A-006 - Universidad Nacional del Nordeste

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2003
Resumen: A-006
Transmisión de marcadores moleculares ligados a la aposporia
en Paspalum notatum.
Martínez, Eric J. - Acuña, Carlos - Coenes, Daniel - Fortes, Nidia B. - Quarin, Camilo L.
Cátedra de Genética y Fitotecnia - Facultad de Cs. Agrarias - UNNE. - IBONE-CONICET
Sargento Cabral 2131 - CC 209 - (3400) Corrientes - Argentina.
Tel./Fax: +54 (03783) 426218
E-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
La apomixis es un sistema de reproducción asexual por medio de semillas (Nogler 1984) que permite la clonación
natural de un genotipo determinado. La aposporia es una variante de la apomixis gametofítica que involucra la
formación de sacos embrionarios no reducidos (2n) a partir de células de la nucela del óvulo. Los embriones se originan
por partenogénesis de la ovocélula no reducida. Es un carácter regulado genéticamente y en algunas gramíneas se
determinó que posee un control monogénico y dominante (Savidan 1982; do Valle y col. 1994; Sherwood y col. 1994,
Ozias-Akins y col. 1998, Martínez y col. 2001). En los últimos años se han detectado varios marcadores moleculares
ligados a la apomixis apospórica en Cenchrus ciliare (Gustine y col. 1997), Pennisetum squamulatum (Ozias-Akins y
col. 1993, 1998), Brachiaria (Pessino y col. 1997 y 1998) y Paspalum (Martínez 2001; Pupilli y col. 2001).
La ausencia de apomixis a nivel diploide es un aspecto que aún no ha sido del todo dilucidado. Aún no se sabe si se
debe a un problema de ausencia del factor(es) necesario/s para su expresión o al hecho de que existe algún mecanismo
que condiciona la expresión del carácter. Se ha propuesto que el factor que controla la apomixis estaría asociado a un
gen letal para los gametos monoploides (n=x) y por lo tanto no se podría transmitir en los gametos del nivel diploide
(Nogler 1982). Sin embargo, la simple duplicación cromosómica de plantas diploides sexuales de Paspalum originó
plantas tetraploides con reproducción apomíctica facultativa (Quarin y Hanna 1980; Quarin y col. 2001).
El objetivo de este trabajo fue analizar la transmisión del carácter aposporia en cruzamientos que involucren plantas
diploides y tetraploides sexuales y un padre triploide apomíctico, con la finalidad de establecer la relación existente
entre el nivel de ploidía y la expresión del carácter.
MATERIALES Y METODOS
Se utilizaron como progenitores femeninos cuatro genotipos diploides (2n=2x=20), dos tetraploides sexuales
(2n=4x=40) y un tetraploide apomíctico facultativo. Un único genotipo triploide apomíctico (2n=3x=30) fue empleado
como donador de polen. Los genotipos diploides y tetraploides sexuales como así también el tetraploide apomíctico
facultativo carecen de ambos marcadores de RAPD ligados a la apomixis (datos previos propios). La Tabla 1 contiene
las características reproductivas de cada uno de ellos y su origen.
Tabla 1. Genotipos utilizados en los distintos cruzamientos de Paspalum notatum.
Accesión
2n
Reproducción
Origen
Q4084 #2
20
Sexual
Argentina, Santa Fe, Cayasta (Planta #2)
C4-55
20
Sexual
Argentina, Corrientes (origen experimental)
Q3658
20
Sexual
USA, Georgia, Tifton (Planta # 2)
Q4175
20
Sexual
Argentina, Santa Fe, Dep. San Justo, 15 Km al oeste de La Criolla
Q3686
30
Apomixis
Argentina, Corrientes, 18 Km al norte de Sauce, Paso Mula
Q3664
40
Apomixis facultativo
USA, Georgia, Tifton (origen experimental)
Q4188
40
Sexual
Argentina, Corrientes (híbrido F1 # 31, entre Q3664 x Q3853)
Q4205
40
Sexual
Argentina, Corrientes (origen experimental, autofecundación Q3664)
Se realizaron cruzamientos controlados de acuerdo a la técnica descrita por Burton (1948). Los cariopses obtenidos
fueron sembrados en terrinas bajo invernáculo. Los plantines fueron transplantados a macetas y al mes llevados a tierra.
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2003
Resumen: A-006
La metodología empleada consistió en lo siguiente: primero se emplearon dos marcadores de RAPD 100% ligados a la
aposporia (Martínez 2001) para determinar la presencia de los mismos en las progenies. Para ello se efectuaron
extracciones de ADN y amplificaciones por PCR de acuerdo a lo descrito por Martínez (2001). Una vez confirmada la
presencia o ausencia de los respectivos marcadores en cada una de las progenies se realizaron recuentos cromosómicos
de todas las plantas que poseían uno o los dos marcadores ligados a aposporia; como así también de algunas progenies
que no lo poseían. Esto nos permitió saber el número cromosómico de los gametos aportados por el padre triploide
apomíctico. Las plantas diploides y tetraploides sexuales normalmente aportan gametos reducidos con n=10 y 20
cromosomas respectivamente. Por último, se efectuó un análisis embriológico de las plantas que amplificaron los
marcadores específicos de la aposporia para correlacionar la presencia de los mismos y la capacidad para formar sacos
embrionarios apospóricos. Los recuentos cromosómicos fueron llevados a acabo de acuerdo a la metodología descrita
por Quarin y col. (2001); mientras que el análisis embriológico se efectuó por medio la técnica de clarificado de ovarios
de Herr (1971).
RESULTADOS Y DISCUSION
Se obtuvieron 7 progenies, de las cuales 4 de ellas fueron originadas por cruzamientos entre plantas diploides sexuales
(Q4084 #2, C4-55, Q3658 y Q4175) como progenitores femeninos y un triploide apomíctico (Q3686) como donador de
polen. Las restantes progenies se obtuvieron al utilizar como madres dos plantas tetraploides sexuales (Q4188 y Q4205)
y un tetraploide apomíctico facultativo (Q3664) con bajo nivel de expresión de la apomixis (Tabla 1). En general, los
porcentajes de plantas obtenidas con relación al número de espiguillas polinizadas fueron muy bajos y variaron entre
0,2 y 2%.
En el cruzamiento Q4084 #2 X Q3686 (diploide X triploide) se obtuvieron 10 plantas de las cuales dos amplificaron
ambos marcadores ligados a aposporia (Figura 1) y resultaron ser triploides 2n=30 (Tabla 2). Estos triploides
probablemente se originaron por la unión de gametos femeninos con n=10 cromosomas y gametos masculinos con
n=20. El resto de las progenies de este cruzamiento tenían un número cromosómico 2n=20. El análisis embriológico
efectuado en las dos progenies triploides que poseían ambos marcadores demostró que las mismas se reproducen por
apomixis. Se observó un alto porcentaje de sacos embrionarios apospóricos (>95%) e incluso varios sacos por óvulo. En
los restantes cruzamientos entre plantas diploides y el triploide apomíctico no se detectaron progenies con los
marcadores y las mismas resultaron ser diploides (2n=20). En el cruzamiento entre Q3658 X Q3686 no se obtuvieron
plantas para el análisis (Tabla 2).
Se obtuvieron un total de 41 plantas del cruzamiento Q3664 X Q3686 (tetraploide X triploide). Una de las plantas
amplificó el marcador UBC243-377 (Figura 1) pero no UBC259-1157 (Tabla 2). Lamentablemente esta planta murió al
poco tiempo de ser llevada a campo y por eso no se pudo efectuar el recuento cromosómico y el análisis embriológico.
Los recuentos cromosómicos efectuados al azar en 13 plantas de este cruzamiento nos permitieron detectar una planta
con 36, una con 37, cuatro con 39 y siete con 40 cromosomas. Por tratarse de una madre tetraploide sexual, lo más
probable es que la misma aportó gametos reducidos con n=20 cromosomas, mientras que el padre triploide debió haber
aportado gametos con n=16, 17, 19 y 20 cromosomas.
En el cruzamiento de Q4188 X Q3686 (tetraploide X triploide), sobre un total de 27 plantas obtenidas, no se observó
ninguna progenie con los marcadores ligados a la aposporia (Tabla 2). Por último, en el cruzamiento entre Q4205 X
Q3686 (tetraploide X triploide) se obtuvieron 45 progenies, de las cuales una amplificó ambos marcadores (Figura 1).
Esta planta resultó tener 39 cromosomas y seguramente se formó por la unión de un gameto femenino con n=20
cromosomas y otro masculino con n=19. El análisis embriológico aún no pudo efectuarse por falta de floración durante
su primer año de crecimiento. En recuentos cromosómicos efectuados al azar en 8 progenies de este cruzamiento se
encontraron plantas con 2n= 36, 37, 38, 39 y 40 cromosomas.
Hasta el momento, no se ha podido detectar ninguna planta que amplifique los marcadores ligados a aposporia y que
provenga de gametos masculinos monoploides (n=x=10) o hipermonoploides (n=x+1, 2, etc.). Por lo tanto, en principio
la hipótesis planteada por Nogler (1982) se estaría cumpliendo y la apomixis solo puede ser transmitida a partir de
gametos diploides (n=2x). Un dato a tener en cuenta es el hecho que hasta el momento no se han podido detectar plantas
triploides (2n=3x=30) que provengan de cruzamientos entre tetraploides sexuales X triploide apomíctico. Esto puede
deberse a la existencia de un desbalance cromosómico del endosperma producido por la relación existente entre el
aporte genómico materno y paterno. En los cruzamientos entre plantas tetraploides sexuales X triploide apomíctico la
formación de un embrión triploide (n + 2n) produciría una relación en el endosperma de 4:1 entre los genomas materno
y paterno. En un estudio previo en P. notatum, Quarin (1999) demostró que en los cruzamientos en los cuales se
emplearon citotipos diploides o tetraploides sexuales como madre, era necesario que exista en el endosperma una
relación materno:paterno de 2:1 para que se produzca semilla normalmente.
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2003
Resumen: A-006
Tabla 2. Cruzamientos efectuados, plantas obtenidas y marcadores moleculares ligados a la
aposporia detectados en las progenies de Paspalum notatum
Espiguillas
polinizadas
Plantas
obtenidas
Q4084 #2 X Q3686
4890
10
2
2
C4-55 X Q3686
1956
4
0
0
Q3658 X Q3686
398
0
0
0
Q4175 X Q3686
1264
8
0
0
Q3664 X Q3686
2050
41
1
0
Q4188 X Q3686
1687
27
0
0
Q4205 X Q3686
5000
45
1
1
Cruzamiento
Número de plantas con
UBC243-377(1) UBC259-1157(1)
(1) Marcadores de RAPD 100 % ligados a aposporia en Paspalum notatum (Martínez 2001)
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos hasta el momento son preliminares y por lo tanto no permiten sacar una conclusión definitiva
sobre la factibilidad de transmisión del locus de la aposporia a partir de gametos monoploides o hipermonoploides. Si
bien es cierto que hasta ahora no se han detectado plantas apomícticas originadas a partir de estos gametos, es necesario
analizar un mayor número de progenies y realizar nuevas combinaciones que nos permitan obtener resultados
concluyentes. Por otra parte, el mismo estudio también se está llevando a acabo en P. simplex con la finalidad comparar
el comportamiento entre estas dos especies.
BIBLIOGRAFIA
Burton G.W. (1948) Artificial fog chamber facilitates Paspalum emasculation. J. Am. Soc. Agron. 40: 281-282.
do Valle C.B., Glienke C. y G.O.C. Leguizamon (1994) Inheritance of apomixis in Brachiaria, a tropical forage grass.
Apomixis Newsl. 7: 42-43.
Gustine D.L., Sherwood R.T. y D.R. Huff (1997) Apospory-linked molecular markers in buffelgrass. Crop Sci. 37: 947951.
Herr, J.M. (1971). A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Amer. J. Bot.
58:785-790.
Martínez E.J. (2001) Herencia de la reproducción apomíctica e identificación de marcadores moleculares ligados al
carácter en Paspalum notatum. Tesis presentada para obtener el título de Doctor de la Universidad de Buenos
Aires (Área: Ciencias Biológicas)
Martínez E.J., Urbani M.H., Quarin C.L. y J.P.A. Ortiz (2001) Inheritance of apospory in bahiagrass, Paspalum
notatum. Hereditas 135: 19-25
Nogler G.A. (1982) How to obtain diploid apomictic Ranunculus auricomus plants not found in the wild state. Botanica
Helvetica 92: 13-22.
Nogler G.A. (1984) Gametophytic apomixis. In: Johri BM (ed.). Embryology of angiosperms. Springer-Verlag, Berlin,
pp 475-518.
Ozias-Akins P., Lubbers E.L., Hanna W.W. y J.W. McNay (1993) Transmission of the apomictic mode of reproduction
in Pennisetum: co-inheritance of the trait and molecular markers. Theor. Appl. Genet. 85: 632-638.
Ozias-Akins P., Roche D. y W.W. Hanna (1998) Tight clustering and hemizygosity of apomixis-linked molecular
markers in Pennisetum squamulatum implies genetic control of apospory by a divergent locus that may have no
allelic form in sexual genotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 5127-5132.
Pessino S.C., Ortiz J.P., Leblanc O., do Valle C.B. y M.D. Hayward (1997) Identification of a maize linkage group
related to apomixis in Brachiaria. Theor. Appl. Genet. 94: 439-444.
Pessino S.C., Evans C., Ortiz J.P.A., Armstead I., do Valle C.B. y M.D. Hay-ward (1998) A genetic map of the
apospory-region in Brachiaria hybrids: Identification of two markers closely associated with the trait. Hereditas.
128: 153-158.
Pupilli F., Labombarda P., Cáceres M.E., Quarin C.L. y S. Arcioni (2001) The chromosome segment related to
apomixis in Paspalum simplex is homoeologous to the telomeric region of the long arm of rice chromosome 12.
Mol. Breed. 8: 53-61.
Quarin C.L. y W.W. Hanna (1980) Effect of three ploidy levels on meiosis and mode of reproduction in Paspalum
hexastachyum. Crop Sci. 20: 69-75.
Quarin C.L. (1999) Effect of pollen source and pollen ploidy on endosperm formation and seed set in pseudogamous
apomictic Paspalum notatum. Sex. Plant Reprod. 11: 331-335.
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2003
Resumen: A-006
Q3686
Q3664
Q3686
Q3686
(C)
100 bp
(B)
100 bp
Q4205
(A)
Q4084 #2
Quarin C.L., Espinoza F. Martínez E.J., Pessino S.C. y O.A. Bovo (2001) A rise of ploidy level induces the expression
of apomixis in Paspalum notatum. Sex. Plant Reprod. 13: 243-249.
Savidan Y. (1982) Nature et hérédité de l’apomixie chez Panicum maximum Jacq. Travaux et Documents OSTROM,
Paris, 153: 1-159.
Sherwood R.T., Berg C.C. y B.A. Young (1994) Inheritance of apospory in Buffelgrass. Crop Sci. 34: 1490-1494.
Q4084 #2 x Q3686
*
C4-55 x Q3686
*
Q3664 x Q3686
*
Q4205 x Q3686
*
Figura 1. Patrón de amplificación del primer UBC243 de RAPD en cuatro progenies de Paspalum
notatum. (A) Progenies originadas por cruzamiento entre dos plantas diploides (Q4084 #2 y C455) y un triploide apomíctico (Q3686). (B) Progenie obtenida por cruzamiento entre una planta
tetraploide apomíctica facultativa (Q3664) y un triploide apomíctico (Q3686). (C) Progenie
producto del cruzamiento entre una planta tetraploide sexual (Q4205) y un triploide apomíctico
(Q3686). Las flechas indican la banda ligada a aposporia (UBC243-377) amplificada por el padre
triploide apomíctico (Q3686) y los asteriscos las plantas que amplificaron dicha banda. 100 bp es
el marcador de peso molecular.