Guía Práctica 9: Micelio de hongos - Producción de micelio

Guía Práctica 9
Micelio de hongos
Producción de micelio en
medio líquido para
extracción de ADN
Guillermo Castellanos, Experto en Investigación–2
Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigación
Gloria Mosquera, Fitopatóloga, Ph.D., Líder de Proyecto
Fitopatología de Frijol
Contenido
Generalidades
Procedimientos
A. Producción de micelio
B. Cosecha del micelio
C. Extracción del ADN del micelio
9-2
9-3
9-3
9-5
9-8
Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
Generalidades
Un punto clave en la extracción de ADN de buena calidad
del micelio de hongos fitopatógenos es el crecimiento
óptimo del micelio sobre un medio de cultivo. Se utiliza,
generalmente, este tipo de tejido del hongo porque tiene un
crecimiento más homogéneo que otros tejidos del hongo.
Las esporas, por ejemplo, son más difíciles de procesar que
el micelio, porque son estructuras muy rígidas que requieren
protocolos de extracción especiales; además, pertenecen,
por su formación, a la etapa madura o senescente del
crecimiento del hongo.
Para lograr un buen crecimiento del micelio de un hongo es
necesario aplicar las buenas prácticas microbiológicas
(BPM), entre ellas las siguientes:
–
–
–
esterilidad
identificación correcta de las muestras
cultivo del hongo en la fase exponencial de
crecimiento
9-2
Guía Práctica 9: Micelio de hongos
Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN
Procedimientos
A. Producción de micelio
Materiales para el medio líquido
–
–
–
–
Dextrosa o sucrosa
Extracto de levadura
Peptona
Agua destilada
20
5
5
1
g
g
g
litro
Preparación
–
–
–
–
Calentar el litro de agua destilada con los
ingredientes para facilitar su mezcla, hasta que
la solución adquiera un color amarillo y se vea
cristalina: esta mezcla es el medio líquido.
Preparar 20 frascos erlenmeyer de 250 ml (cada
uno recibe 50 ml de la mezcla anterior).
Tapar cada uno de los frascos erlenmeyer con los
siguientes elementos: tapón de algodón, papel de
aluminio, papel de envolver y banda de caucho.
Llevar los frascos erlenmeyer al autoclave y
esterilizarlos.
Una vez preparado el medio líquido, se ejecutan los
cuatro pasos del proceso de producción.
9-3
Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
Pasos del proceso
Se toman los diferentes aislamientos de hongos que
serán utilizados para producir micelio, los cuales han
crecido previamente en cajas petri que contengan el
medio de cultivo adecuado. Se comprueba luego que
hayan esporulado y que estén totalmente puros (es
decir, libres de otros microorganismos contaminantes).
En estos procesos se utilizan pipetas pasteur estériles
y todos los procesos se ejecutan en la cámara de flujo
laminar.
• Paso 1
Marcar el frasco erlenmeyer con el nombre del
aislamiento que va a crecer en este medio. Proceder
luego de la siguiente manera: retirar de los frascos
erlenmeyer la banda de caucho, los pedazos de papel
de envolver y el tapón de algodón, y colocarlos a un
lado evitando que se contaminen, ya que serán
reutilizados en el paso siguiente.
• Paso 2
Tomar con la pipeta 5 ml de medio líquido del frasco
erlenmeyer, depositarlo sobre el hongo en
crecimiento en una caja petri y raspar su superficie
con la pipeta; de este modo se hace una suspensión
con el micelio y las esporas del aislamiento.
9-4
Guía Práctica 9: Micelio de hongos
Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN
• Paso 3
Aspirar con la pipeta la suspensión obtenida y
colocarla de nuevo en el frasco erlenmeyer de donde
se extrajo el medio líquido (paso anterior).
Inmediatamente después tapar el frasco erlenmeyer
colocando en él de nuevo el tapón de algodón, los
pedazos de papel de envolver y la banda de caucho
que se habían reservado.
• Paso 4
Colocar los frascos erlenmeyer en un agitador a
80 rpm durante 10 días a temperatura ambiente
(22 °C). Este tiempo es suficiente para que crezca el
micelio, que se cosechará más tarde. Durante la
agitación, el medio debe conservar su estado
cristalino. Si se ve turbio, está contaminado; se debe
descartar ese aislamiento y repetir todo el proceso.
B. Cosecha del micelio
Materiales
–
–
–
–
–
Frascos de vidrio con tapa rosca, que se esterilizan en
autoclave
Toallas de papel esterilizadas en autoclave
Gasa cortada en cuadros de 15 x 15 cm y esterilizada
en autoclave
Cinta de enmascarar delgada
Marcador de punta fina y recipiente de vidrio para
desechar el medio de cultivo líquido donde creció el
hongo
9-5
Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
Pasos del proceso
Foto 1
Foto 2
Foto 3
Foto 4
• Paso 1
Retirar de cada frasco erlenmeyer la banda de caucho,
los trozos de papel y el tapón de algodón (Foto 1).
• Paso 2
Colocar en la boca de cada frasco erlenmeyer un
cuadrado de gasa, sujetarlo allí con los dedos por sus
bordes (puede ayudarse con una varilla de vidrio
esterilizada) e inclinar el frasco erlenmeyer sobre un
vaso grande para que salga el medio líquido a través
de la gasa (Foto 2). De este modo se filtra el medio y
se retiene en la gasa el micelio que creció dentro del
frasco erlenmeyer (Foto 3).
• Paso 3
Retirar la gasa con el micelio de la boca del frasco
erlenmeyer y depositarlo sobre dos toallas de papel
(Foto 4). Enrollar las toallas sobre el micelio y hacer
presión con los dedos para extraerle el remanente de
medio de cultivo líquido (Foto 5).
• Paso 4
Tomar el frasco de vidrio con tapa rosca donde se
almacenará el micelio y marcarlo con el nombre del
aislamiento usando cinta de enmascarar (Foto 6).
Foto 5
Foto 6
9-6
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Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN
• Paso 5
Depositar el micelio secado con las toallas en el
fondo del frasco de vidrio, ya marcado, con la ayuda
de una espátula esterilizada pequeña (Foto 7).
Colocar luego la tapa del frasco (Foto 8) dejando
éste a medio cerrar (no enroscar totalmente la tapa).
• Paso 6
Llevar los frascos que contienen el micelio —y que
están aún con la tapa floja— al liofilizador (ver
descripción en otras guías) y dejarlos allí durante
24 horas para que termine de secar el micelio
(Foto 9). Pasado ese tiempo de secado, apagar el
liofilizador, retirar de él los frascos y ajustar sus
tapas.
Foto 7
Foto 8
Si no se procede enseguida a extraer el ADN del
micelio, los frascos con micelio se almacenarán a
−80 °C (Foto 10).
Foto 9
Foto 10
9-7
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Manejo de Patógenos del Frijol
C. Extracción del ADN del micelio
Materiales (soluciones)
Acetato de amonio 7.5 M
PM = 77.08 (CH3 –COO−NH4)
Preparación de 500 ml de solución:
–
–
–
Diluir 289 g de acetato de amonio en 300 ml de
agua destilada estéril. Cuando el acetato esté
completamente disuelto, ajustar el volumen de la
solución a 500 ml.
Esterilizar la solución mediante filtros de 0.22 μm.
Almacenar a temperatura ambiente (RT).
Buffer de extracción
Soluciones ‘stock’:
Solución ‘stock’
NaCl
Tris-HCl, pH 7.5
EDTA, pH 8.0
[Inicial]a
5M
1M
0.5 M
Volumen usado
(ml)
[Final]a
20
40
4
0.5 M
0.2 M
10 mM
Compuesto
SDSb (2 g)
1%
a. Concentraciones inicial y final (está en los 200 ml, ver abajo).
b. SDS = dodecil-sulfato sódico, compuesto tensoactivo aniónico.
9-8
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Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN
Preparación de 200 ml de buffer:
–
–
–
Disolver el SDS (2 g) en 80 ml de agua destilada
estéril tibia.
Adicionar las soluciones ‘stock’ como indica el
cuadro arriba y ajustar el volumen a 200 ml con
agua destilada estéril.
Guardar a temperatura ambiente (RT).
Proteinasa K
[10 mg/ml]
Referencia: Proteinasa K, Promega Cat# V3021 100 mg
Preparación:
•
Stock 1
[20 mg/ml]
Reconstituir 5 ml de una solución de Tris HCl 50 mM,
pH 8.0 y de una de CaCl2 10 mM, así:
–
–
–
•
Tomar 250 μl del ‘stock’ 1 M Tris-HCl pH 7.5
Añadirle 50 μl de un ‘stock’ 1 M CaCl2
Ajustar el volumen a 5 ml
Stock 2
[10 mg/ml]
Diluir 5 ml del ‘stock’ 1 anterior con 5 ml de gricerol
al 100%, para obtener una solución de glicerol al
50%.
–
Alicuotar la solución anterior en microtubos de
1.5 ml y almacenarlos a −20 °C.
La concentración usual de trabajo de la proteinasa K
está entre 50 y 100 μg/ml.
9-9
Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
1X TE pH 8.0
Soluciones ‘stock’:
Solución ‘stock’
[Inicial]a
Volumen usado
(ml)
Tris-HCl, pH 8.0
1M
5
10 mM
0.5 M
1
1 mM
EDTA, pH 8.0
[Final]a
a. Concentraciones inicial y final (está en los 500 ml, ver abajo).
Preparación de 500 ml de solución:
–
–
Ajustar el volumen (6 ml) hasta 500 ml con agua
destilada estéril.
Esterilizar esta solución por filtración (poros de
0.22 μm). Tomar alícuotas en microtubos de 1.5 ml
y guardarlos a 4 °C.
RNAasa A
[1 mg/ml]
Referencia: RNAasa A Roche 100 mg
Preparación:
•
Stock 1
[10 mg/ml]
– Resuspender todo el contenido de la enzima en
10 ml de una solución 10 mM de Tris-HCl,
pH 7.5 (100 μl de 1 M Tris-HCl) + 15 mM NaCl
(37.5 μl de 1 M NaCl)
– Calentar esta suspensión a 100 °C durante
15 minutos.
– Dejar enfriar a temperatura ambiente y tomar
alícuotas.
9 - 10
Guía Práctica 9: Micelio de hongos
Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN
•
Stock 2
[1 mg/ml]:
– Diluir 100 μl del ‘stock’ 1 anterior con
900 μl de solución 10 mM Tris-HCl
pH 7.5 + 15 mM NaCl (37.5 μl 1 M NaCl).
– Hacer alícuotas y almacenarlas a −20 °C.
Tris-HCl 1 M
Partiendo de Trizma Base:
PM = 121.1
Preparación de 1000 ml de solución:
–
–
–
–
Disolver 121.1 g de Trizma Base en 800 ml de agua
destilada.
Ajustar el pH al valor deseado adicionando HCl
concentrado.
Completar a 1 litro con agua destilada y esterilizar
en autoclave.
Guardar a 4 °C.
NaCl 5 M
PM = 58.44
Preparación de 500 ml de solución:
–
–
Disolver 146.1 g de NaCl en agua destilada.
Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura
ambiente.
9 - 11
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Manejo de Patógenos del Frijol
EDTA 0.5 M pH 8.0
PM = 372.4
Preparación de 1000 ml de solución:
–
–
–
Disolver 186.2 g de EDTA en 800 ml de agua
destilada; usar un agitador magnético.
Ajustar el pH hasta 8.0 con NaOH (~20 g) y
completar el volumen a 1000 ml. El EDTA se
disuelve bien cuando la solución alcanza el pH
apropiado.
Esterilizar en autoclave y guardar a temperatura
ambiente.
Acetato de sodio 3 M pH 5.2
PM = 82.03 (anhidro) (CH3−COO−Na)
Preparación de 100 ml de solución:
–
–
–
Disolver 24.61 g de acetato de sodio en 80 ml de
agua destilada.
Ajustar el pH hasta 5.2 con ácido acético glacial y
completar el volumen a 100 ml.
Esterilizar en autoclave y guardar a temperatura
ambiente.
9 - 12
Guía Práctica 9: Micelio de hongos
Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN
Proceso de extracción
La extracción del ADN del micelio de los hongos
fitopatógenos considerados en estas guías comprende
los siguientes pasos:
1. Precalentar el buffer de extracción a 65 °C al baño
María.
2. Adicionar al buffer la Proteinasa K [10 mg/ml] hasta
obtener una concentración final de 30 µg/ml.
Adicionar, por tanto, 3 µl de Proteinasa K por cada
ml de buffer, lo que equivale a tomar 2.1 µl de
Proteinasa K por 700 µl de buffer.
3. Macerar el micelio fresco o almacenado (ver
protocolo anterior) empleando nitrógeno líquido.
Pasar el micelio macerado a tubos eppendorf de
1.5 ml con la ayuda de un pistilo, llenándolos hasta la
marca de 100 o 150 µl.
4. Adicionar a cada muestra (tubo de 1.5 ml) 700 µl
del buffer de extracción con Proteinasa K preparado
en el Paso 2. Homogeneizar la mezcla mediante
vórtex o mezclador de tubos e incubar al baño María
a 65 °C durante 1 hora, como mínimo.
5. Mezclar por inversión manualmente cada 20 o
30 minutos.
6. Hay dos opciones en este paso:
–
Después de la incubación (Paso 4), agregar
0.5 volúmenes del acetato de amonio 7.5 M
preparado antes, mezclar por inversión del tubo e
incubar a temperatura ambiente durante
10 minutos.
9 - 13
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Manejo de Patógenos del Frijol
–
Después de la incubación (Paso 4), mezclar
nuevamente y agregar un volumen igual
(700 µl) de la solución de fenol, cloroformo e
isoamilalcohol (25:24:1) y mezclar con vórtex.
Esta solución fenólica debe manipularse en
cámara extractora evitando inhalar los vapores
que desprende.
7. Centrifugar a temperatura ambiente a 12.000 rpm
durante 10 minutos.
8. Rescatar el sobrenadante, teniendo cuidado de no
tomar la interfase, y pasarlo a un nuevo tubo
eppendorf de 1.5 ml.
9. Adicionar 1 volumen igual de una solución de
cloroformo y alcohol isoamílico (24:1) y centrifugar a
12.000 rpm durante 10 minutos a temperatura
ambiente. La solución debe estar a temperatura
ambiente al momento de usarla y debe manipularse
en cámara extractora evitando inhalar los vapores
que desprende.
10. Rescatar el sobrenadante y pasarlo a un nuevo tubo
eppendorf de 1.5 ml.
11. Paso opcional: Agregar acetato de sodio 3 M de
pH 5.2 (1/10 del volumen del sobrenadante) y
homogeneizar manualmente por inversión.
12. Agregar isopropanol frío en una relación 1:1 y
homogeneizar suavemente por inversión del tubo
manualmente.
13. Incubar a –20 °C durante toda la noche.
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Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN
14. Centrifugar a 14.000 rpm durante 10 minutos a
temperatura ambiente y descartar el sobrenadante
invirtiendo el tubo, teniendo cuidado de no perder la
bolita (‘pellet’) de ADN.
15. Lavar el ‘pellet’ con 800 µl de etanol al 70%, frío y
centrifugarlo a 14.000 rpm durante 5 minutos.
16. Descartar el sobrenadante y secar el ‘pellet’ por
inversión del tubo, a temperatura ambiente.
17. Diluir el ‘pellet’ en el buffer 1X TE ya preparado
(usualmente, en 100 µl) añadiendo 2 µl de RNAasa
[1 mg/ml] e incubar a 37 °C durante una hora,
como mínimo.
Recomendación: Resuspender el ‘pellet’ durante
toda la noche a 4 °C con 1X TE, y al día siguiente
adicionarle la RNAasa; incubar luego a 37 °C.
18. Almacenar el ADN a –20 °C.
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