Standarización de la técnica de extracción de ADN de bacterias

Resumen: M-071
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
Standarización de la técnica de extracción de ADN de bacterias periodontales
en placas ateromatosas de aorta.
Rosende, Virginia C. - Zibelman de Gorodner, Ofelia - Lucero, Horacio - Guiroy, Juan
Instituto de Medicina Regional
Av Las Heras 727 CP: 3500 Resistencia Chaco – Argentina
Tel- fax : 03722- 428213 e-mail : [email protected]
Resumen:
Cientos de bacterias diferentes habitan la cavidad bucal. La enfermedad periodontal es la inflamación de los tejidos de
soporte de los dientes; aproximadamente una docena de bacterias están asociadas a su etiología. Estas bacterias
incorporadas a la placa dental atenúan la respuesta inmunitaria disminuyendo la fagocitosis y así prolongan el proceso
infeccioso.
Además estas bacterias pueden penetrar los tejidos periodontales y alcanzar el torrente sanguíneo produciendo una
bacteriemia. Es por ello que se vincula a este tipo de enfermedades infecciosas como un factor de riesgo para
arteriosclerosis vascular y cardiopatía isquémica. Algunas de las bacterias asociadas a ambas patologías y que han sido
estudiadas por varios autores son el Actinobacillus Actinomicetemcomitans y la Porfiromona Gingivalis entre otras.1
De aquí surge nuestro interés en identificar dichas bacterias propias de la enfermedad periodontal en placas
ateromatosas de aorta de pacientes con diagnóstico de enfermedad periodontal y coronariopatía severa que requieren
de cirugía de revascularización miocárdica, mediante el uso de la técnica de Multiplex- PCR (reacción en cadena de la
polimerasa).
Antecedentes del tema:
El término enfermedad periodontal destructiva crónica describe todas las formas de enfermedad periodontal causadas
primariamente por factores locales como ser la placa bacteriana y el trauma oclusal. La periodontitis es el tipo más
común enfermedad periodontal producida por la extensión hacia los tejidos periodontales de la inflamación iniciada en
la encía hacia los tejidos periodontales de soporte. Dentro de ella, la periodontitis simple se caracteriza por la
inflamación crónica de la encía, la formación de bolsa periodontal y la pérdida ósea acompañante.2
Cada tipo de periodontitis está asociado a diferentes tipos de bacterias. Entre ellas, el Actinobacillus
Actinomicetemcomitans, un cocobacilo fermentativo inmóvil, Gram- negativo, se vincula a la periodontitis juvenil. Y la
Porfiromona Gingivalis, bacteria Gram – negativa anaerobia, fuertemente implicada en la periodontitis del adulto.1
Estas especies bacterianas periodontales pueden invadir directamente células y tejidos.3
Como ya se mencionó, la enfermedad periodontal es una patología infecciosa crónica y progresiva que se produce como
consecuencia de la respuesta inflamatoria del huésped a la agresión tisular por microorganismos predominantemente
gramnegativos y anaerobios de la placa bacteriana depositada en el surco gingivodental.4 La etiología de las diversas
periodontopatías es multifactorial e involucra la presencia de ciertos patógenos periodontales específicos a los que se
suman los factores de riesgo extrínsecos e intrínsecos del paciente;5 los patógenos periodontales, sus toxinas y la
respuesta inmunoinflamatoria que desencadenan tienen consecuencias orgánicas que van más allá de la destrucción
tisular local.3
Diferentes autores demostraron que en presencia de bolsas periodontales se producen bacteriemias posteriores al
cepillado dental, la masticación y manipulación de placa bacteriana en tratamientos periodontales. 1,3, 6
La cardiopatía isquémica y las enfermedades cardiovasculares son la primer causa de mortalidad en países
desarrollados, tanto en hombres como en mujeres, determinando una importante tasa de morbilidad y demandando altos
costos a los sistemas de salud. La cardiopatía isquémica es de origen multifactorial los principales factores de riesgo
que se asocian son la hipertensión arterial, el tabaquismo, la diabetes, la hipercolesterolemia, entre otros.7 Existe una
estrecha relación entre los procesos inflamatorios y la aterosclerosis, como lo prueba el hecho de que factores como la
hipertensión, la diabetes, el colesterol o la obesidad, que incrementan el tono inflamatorio del cuerpo, están muy
relacionados con el riesgo cardiovascular; los mecanismos inflamatorios juegan un papel importante en la etiología de
la aterosclerosis, ya que estos factores de riesgo convencionales y las infecciones crónicas elevan los niveles de
citoquinas: estas pasan a la sangre, actúan sobre otras células y el resultado final es el daño del vaso.8
La enfermedad periodontal se considera un factor de riesgo potencial para el desarrollo de aterosclerosis coronaria y
eventos coronarios agudos como el infarto de miocardio. 9-17 Para establecer dicho vínculo se han realizados múltiples
estudios, desde análisis meramente clínicos3, 18 a otros que la relacionaron con patrón angiográfico,19 hasta la utilización
de técnicas mucho más sofisticadas, como ser cultivos in vitro para constatar la invasión de bacterias periodontales a las
células endoteliales1, utilización de PCR20 y variantes de la misma.21,22
Nuestra hipótesis de trabajo consiste en determinar que la presencia de bacterias periodontales, como Actinobacilo
actinomicetemcomitans y Porfiromona gingivalis en placas ateromatosas de aorta permite identificarlas como un factor
de riesgo en la génesis de la enfermedad isquémica cardiovascular. Este proyecto planifica mediante la aplicación de
técnicas de biología molecular detectar la presencia de dichas bacterias en placas ateromatosas de aorta de pacientes con
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antecedentes de aterosclerosis coronaria severa y enfermedad periodontal. La primera fase comprende la standarización
de la técnica Multiplex - PCR aplicada a esta finalidad.
Materiales y Métodos:
Se analizaron las lesiones ateromatosas de aorta obtenidas por punch intraoperatorio de pacientes intervenidos por
cirugía de revascularización miocárdica en el Sanatorio Güemes de Resistencia, Chaco en un lapso de 8 meses.
Se utilizó el índice de Ramfjord para evaluar el estado periodontal de los pacientes a ser intervenidos.
La técnica de diagnóstico que se utilizó fue la de Multiplex-PCR (reacción en cadena de polimerasa). Los 16S rDNA
primers utilizados son los siguientes:
A. actinomycetemcomitans : primer (AaF), 5´-ATT GGG GTT TAG CCC TGG TG-3´;
P. gingivalis primer (PgF), 5´-TGT AGA TGA CTG ATGGTG AAA ACC-3´
C11R Reverse: primer (C11R), 5´-ACG TCA TCC CCA CCT TCC TC- 3´
Recolección de muestras:
Actualmente se han recolectado 17 muestras provenientes de lesiones ateromatosas de aorta obtenidas por punch
intraoperatorio de pacientes intervenidos por cirugía de revascularización miocárdica, las mismas fueron resuspendidas
en buffer de PBS.
Procesamiento de muestras:
El procesamiento de dichas muestras constó de varias etapas:
Etapa I: Extracción de ADN
Etapa II: Preparación de controles positivos
Etapa III: Standarización de la técnica de amplificación del ADN por PCR
Etapa IV: Corrida electroforética de los fragmentos amplificados.
Etapa V: Amplificación de control interno de integridad de ADN extraído
Etapa I: Extracción del ADN
La técnica de extracción empleada fue con bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) con purificación
Las muestras obtenidas han sido seccionadas con bisturí bajo flujo laminar clase II. Para luego realizar la digestión con
el buffer de CTAB. Finalizada la misma se realizó la extracción con cloroformo/alcohol isoamílico, posteriormente
con alcohol isopropílico y por ultimo con etanol 70%. Finalmente el ADN obtenido se resuspendió en agua destilada
estéril.
Etapa II: Preparación de controles positivos
Como controles positivos se utilizó ADN bacteriano obtenido de cultivos de cepas puras de Actinobacilo
Actinomicetemcomitans y la Porfiromona Gingivalis, las que fueron provistas por el Servicio de Bacteriología del
Instituto “Carlos G. Malbrán”. Los cultivos se realizaron en el Área de Bacteriología del Instituto de Medicina
Regional. Las bacterias recuperadas fueron resuspendidas en caldo glicerinado 15%.
El método de extracción utilizado en este caso fue el de Boiling, dicha técnica consiste en mantener la muestra en tubo
eppendorf a 100º C durante 15 minutos.
Etapa III: Standarización de la técnica de amplificación del ADN por PCR
La reacción de PCR utilizada se basó en el protocolo descripto por Tran y Rudney23 que utiliza el siguiente set de
primers dirigidos a la región 16S rDNA:
A. actinomycetemcomitans Forward: primer (AaF), 5´-ATT GGG GTT TAG CCC TGG TG-3´;
P. gingivalis Forward: primer (PgF), 5´-TGT AGA TGA CTG ATGGTG AAA ACC-3´
C11R Reverse: primer (C11R), 5´-ACG TCA TCC CCA CCT TCC TC- 3´
En el presente trabajo se utilizó el protocolo modificado que se detalla a continuación:
2,5 ul Buffer, 0,25ul de AaF, 0,80ul PgF, 0,50ul C11R, 0,7 ul Taq polimerasa, 2,5 ul Cl2Mg, 0,20 dNTPs 15,05 ul agua
destilada estéril. El volumen final fue de 22,5 ul de master mix y 2,5 de ADN.
Etapa IV: Corrida electroforética de los fragmentos amplificados
Las corridas electroforéticas se realizaron en gel de agarosa 3% con buffer de TBE 0,5X.
Posteriormente se observaron los diferentes geles de corridas con transiluminador capturándose las imágenes con un
digitalizador de imágenes, UVIPRO bronze. Las mismas fueron analizadas por medio del software que acompaña al
digitalizador. Se considera la presencia de A. actinomycetemcomitans ante un amplicón de 360 pb y de P. Gingivalis
ante un amplicón de 197 pb.
Etapa V: Amplificación de control interno de integridad de ADN extraído
Para corroborar que el ADN de la muestra no esté deteriorado, o que exista algún inhibidor que impidiera la
amplificación se realizó un control interno usando un par de primers para β - globina. Se realizó una PCR que amplifica
a 268 pb.
Control odontológico:
Además se realizó un control clínico bucal de todos los pacientes de quienes se obtuvieron muestras biopsias, el que
consistió en la confección de una historia clínica completa, con anamnesis y evaluación de factores de riesgos tanto para
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enfermedad periodontal como para enfermedad cardiaca. Luego se realizó una revisión del estado general de la boca, se
confeccionó odontograma y se aplicó el índice de Ramfjord para evaluar el estado periodontal.
Discusión de Resultados:
Los controles provistos por el Instituto “Dr. Carlos G. Malbrán” dieron las bandas esperadas tanto para A.
actinomycetemcomitans como para P. Gingivalis, luego de emplear nuestro protocolo de PCR modificado.
La totalidad de las muestras de pacientes procesadas demostraron amplificación para el gen de β - globina lo que indica
una adecuada técnica de extracción de ADN.
Actualmente están en realización standarizaciones de la técnica de PCR con diferentes diluciones de muestras de ADN
con el objeto de determinar la presencia de las bacterias en estudio en las muestras de pacientes.
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