Diapositiva 1 - Fundacion Conchita Rabago de Jimenez Diaz

Terapia génica del síndrome de Wiscott-Aldrich:
hacia la expresión
fisiológica del gen terapéutico
Dr. Francisco Martín
Molina.
Gene and Cell Therapy Group
Centro Pfizer-Universidad de Granada-Consejería de Salud de
Genómica e Investigación oncológica (GENYO)
Parque Tecnológico Ciencias de la Salud (PTS)
¿Que es la terapia génica?
DISCIPLINA CUYO OBJETIVO ES LA CURA O CONTROL DE ENFERMEDADES MEDIANTE
MODIFICACIÓN GENÉTICA
•
Vectores: herramientas utilizadas para introducir el material genético en las
células deseadas.
– Virales (oncoretrovirus, lentivirus, adenovirus, adenoasociados, otros)
– No virales (ADN desnudo, Liposomas, etc)
•
Células diana. Son las células a modificar por el vector
– Cáncer: Células tumorales o células del sistema inmune.
– Inmunodeficiencias: Células hemotopoieticas multipotenciales.
– Enfermedades autoinmunes: Células del sistema inmune.
LENTIVIRAL VECTORS: Efficacy and safety
LENTIVIRAL VECTORS: Efficacy and safety
Genoma Viral
LENTIVIRAL VECTORS: Efficacy and safety
Gen terapéutico
Nuestra experiencia:
Terapia génica del síndrome de Wiskott-Aldrich
- Inmunodeficiencia ligada al cromosoma X causada por mutaciones en el gen WASP, expresado
únicamente en el sistema hematopoyético.
- La proteína WASP hace de adaptador entre señales extracelulares y reorganización del
citoesqueleto.
WASP es importante:
Pacientes con WAS
Señalización
Migración
Sinapsis inmunológica
Infecciones recurrentes
Hemorragias
Leucemias
Tratamiento
Trasplante de médula
Eliminación del bazo
Inmunoglobulinas
Antecedentes
Terapia génica de WAS y otras inmunodeficiencias Primarias
Células troncales hematopoyéticas
de los pacientes (HSCs)
Oncoretrovirus (RVs)
cDNA expresando la versión correcta del gen
mutado en la inmunodeficiencia
Células troncales
hematopoyéticas de los pacientes
Células troncales
(HSCs)
hematopoyéticas
Vectores retrovirales expresando
la proteína “que les falta” a los
pacientes
Ensayos clínicos de TG utilizando vectores
g-retrovirales (RVs)
- Inmunodeficiencias primarias:
-
SCID-X1 (Francia e Inglaterra)
SCID-ADA (Italia)
CGD (Alemania)
WAS (Alemania)
60 de unos 70 pacientes intervenidos han corregido sus defectos funcionales y
pueden vivir vidas normales o “casi” normales
Resultados globales de supervivencia y efectos secundarios en línea con
trasplante de médula haploidentico
¿Problemas?
Genotoxicidad
Eficiencia/estabilidad
RVs: Problemas I
Pérdida de la expresión del gen terapéutico
-
SCID-X1 (Francia e Inglaterra)
SCID-ADA (Italia)
CGD (Alemania). Silenciamiento del promotor
WAS (Alemania)
RV: Problemas II
Desarrollo de leucemias
-
Gen B
SCID-X1 (Francia e Inglaterra)
SCID-ADA (Italia)
CGD (Alemania)
WAS (Alemania)

RRE
Gene terapéutico
400bp
Gag (ATGD)
Gen A
Activación de oncogenes
Alteración de la expresión del vector dependiente del sitio de integración
Mejoras en los vectores retrovirales:
Bioseguridad y eficiencia
Promotor viral muy fuerte: “Enhancer” capaz de activar genes lejanos
Primera generación

RRE
Therapeutic gene
g-retrovirales (RVs)
400bp
Gag (ATGD)
Tercera generación
g-retrovirales (RVs)

RRE
400bp
Gag (ATGD)
Therapeutic gene
Lentivirus (LVs)
Alfavirus
Ensayos clínicos fase I/II para TG WAS
(Auiti, Science 2013 & Hacein-Bey Abina, JAMA 2015)
Resultados obtenidos en 10 pacientes con WAS:
No Leucemias
Reducción del número de infecciones, sangrados, eczema y manifestaciones autoinmunes
50% de los pacientes no requieren administración de inmunoglobulinas
La microtrombocitopenia se mantiene en varios pacientes
Expresión de WASP en plaquetas y células B por debajo de lo “normal”
Mutaciones en el gen WASP
Ausencia de proteína o de función = Inmunodeficiencia (WAS)
Reducción en la actividad = Trompocitopenia (XLT)
Forma hiperactiva de la proteína = Neutropenia (XLN).
Es importante mantener los niveles fisiológicos de expresión
1- Solo se debe de expresar en las células que normalmente lo expresen
2- Debe de expresar niveles parecidos al sistema hematopoyético de individuos sanos
Terapia celular-génica del Síndrome de Wiskott
y Aldrich (WAS)
Objetivo 1
Desarrollar vectores lentivirales para TG de WAS con expresión lo
mas fisiológica posible
Objetivo 2
Desarrollar modelos celulares humanos donde poder estudiar las
estrategias terapéuticas
Diseño de vectores mas seguros y eficientes para
TG de WAS
LVs
c-Ets-1, PU.1, cRel
Promotor
proximal WASP
WASP
0.5WW
Similar al 1.6kb_WW
c-Ets-1, PU.1, cRel
Promotor proximal y
alternativo WASP
WASP
AWW
PU.1, c-ETS-2, Sp1, c-Myb, AP2, GCF, C/EBP
LENTIVIRAL VECTORS for WAS GT
Promotor WAS
WASP
LVs expresando el gen
WASP por diferentes
fragmentos de su propio
promotor
¿Es específico de células
hematopoyéticas?
Células TWAS
Fibroblastos
células endoteliales
Células mesenquimales
Martin et al. Gene Therapy 2005
¿Expresión fisiológica? Análisis en Células T de pacientes WAS
Rescate funcional de células T de pacientes WAS
- Normalización de la respuesta a
αCD3 (proliferación) de células T de
pacientes WAS
Reconstitución morfológica de células T de pacientes WAS
Martin et al. Gene Therapy 2005
¿Qué vector consigue expresar
WASP de forma mas fisiológica
en los diferentes linajes
hematopoyéticos ?
0.5_WW
AWW
hHSC
0.5_WE
2 Gry x77´´
Newborn
RAG2-/-; gc-/- MICE
AWE
CD34+ de sangre de
cordón umbilical
HSC/ WE
HSC/ AWE
Los vectores terapéuticos incorporando el promotor alternativo expresan
“mas fisiológicos” que los que tienen solo el promotor proximal
0.5_WE
AWE
WASP
WASP
Frecha et al. Gene Therapy 2008
Terapia celular-génica del Síndrome de Wiskott
y Aldrich (WAS)
Objetivo 2: Desarrollar modelos celulares humanos donde poder estudiar las estrategias
terapéuticas
- Células inmortalizadas WASKO
- Células embrionarias humanas (hESCs) WASKO
WASP
WASP
Determinar como y cuando se expresa WASP durante diferenciación
hematopoyética y estudiar su función
Estudiar que vectores mimetizan mejor este patrón de expresión
Megacariopoyesis y trombopoyesis
Desarrollo de células embrionarias deficientes para WASp
hESCs-WASKO:
La patología en el laboratorio (Disease in a Dish)
Generación de líneas embrionarias humanas deficientes para
WAS: Generación de plaquetas WASKO
La ausencia de WASp incrementa la aparición de MKs y plaquetas derivadas
de hESCs
La ausencia de WASp afecta en mayor medida a los MKs que a las plaquetas
derivadas de hESCs
Respuesta a trombina
Ca++
Toscano et al. Molecular Therapy 2015
Hipótesis
La reducción de plaquetas en sangre de pacientes con WAS es debido a
alteraciones que ocurren en los megacariocitos
Preguntas
¿Cómo afecta a los megacariocitos la expresión reducida y/o elevada de WASP?
¿Logran los vectores actuales niveles fisiológicos de WASP en megacariocitos?
On going ……
Megacariopoyesis y trombopoyesis
¿ [WASP ] ?
¿ [WASP ] ?
¿ [WASP ] ?
Modelos celulares: Células HSCs de pacientes WAS y células
inmortalizadas editadas
Modelos celulares: Células HSCs de pacientes WAS y células
inmortalizadas editadas
HSCs
WASKO
K562_WASKO
MEG-1_WASKO
AWW: LENTIVIRAL VECTORS for WAS GT ?
AWW
WASP
ORPHAN DRUG
DESIGNATION
CLINICAL TRIAL
AGRADECIMIENTOS
GTCG
Pablo Menéndez
Miguel G. Toscano
Pilar Muñoz
Marién Cobo
Almudena Gilabert
María Tristán
Clara Bueno
Pedro Real
Verónica Ramos
Karim Benabdellah
Alejandra Gutierrez
Sabina Sánchez
Per Anderson
Ana Belén Carrillo
INSERN (Université de Lyon)
Els Verhoyen
Cecilia Frecha
Sangamo Biosciences
San Francisco. CA
Institute of Child Health
UCL. London
Ignacio Molina
Michael Holmes
Adrian Thrasher
Zulema Romero