de
las mismas.
105
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
En la actualidad, la investigación enológica está buscando paliar este importante efecto negativo en los
vinos tintos, encontrando algunas posibles soluciones, como la utilización de levaduras genéticamente
modificadas para la eliminación del ácido málico
durante la fermentación alcohólica, y sin que ello
suponga una pérdida de color en los vinos. O bien utilizando la técnica de micro-oxigenación del vino tinto
antes de la FML, buscando la polimerización y estabilización de los antocianos con los taninos, antes de
que ésta se desarrolle y cause una disminución de la
intensidad de color, mediante la aplicación de una
dosis de 10 a 25 ml de oxígeno por litro de vino y por
mes.
La FML de los vinos tintos realizada en barrica, produce del mismo modo una estabilización del color, y en
consecuencia evita una caída de la intensidad colorante, ya que al introducir el vino en las barricas,
comienza a penetrar aire a través de la madera a razón
de 2 a 4 mg de oxígeno por litro de vino y por mes,
produciéndose una polimerización de los antocianos
y taninos de tipo “puente etilado”; donde el etanal o
acetaldehído que contiene el vino procedente de la
oxidación del etanol en presencia de polifenoles o de
iones Fe3+ o Cu2+, o bien de la descarboxilación del
ácido pirúvico, reacciona con las valencias negativas
de los taninos en las posiciones 4 y 8, así como también con los antocianos en la forma carbinol (AOH)
neutra.
El polímero formado es de color rojo-malva muy estable, de tono vivo al principio y evolucionando con el
tiempo hacia un matiz más oscuro llamado como
“rojo sombra” o rojo picota. Este es uno de los motivos
de realizar este proceso en barricas nuevas o seminuevas, donde la penetración del oxígeno a través de
la madera es la que exactamente corresponde para
realizar el proceso de polimerización antes descrito.
Se ha estudiado durante la crianza de los vinos sobre
106
lías, el efecto protector de la morfología de las levaduras por los polifenoles, pues en ausencia de éstas sustancias las levaduras adquieren rápidamente una
forma aplastada hacia el final de la fermentación alcohólica, mientras que cuando existen polifenoles en el
medio, las levaduras permanecen esféricas, emitiendo la hipótesis de que los compuestos fenólicos protegen las paredes de la levaduras frente a la hidrólisis
enzimática, y dificultan en consecuencia la cesión de
manoproteínas al vino.
2.4. Modificación de los aromas en los vinos.
Durante la FML se produce una modificación de los
aromas de los vinos, debido en parte a una disminución de los aromas varietales por una degradación o
hidrólisis de los compuestos aromáticos de la uva; por
otra parte a una atenuación o desaparición de algunas sustancias aromáticas agradables formadas
durante la fermentación alcohólica, donde destacan:
3-metil-n-butilacetato, n-hexilacetato, 2-fenil-etilacetato y 2-etil-n-hexanoato; y por último a la formación
de diferentes ésteres, como el acetato de etilo de
inconfundible olor a pegamento, o el lactato de etilo
de olor lácteo, o bien los alcoholes superiores como:
n-propanol, 2-butanol y n-hexanol de olor más pesado y grosero. Pero quizás el compuesto aromático
más característico que se forma durante la FML es el
diacetilo o 2,3-butanodiol, formado a partir de la
degradación del ácido cítrico por las bacterias lácticas, y con un inconfundible olor a mantequilla, perceptible por encima de los 5 a 7 mg/litro.
El anhídrido sulfuroso reduce el contenido en diacetilo, debido a una interacción entre ambas sustancias,
atenuándose el impacto olfativo, que puede aparecer de nuevo cuando se reduce el nivel de sulfuroso.
Las poblaciones reducidas de bacterias lácticas, la
presencia de oxígeno en el medio, los valores de pH
bajos y la temperaturas reducidas, ralentizan la FML y
en consecuencia contribuyen a elevar el nivel de diacetilo en los vinos. Por el contrario, el contacto del
vino con las lías, así como la presencia de azúcares
residuales en el mismo, disminuyen la formación de
esta sustancia.
Por otra parte, la autolisis de las levaduras también
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genera la formación de compuestos volátiles, que
participan en el aroma de los vinos, donde destacan
cuantitativamente y cualitativamente, los ésteres
pesados de los ácidos grasos de cadena larga; así
como los alcoholes terpénicos como el linalol, α-terpineol, citronelol, geraniol y farnesol; también los
alcoholes superiores, como el alcohol isoamílico y el
fenil-2-etanol, y sus aldehídos, citando el metil-3butanal de olor herbáceo y el benzaldehído de aroma
a almendras amargas; las lactonas como la α-decalactona de olor a melocotón y nuez de coco y el 3-hidroxi-4,5-dimetil-5-furanona o sotolón de aroma a nuez
que aparece patente en los vinos criados bajo velo de
levaduras; y por último los compuestos azufrados
volátiles, u otras sustancias, como el vitispirano, que
es un derivado norisoprenoide de aroma alcanforado
o eucalipto.
Por último, la madera de roble y sobre todo su interacción la FML, hacen que aparezcan en el vino sustancias aromáticas agradables procedentes de este
material. Los compuestos cedidos por la madera de
roble se ven muy atenuados, por una parte los taninos por su combinación con los polisacáridos de las
paredes celulares, y por otra parte algunas sustancias
aromáticas son reducidas por las levaduras perdiendo
el carácter aromático, especialmente la vainillina y los
aldehídos furánicos de aromas tostados. Mientras que
otros compuestos, como el eugenol de aroma especiado o la β-metil-γ-octolactona de aroma a coco no
se ven afectados. La consecuencia es un vino de
menor carácter maderizado, así como de boca más
suave e integrada. Las bacterias lácticas consumen
cantidades notables de vainillina de la madera de
roble, lo que explica su contenido inferior en los vinos
que han realizado la FML en barrica.
Recientemente se ha comprobado que, la presencia
de lías en la barrica, favorece la síntesis de furfuriltiol,
sustancia de agradable aroma a café tostado, muy
característico de los vinos que se elaboran por FML en
barrica; el cual procede de la reacción del sulfuro de
hidrógeno (SH2) con el furfural contenido en la madera tostada, favoreciendo en consecuencia la aparición
de este compuesto en las barricas nuevas. Sin embargo, durante la estancia del vino sobre sus lías, las enzimas glucanasas pueden producir una liberación de
aminoácidos y glucosa, llegando esta última sustancia hasta concentraciones de 500 a 900 mg / litro,
pudiendo incidir en el desarrollo de levaduras del
género Brettanomyces de nefastas consecuencias
para el vino almacenado en la barrica.
Fermentación Maloláctica
2.5. Práctica de la fermentación maloláctica en
barrica.
No se debe confundir la técnica de fermentación de
mostos blancos en barrica, con la de FML en barrica
generalmente de vinos tintos, pues aunque con
ambos métodos se consigue unos efectos sensoriales
muy parecidos originados por la autolisis de las levaduras; en la primera se trata de realizar la fermentación alcohólica de un mosto blanco dentro de un
envase de madera, seguido de una estancia del vino
sobre sus lías, con o sin FML posterior, y buscando
obtener como principal fin, unas mayores sensaciones de volumen y complejidad en la boca; mientras
que con la segunda se pretende conseguir, además
de una mayor estructura gustativa, otros objetivos
sensoriales diferentes, como son la estabilización del
color del vino tinto, así como la adquisición de aromas agradables muy particulares, mediante la FML
del vino en envases de madera de similares características, y también seguido de una permanencia del vino
sobre sus lías.
Un primer aspecto técnico a tener en cuenta para la
FML en barrica son las características fisico-químicas
que debe reunir el vino tinto. Este deberá poseer unas
mínimas condiciones cualitativas, sobre todo en lo
referente a la calidad de la vendimia, así como también a su grado de maduración, partiendo de vinos
sanos y bien elaborados, mejor dotados de una elevada carga de fruta, y presentando una analítica y
estructura fenólica suficiente, que podemos resumir
en las siguientes condiciones:
• Indice de polifenoles totales (IPT) superiores a
60 o 70.
• Intensidad de color (IC) superior a 10 o 12.
• Riqueza en antocianos superior a 600 o 800
mg/litro.
• Riqueza en taninos superior a 3 o 4 gramos/litro.
• Relación antocianos / taninos de 1 / 4 a 1 / 5.
• Nivel de dióxido de azufre lo más bajo posible.
• Acidez total superior a 5 o 6 gramos / litro en
ácido tartárico.
• Valores de pH los más bajos posible y siempre
inferiores 4.
• Acidez volátil moderada y siempre inferior a 0,5
a 0,6 gramos / litro.
• Ausencia de azúcares residuales.
El vino tinto deberá introducirse lo más íntegro posible, es decir con toda la carga de lías que pudiera contener como consecuencia de la fermentación alcohólica, con objeto de disponer de la mayor masa posible
de levaduras para su posterior autolisis. Lógicamente,
en el caso de desear la extracción de un nivel de
manoproteínas más reducido, entonces será posible
realizar el correspondiente trasiego, consiguiendo la
eliminación parcial de las lías gruesas, y prestando
siempre atención para no airear en exceso el vino,
107
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
pues esto dificultaría el posterior arranque de la FML.
Un criterio que puede seguirse en este sentido es el
de eliminar las lías más pesadas de tamaño superior a
las 100 μm, compuestas principalmente de restos
vegetales de la vendimia y después de una sedimentación de 24 a 48 horas, conservando las lías gruesas
y finas de tamaño inferior a 100 μm, compuestas principalmente de levaduras.
Con el fin de facilitar el arranque de la FML, algunos
enólogos conservan el vino con sus lías en depósito,
y esperan que éste inicie la FML, para inmediatamente trasegarlo sin aireación y con todas sus lías hacia las
barricas. De este modo se vence la dificultad que ofrece el arranque de este proceso en pequeños envases
de madera, donde por una parte el vino se puede
enfriar, y por otra parte, la posible entrada de aire
debido a la operación de trasiego, o bien al que penetra a través de la madera, dificultan el desarrollo y la
actividad de las bacterias lácticas. Sin embargo, esta
forma de operar no es muy conveniente, pues se pierde parte del efecto de protección del color que se
busca con la FML en barrica, ya que se reduce el tiempo necesario para la polimerización de antocianos y
taninos, cuya reacción de por sí es bastante lenta.
Un segundo aspecto a tener en cuenta es el tipo de
envase a utilizar, debiendo siempre tratarse de barricas nuevas, o a los sumo seminuevas, donde se posibilite la entrada de aire en los anteriormente citados
valores de 2 a 4 mg de oxígeno por litro de vino y por
mes, y utilizando diferentes tipos de maderas y grados
de tostados, en función de los gustos particulares de
cada elaborador. Sin embargo siempre es aconsejable
para este tipo de elaboraciones, utilizar maderas bastante tostadas, para favorecer la síntesis del furfuriltiol,
una sustancia de agradable aroma a café con leche,
cuyo origen se detalla más adelante.
El volumen del envase tiene también una gran importancia, pues debe facilitarse en la medida de lo posible, el contacto de las lías con el vino. En los recipientes de gran volumen, la superficie de contacto líasvino es muy limitada, sin embargo, cuando se utiliza
una barrica, esta superficie es
más elevada.
108
Así para un depósito de 200 hl, la superficie lías-vino
situadas en el fondo del mismo es del orden de 2 a 3
cm2 / litro, mientras que para una barrica bordelesa
de 225 litros es de 5 a 10 cm2 / litro.
Para aumentar esta superficie de contacto, se procede al removido periódico de las lías después de terminar la FML, mediante una operación conocida como
“bâtonnage”, realizada durante el tiempo de contacto
que se crea oportuno, en general de 4 a 8 meses, y
con una periodicidad suficiente de 3 a 7 días. Para realizarla, existen diferentes herramientas de “bâtonnage”, desde simples listones de madera o metal, hasta
complicados sistemas de agitación; siendo un buen y
sencillo sistema de removido, el rodado o girado de la
barrica en un ángulo 180º, realizado en el primer caso,
directamente sobre el suelo, lo que supone un
pequeño desplazamiento de la barrica, o en el segundo caso, utilizando un durmiente especial dotado de
un juego de cuatro pequeñas ruedas.
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La operación de “bâtonnage”supone poner las levaduras en suspensión en el vino, consiguiendo de esta
forma, una superficie de contacto lías-vino elevadísima, del orden de 18 m2 / litro o 180.000 cm2 / litro,
muy superior a las conseguidas con un mero contacto estático. A las pocas horas de realizar esta operación, las lías se vuelven a depositar en el fondo del recipiente, lo que implica realizar su removido de forma
periódica, con los plazos anteriormente señalados.
Otra razón que obliga a la utilización de envases de
pequeño volumen, es la influencia que tiene el tamaño del recipiente en la aparición de olores azufrados
defectuosos, pues las lías situadas en el fondo de
envases de gran capacidad, hace que las lías sean
comprimidas y entonces se favorezca la aparición de
estas sustancias. Sin embargo, separando temporalmente las lías del vino y alojándolas en barricas
durante un mes, se logra atenuar su actividad sulfitoreductasa, pudiendo ser luego reincorporadas al vino
y evitar de este modo la aparición de olores azufrados,
especialmente del sulfuro de hidrógeno y del metanotiol. La pérdida progresiva de la aptitud de las lías
de liberar compuestos azufrados, puede explicar
entre otros factores, la posibilidad de mantener vino
sobre sus lías en barricas o bien en depósitos de
mayor volumen.
Fermentación Maloláctica
Durante el desarrollo de la FML en barrica, es conveniente que las barricas no estén llenas del todo, respetando un espacio de un 5 a 10 por 100, pues debido
al metabolismo de las bacterias lácticas, siempre de
produce un desprendimiento de gas carbónico, y
además se debe evitar el derramamiento del vino
cuando se introduce el dispositivo de “bâtonnage”, y
mejor colocando un sistema de cierre semihermético,
existiendo tapones específicos para esta operación.
Un tercer aspecto a contemplar son las condiciones
ambientales ideales para el desarrollo de la FML en
barrica, pues por una parte deben posibilitar la actividad de las bacterias lácticas, y por otra parte mantener el ambiente adecuado para permitir una buena
estancia del vino en barricas. Durante la FML, el factor
ambiental más importante es la temperatura, que
deberá estar comprendida entre los 18º a 22º C, para
lo que se recurre generalmente a la climatización de
la sala de barricas, e incluso llegando a la instalación
de suelos radiantes en una zona de la bodega.
Sin embargo, cuando la FML termina, las condiciones ambientales
deben cambiar radicalmente, pues
en primer lugar es conveniente
bajar la temperatura del vino bruscamente, hasta alcanzar valores
comprendidos entre 5º a 10ºC, buscando inhibir la actividad bacteriana, para en segundo lugar, después
alcanzar temperaturas entre 12º a
15º C que permitan unas buenas
condiciones de crianza del vino,
acompañado de otras muy importantes como: humedad relativa no
superior de 70 a 80 por 100, ausencia de olores extraños, poca o nula
iluminación, etc.
109
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
La autolisis de las levaduras en los vinos puede ser
muy rápida en medios de pH 4,5 a 5,0 y a temperaturas de 35º a 40º C, mientras que en las condiciones
reales de los vinos, con valores de pH entre 3,0 a 3,5 y
temperaturas inferiores a 15º C, se puede realizar en
un plazo de 2 a 3 meses o más, intensificándose la
autolisis si periódicamente se agitan las lías.
Un cuarto aspecto a tener en cuenta es la utilización
de cultivos seleccionados de bacterias lácticas, obtenidas industrialmente en forma líquida, congelada o
liofilizada, y preparadas de forma sencilla para su adición al vino, en unos casos mediante una protocolo
de reactivación, o bien en la actualidad mediante su
adición directa (“one-step”). La bacteria láctica seleccionada más utilizada es la Oenococcus oeni, antiguamente llamada Leuconostoc oenos, que contienen
una población de 1 x 1011 a 1 x 1012 bacterias vivas por
gramo, lo que supone una dosis del orden de 30 a 50
mg / litro, que asegura la siembra de una población
de 1 a 10 millones de células por ml y creciendo en el
medio hasta unos 50 millones de bacterias por ml de
vino.
La inoculación de bacterias seleccionadas impide el
desarrollo de las bacterias lácticas salvajes, que pueden tener un efecto negativo sobre la calidad del
vino, especialmente en la acidez volátil, y debida al
desarrollo de bacterias lácticas salvajes de los géneros
Lactobacillus y Pediococcus. Además, las bacterias
lácticas seleccionadas suelen ser criotolerantes, desarrollándose bien a temperaturas de 13º a 14º C, lo
que evita el calentamiento de los vinos, y permite un
desarrollo de la FML lenta y a baja temperatura, conservando mejor los aromas varietales de los vinos y
reduciendo las pérdidas de materia colorante en los
vinos tintos. La inoculación con cantidades elevadas
de bacterias lácticas reduce sensiblemente la formación de diacetilo en los vinos, así como evitando la
formación de las aminas biógenas.
Para aumentar la cesión de manoproteínas a los vinos
que permanecen sobre sus lías, se puede añadir la
misma enzima que hidroliza los glucanos de la
Botrytis cinerea, es decir una β-(1→3)-D-glucanasa;
realizando el tratamiento con una dosis de 1 a 2 gramos / hectólitro de vino, durante un tiempo de 2 a 4
semanas, y siempre sobre las levaduras muertas de la
fermentación; respetando además las condiciones
del medio señaladas con anterioridad, es decir: temperatura superior a los 10º C y ausencia de bentonita
en el vino. Otra opción es añadir cortezas de levaduras de elevado contenido en manoproteínas (CLECM),
en dosis de 20 a 40 gramos/hectolitro.
La utilización de autolizados de levaduras también
tiene un gran interés, pues estas sustancias pueden
ser añadidas a partir de preparados comerciales de
cepas de levaduras de Saccharomyces cerevisiae
seleccionadas por su elevado poder proteolítico, rea110
lizándose su autolisis en un medio hidroalcohólico
tamponado a pH 3,0 y 30º a 50º C de temperatura,
siendo después centrifugadas para separar las paredes celulares y luego secadas por calor.
También existen preparados de levaduras inactivas, a
la cual se le aplica un proceso de extracción específico para hacer más fácil la liberación de polisacáridos
de las paredes celulares. Aplicado en dosis de 30 gramos por hectolitro en vendimias tintas, al principio de
la fermentación alcohólica y de la maceración, se consigue suministrar al medio una cantidad temprana de
polisacáridos, que son capaces de fijar los taninos
extraídos de los hollejos y de las pepitas, estabilizándolos en el vino y comunicándoles sensaciones de
redondez y volumen.
Un quinto aspecto a contemplar, es el control y ries gos del proceso de FML en barrica. Previo a su inicio
es importante realizar una analítica al vino, para conocer algunos parámetros. Unos servirán para conocer
las posibles dificultades del medio para el arranque
de la FML: anhídrido sulfuroso libre y total, azúcares,
pH, y grado alcohólico, y otros servirán para controlar
el desarrollo de la misma: acidez total, acidez volátil y
ácido málico.
La FML se manifiesta exteriormente por un patente
desprendimiento de anhídrido carbónico, que forma
en la superficie del vino una espuma característica, al
mismo tiempo que comienza una continua caída de
la acidez total, con una progresiva disminución del
ácido málico y un aumento del ácido láctico, así
como también del ácido acético sobre todo al finalizar el metabolismo. La evolución de los ácidos málico
y láctico se pueden medir mediante métodos enzimáticos, aunque la mejor manera de hacerlo es
hacerlo por cromatografía sobre papel, que supone
un método semicuantitativo y rápido de realizar.
Otro sistema para la fácil medición del ácido málico o
del ácido láctico es el sistema Reflectoquant de la
firma Merck, que consiste en la utilización de un aparato reflectómetro para la evaluación de tiras analíticas, que impregnadas de mosto o vino, son capaces
de medir instantáneamente una gran cantidad de
parámetros, donde además de estos ácidos, destacan
los siguientes: azúcares, dióxido de azufre libre, acidez
total, calcio, potasio, etc.
Además de la disminución de la acidez total y de la
evolución de los ácidos málico y láctico, también es
conveniente controlar el incremento de la acidez
volátil, pues una subida anormal de esta sustancia
puede indicar una anomalía en el desarrollo de la
FML, e incluso llegar a tener que tomar medidas para
paralizar el proceso microbiano.
La seguridad de que una FML se realice con una
determinada especie o cepa de bacteria láctica,
puede ser comprobada con métodos de análisis
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Fermentación Maloláctica
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moleculares (RAPD, Ribotipado, ARDRA, AFLP, etc.),
que permiten una identificación rápida y precisa de
estos microorganismos. Del mismo modo otras técnicas, como la de hibridación fluorescente in situ (FISH.
fluorescent in situ hybridization), posibilitan además
de la identificación de las bacterias, su recuento
simultáneo.
permanecerá mucho tiempo sobre una masa de lías.
El final de la FML es una etapa que debe ser controlada y manejada adecuadamente, pues normalmente
los vinos son abandonados, y entonces se pueden
producir transformaciones indeseables sobre otras
sustancias del vino, que tienen como consecuencia
una excesiva subida de la acidez volátil. Cuando el
ácido málico desaparece, las bacterias lácticas
comienzan a metabolizar el ácido cítrico del vino, produciéndose una “fermentación citroacética” que produce notables cantidades de ácido acético. Para evitarlo se debe operar de la siguiente forma: cuando en
el vino resta medio gramo por litro o menos de ácido
málico, la FML se debe de dar por finalizada, y entonces se procede al trasiego y sulfitado del vino (3 a 6
gramos / hl) para paralizar a las bacterias lácticas;
resultando el vino sin ácido málico al terminar el proceso, debido a que la enzima maloláctica residual es
capaz de metabolizar por inercia los restos de este
ácido, a pesar de la muerte de estas bacterias, y quedando por lo tanto el ácido cítrico sin degradar.
El nivel de anhídrido sulfuroso a mantener en el vino
debe ser lo más bajo posible, con objeto de permitir la
formación de acetaldehído y así posibilitar la polimerización de antocianos y taninos, pero esta carencia de
dióxido de azufre puede conducir al desarrollo de
microorganismos indeseables, como las mismas bacterias lácticas que podrían metabolizar otras sustancias del vino: ácido cítrico, ácido tartárico, glicerina,
etc., o también bacterias acéticas, e incluso de levaduras indeseables como las Brettanomyces, todos ellos
de nefastas consecuencias. Del mismo modo, la
ausencia de anhídrido sulfuroso podría conducir a una
oxidación irreversible en el vino. Con este motivo, es
muy importante realizar controles periódicos de los
vinos, atendiendo especialmente a su análisis sensorial, que permitirá al enólogo conocer la evolución del
vino, y así decidir el final de su permanencia sobre las
lías, pudiendo entonces completarse la crianza en
madera con una estancia suplementaria en barrica.
La duración de la FML es muy variable, transcurriendo
en un plazo medio de una a dos semanas, aunque en
algunas ocasiones puede desarrollarse en un período
mucho más largo, cuando se manifiestan en contra
uno o más factores de crecimiento, siendo la baja
temperatura y el valor reducido de pH los que más
influyen en esta ralentización.
Terminada la FML, los controles que se deben realizar
al vino en crianza sobre sus lías, deben ser los habituales para un vino situado en estas condiciones, teniendo especial cuidado en lo referente a posibles alteraciones microbianas, pues no se debe olvidar que éste
•
•
•
•
•
Acidez volátil.
Anhídrido sulfuroso libre y total.
Potencial redox.
Control microbiológico.
Análisis sensorial.
En sexto y último lugar, las condiciones de embotella do de los vinos elaborados por este sistema, no pueden ser más sencillas, pues en general no es necesario realizar tratamiento de estabilización alguno, pues
como anteriormente se ha comentado, los vinos
resultan estables frente a las insolubilizaciones de tartratos, proteínas y materia colorante. Aunque los tratamientos de estabilización de los vinos, como las clarificaciones y estabilización tartárica, no afectan sustancialmente a su contenido en manoproteínas,
mientras que las filtraciones muy cerradas pueden
hacerlo en cierta cuantía, y teniendo como consecuencia una rápida colmatación de los filtros.
111
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
Unicamente podría ser necesario realizar un ajuste del
nivel de anhídrido sulfuroso libre hasta 30 a 40
mg/litro, y en ocasiones añadir una dosis de hasta 200
mg/litro de goma arábiga inmediatamente antes del
embotellado, con el propósito de prevenir la precipitación de materia colorante en el tiempo.
2.6. Crianza de vinos sobre lías en depósito.
Una alternativa a la FML en barrica y su posterior
estancias sobre las lías, consiste en realizar este
mismo proceso en depósitos de mayor capacidad, y
en consecuencia aprovechar las mismas ventajas que
este método ocasiona, y sin que las sensaciones aromáticas y gustativas aportadas por la madera se transmita y “deforme” a los vinos. Se trata de obtener un
vino fermentado en barrica, pero sin barrica.
Esta técnica se puede aplicar tanto a los vinos tintos
como a los blancos, donde simplemente consiste en
dejar los vinos sobre sus lías, removiéndolas con la
misma periodicidad, y consiguiendo que el poder
reductor de las lías se compense con oxígeno aportado, bien mediante aireación o mejor utilizando la técnica de micro-oxigenación, permitiendo de este
modo la autolisis de las levaduras sin la aparición de
olores azufrados desagradables.
Las cantidades de oxígeno a aplicar oscilan entre 1 a
3 ml por litro y día, acompañadas de un puesta en
suspensión de las lías, utilizando para ello cualquier
dispositivo al efecto: bombas de remontado, agitadores de hélice, turbobazuqueadores, etc.
112
El control de este proceso es similar al anteriormente
expuesto, aunque en este caso se debe prestar especial atención para conseguir un buen equilibrio de
oxidación-reducción, aireando u oxigenando algo
más cuando el vino se comience a reducir, o bajando
la aireación u oxigenación, e incluso llegando a corregir el nivel de anhídrido sulfuroso libre, cuando el vino
presente ligeros síntomas de oxidación.
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Informe Técnico
Fundación para la Cultura del Vino
Fermentación Maloláctica
115
F
IV.3
Fermentación
maloláctica:
cuándo y cómo
Antonio PALACIOS
Carlos SUÁREZ
José María HERAS
Sibylle KRIEGER.
Lallemand
3.1 Introducción
3.2 fermentación maloláctica: si o no
3.3 Conclusión
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
3.1 Introducción
IV.3. Fermentación maloláctica:
cuándo y cómo
l vino es uno de los productos
más antiguos donde los procesos microbiológicos hacen una
contribución importante en la
calidad final del producto. La elaboración del vino es un proceso bien conocido desde hace siglos, pero no obstante nuevos desarrollos, especialmente tratamientos biotecnológicos,
son lentamente aceptados y utilizados
en las bodegas.
E
Más recientemente, las bodegas más
modernas han introducido instalaciones que hacen
posible seguir unas normas higiénicas rigurosas,
donde todos los procesos de elaboración se controlan, incluyendo los microbiológicos. Al comienzo de
esta evolución apareció el uso de levaduras seleccionadas con fines enológicos, siendo un tratamiento
muy extendido en nuestros días. A principios de los
años noventa, los cultivos de bacterias lácticas liofilizadas se habían introducido en los mercados, comenzando con productos tipo “Standar”, que requieren un
tiempo y trabajo intenso de reactivación.
Posteriormente los cultivos tipo “1-Step” (de un solo
paso), con una única etapa de adaptación y luego, los
primeros cultivos de inoculación directa, que aparecieron en los años noventa. Los nuevos cultivos tipo
MBR® se introdujeron a principios del año 2000, pertenecen ya a la segunda generación de cultivos de bacterias malolácticas de inoculación directa.
Estos cultivos con alta concentraron bacteriana,
representan una herramienta útil e innovadora para
una controlada, rápida y confortable fermentación
maloláctica (FML) dentro de un proceso de vinificación en condiciones limitantes, con resultados predecibles y uniformes.
3.2 Fermentación maloláctica: si o no
La realización de la FML nunca ha sido cuestionada en
un vino tinto, pero en vinos blancos, es todavía una
materia de preferencia y del estilo de vino.
Investigando en diversos vinos tintos y blancos australianos, Bartowski y Henschke1 observaron que la
gran mayoría de vinos tintos habían experimentado
una FML completa, encontrando en los vinos blancos
una gama completa de diferentes niveles de FML,
comenzando sin FML en vinos de la variedad Riesling
y terminando por vinos reservas Chardonnay con
100% de FML y con mucho cuerpo. Pero la mayoría de
los vinos blancos habían experimentado una FML
parcial.
117
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
Desde hace algún tiempo, era posible distinguir fácilmente los vinos blancos producidos en las regiones
norteñas de climas fríos con una acidez muy marcada,
de los vinos producidos en climas más cálidos. Pero
obviamente el gusto de los consumidores ha cambiado a través de los tiempos, la mayoría de los consumidores prefieren un vino blanco afrutado con una acidez moderada5.
Así aparecen unas preguntas importantes a resolver:
¿En qué vino?, ¿En qué grado la acidez tiene que ser
disminuida? y mediante ¿Que método?.
Durante años, la FML ha sido reconocida únicamente
por la reducción de la acidez, pero más recientemente la FML se ha mostrado como un medio para mejorar organolépticamente y dar una estabilidad microbiológica al producto final, Krieger, 1999 6.
La decisión FML "SI" o "NO" tiene que ser tomada muy
rápidamente en el proceso de vinificación. Si la decisión es "NO" para los vinos blancos o FML parcial, los
tratamientos posibles y únicos serán: una buena clarificación, adición de SO2 y disminución de la temperatura. Más recientemente, un nuevo aditivo se ha introducido en la industria del vino llamado lisozima como un
elemento de control de bacterias lácticas, Gerbaux, 983
y Gerland 99 4.
La OIV ha aprobado el uso de lisozima en el vino y la
decisión se transmitió debidamente a la CEE. Este
• La lisozima no tiene efecto antioxidante. Así, el SO2 no puede ser
completamente reemplazado.
• Como la lisozima tiene una estructura proteica, la bentonita reacciona con la enzima inmediatamente.
Si un tratamiento con bentonita se
lleva a cabo, debe hacerse con
anterioridad a la adición de lisozima.
• El efecto de la lisozima disminuye
después de algunas horas. La lisozima puede inhibir la FML durante
un período corto de tiempo, pero
La lisozima es una enzima extraída de la clara de
huevo de gallina, con una acción inhibitoria muy
específica sobre bacterias Gram +, especialmente lácticas.
Las diversas experimentaciones realizadas han mostrado que aplicando lisozima en dosis de 500 mg/l al
comienzo de la fermentación alcohólica en vinos con
un alto riesgo de sufrir FML o dos adiciones separadas
en el tiempo en vinos con menor riesgo, al comienzo
y al final de la fermentación alcohólica, pueden evitar
la FML, permitiendo utilizar niveles reducidos de SO2.
Acorde a Gerbaux (98), las dosis de SO2 pueden ser
reducidas a 4 o 5 g/hl con la presencia de lisozima.
La fermentación alcohólica no se ve influenciada por
el tratamiento con lisozima.
Algunas reglas importantes tienen que ser respetadas
en la aplicación de lisozima en vinificación en blanco:
el vino todavía tiene que ser filtrado antes de ser embotellado para
evitar una FML espontánea en
botella.
• La actividad de la lisozima disminuye con el pH.
• Existe riesgo de recontaminación
cuando se mezclan vinos tratados
y no tratados.
• Aunque siendo inactivada, la lisozima permanecerá en el vino a
causa de su estructura proteica.
Los vinos tratados mostrarán una
A pesar de todas las ventajas y la buena actividad de
la lisozima, las reglas básicas de buenas prácticas enológicas todavía tienen que ser respetadas: higiene,
higiene e higiene.
Si la decisión se ha hecho en favor de una FML parcial,
las adiciones de lisozima en la gama de 200 a 300
mg/l durante la fermentación, pueden parar la FML
durante varias horas. Nuevamente, se debe prestar
atención a la disminución del efecto de la lisozima a
118
organismo ha incluido la lisozima en la lista de tratamientos y prácticas autorizadas en la vinificación,
pero dentro de unos límites, a condición de ser determinados dichos límites. Desafortunadamente la
Comisión no fue capaz de establecer estos límites en
el plazo de tiempo requerido. En USA el uso de lisozima está permitido, pero la bodega debe notificarlo a
la BATF. En nuestro conocimiento, ninguna reglamentación existe para Australia y Nueva Zelanda.
reacción positiva después de un
calentamiento, aunque numerosas
experimentaciones no han podido
probar ninguna inestabilidad proteica en el vino embotellado.
• ATENCION: La adición de ácido
metatartárico para la estabilización
tartárica de vinos tratados con
lisozima, provoca una fuerte turbidez en el vino, aunque los vinos se
hayan tratado con bentonita. Este
fenómeno no ha podido ser aclarado hasta el momento.
través del tiempo, por lo que se hace preciso vigilar
las posibles recontaminaciones.
Durante la vendimia de 1999, la supervivencia de
bacterias lácticas salvajes en el vino podía ser observada durante meses, pudo comprobarse lo mismo en
algunos vinos tratados con lisozima, aunque con
menor frecuencia. Una observación realizada por
parte del ITV en Francia, que debe ser todavía confirmada, conduce a pensar que en vinos inoculados con
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Fermentación Maloláctica
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cultivos seleccionados para iniciar la FML, las bacterias
parecen ser más fácilmente inactivadas por lisozima
que las bacterias propias de una FML espontánea.
Así, si la decisión es una FML parcial, interrumpiendo la
FML con lisozima o SO2, la recomendación es inducir
la FML mediante cultivos iniciadores seleccionados.
La figura 1 muestra la supervivencia y la cinética de la
FML en un vino Riesling de 1999 (Alemania) después
de la inoculación con el cultivo llamado Alpha. El control (tanque 1) no fue tratado con lisozima, en el tanque 2 se hizo FML con una adición pequeña de lisozima cuando se había degradado la mitad del ácido
málico, y en el tanque 3, se agregó lisozima al principio, directamente después de la inoculación con
Alpha, para evitar cualquier degradación del ácido
málico. La adición de lisozima provoca una muerte
brusca de las bacterias y 4 días después de la adición
de lisozima, no debería detectarse ninguna bacteria.
Figura 1.
FML en un vino Riesling de 1999 después de la inoculación directa con Alpha, con y sin tratamiento de lisozima (pH 3,03; alcohol 12 %
vol; AT 8,0 g/l; SO2 total < 35 ppm; temperatura 18 °C)
5,0
1,0E+07
1 (m álic o)
sin lisozim a
1,0E+06
3,0
adic ión de lisozim a
1,0E+04
(g/l)
ácido málico
1,0E+05
1,0E+03
2,0
lis ozim a
MLF 50 %
MLF
3 (m álic o)
lis ozim a
al principio
1 (cfu)
sin lisozim a
1,0E+02
2 (cfu)
li s ozim a
MLF 50 %
1,0E+01
3 (cfu )
lis ozim a
al principio
1,0
0
Células Viables (cfu/ml)
2 (m álic o)
4,0
1,0E+00
0
5
10
15
20
25
30
35
Tiem po (d)
% DE VINOS CON CONCENTRACIONES
DE HISTAMINA > 2.5 mg/l
Cuando la FML se para en alguna etapa de la degradación del ácido málico, pueden aparecer algunas
secuelas organolépticas. Durante la FML, pueden producirse algunos compuestos con gusto indeseable,
que se degradarán nuevamente al final o durante la
FML. Si la FML se interrumpe, algunos de estos compuestos pueden ser no degradados permaneciendo
en el vino. En la mayoría de los casos, es mejor mezclar un vino con FML completa con el mismo vino
donde se ha evitado la FML. De esta forma, será posible hacer una maceración post-FML, incluyendo en el
esquema de elaboración una buena gestión en la
producción de diacetilo1.
90
80
A NT ES M L F
70
D ES P U ES M L F
60
M LF + 3 m
50
40
30
20
10
0
CHA RDO NNA Y
(1 0 t a n q u e s )
P IN O T N O IR
(1 7 t a n q u e s )
Si la FML es deseada, las decisiones adicionales son
necesarias en lo que concierne al "COMO", y "CUANDO", “FML espontánea o inducida”. Si la decisión es en
favor de la FML, se recomienda restringir la aplicación
de SO2 al comienzo de la vinificación. El nivel de SO2
total no debe ser superior de 50 mg/l. Un contenido
en SO2 libre de 15-20 mg/l puede atrasar la FML o
incluso impedirla completamente, que es frecuentemente el caso de vinos con pH bajo, donde el efecto
antimicrobiano del SO2 libre es mucho más fuerte.
Si la preferencia es de FML espontánea, las uvas deberán ser sanas. Los conteos altos de células viables de
bacterias lácticas salvajes pueden tener una
influencia negativa sobre la calidad del
vino. En la mayoría de los casos, cuando
Lactobacillus o Pediococcus dominan la
FML espontánea, frecuentemente resultan
niveles altos de subproductos indeseables,
tal y como acidez volátil, aromas de reducción; o en el supuesto del crecimiento
excesivo de Pediococcus, altos niveles en
aminas biógenas (histamina entre otras),
que pueden provocar problemas importantes a personas sensibles (Figura 2).
Figura 2.
Aminas biógenas – Evolución durante la vinificación
(datos:ITV FRANCE, 1998)
119
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
En vinos con alto pH, la
inoculación temprana del
cultivo bacteriano seleccionado y caracterizado,
como las cepas L31 o
Alpha, es altamente recomendable.
Figura 3.
Desarrollo de una FML
controlada
En condiciones óptimas para el crecimiento de bacterias, como pH alto, excesiva madurez o presencia de
uvas botritizadas, temperaturas próximas a los 22º C,
una temprana adición de lisozima (500 mg/l) consigue reducir la presencia de bacterias lácticas indeseables y ayuda a conseguir una fermentación alcohólica
más saludable. La FML puede ser inducida posteriormente al final de la fermentación alcohólica inoculando bacterias seleccionadas (Figura 3).
La alta tolerancia a las bajas temperaturas (inferiores a
13-14º C) de los nuevos cultivos MBR® de inoculación
directa, puede ser un parámetro muy interesante a
utilizar en vinificación en tinto así como en blanco.
Además supone una ventaja económica, ya que no es
necesario calentar el vino o las bodegas para alcanzar
una temperatura entre 18º y 22° C.
Reduciendo la temperatura, se reduce la velocidad de
la FML. Lonvaud-Funel8 ha publicado resultados donde
se muestra un incremento del diacetilo y una degradación más lenta del ácido málico, así como un incremento en la producción de ácido acético cuando la
FML es muy rápida. Una degradación del ácido málico
más lenta permite estabilizar mejor el color en los vinos
tintos a baja temperatura, resultando un descenso
menor del color, causado solamente por el cambio de
pH. Por esta razón, ciertos enólogos franceses prefieren
para sus vinos una FML lenta a baja temperatura
(comunicación personal Vignerons Buzet). Ver figura 4.
Figura 4.
Tiempo de FML en Pinot Noir de Burgundy de 1999 (Francia), después de inocular directamente los cultivos seleccionados a diferentes
temperaturas (pH 3,46, alcohol 13,3 %vol)
120
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
Otra ventaja muy importante resultante de inducir la
FML con cultivos seleccionados, es limitar el crecimiento de bacterias en el vino, ya que los cultivos son
inoculados a un nivel de 2 millones de bacterias por
ml de vino, creciendo hasta 50 millones de células por
ml. Para inducir la FML de forma espontánea, es necesario crecer desde 100 bacterias/ml hasta 50 millones
de células, lo cual significa un crecimiento celular
mayor y mayor número de generaciones, acumulándose gran cantidad de metabolitos. Lo que significa
un mayor riesgo de producir un impacto láctico indeseable.
Laurent y Henick-Kling7 comprobaron que pueden
encontrar diferencias en el impacto aromático según
la contribución de diferentes cepas de bacterias. A
algunas cepas se les ha reconocido la capacidad de
producir un fuerte impacto de mantequilla, nueces y
aromas de levadura; otras cepas parecen contribuir
muy poco en el aroma del vino1.
La Figura 5 muestra la cinética de degradación del
ácido málico en vinos Riesling de Alemania de 1999
(pH 3,03, alcohol 95,0 g/l) a una temperatura de 18 °C,
inoculando con diferentes cultivos comerciales. La
figura 6 muestra los resultados del perfil sensorial de
estos vinos.
Figura 5.
Cinética de la degradación del ácido málico en vinos de Riesling, 1999 (D).
(pH 3,03, alcohol 95,0 g/l).
Las cinéticas de las FML llevadas a cabo en tanques de
acero inoxidable inoculados con varias cepas de bacterias seleccionadas fueron comparadas en la degradación del ácido málico durante 30 días. Los análisis
de implantación fueron positivos para todas las cepas,
lo cual indica que las cepas inoculadas indujeron la
FML.
Este tipo de control es necesario para poder relacionar las diferencias observadas durante la evaluación
sensorial de los vinos según la contribución de cada
cepa en particular.
A pesar de observar unas cinéticas de degradación de
málico muy similares, la evaluación sensorial de los
vinos reveló unas diferencias significativas entre las
diferentes cepas. Los vinos fermentados con la cepa
MCW mostraron una mayor apreciación de los descriptores "cuerpo/intensidad". Esta cepa ha tenido un
importante mercado en California debido a su contribución en los aromas de mantequilla, nueces, nata y
carácter de levadura. Unos análisis químicos más
exhaustivos revelaron niveles de acetaldehído medidos a mitad de la FML superiores.
La cepa Alpha, como en otros casos, dio una percepción sensorial dirigida hacia un vino afrutado en combinación con complejidad aromática y mejora del
cuerpo. En los vinos fermentados con SP1, se produjo
un incremento del afrutado.
121
IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
Figura 6.
Influencia de los inóculos bacterianos de FML en el perfil gustativo de un vino Riesling QBA de 1999 (Württemberg – Alemania)
Bartowsky 1. Fornachon y Lloyd2 demostraron que los
vinos que han sufrido la FML contienen más diacetilo
que los vinos sin FML. Concentraciones superiores a
5-7 mg/l son indeseables en los vinos, pero si el diacetilo participa en concentraciones inferiores, contribuye positivamente en el aroma y en la calidad organoléptica del vino.
La figura 7 muestra el contenido en diacetilo de un
vino Pinot Noir de Baden en Alemania de 1998. Tres
cultivos comerciales distintos fueron inoculados a
diferentes dosis junto a levaduras o directamente después de la fermentación alcohólica. Todos los ensayos
se realizaron por duplicado. Inmediatamente después
de la FML, los ensayos "A" fueron tratados con SO2
(100 mg/l) y filtrados posteriormente. Los ensayos "B"
sufrieron una crianza sobre lías durante cuatro semanas realizando un “batonnage” por semana; después
de las cuatro semanas, los ensayos "B" fueron también
tratados con dióxido de azufre y filtrados.
La concentración de diacetilo puede ser manejada de
una forma significativa por el enólogo. La dosis de
inoculación de bacterias afecta al grado de degradación del ácido málico y tiene una influencia importante en la concentración final del diacetilo.
Los contenidos en diacetilo al final de la FML fueron
significativamente diferentes. Obviamente, el tiempo
de inducción de la FML durante la fermentación alcohólica o posteriormente, tiene poca influencia en el
contenido de diacetilo de los vinos.
El diacetilo esta asociado al carácter de mantequilla.
Este compuesto se forma como intermediario en la
degradación de azúcares y del ácido cítrico por parte
de las bacterias lácticas.
Figura 7.
Contenidos en diacetilo en vinos Pinot Noir de 1998 según el tratamiento y dosis de inoculación
4,5
4
diacetilo (mg/l)
después MLF
diacetilo (mg/l)
después de filtrar + SO2 A
diacetilo (mg/l) después 4
B
sem anas sobre lias
3
mg/l
diacetilo (mg/l)
3,5
2,5
2
Diacetilo después de ferm. alcoh.
1,5
1
0,5
122
4x10e6 cfu/ml
después ferm
alcohol.
fermentation
4x10e6 cfu/ml
inoculación
simultanea
2x10e6 cfu/ml
después ferm
alcohol.
fermentation
2x10e6 cfu/ml
inoculación
simultanea
1x10e6 cfu/ml
después
ferm. alcohol.
fermentation
1x10e6 cfu/ml
inoculación
simultanea
2x10e5 cfu/ml
después ferm.
alcoholica
2x10e5 cfu/ml
inoculación
simultanea
0
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
Además, no se ha podido observar en nuestros ensayos una influencia importante por parte de la cepa
inoculada, pero si se pudo mostrar un efecto según la
dosis de inoculación en la concentración final de diacetilo. Los ensayos inoculados con alta dosis (5x106
cfu/ml) de bacterias, donde hubo un crecimiento
limitado, mostraron niveles bajos de diacetilo (1,1
mg/l), mientras que en los ensayos inoculados con un
bajo número de bacterias (2x104 cfu/ml) se encontraron cantidades de diacetilo de 3,9 mg/l. Después de
adicionar dióxido de sulfuroso, huvo un detrimento
del 50 % del diacetilo medible, debido a la interacción
entre ambas moléculas, aunque todavía permanece
por enzima del umbral mínimo detectable en vinos
de Pinot noir. En todos los ensayos con tratamiento
sobre lías se observó un importante y rápido detrimento en la concentración de diacetilo.
Independientemente del nivel de diacetilo al comienzo de la crianza sobre lías, solo 0,2 mg/l de diacetilo
fueron medidos después de cuatro semanas, lo cual
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se corresponde con el umbral mínimo de percepción
sensorial en vinos de Chardonnay9.
Aun así, el diacetilo no puede explicar por sí solo la
gran variación en el perfil aromático entre vinos fermentados con diferentes cultivos bacterianos, como
recientemente Richardson y Henick-Kling11 han mostrado en vinos de Cabernet Sauvignon y Chardonnay
después de realizar la FML y analizando los vinos usando técnicas de GC/MS y GC/olfactometría.
3.3 Conclusión
Basándose en los amplios resultados encontrados en
una extensa bibliografía internacional y en los nuestros propios, creemos que se puede manejar el perfil
sensorial de los vinos eligiendo el cultivo bacteriano
adecuado para dirigir la FML, siendo un cultivo bien
definido por sus propiedades fermentativas y efectos
organolépticos.
7 Laurent, M.H., Acree, T.E., Henick-Kling,T.: Changes in
aroma and odor of Chardonnay due to malolactic fermentation. Weinwissenschaft 49, 3-10, 1994
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5 Klein, R.: Malo macht munter. Alles über Wein 1/97,
98-99, 1997
6 Krieger, S.A., Lemperle, E., Ernst, M.: Management of
malolactic fermentation with regard to flavour modification. Session 3B, Flavour modification in the
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International Symposium on Cool Climate Viticulture
and Oenology . 16-20 January, 2000, Melbourne,
Australia.
123
L
V. La
microoxigenación
Índice
127
127
V.1. Microoxigenación y fermentación maloláctica
Stéphane Yerle
Oenodev S.A.R.L.
M
V.1.
Microoxigenación
y fermentación
maloláctica
Stéphane YERLE
Oenodev S.A.R.L.
1.1 Histórico y presentación de la
microoxigenación
1.2 ¿Microoxigenación y fermentación
maloláctica?
1.3 Bases de la oxigenación
cuantificada
1.4 Aplicaciones de la
microoxigenación.
1.5 Reacciones del vino implicadas en
la microoxigenación.
1.6 Nociones teóricas sobre el control
de la microoxigenación antes de la
fermentación maloláctica
1.7 Parámetros de control de la
microoxigenación antes de la
fermentación maloláctica.
1.8 Novedades sobre la secuencia
cronológica de la microoxigenación
y de la fermentación maloláctica.
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
o se trata en modo alguno
de sustituir la barrica. La
microoxigenación y la barrica son incluso complementarios, como lo demuestra el hecho de
que nuestro mayor mercado en la
región de Burdeos sea Saint-Emilion,
donde el 90% de nuestros clientes
crían el vino en barrica. Por lo tanto,
con la microoxigenación se confiere
estructura a los vinos antes de su
envejecimiento. Esta técnica viene a
ser como los cimientos de una casa:
cuanto más sólidos sean, mejor resistirá la casa el paso del tiempo.
N
V.1. Microoxigenación y
fermentación maloláctica
(...) Todos los vinos del mundo necesitan oxígeno.
Algunos muy poco, como el Beaujolais, mientras que
otros, muy tánicos, tienen necesidades enormes,
como el Madiran. (...)"
A continuación se exponen algunos comentarios del
inventor, que todavía permiten resumir la herramienta adicional que tenemos en la microoxigenación.
1.1 Histórico y presentación de la
microoxigenación
Los experimentos de un viticultor con talento
A principios de los años 1990, Patrick Ducournau y la
familia Laplace, viticultores de la denominación
Madiran, deciden estudiar el control de los aportes de
oxígeno durante la crianza. Enfrentados a los problemas
de la crianza de los vinos elaborados a partir del varietal
Tannat, ricos y con una alta concentración de taninos
(hasta 7 g/l) y también de antocianos al principio de la
crianza (2 g/l, comparada con la concentración de 0,6
g/l de un vino de Garnacha o Pinot Noir), observan una
desecación de los vinos al final de la crianza. Así
comienza la búsqueda de una técnica de crianza adecuada que permita conservar la untuosidad y el carácter afrutado del vino, ya se críe en depósito o en barrica.
En 1991, los primeros ensayos de aportes de oxígeno
cuantificados y constantes demuestran rápidamente
su superioridad con respecto a los trasiegos y más
aún con respecto a la ausencia de oxígeno: los vinos
evolucionan mejor, y también, cosa más sorprendente para la época, parecen evolucionar más despacio.
En unas circunstancias en las que los vinos evolucionaban perdiendo color y desecándose, ahora conservan más color y más fruta, pero también y sobre todo
conservan taninos más arropados. (LEMAIRE, 1995).
En 1996, apoyándose en el éxito naciente de la microoxigenación, se funda Boisé France con el objeto de
desarrollar una gama de viruta de roble pensada por
el enólogo y para el enólogo: en lugar de contentarse
127
V. La microoxigenación
con el mero efecto aromático de la madera (lactona,
aldehídos, fenoles volátiles y furanos), se perseguían
además efectos enológicos sobre la estructura (riqueza en taninos elágicos).
mente en las bodegas, y así adaptar nuestros productos a las necesidades de los clientes.
La validación científica
Esta pregunta es tan antigua como la historia del vino.
En realidad, no se trata tanto de una tecnología como
de una antigua práctica. Porque en 1993, Patrick
Ducournau y sus colaboradores no han inventado una
receta; simplemente han puesto a punto una herramienta de oxigenación lenta fiable, precisa y regulable.
Una de sus aplicaciones modernas se inscribe entre la
fermentación alcohólica y la FML, con objeto de estabilizar el color y la estructura del vino, y es el fruto de años
de observación de los efectos beneficiosos del contacto prolongado entre un vino joven con un pH bajo, sin
azufrar, y el aire. Se habla entonces de FML en barrica,
una operación que genera etanal porque al vaciar la
barrica ésta contiene un vino con color, concentrado y
sin azufre, similar al obtenido mediante el bazuqueo
borgoñón que a menudo provoca la caída del sombrero de orujo, dejando el vino contenido en una cuba
troncocónica en contacto con el aire libre.
Financiada inicialmente por un proyecto ANVAR con
el aval científico del INRA de Montpellier, representado por Michel Moutounet, la empresa Oenodev se ha
esforzado por conseguir rápidamente una validación
científica de la patente registrada en 1993.
En la actualidad, la validación científica de la microoxigenación se basa fundamentalmente en ensayos en
bodegas. Se ha hecho un seguimiento analítico de los
vinos, y los estudios se han basado en grupos de jurados expertos, entrenados regularmente en ese tipo de
análisis sensorial por un profesional (Maurice Chassin,
del Institut de Dégustation de Tours).
En 2006, ya la técnica suma 13 años de validación en
todo el mundo y en todo tipo de tintos, así como de
blancos y rosados tanto en bodegas industriales
como en estaciones experimentales (INRA Pech
Rouge, Institut Rhodanien, Universidad de Tarragona,
Estación Enológica de Rueda,…). Además, desde
hace tres años, Oenodev también dispone de su propia nave tecnológica equipada con 150 cubas inertes
de tres hectolitros, en las que se puede controlar la
turbidez, la temperatura y la madera.
Con la experiencia, las prescripciones han cambiado.
Desde principios de los años 1990, la técnica de microoxigenación se ha refinado. Los ensayos en bodega han
llevado a modificar las precauciones. Antiguamente, el
aporte de oxígeno empezaba después de la fermentación maloláctica (FML), con el vino azufrado. Se prefería
no correr ningún riesgo. Desde hace algunos años, se
prescribe una adición de oxígeno más precoz, justo al
final de la fermentación alcohólica.
Oenodev, innovación sobre el terreno
En la actualidad, Oenodev tiene una plantilla de 25
personas, de las que 17 son enólogos, 2 técnicos y 3
investigadores repartidos por todos los continentes.
Con sus filiales en Australia, Estados Unidos,
Argentina, Chile e Italia, Oenodev dispone de su propia red de distribución, lo cual le permite llevar la
misma propuesta al mundo entero. En España,
AZ3oeno constituye el mejor ejemplo de colaboración de Oenodev con cuatro jóvenes enólogos competentes y formados desde los primeros pasos de la
microoxigenación: cursos de cata, expertos en clientela (oxígeno disuelto y Brettanomyces), asesoría en
microoxigenación y crianza sobre lías…
Esta presencia única sobre el terreno permite transmitir rápidamente la información recopilada directa128
1.2 ¿Microoxigenación y fermentación maloláctica?
En la actualidad, Oenodev se ha convertido en una
empresa especializada en la crianza de vinos, y se
sigue planteando las mismas preguntas. ¿Cuál es el
mejor ajuste de las herramientas eficaces desarrolladas durante estos últimos años (microoxigenación,
inyector de oxígeno, virutas de roble, bazuqueador…)
para conseguir el vino perseguido a partir de una
materia prima determinada? Lo mismo cabe decir
sobre la fase estratégica de la espera de la FML: ¿cuáles son los límites e imperativos de esta aplicación?
1.3 Bases de la oxigenación cuantificada
Ante todo, hablemos del propio principio de la microoxigenación y de la mecánica que consiste en estabilizar la evolución de la estructura de un vino tinto. Es
el principio de la oxigenación cuantificada: velocidad
de introducción del O2 en el vino, inferior en todo
momento a la velocidad de reacción del O2 en el vino.
Eso es lo que sucede empíricamente en barrica (aporte lento, a un ritmo de entre 0,5 y 0,75 ml/l/mes), y es
lo que hemos reproducido para las cubas gracias a un
sistema de microoxigenación con mayor control:
-
Caudal débil, continuo y controlado de O2 ;
100 % de transferencia al vino.
De ese modo, la gran diferencia entre el aporte puntual (trasiego) y el aporte cuantificado es que nunca
se produce una acumulación de oxígeno disuelto
(< 0,03 ppm) lo cual asegura la preservación de
numerosos compuestos, en especial aromáticos. Para
ello, Oenodev ha colaborado con el INRA de Pech
Rouge para desarrollar el primer protocolo de dosificación del oxígeno disuelto en los vinos por métodos
electroquímicos.
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
Figura 1.
Niveles de oxígeno disuelto idénticos en barrica y en cuba inerte (Lemaire, 1994).
1.4 Aplicaciones de la microoxigenación.
Las principales aplicaciones de la microoxigenación
serán pues:
-
-
Aporte de O2 a las levaduras durante las FA
Aporte de O2 durante la crianza sobre lías de los
vinos blancos, consiguiéndose mayor untuosidad y frescor aromático
Disminución de los caracteres de reducción
Reducción de los caracteres herbáceos
Trabajo de la estructura global de los tintos.
Nos concentraremos en esta última aplicación, aunque en la actualidad numerosos usuarios apliquen
con éxito esta técnica en las situaciones restantes.
1.5 Reacciones del vino implicadas en la
microoxigenación.
A continuación expondremos esquemáticamente las
reacciones diversas que se producen en el vino gracias a la oxigenación cuantificada. Aquí tenemos
representado un flavanol (vulgarmente denominado
tanino). Los flavanoles forman parte de la familia de
los flavanoides (igual que los antocianos, dicho sea de
paso) y se caracterizan por una estructura de 15 carbonos que consta de dos ciclos fenólicos A y B, y de
un heterociclo oxigenado C unido al ciclo A. Después,
estas moléculas se podrán asociar directamente
mediante enlaces C4-C6 o C4-C8.
Globalmente, los antocianos tienen las mismas características químicas que los flavanoles, con la diferencia
de la posibilidad de rotación alrededor del enlace
entre el ciclo B y el heterociclo C. Así, se podrán observar reacciones de polimerización directa entre taninos y antocianos a través de enlaces C4-C6 o C4-C8.
También se pueden producir otras reacciones de polimerización, principalmente a través del etanal .
¿Cómo se forma el etanal en el vino? Se obtiene
mediante oxidación conjunta de los ortodifenoles y el
etanol (trabajos de Singleton 1974-1987). El O2 presente en el medio (y en mayor medida gracias a la
microoxigenación) reacciona con los ortodifenoles
originando ortoquinona y peróxido de oxígeno, que
permitirá la oxidación del etanol en etanal. De ese
modo, se pueden obtener distintos tipos condensación:
Taninos – Etilo – Taninos
Taninos – Etilo – Antociano
Esta última asociación se caracteriza por un aumento
del color rojo y púrpura. De ese modo, el aporte de
oxígeno a un vino tinto estructurado y rico en anto129
V. La microoxigenación
cianos libres permite estabilizar los antocianos con los
taninos por mediación del puente etanal, bloqueando la evolución de estos últimos (los antocianos cierran la polimerización al final de la cadena). Por lo
tanto, es necesario oxigenar vinos suficientemente
estructurados y colorados para obtener un buen rendimiento de la reacción, pues la oxidación del etanol
(reductor secundario) en etanal requiere una oxidación previa de los taninos (reductor primario). Por último, la oxigenación de un vino desequilibrado por
falta de color (y por tanto de antocianos) desembocaría en la polimerización sin límite de los polifenoles
entre sí, provocando la desecación y el amarilleo
(SAUCIER, 1997). Así pues, en presencia de grandes
cantidades de antocianos monoméricos, las reacciones conducen a moléculas de menor peso. La polime-
rización inducida por el etanal cesa cuando los dos
extremos de la cadena están ocupados por un antociano. (CHENIER & al 2000).
Los últimos ensayos realizados durante la campaña
2002 (ver figura 2) por el departamento de
Investigación y Desarrollo de Oenodev permiten confirmar el efecto positivo de este aporte sobre el color
del vino, y la pertinencia del modelo de control de la
oxigenación en función de la percepción del etanal
(CABRI, DUCOURNAU, LEMAIRE, 2002). Esta fase de
estabilización es necesaria para la buena evolución de
cualquier tinto en barrica, pues además de estabilizar
su color, confiere al vino una mayor resistencia a la
oxidación gracias a una menor oxidabilidad de sus
polifenoles.
Figura 2.
Evolución del color de un vino sometido a un aporte cuantificado entre FA y FML (Oenodev, 2002).
20,00
Balance de densidades ópticas: 420, 520, 620, IC y matiz
al cabo de 23 días de micorooxigenación antes de la FML
18,00
DO 420
16,00
DO 520
14,00
DO 620
12,00
IC
10,00
Matiz
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
Testigo
30 cc
60 cc
90 cc
DO 420
4,63
5,55
6,33
6,63
DO 520
5,95
7,57
8,45
9,23
DO 620
1,93
2,25
2,45
2,63
12,51
15,37
17,23
18,49
0,78
0,73
0,75
0,72
IC
Matiz
Por lo tanto, se puede observar que:
-
-
-
130
Los vinos jóvenes se caracterizan por sus altos
contenidos de pigmentos no resistentes a la
decoloración por el SO2 y más concretamente
por los antocianos nativos
En los vinos más viejos, los contenidos de estos
compuestos han disminuido claramente, dejando su lugar a compuestos más estables, como
los piranoantocianos y los pigmentos T-A+
En los vinos microoxigenados, se ha podido
observar la presencia de flavanoles piranoantocianos, y el análisis por espectometría de masa
ha permitido identificar compuestos en los que
participa el etanal (simbolizado en azul turquesa): Condensación de compuestos fenólicos
gracias, principalmente, al etanal (F-etil-A+).
Por otra parte, se han identificado otros dos
tipos de moléculas resultantes bien de la reacción directa entre antocianos (Ant-Ant) bien
con la participación del etanal (Ant-etil-Ant).
Este último descubrimiento es absolutamente innovador en el mundo de la enología, puesto que es la
primera vez que se ha puesto de manifiesto este tipo
de reacción, que bien podría contribuir al cambio de
las características organolépticas, y más concretamente del color (su evolución). La característica general de los pigmentos obtenidos es una mayor resistencia a la decoloración por el SO2, y por lo tanto una
mayor estabilidad de la materia colorante con el paso
del tiempo (ATANASOVA, 2003).
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
vino joven
vino viejo
F
A
A
A
CPNR SO2
vino oxigenado
A
F n
COOH
A
A
A
F
A n
F n
1.6 Nociones teóricas sobre el
control de la
microoxigenación antes de la
fermentación maloláctica
Pigmentos resistentes a la decoloración por SO2
ATANASOVA, 2003 (tesis doctoral)
Ahora bien, hay que recordar que la oxigenación no
está reservada a esta fase únicamente, y que más adelante, durante la crianza, el equilibrio inicial
taninos/antocianos se modifica debido a la desaparición de una gran cantidad de antocianos. Esto induce
una evolución excesiva de los flavanoles en un medio
oxidante pobre en antocianos. La polimerización oxidativa de los flavanoles se lleva a cabo por mediación
de la formación de quinonas. En este caso, la polimerización no se realiza entre los núcleos A y C, sino
entre los núcleos A y B. Hay que
señalar que se trata de una
polimerización que hace
aumentar el grado de polimerización medio. Los productos
formados son de tamaño considerable (y por lo tanto menos
solubles, hasta precipitarse) y
presentan un color pardusco
(VIDAL, 2003). Es la llamada
desecación de los vinos tintos
característica de las oxigenaciones tardías, al final de la
crianza.
Para controlar esta fase ideal de
oxigenación de los vinos,
Oenodev ha desarrollado
varios modelos que recurren tanto al análisis como a
la cata, de forma similar a las operaciones de seguimiento de la crianza en barrica. ¡El enólogo no elige la
fecha del trasiego de barrica en función de los resultados de su espectrofotómetro!
Por lo que se refiere a la percepción del etanal, desde
2002 (figura 3) Oenodev ha confirmado la existencia
de una excelente correlación entre la concentración
química de este compuesto y su percepción sensorial.
Figura 3.
Correlación entre el etanal percibido y el etanal analizado (Oenodev, 2002).
Comparación entre el etanal percibido y el etanal analizado
(Etanal analizado mediante CPG)
50,00
45,00
40,00
T Analizado
30 Analizado
60 Analizado
90 Analizado
T perçu
30 perçu
60 perçu
90 perçu
5,00
4,00
3,00
Etanal mg/l
30,00
25,00
2,00
20,00
Intensidad
35,00
15,00
1,00
10,00
5,00
0,00
0,00
8/10/02
17/10/02
23/10/02
29/10/02
131
V. La microoxigenación
He aquí una tabla de simulación en función de algunas reglas:
•
•
•
•
•
Aumento del volumen, pero sin evolución del
OD (Oxígeno Disuelto) y del etanal: hay que
incrementar la dosis (dosis insuficiente) ;
Aumento del volumen, del etanal y sobre todo
del OD: hay que reducir la dosis, pues no se ha
utilizado parte del O2;
Aumento del volumen y del etanal y estabilidad del OD: hay que mantener la dosis (dosis
correcta) ;
Estabilidad de los diversos factores: hay que
preguntarse por los factores limitadores, como
la turbiedad;
Estabilidad del volumen y del etanal pero
aumento del OD: ensamblaje imperativo, pues
falta concentración.
En la actualidad, la dosificación del oxígeno disuelto
se lleva a cabo de forma rutinaria hasta algunas decenas de ppb mediante la luminiscencia (figura.4), una
técnica que no requiere ni regeneración, ni calibrado,
y que permite al enólogo controlar de ese modo el
oxígeno disuelto desde la extracción de los mostos
hasta el embotellado de los vinos. Entre la FA y la FML
el oxígeno disuelto constituye pues un valioso asistente de ayuda a la decisión, que Oenodev propone
sistematizar.
Al final, serán los objetivos de reactividad y de aporte
total (dosis acumulada) los que dicten el trabajo de
oxigenación, sabiendo que el etanal no constituye un
fin en sí, sino un paso obligado para la construcción
de la futura estabilidad de los vinos. El etanal no se
debe conservar en ningún caso después de la FML a
niveles distintos de los de un vino sin tratar.
Dependiendo de los vinos, el umbral de detección es
del orden de 20 mg/l.
1.7 Parámetros de control de la microoxigenación
antes de la fermentación maloláctica.
Empezando por los grandes parámetros que hay que
vigilar antes de la FML, la turbidez es el que más
influencia tendrá en la reactividad del vino: ¡una biomasa puede consumir diez veces más que cualquier
carga tánica! A continuación se facilitan algunos valores de referencia del consumo de oxígeno:
-
Lías (108 levaduras/ml): alrededor de 900 g/l/h
Vino blanco limpio: 0,2 g/l/h
Vino tinto joven limpio: 120 g/l/h
Cuanto mayor es la turbidez, menos eficaz sobre la
estructura es el oxígeno, pero más se favorece el
aumento de untuosidad originado por la autolisis de
las levaduras. Sin embargo, no hay que olvidar que
esta autolisis requiere largos
Figura 4.
meses de espera a alta tempePrincipio de medición del oxígeno disuelto por luminiscencia (Hach Lange, 2004).
ratura (VUCHOT, 2001).
Lange LDO™
Cuerpo
Caps
Moléculas
luminescentes
Capa
polímero
Oxígeno
132
Por otro lado, el segundo parámetro que debe figurar entre
los elementos de control, y sin
el cual no se puede hacer nada,
son las Brettanomyces. Estas
auténticas levaduras de contaminación esperan a la fase de
latencia del final de la fase alcohólica para desarrollarse en
ausencia de azufre, en un
momento en que en el medio
abundan azúcares. Nuestro
microbiólogo, el doctor Jean
François Bilis, ha demostrado el
interés del recuento sistemático al final de la FA para desplegar medios preventivos y
poder mocrooxigenar con
tranquilidad. Recordemos que
las Brettanomyces no han
esperado a la microoxigenación para desarrollarse, y que
los aportes puntuales (trasiego
que ocasiona la disolución de
algunas ppm) son los que más
estimulan las colonias (GILIS,
2003). Estas levaduras son
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
capaces de consumir hasta 0,3 mg de O2/l/hora con
una población de 105 UFC/ml, de modo que pueden
anular todo el efecto positivo del oxígeno aportado
bruscamente. En este ensayo, realizado durante la
crianza, observamos que los lotes oxigenados por
acumulación de oxígeno disuelto (trasiego y dosis
excesivas) son los que permiten la mayor proliferación
de Brettanomyces (figura 5).
Figura 5.
Evolución de las poblaciones de Brettanomyces en función del modo de oxigenación (después de la FML, Oenodev, 2001).
16 00000
Azufre
Cata 2
O2 - 20 cc (dosis excesiva)
14 00000
Cata 3
O2 - 10 cc
O2 - 5 cc (dosis normal)
Cata 1
(UFC/ml) Brettanomyces
12 00000
O2 - Efecto inyector del
Oxígeno
10 00000
80 0000
60 0000
Efecto
inyector
40 0000
20 0000
0
0
5
10
15
20
25
30
Tiempo (días)
En esta fase estratégica, entre la FA y la FML, no
debemos desdeñar el papel determinante desempeñado por los azucares residuales en el desarrollo
de las levaduras de tipo Brettanomyces. Más que el
oxígeno, la presencia de glucosa y fructosa en canti-
dades importantes es capaz por sí sola de aniquilar
todo el trabajo de crianza de los vinos. En efecto,
Gilis (figura 6. 2003) ha demostrado que la influencia
de los azúcares (> 2 g/l) es más determinante que la
del oxígeno.
Figura 6.
Evolución de las poblaciones de Brettanomyces en función de la concentración de azúcares residuales (Oenodev, 2003).
133
V. La microoxigenación
Una presencia importante de azúcar residual incrementa considerablemente la producción de fenoles
volátiles (+ 40% de etilguayacol, + 45% a + 60% de etilfenol). Desde el punto de vista gustativo, sólo los vinos
que contienen azúcares residuales desarrollan un olor
“animal” característico (sudor, cuero, establo) muy desagradable, que aparece durante la fase estacionaria y
aumenta considerablemente durante la fase de declive. Son vinos que presentan una desaparición total de
los caracteres afrutados, y en boca se caracterizan por
una pérdida de untuosidad, un aumento del amargor,
y una sensación general de sequedad.
En el caso de los vinos secos, se observa un cambio
en la paleta aromática, que desemboca en una disminución del carácter afrutado en beneficio de los
caracteres especiados que contribuyen en la complejidad. Esta es pues una razón adicional para terminar
primero la fermentación alcohólica antes de proceder
a ninguna adición de oxígeno.
Por todos esos motivos de turbidez y estabilidad
microbiológica, Oenodev preconiza recurrir sistemáticamente al centrifugado de los vinos almacenados en
grandes depósitos > 500 hl, pues ha quedado demostrado el interés de esta herramienta debido a su
acción de eliminación selectiva de las Brettanomyces
y no de las bacterias, lo cual permite concluir las FML
con toda tranquilidad.
Finalmente, el último parámetro de control, a saber el
oxígeno disuelto, permite comprobar el buen consumo del oxígeno aportado, en especial en el caso de
los inviernos fríos, pues la temperatura condiciona
estrechamente su consumo por parte de los polifenoles. Antes de la FML, por lo general los vinos tienen
temperatura suficiente, pero el control del oxígeno
disuelto también puede garantizar que no se caiga en
una dosificación excesiva por falta de concentración
fenólica del vino: una vez más, el oxímetro demuestra
ser una ayuda muy valiosa.
Figura 7.
Ausencia de relación entre dosis de oxígeno y oxígeno disuelto antes de la FML (Oenodev, 2001).
D.O. / Dosis de Oxigeno medida en más de 160 depositos.
2,0
1,8
1,6
D.O. mg/l
1,4
R2=0.3
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
20
40
60
80
Dosis de microoxigenación ml/l/mes
También hemos puesto de manifiesto la ausencia de
oxígeno disuelto en la totalidad de los depósitos microoxigenados antes de la FML cuando las dosis añadidas
son acordes con las recomendaciones, es decir de hasta
60 ml/l/mes (Figura 7).
A veces, la práctica nos lleva a continuar el trabajo de
oxigenación después de la FML, cuando los vinos aún
están suficientemente equilibrados, y en caso de que
la temperatura sea correcta, pero habrá que tener cuidado en todo momento de no volver la estructura
134
más desecadora, por oxigenación de un vino empobrecido en antocianos (en especial tras un periodo de
frío prolongado, cuando se pierden más antocianos
que taninos). Este riesgo no existe antes de la FML y
esa es la razón por la cual el 100% de los usuarios prefiere iniciar la adición en ese momento: el rendimiento de la reacción siempre es óptimo, a condición de
que se controle el entorno del vino (turbidez, oxígeno
disuelto y Brettanomyces). En efecto, si se administra
bien esta adición, no debe aumentar el oxígeno
disuelto.
100
Informe Técnico
Fermentación Maloláctica
Fundación para la Cultura del Vino
1.8 Novedades sobre la secuencia cronológica de la
microoxigenación y de la fermentación
maloláctica.
ácido málico se practica conjuntamente con el de los
azúcares. En algunos lotes, se microoxigenan los vinos
al final de la FA y también de la FML (por la coinoculación) sin adición azufre, cuando ya no queda ácido
málico, en cuyo caso se bloqueará la población de
bacterias mediante la adición de lisozimas. El perfil de
oxigenación coincide entonces con el aplicado al
vino sin azufrar (adición total > 10 ml/l) y el azufre no
se añadirá hasta el final de la oxigenación, en una
dosis de 5 g/hl.
Durante los ensayos realizados sobre la vendimia de
2005, los investigadores del departamento de I+D de
Oenodev han estudiado la posibilidad de microoxigenar después de la FML un vino sin azufrar pero estabilizado con lisozimas. La siembra se lleva a cabo
mediante inoculación conjunta, y el seguimiento del
Figura 8.
Aplicación innovadora de la adición de oxígeno mediante lisozimas (Oenodev, 2005).
Fermentación Alcohólica
Maceración
Levaduras
Crianza
Azúc
Ac. Málico
Oxígeno: - 40 mL/L/mes - 2 días
30 mL/L/mes - 6 días
15 mL/L/mes - 2 días
10 mL/L/mes - 11 días
Azúcares (g/L)
Total: 13 ml/l sobre 21 días
Bacteria
Málico (g/L)
Lisozimas
Fin MicroO 2
SO 2
MicroO 2
Tiempo (días)
El estudio comparativo entre esta aplicación y una
adición más clásica antes de la FML demuestra que
se consigue mayor efecto sobre el color (intensidad
y tono) antes que después de la FML, en el vino sin
azufrar, a pesar de que esta última aplicación innovadora también aporta resultados alentadores
(figura 8).
En efecto, sabemos que esta diferencia de resultado
se explica sin lugar a dudas por la mejor reactividad
de los antocianos y del etanal con un pH bajo. En
cambio, resulta obvio que de cara al objetivo de un
mayor control de las diversas poblaciones de microorganismos (bacterias y levaduras contaminantes), la
inoculación conjunta seguida de una adición de lisozimas al final de la FML puede ser positiva si se desea
estabilizar significativamente el color del vino
mediante una micro-adición de oxígeno. Por otra
parte, en este ensayo confirmamos que no existe relación entre un aporte cuantificado y el desarrollo de la
FML, observación corroborada en numerosas bodegas (figura 9).
135
V. La microoxigenación
Figura 9.
Comparación de la FML entre un testigo y un vino microoxigenado (Oenodev, 2005).
6,00
Ácido Málico Testigo
Ácido Málico (Microoxigenación)
5,00
Ac. Malique (g/L)
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0
10
20
30
40
Por último, para incrementar la reactividad del sistema
tanino-antociano, también se podría plantear una
reducción del pH del vino durante esta fase, o bien la
sustitución del efecto de las lisozimas por acidificación,
mediante técnicas de electromembranas (electrodiálisis mediante membranas bipolares) que tal vez nos
abran nuevas perspectivas de aquí a algunos años…
Lo que es indudable a estas alturas, es decir al cabo
de los más de diez años que viene definiéndose, es
que la microoxigenación, inspirada en la antigua
práctica de la crianza de los vinos, es una técnica fiable, segura y precisa. El enólogo dispone al fin de
136
50
60
Temps (jours)
70
80
90
100
una herramienta regulable de adición moderada de
oxígeno, que puede utilizar con la máxima seguridad controlando parámetros como la temperatura,
el oxígeno disuelto, la medición de la turbidez, el
seguimiento de las poblaciones de Brettanomyces,
las lisozimas y por último la siembra de bacterias
malolácticas. Al margen de los esquemas convencionales de aplicación del oxígeno entre la FA y la
FML, se abren nuevas perspectivas que permiten al
enólogo dirigir todas las facetas del juego: controlar
el proceso de elaboración en función de imperativos
técnicos y de objetivos propios, hasta el producto
final: el vino.