La levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo y herramienta

Saccharomyces cerevisiae
4-6 μm
La levadura Saccharomyces cerevisiae como
modelo y herramienta para el estudio de
enfermedades genéticas humanas
Dr. Pascual Sanz
3º Curso de Genética Humana,
Valencia, Enero 2008
1
Saccharomyces cerevisiae: bases de datos
www.yeastgenome.org
Saccharomyces cerevisiae: genética
Segregación
mendeliana de
caracteres
a
b
c
d
1
2
Mayo-1997
3
1
2
3
EUROpean Saccharomyces
Cerevisiae ARchive for
Functional analysis
2
Facilidad de introducción de plásmidos
y de expresión de proteinas heterólogas
URA3, TRP1, HIS3, LEU2
-Integrativos
-Centromericos (CEN)
-Episomales (2μm)
-Supresión por sobrexpresión
Métodos genéticos
-Supresores extragénicos.
-Letales sintéticos.
Expresión constitutiva (ADH1p)
Expresión regulable (GAL1p)
3
3.1.- Supresión por sobrexpresión
3.2.- Supresores extragénicos
-Transformación con librería.
-Selección de transformantes. Rescate del plasmido.
-Comprobación de supresión.
-Identificación de gen supresor en multicopia. En el caso de
fragmentos grandes, acotar el gen responsable de la supresión.
4
Saccharomyces cerevisiae: modelo estudio de rutas de señalización
3.3.- Synthetic letal effects
La combinación de dos mutaciones, viables cada una de ellas
por separado, conduce a una perdida de la viabilidad.
Cruce con colección de mutantes
5
Glucose
Hxts
Glucose
Metabolismo
Glucosa
Hxk2
Reg1/Glc7
Expresión génica
Snf1-P
Snf1
Crecimiento
Mig1
Cat8
SUC2
FBP1
Sanz et al., (2000) Mol. Cell. Biol. 20:1321
6
Elements involved in glucose repression
Component
Yeast
Pancreatic β-cell
Low-affinity glucose
transporter
Hxt1
Glut2
Glucose phosphorylating
enzyme (sensor)
Hxk2
GlkB
Protein kinase
Snf1
AMPK
Reg1/Glc7
PP1?
Protein phosphatase
Glucose
Insulin
Glucose
transporter
Glucose
Glucokinase
Glucose 6-P
Metabolism
ATP:ADP
K+
(-)
After Efrat et al., 1994. TIBS 19: 535
+2
Ca
ΔΨ
(+)
Sensor de glucosa
F. M. Matschinsky (1990) Diabetes 39: 647
7
.
HuGlkB
ScHxk1
ScHxk2
...........MLDDRARMEAAKKEKVEQILAEFQLQEEDLKKVMRRMQKEMDRGLRLET 49
MVHLGPKKPQARKGSMADVPKELMDEIHQLEDMFTVDSETLRKVVKHFIDELNKGL...T 57
MVHLGPKKPQARKGSMADVPKELMQQIENFEKIFTVPTETLQAVTKHFISELEKGL...S 57
:::.::
* : * *: * ::: .*:::**
:
HuGlkB
ScHxk1
ScHxk2
HEEASVKMLPTYVRSTPEGSEVGDFLSLDLGGTNFRVMLVKVGEGEEGQWSVKTKHQMYS 109
KKGGNIPMIPGWVMEFPTGKESGNYLAIDLGGTNLRVVLVKLS....GNHTFDTTQSKYK 113
KKGGNIPMIPGWVMDFPTGKESGDFLAIDLGGTNLRVVLVKLG....GDRTFDTTQSKYR 113
:: ..: *:* :* . * *.* *::*::******:**:***:.
*: :..*.:. *
HuGlkB
ScHxk1
ScHxk2
IPEDAMTG.TAEMLFDYISECISDFLDKHQMK..HKKLPLGFTFSFPVRHEDIDKGILLN 166
LPHDMRTTKHQEELWSFIADSLKDFMVEQELLNTKDTLPLGFTFSYPASQNKINEGILQR 173
LPDAMRTTQNPDELWEFIADSLKAFIDEQFPQGISEPIPLGFTFSFPASQNKINEGILQR 173
:*.
*
: *:.:*::.:. *: ::
. :*******:*. ::.*::*** .
HuGlkB
ScHxk1
ScHxk2
WTKGIKASGAEGNNVVGLLRDAIKRRGDFEMDVVAMVNDTVATMISCYYEDHQCEVGMIV 226
WTKGFDIPNVEGHDVVPLLQNEISKR.ELPIEIVALINDTVGTLIASYYTDPETKMGVIF 232
WTKGFDIPNIENHDVVPMLQKQITKR.NIPIEVVALINDTTGTLVASYYTDPETKMGVIF 232
****:. .. *.::** :*:. *.:* :: :::**::***..*:::.** * : ::*:*.
HuGlkB
ScHxk1
ScHxk2
GTGCNACYMEEMQNVELVEG...DEGR....MCVNTEWGAFGDSGELDEFLLEYDRLVDE 279
GTGVNGAFYDVVSDIEKLEGKLADDIPSNSPMAINCEYGSFDN.EHLVLPRTKYDVAVDE 291
GTGVNGAYYDVCSDIEKLQGKLSDDIPPSAPMAINCEYGSFDN.EHVVLPRTKYDITIDE 291
*** *..: : .::* ::*
*.:* *:*:*.: .:
:** :**
HuGlkB
ScHxk1
ScHxk2
SSANPGQQLYEKLIGGKYMGELVRLVLLRLVDENLLFHGEASEQLRTRGAFETRFVSQVE 339
QSPRPGQQAFEKMTSGYYLGELLRLVLLELNEKGLMLKDQDLSKLKQPYIMDTSYPARIE 351
ESPRPGQQTFEKMSSGYYLGEILRLALMDMYKQGFIFKNQDLSKFDKPFVMDTSYPARIE 351
.*..**** :**: .* *:**::**.*: : .:.::::.: .::
::* : :::*
HuGlkB
ScHxk1
ScHxk2
SDTGDRKQIYN..ILSTLGLRPSTTDCDIVRRACESVSTRAAHMCSAGLAGVINRMRESR 397
DDPFVFLEDTDDIFQKDFGVKTTLPERKLIRRLCELTGTRAARLAVCGIAAICQKRG... 411
EDPFENLEDTDDLFQNEFGINTTVQERKLIRRLSELIGARAARLSVCGIAAICQKRG... 411
.*.
: : : . :*:..: : .::** .* .:***::. .*:*.: ::
HuGlkB
ScHxk1
ScHxk2
SEDVMRITVGVDGSVYKLHPSFKERFHASVRRLTPS.......CEITFIESEEGSGRGAA 450
...YKTGHIAADGSVYNKYPGFKEAAAKGLRDIYGWTGDASKD.PITIVPAEDGSGAGAA 464
...YKTGHIAADGSVYNRYPGFKEKAANALKDIYGWTQTSLDDYPIKIVPAEDGSGAGAA 465
:..*****: :*.***
.:: :
*.:: :*:*** ***
HuGlkB
ScHxk1
ScHxk2
LVSAVACKKACMLGQ...... 465
VIAALSEKRIAEGKSLGIIGA 485
VIAALAQKRIAEGKSVGIIGA 486
:::*:: *: .
.
Phosphate 1
hxk2
Sugar binding
+ GlkB
Connect 1
Phosphate 2
Adenosine
Connect 2
- La glucokinasa pancreá
pancreática humana
complementa la funció
función fosforiladora de glucosa
Hxk2 (PDB: 2nzt); Kuser et al (2000)
- La glucokinasa pancreá
pancreática humana
complementa la funció
función reguladora de Hxk2
Hxk2
GlkB
Identities
33%
Similarities 54%
(Mayordomo et al., 2001)
8
GlkB mutations isolated in MODY2 and
hyperinsulinemic patients
T168P: Formas mutantes de GKB aisladas de pacientes con
MODY2 identificadas como perdida de actividad ,
no muestran ni actividad catalítica ni funcionalidad
en el proceso de señalización por glucosa en levaduras.
Y214C
A456V
Matschinsky, (2002), Diabetes 51: S394
1.1.- No glucokinase is present in cells or if present is inactive (MODY2).
2.2.- Glucokinase is present and it is as active as regular enzyme (MODY2).
A53S y V367M: Formas mutantes aisladas de pacientes con
MODY2 con propiedades cinéticas similares a la
silvestre, muestran buena funcionalidad en el proceso
de señalización por glucosa en levaduras.
Y214C y V455M: Formas mutantes aisladas de pacientes
con hiperinsulinismo,
hiperinsulinismo muestran una mayor afinidad por
la glucosa y una buena funcionalidad en el proceso de
señalización por glucosa en levaduras.
3.3.- Glucokinase is present and it is hyperactive (hyperinsulinism).
hyperinsulinism).
9
Elements involved in glucose signaling
Component
Yeast
Pancreatic β-cell
Low-affinity glucose
transporter
Hxt1
Glut2
Glucose phosphorylating
enzyme (sensor)
Hxk2
GlkB
Protein kinase
Snf1
AMPK
Reg1/Glc7
PP1?
Protein phosphatase
Hxk2 (PDB: 2nzt); Kuser et al (2000)
GlkB (PDB: 1v4s); Kamata et al (2004)
10
AMP-activated protein kinase, AMPK
[AMP]:[ATP]
e.g. anoxia
Otras señ
señales
e.g. estré
estrés hiperosmó
hiperosmótico
Nutrientes
Ejercicio
Estrés
AMP
ATP
Corazón
AMPK-P
Adipocitos
Lipogénesis y
lipólisis
ACC, FAS, L-PK
Fosfofructoquinasa-2
Translocación GLUT4
Glucólisis
Lipasa sensible a hormonas
AMPK
Glucógeno fosforilasa
Anabolismo
HMG-CoA Reductasa
Catabolismo
Glucógeno sintasa
Acetil-CoA Carboxilasa
Translocación GLUT4
Efectos a largo plazo:
Regulació
Regulación de la expresió
expresión gé
génica
GLUT4, Hexoquinasa II
ACC, FAS, L-PK
PPI
PEPCK, G6Pasa
Enzimas mitocondriales
Músculo esquelético
Gasto
energé
energético
Hígado
Páncreas
Aporte
energé
energético
Oxidación ácidos grasos
Cetogénesis
Lipogénesis, síntesis de
colesterol y triacilgliceroles
Oxidación ácidos grasos
Captación de glucosa
Secreción de insulina
Gluconeogénesis
11
AMPK, diabetes y obesidad
High glucose
1) El efecto neto de la activació
activación de AMPK por ejercicio o mediante
activadores farmacoló
farmacológicos podrí
podría ser efectiva para corregir la
resistencia a insulina en pacientes con alteraciones de la tolerancia
tolerancia a
Snf4
Low glucose
Pak1, Elm1,
Tos3
glucosa y diabetes tipo 2.
Reg1/Glc7
2) La metformina y la rosiglitazona
(antidiabé
(antidiabéticos orales) son capaces
de activar AMPK in vivo.
α1, α2
β1, β2
γ1, γ2, γ3
P
T210
Snf1
Sip1/Sip2/
Gal83
Inactive
Non-stress
Active
AMPK γ
AMPK
3) AMPK juega un papel en la
regulació
regulación de la toma de alimentos,
alimentos,
por acció
acción sobre las neuronas del
hipotá
hipotálamo.
lamo.
Stress
LKB1
CaMKKβ
CaMKKβ
P
SNF1
T172
AMPK α
AMPK
Ppase?
AMPK β
Inactive
Active
12
AMPK e Hipertrofia del mú
músculo esquelé
esquelético
y cardí
cardíaco. Glucogenosis.
Glucogenosis.
En 2000, se describe en cerdos una
mutació
mutación en la subunidad AMPK γ3 (R200Q)
como
la
responsable
de
elevados
contenidos en glucó
glucógeno en mú
músculo
esquelé
esquelético (Milan
(Milan et al., 2000).
La función nuclear de la protein fosfatasa de tipo 1 (PP1)
- PP1 es esencial para una correcta progresión del ciclo celular
- PP1 no tiene NLS, pero alcanza el núcleo por unión a
proteinas reguladoras
En humanos, mutaciones halladas en
subunidades
gamma
de
AMPK
abundantes en corazó
corazón (AMPK
(AMPK γ2) está
están
relacionadas con la cardiopatí
í
a
familiar
cardiopat
hipertró
hipertrófica (HCM) y con el síndrome de
WolffWolff-ParkinsonParkinson-White (WPW)
Introducció
Introducción de formas AMPKγ
AMPKγ en snf4,
snf4, actividad constitutiva
13
Yeast vs Humans
Yeast
Yeast Sds22-Glc7-Ypi1 form a ternary complex
Yeast
Humans
Humans
Inh3
Ypi1
Glc7
PP1
PPP1R11
21%
90 %
Sds22
Ypi1
Glc7
Sds22
hSds22
Inh3
PP1
hSds22
PPP1R7
46 %
In humans hSds22-PP1-Inh3 also form a heterotrimeric complex
No direct interaction between Inh3 and hSds22 Lesage et al. Biochem (2007)
14
Ypi1 functional studies
Construction of a ypi1 conditional mutant
W303ypi1 Δ::KANMX4 (pGAL1- HA-Ypi1)
8
100
7
Glucose 4%
Galactose 2%
4
G2
DNA
replication
0
0
HA
GALACTOSE
YPI1
ON
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
S
24
GLUCOSE
Bud formation
Glucose 4%
OFF
0
2
3
4
6
M
G1
Time (h)
Ypi1
8 24
hours
ON
OFF
70
2
1
80
Chromosomal
segregation
Percentage
OD600
5
Nuclear
migration
3
pGAL1
Galactose YPI1
Glucose YPI1
90
Spindle
formation
6
KANMX4
60
50
40
30
20
10
START
Growth
0
35
G1
30
S-phase Metaphase/Anaphase
Telophase
KDa
Western anti-HA
Depletion of Ypi1 causes cell growth arrest
Ypi1 is necessary for the progression from metaphase to anaphase
Similar results have been reported in a sds22 mutant
MacKelvie et al., (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 3777-3785
15
Summary of Ypi1 and Sds22 functional studies
Complementation of yeast mutants with mammalian orthologues
W303 ypi1 Δ::KANMX4
Glc7
Glc7
Ypi1
Sds22
Ypi1
Inh3 + hSds22
(pGAL1- HA-Ypi1)
Inh3 does NOT complement a ypi1 mutant
Sds22
Inh3 interacts physically with yeast Glc7 but NOT with ySds22
KANMX4
Ypi1 (NLS)
nucleus
EGFP-PP1γ F257A
FLAG-hSds22
EGFP
EGFP-PP1γ
Galactosa (ON)
Glucosa (OFF)
pWS-Inh3
Lex A
pWS-Inh3
Lex A
Lesage et al (2004)
JBC 279: 55978
pWS93
Lex A
pWS-Ypi1
Lex A
pWS 93
Lex A
pWS-Ypi1
Lex A
COS1 cells
pWS-Inh3
LexA hSds22
pWS-Inh3
LexA hSds22
EGFP-PP1γ F257A GST-Inh3
pWS93
LexA hSds22
pWS93
LexA hSds22
Lesage et al.
unpublished
The co-expression of Inh3 plus hSds22 complements ypi1 deficiency
16
Epileps
y
+
Saccharomyces cerevisiae: herramienta de estudio
Sistema de doble híbrido
Neurod
egener
ation
(Fields and Song, 1989. Nature 340: 245)
AD
BD
lacZ
- Interacción in vivo.
- Deben de alcanzar el núcleo
- Proteínas solubles, estables
lacZ
lacZ
n
i
r
o
f
la
LAFORA DISEASE
Malin
en
g
o
c
y
Gl
17
SECOND GENE RELATED TO LAFORA DISEASE
EPM2A, 6q24: LAFORIN
G279S
53/90 (59%)/ 47 mut
* C266S
W32G
T194I R241X
R108C
F84L
17/90 (19%)/ 51 mut
EPM2B, 6p22.3: MALIN
Q293L
Y294N
G240S
Malin has E3-Ubiquitin
ligase activity
P301L
NH 2
116
156
COOH
DSPD
Exon 1
Exon 2
Exon 3
Exon 4
(1-101)
(102-160)
(161-240)
(241-331)
Consensus PTPase
Laforina
DUS5 (H. sapiens)
F28C6.8 (C. elegans)
YVH1 (S. pombe)
PTP3 (C. eugametos)
Q302P
Q226X
C68Y
F33S
320
CBD
P264H
E280K
D146N
E67Q
1
Malin
L87P
C26S P69A
22
73
395
1
NH2
RING
finger
2
3
4
5
6
COOH
NHL
I
T
VHC-AG--RSG
EKGHIVYVHCNAG VGRSTAAVCGWLQ
EKGGKVLVHCEAG ISRSPTICMAYLM
SKG KTVYVHCKAG RTRSATVATCYLM
SKNAKVLVHCFAG ISRSVTLVAAYLM
ASGGVCL VHCLAG ISRSASVVIAYLM
C266S
18
Importance of the
Laforin- Malin interaction (I)
Malin
L87P
C26S
P264H
E280K
P69A
E67Q
D146N
Q302P
Q226X
C68Y
F33S
22
?
Laforin
73
395
1
NH2
2
RING
finger
Malin
3
4
5
6
COOH
NHL
Yeast T-H: LexA-Malina mut + GAD-Laforina
(E3-Ubiquitin ligase)
LD
Polyglucosan accumulation
β-Galacotosidase (Units)
50
(DS-phosphatase)
40
30
20
10
0
WT+GAD
E3 Ubiq ligase
WT
+
C26S
-
P69A
D146N
-
+
Q226X E280K
nd
nd
Interaction of malin with laforin is crucial for function
19
The Laforin-Malin interaction is a regulated process
Importance of the Laforin- Malin interaction (II)
G279S
Q293L
W32G
T194I
R108C
F84L
1
116
R241X
G240S
Interaction between laforin and malin is increased at low-glucose conditions
Yeast Two-hybrid
Y294N
320
Yeast two-hybrid: LexA-Laforin + GAD-Malin
pGBT9-laforin mut + pACT2-malin
P301L
156
140
COOH
120
Some LD-laforin mutations
abolished the interaction
with malin
A) CTY10.5d
100
80
60
40
-
P301L
-
C266S
+
Q293L
-
Y294N
-
R241X
T194I
G240S
- -
G279S
F84L
+
R108C
-
W32G
WT
Phosphatase activity
none
20
The phosphatase activity of
laforin is crucial for function
-
-
-
-
Binding to glycogen
-
+
- nd
- nd
+
nd
-
-
-
-
+
Binding to R5/PTG
-
+
-
-
-
nd
-
-
-
-
++
The interaction with R5/PTG is
crucial for function
-
-
20
B)
4% glucose
0.05% glucose
15
10
5
LexA-Laforin LexA-Laforin
+
+
GAD-Malin
GAD
Activation of Snf1/AMPK kinase
4% glucose
0.05% glucose
400
β-Galactosidase (Units)
DSPD
Relative Interaction
CBD
β-Galactosidase (Units)
NH2
300
200
100
Wild type
snf1Δ
Snf1/AMPK improves binding
of laforin to malin
20
Conclusiones
Unidad de Señalización por Nutrientes
SAF2005-00852
- Saccharomyces cerevisiae es un modelo de estudio
ideal para procesos fisiológicos conservados. Aporta
información sobre la posible función de genes
conservados, así como permite el estudio de las
alteraciones asociadas a patología humana.
- Saccharomyces cerevisiae es una herramienta
potente para el estudio de procesos fisiológicos no
conservados.
LSHM-CT-2004-005272
Exp. 061932
Miguel, Leda, MC, Tere, Dani, Santi, Ada, Luisa y Elena
INTRA/07/738.1
CIBERER U-742
21
Colaboraciones
- GlkB
- Alberto Marina, IBV.
- Antonio Cuesta Muñ
Muñoz, Hospital Carlos Haya, Má
Málaga.
- Luis Castañ
Castaño, Hospital de Cruces, Barakaldo.
Barakaldo.
- AMPK
- Grahame Hardie,
Hardie, Wellcome Trust Biocentre,
Biocentre, Dundee Univ. Dundee.
Dundee.
- David Carling,
Carling, MRC Clinical Sciences Centre, London.
London.
- Glc7/PP1, Ypi1, Sds22
- Joaquí
Joaquín Ariñ
Ariño, Dept.
Dept. Bioquimica y Biologí
Biología Molecular, UAB, Barcelona.
- Mathieu Bollen, Dept.
Dept. Mol.
Mol. Cell Biol. KULeuven.
KULeuven.
- LaforinaLaforina-malina
- Santiago Rodriguez de Có
Córdoba, CIBCIB-CSIC, Madrid.
- Joan Guinovart,
Guinovart, Parc Cientific de Barcelona.
- Erwin Knecht,
Knecht, Centro Invest.
Invest. Principe Felipe, Valencia.
- Jose Maria Serratosa,
Serratosa, Fundació
Fundación Jimenez Diaz,
Diaz, Madrid.
Madrid.
La levadura Saccharomyces cerevisiae como
modelo y herramienta para el estudio de
enfermedades genéticas humanas
Dr. Pascual Sanz
3º Curso de Genética Humana,
Valencia, Enero 2008
22