Avances en el manejo de la reproducción por inducción en peces

Avances en el manejo de la reproducción
por inducción en peces teleósteos.
Aplicaciones en el pejerrey.
Gustavo M. Somoza & Leandro M. Miranda
Laboratorio de Ictiofisiología y Acuicultura. IIB-INTECH
Chascomús. Provincia de Buenos Aires. Argentina
En qué casos debo intentar
controlar la reproducción
en cautiverio?
1.Control de la gametogénesis
2.Control de la maduración final
1. Control de toda la gametogénesis
1. Control de toda la gametogénesis
• Para inducir pubertad.
1. Control de toda la gametogénesis
• Para inducir pubertad.
• Para adelantar la reproducción.
1. Control de toda la gametogénesis
• Para inducir pubertad.
• Para adelantar la reproducción.
• Para retrasar la reproducción.
1. Control de toda la gametogénesis
• Para inducir pubertad.
• Para adelantar la reproducción.
• Para retrasar la reproducción.
• Para obtener más de un desove del mismo
stock de reproductores en una misma
temporada.
1. Control de toda la gametogénesis
• Para inducir pubertad.
• Para adelantar la reproducción.
• Para retrasar la reproducción.
• Para obtener más de un desove del mismo
stock de reproductores en una misma
temporada.
• Para extender la temporada reproductiva.
2. Control de la maduración final
2. Control de la maduración final
• La espermiación ocurre pero la producción de
esperma es pobre.
2. Control de la maduración final
• La espermiación ocurre pero la producción de
esperma es pobre.
• Aunque la gametogénesis ocurre normalmente la
ovulación está a menudo bloqueada por falta de
estímulos ambientales.
2. Control de la maduración final
• La espermiación ocurre pero la producción de
esperma es pobre.
• Aunque la gametogénesis ocurre normalmente la
ovulación está a menudo bloqueada por falta de
estímulos ambientales.
• Para sincronizar la reproducción entre peces.
2. Control de la maduración final
• La espermiación ocurre pero la producción de
esperma es pobre.
• Aunque la gametogénesis ocurre normalmente la
ovulación está a menudo bloqueada por falta de
estímulos ambientales.
• Para sincronizar la reproducción entre peces.
• Para evitar manipulación repetida durante la
estación reproductiva (estres, anestesias repetidas,
daños en la piel y patologías asociadas).
Disfunciones reproductivas en hembras
•Ausencia completa de vitelogénesis en cautiverio
(Anguilla anguilla).
•La vitelogénesis progresa pero no se produce la
maduración
final
(Paralichthys
lethostigma,
Pleuronectes ferrugineus, Morone saxatilis)
•Ausencia de desove a pesar que los oocitos han sido
ovulados (Oncorhynchus mikiss, Epinephelus aeneus)
Disfunciones reproductivas en machos
•Ausencia completa de espermatogénesis en
cautiverio (Anguilla anguilla).
• Reducción en la cantidad o calidad de
esperma (Mylonas et al., 1998; Mylonas &
Zohar, 2001).
Espermatogénesis
A1
I
Ovogénesis
A0 ?
A1 ( 2)
B1 (2)
II
B2 (4)
B3 (8)
b
B4 (16)
B5 (32)
c
B6 (64)
previtelogénesis
vitelogénesis
III, IV
V, VI
Spermatocytes II (256)
Spermatids (512)
Espermiación
Fases LH dependientes
Spermatocytes I (128)
Maturación oocitaria
Hidratación 1º cuepo
polar
Ovulación
Profase primer división Primer división
a
Fases FSH dependientes
A2
+/- Factores ambientales
Cerebro
GnRH
(+)
DA
(-)
Hipófisis
FSH (GtH I)
Gonada
LH (GtH II)
Inducción. Cómo????
• Domesticación
• Domesticación
• Manejo de los factores ambientales
• Domesticación
• Manejo de los factores ambientales
• Extractos hipofisarios
•
•
•
•
Domesticación
Manejo de los factores ambientales
Extractos hipofisarios
Gonadotrofinas heterólogas
•
•
•
•
•
Domesticación
Manejo de los factores ambientales
Extractos hipofisarios
Gonadotrofinas heterólogas
Gonadotrofinas homólogas (ej.
SGG100)
•
•
•
•
•
Domesticación
Manejo de los factores ambientales
Extractos hipofisarios
Gonadotrofinas heterólogas
Gonadotrofinas homólogas (ej.
SGG100)
• Hormonas liberadora de
gonadotrofinas
•
•
•
•
•
•
•
Domesticación
Manejo de los factores ambientales
Extractos hipofisarios
Gonadotrofinas heterólogas
Gonadotrofinas homólogas (ej.
SGG100)
Hormonas liberadora de
gonadotrofinas
Hormonas gonadales (esteroides)
Niveles de intervención
Factores ambientales = activación del
eje cerebro-hipófisis-gonada para:
-control a largo tiempo del ciclo
reproductivo para estimular FSH
- inducir el pico ovulatorio de LH
Cerebro
GnRH
Estimulación de la secreción de GtHs
endógenas. Estimulación de la secreción
de LH por el uso de análogos de GnRH.
Hipófisis
FSH
LH
Gonadas
Inyección de gonadotrofinas exógenas,
extractos hipofisarios = hipofisación,
para iniciar maduración final y
ovulación
Injección de esteroides inductores de la
maduración para iniciar maduración
final y ovulación
• Domesticación
• Manejo
de
ambientales
los
factores
Niveles de intervención
Factores ambientales = activación del
eje cerebro-hipófisis-gonada para:
-control a largo tiempo del ciclo
reproductivo para estimular FSH
- inducir el pico ovulatorio de LH
Cerebro
GnRH
Hipófisis
FSH
LH
Gonadas
Los factores ambientales no aptos, pueden
evitarse con la adaptación/domesticación
Ejemplo, seabream Sparus auratus.
Cuando comenzó su cultivo al comienzo de los
´70 sólo se lograba el desove por inducción
hormonal y stripping (Gordin & Zohar, 1978;
Zohar & Gordin, 1979, Zohar & Mylonas,
2001).
Los factores ambientales no aptos, pueden
evitarse con la adaptación/domesticación
Ejemplo, seabream Sparus auratus.
Cuando comenzó su cultivo al comienzo de los
´70 sólo se lograba el desove por inducción
hormonal y stripping (Gordin & Zohar, 1978;
Zohar & Gordin, 1979, Zohar & Mylonas,
2001).
Actualmente desova diariamente durante los
tres meses de la estación reproductiva, usando
inducción sólo para aquellos peces que no
responden (Barbaro et al., 1997).
Me puedo reproducir dos veces al año bajo
fotoperíodo controlado
Desove natural
Duración del dia en horas
2do desove avanzado bajo fotoperíodo controlado
Pero con mucha luz no puedo!!!!!!!
Hembras que ovulan % del total en:
Fotoperíodo natural
A: luz continua desde el comienzo de la alimentación
B: luz continua desde primavera
•
Extractos hipofisarios
• Gonadotrofinas
heterólogas
• Gonadotrofinas
homólogas
Niveles de intervención
Cerebro
GnRH
Hipófisis
FSH
LH
Gonadas
Inyección de gonadotrofinas exógenas,
extractos hipofisarios = hipofisación,
para iniciar maduración final y
ovulación
Ejemplos de aplicaciones de preparaciones de gonadotrofinas.
Zohar & Mylonas, 2001
Sin embargo puede tener sus dificultades!!!!!
Morone saxatilis
hCG 500 UI/Kg
Zohar & Wehage
Hormonas liberadora de gonadotrofinas
(GnRH)
Análogos superactivos
Niveles de intervención
Cerebro
GnRH
Estimulación de la secreción de GtHs
endógenas. Estimulación de la secreción
de LH por el uso de análogos de GnRH.
Hipófisis
FSH
LH
Gonadas
Secuencia aminoacídica de los ocho GnRHs
encontrados en teleósteos
mammalian pGlu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly NH2
Ser sea bream
- Trp Leu salmon
- Met Asn whitefish
His - Asn catfish
- His Ser herring
- His - Trp Tyr chicken-II
- Phe Ser pejerrey
Ventajas del uso de GnRH
• Libera las propias gonadotrofinas
Ventajas del uso de GnRH
• Libera las propias gonadotrofinas
• Similaridad estructural ⇒ no hay
especificidad
Ventajas del uso de GnRH
• Libera las propias gonadotrofinas
• Similaridad estructural ⇒ no hay
especificidad
• Decapétidos ⇒ no respuesta inmune
Ventajas del uso de GnRH
• Libera las propias gonadotrofinas
• Similaridad estructural ⇒ no hay
especificidad
• Decapétidos ⇒ no respuesta inmune
• Puede ser sintetizado a bajo costo
Ventajas del uso de GnRH
• Libera las propias gonadotrofinas
• Similaridad estructural ⇒ no hay
especificidad
• Decapétidos ⇒ no respuesta inmune
• Puede ser sintetizado a bajo costo
• Se sintetizan análogos superactivos
125I-sGnRH
sGnRH en circulación luego de
la inyección intravenosa
en seabream
en cirulación
luego de la inyección intravenosa
en goldfish
Gothilf & Zohar, 1996
Huang et al., 1991
% total / ml suero
Plasma GnRH nM
Cuidado!!!!! la vida media de GnRH
es muy corta
10
1
64
32
16
0.1
600
2400
segundos
40
160
minutos
Las endopeptidasas degradan GnRH
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - GLU-TRP-LEU-PRO -GLYNH2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
En hipófisis
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR
GLU-TRP-LEU-PRO-GLYNH2
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - GLU-TRP-LEU-PRO
Un proceso similar ocurre en hígado y riñon
Degradación de sGnRH y mGnRH nativos
por diferentes tejidos Sparus aurata
Hipófisis
Riñón
% degradación
T 1/2
% degradación
T 1/2
45m
sGnRH
Hígado
180m
45m
180m
% degradatción
T 1/2
45m
180m
77 35.4
78.3
62
36.6
88
81
33.2
77
mGnRH 48 50.2
87.7
42
50.1
93.1
48
48.8
91
Análogos Superactivos de GnRH
Diseñados para evitar la degradación enzimática
por sustitución de aminoácidos en la posición 6 por
D-aminoácidos
sGnRH-A
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - GLU-TRP-LEU-PRO -GLYNH2
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - D-TRP-TRP-LEU-PRO -net etilamida
mGnRH-A
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - GLU-LEU-ARG- PRO –GLYNH2
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - D-ALA-LEU-ARG- PRO -net etilamida
Degradación de sGnRH, mGnRH, sGnRH-A y
mGnRH-A por diferentes tejidos Sparus aurata
Hipófisis
Riñón
% degradación
T 1/2
Hígado
% degradación
T 1/2
45m
sGnRH
77
35.4
mGnRH
48
50.2
D-Ala6
mGnRH
D-Arg6
sGnRH
180m
78.3
% degradación
T 1/2
45m
180m
45m
180m
62
36.6
88
81
33.2 77
87.7
42
50.1
93.1
48
48.8 91
454 12.6
24.2
232
15.3
36.1
294
2186 3.9
7.0
867
4.1
10.9
6.5 15.7
>2500 1.8 2.2
Los análogos de GnRH son más potentes que los
nativos para estimular la liberación de LH
Liberación de LH
Eficiencia de varios análogos sobre la liberación de
LH por células hipofisarias dispersas en goldfish
100
50 %
0
Además, la pegada al receptor está
igualmente incrementada
ED50
dosis de GnRH
Habibi et al., 1989
Neuronas GnRHérgicas en el cerebro del sea bass
CC
Tel
OT
VC
OB
GL
TNgc
sGnRH
sbGnRH
cGnRH-II
sGnRH
Vv
NPOpc
NPOav
nMLF
MO
Hypot
SC
Pit
SV
cGnRH-II
sbGnRH
Gonzalez-Martínez et al., 2001
Inervación hipofisaria de fibras
GnRHérgicas en sea bass
Secciones adyacentes
RI
RI
RI
PPD
sGnRH
PPD
PPD
sbGnRH cGnRH-II
Gonzalez-Martínez et al.
Todas las variantes de GnRH tienen efectos
hipofisotrópicos?
En seabream, es cGnRH-II la más activa
Todas las variantes de GnRH están relacionadas
con el control de la secreción de gonadotrofinas?
Zohar et al., 1995
Los análogos de GnRH son usados en muchas
especies
En
algunas
especies
(salmónidos,
y
especies
marinas), una sola inyección
induce ovulación
En otras se precisa combinar con
antagonistas dopaminérgicos como
(domperidone, pimozide, etc.)
DArg6Pro9net-sGnRH
% de ovulación
DTrp6-LHRH
DAla6Pro9net-LHRH
Control
DTrp6Pro9net-sGnRH
Especie
análogo dosis
antagonista
µg/kg
Af. Catfish
goldfish
goldfish
carpa
In. catfish
Yellow perch
Black carp
D-Ala
D-Ala6
D-Arg6
D-Ala6
D-Arg6
D-Ala6
D-Ala6
65
Pim
50
Pim
10
Pim, Dom
10
Pim, Dom
25
Dom
100 Pim
10+20 Dom
No todos los análogos (20 µg /kg)
tienen la misma potencia
Breton et al. 1988
Formas de administración
• Administración aguda
• Administración crónica
• Intraperitoneal, intramuscular
• En el agua
• En la comida
Liberación lenta de GnRH-A
La liberación sostenida de análogos de GnRH estimula la
secreción de GtH en forma prolongada
Efecto de adinistración aguda y sostenida de
D-Trp6 mGnRH sobre la secreción de LH
en trucha (20 µg / kg)
LH plasma ng / ml
Breton et al. 1988
60
50
40
sostenido
Agudo
30
20
10
1
3
9
horas
24
2
5
8
dias
12
15
Breton et al. 1988
La liberación lenta es más eficiente para inducir ovulación
Sostenido
% de ovulación acumulada
Agudo
DArg6Pro9net-sGnRH
DTrp6-LHRH
DAla6Pro9net-LHRH
Control
DTrp6Pro9net-sGnRH
Dias de post tratamiento
Breton et al., 1988
Estos análogos también promueven espermiación
Sorbera et al., 1996
Sistemas de liberación sostenida
¬ Pellets de colesterol
¬ Pellets de celulosa
¬ EVAc (polietilen-vinil-acetato)
¬ FAD-sa (poli-lactitide-glicolide)
¬ Met (polymetacrilato)
La liberación sostenida es especialmente
útil en especies de vitelogénesis
asincrónica
En turbot (Scophtalmus maximus), 25 µg /kg
de DAla6Pro9net-LHRH en dos triempos
diferentes d acuerdo a características
morfológicas y volúmen del ovario
Estadío 1: No todos los peces ovularon
Estadío 2: todos ovularon
El tratamiento muy temprano decrece el % de ovulación y la calidad de los huevos
Mugnier et al 2000
El problema principal:
Un buen criteria para verificar la madurez de los huevos
Los más usuales
- apariencia externa: abdomen dilatado, papila genital
Luego de la biopsia:
* posición de la vesícula germinal en la periferia del oocito luego del aclaramiento
Central
Migrando
Periférica
* diámetro del oocito
* distribución de los diámetros de los oocitos, presencia de oocitos en la clase más madura
Porqué el pejerrey????
Odontesthes bonariensis
Foto: CA Strüssmann
1. Es una especie endémica cuyo cultivo despierta mucho interés
y aún está en vías de desarrollo.
2. Es un desovador múltiple.
3. Posee vitelogénesis y desove asincrónico.
4. Los machos poseen muy poco esperma liberable
2. Control de la maduración final
• La espermiación ocurre pero la producción de
esperma es pobre.
• Aunque la gametogénesis ocurre normalmente la
ovulación está a menudo bloqueada por falta de
estímulos ambientales.
• Para sincronizar la reproducción entre peces.
• Para evitar manipulación repetida durante la
estación reproductiva (estres, anestesias repetidas,
daños en la piel y patologías asociadas).
• Inducción de espermiación mediante el uso de
hCG.
• Inducción de espermiación mediante el uso de
hCG.
• Inducción de espermiación mediante el uso de
extractos heterólogos de hipófisis.
• Inducción de espermiación mediante el uso de
hCG.
• Inducción de espermiación mediante el uso de
extractos heterólogos de hipófisis.
• Inducción de espermiación mediante el uso de
análogos superactivos de GnRH-A (GnRHA).
• Inducción de espermiación mediante el uso de
hCG.
• Inducción de espermiación mediante el uso de
extractos heterólogos de hipófisis.
• Inducción de espermiación mediante el uso de
análogos superactivos de GnRH-A (GnRHA).
• Inducción del desove por implante de pellets
de liberación sostenida de GnRH-A.
Niveles de intervención
CEREBRO
GnRH
HIPOFISIS
FSH
LH
GONADAS
GnRH-A
hCG
Extractos hipofiarios
Procedimiento
Efecto de hCG sobre producción de esperma en pejerrey
c
MILT VOLUME (% body weight)
0.30
0.25
c
0.20
c
0.15
b
0.10
b
0.05
a
0.00
Control
39 UI/kg 78 UI/kg 156 UI/kg 312 UI/kg 625UI/kg
Miranda et al., 2005
Efecto de extractos hipofisarios de salmón
sobre producción de esperma de pejerrey
c
MILT VOLUME (% body weight)
0.30
0.25
c
0.20
c
0.15
b
0.10
b
0.05
a
0.00
Control
5 mg/Kg 10 mg/kg 20 mg/Kg 30 mg/Kg 40 mg/Kg
Miranda et al., 2005
Ö No hubo diferencias significativas en la
concentración de espermatozoides.
Ö No hubo cambios en la motilidad de los
espermatozoides.
Ö No se observaron diferencias entre los
porcentajes de fecundación entre los distintos
tratamientos.
Tratamiento
% Fecundación
Control
77.5 ± 6.1
hCG (156 UI/kg)
74.2 ± 5.3
CPE (10 mg/Kg )
76.5 ± 4.2
SPE (20 mg/Kg )
78.6 ± 2.9
sGnRH-A (5µg/Kg )
80.4 ± 6.9
mGnRH-A (10µg/Kg)
75.6 ± 3.2
Miranda et al., 2005
Inducción del desove mediante el uso de
implantes de sGnRH-A
Gametogénesis en peces teleósteos hembra
Crecimiento primario
Oogonia
Proliferación mitótica
Síntesis de
proteínas
Vesícula germinal
Células foliculares
Primario
Arresto meiótico (Profase I)
Perinucleolar
Ovulación
Contracción del folículo
Crecimiento secundario
Gránulos corticales o
lipídicos
Vitelogénico
Gran aumento
en el tamaño del
ovario
Desarrollo del
Corion
Deposición de
gránulos de
vitelo
(fosfoglicolipoproteina)
Gotas
lípidos
Alvéolos corticales
(glicoproteinas)
Granulosa
Dos capas de células foliculares
Teca
Disolución de la
membrana
nuclear
Maduración Final
Migración de
vesícula germinal
Vesícula germinal
excéntrica
Vesícula germinal
periférica
Desaparición de
vesícula
Ruptura del
Folículo
Adaptado de C. Sullivan
Oocito maduro
Fusión del
vitelo
Gran
gota lipídica
Hidratación
Coalescencia de
gotas lipídicas
Vesícula
Clarificación del
germinal periferica ooplasma
• Peces nacidos y criados en cautiverio
• Peso corporal = 202 ± 19 gramos
• Estanques interiores (3000 litros)
• Sistema de circulación abierto
• Fotoperíodo natural y temperatura controlada
(18 ± 2 ºC)
• Caracterización del estadío gonadal por biopsia
• Implante de pellets de sGnRH-A (75 µg/pez)
Procedimiento
10 hembras de pejerrey en fin de vitelogénesis
con pellets de sGnRH-A + 10 machos sin
tratamiento.
Grupo control: 10 hembras de pejerrey en fin de
vitelogénesis con pellets de colesterol + 10 machos
sin tratamiento.
Tiempo
(hs)
# Huevos
%
Fecundación
60
12.500
55
84
10.250
60
108
4.500
62
132
6.000
58
156
5.500
63
180
12.000
55
Total
50.750
Hembras
desovadas
Implante
12
36
9 (90 %)
NO SE OBSERVARON DESOVES EN EL GRUPO CONTROL
AGRADECIMIENTOS
Personal del Laboratorio
Financiación
Dr. Leandro Miranda
Dr. Fabián Canosa
Dr. Pedro Carriquiriborde
Lic. Pablo Strobl
Lic. Gastón Guilgur
Lic. Juan Ignacio Fernandino
Lic. Martín Blasco
Hga. Carina López
Srta. Analía Núñez
Sr. Federico Soria
Srta. Emilia Scharrig
Sr. Fabián Shalom
Sr. Horacio Sandoval
ANPCYT
CONICET
SECyT
Fundación Antorchas
JICA
UNSAM