en todo el intervalo de trabajo

Validación de Métodos
Francisco Rojo Callejas
FRC
Validación de Métodos
Definiciones
Parámetros básicos
Requisitos
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Validación de Métodos
• El proceso de definir las condiciones analíticas y
confirmar que el método cumple los objetivos.
• El objetivo es garantizar que el método y el
lugar donde se implementan son capaces de
lograr resultados rutinarios dentro de las
especificaciones del método y que sus
resultados son confiables.
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Parámetros que otorgan validez
• Selectividad y Especificidad
• Precisión
– Repetibilidad
– Reproducibilidad intermedia (intra-laboratorio)
– Reproducibilidad Inter-laboratotrio
– Incertidumbre combinada de la medición
• Exactitud
– Materiales de referencia (trazabilidad)
– Ningún error sistemático en todo el intervalo de trabajo
• Linealidad, intervalo lineal y de trabajo
• Límites de detección y cuantificación
• Ausencia de efectos de matriz
• Estabilidad de la muestra
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• Robustez
¿Cuando hay que validar?
• Si se pretende una acreditación (EMA,
ISO/CIEC 17025) o certificación (ISO 9000)
• Cuando se desarrolla un método nuevo
• Si se adquiere un equipo nuevo se necesita una
transferencia de método.
• Cuando se le hace algún cambio significativo a
un método validado.
• Cuando se quiere demostrar que el método
propio es equivalente a uno publicado
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Validación
• Las normas internacionales y las normas
mexicanas de acreditación y certificación
obligan a la validación de métodos.
• Opciones:
– Validación total de un método propio o nuevo: es
necesario validar todos los parámetros
– Implementación de un método validado: Solo hay que
evaluar linealidad, exactitud, repetibilidad y si aplica,
límite de detección y cuantificacción.
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Implementación de Métodos
Validados
Si se va a montar un método oficial, o previamente
validado y publicado, solo se necesita evaluar:
• Linealidad
• Precisión (repetibilidad)
• Exactitud
• Incertidumbre de la medición
• Si aplica, límite de detección y cuantificación
FRC
Validación de Métodos
• La Selectividad y Especificidad es
fundamental en ellos
• Se requiere evaluar casi todos los
parámetros, puede que algunos no
apliquen
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Selectividad / Especificidad
• Es la habilidad del método para medir solo lo que se
pretende.
• Debe confirmar que la medición obtenida proviene única y
exclusivamente del analito, las interferencias pueden
diferenciarse.
• Es muy común el uso de adiciones patrón (spiked samples)
• Si por la naturaleza de la medición el método es
inherentemente específico, no se necesita evaluar (p. ej. pH)
• En cromatografía es necesario el uso de un segundo método,
o segunda columna con selectividad diferente para demostrar
especificidad.
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Selectividad/Especificidad
Que hacer
Que medir
Notas
Analizar muestras y
materiales de referencia por
el método a evaluar y por
otro método independiente,
trazable.
Confirmar que el método a
validar únicamente mide el
analito de interés, separado
de las posibles
interferencias.
Planear el experimento
ANTES de iniciar la
validación, dependiendo del
método, el analito y las
interferencias.
Analizar muestras
conteniendo las posibles
interferencias, en presencia
del (los) analito (s).
Investigar el efecto de cada
interferencia, de haberlo,
puede ser positivo o incluso
negativo (quenching).
Desde el desarrollo del
método deben enumerarse
las posibles interferencias,
ANTES de iniciar la
validación.
FRC
Ejemplo: especificidad de una
cuantificación cromatográfica.
•
•
•
•
•
•
•
•
1) Blanco (matriz) — sin analito
2 Matriz adicionada del analito
3) Matriz adicionada de interferencia
4) Matriz adicionada de otras interferencias
(triangulo de Pascal)
5) Muestra sola
6) Muestra adicionada del analito
7) Muestra adicionada de interferencia
8) Muestra adicionada de otras interferencias
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Selectividad/Especificidad Cromatográfica
•
•
•
•
•
•
El método puede considerarse específico si:
El analito solo aparece en la matriz adicionada del mismo y en las muestras
La señal del analito se incrementa de la muestra sola a la muestra
adicionada del mismo.
Las interferencias dan picos separados del analito y no modifican su forma
ni área.
El uso de una segunda columna (o fase móvil en HPLC) con
SELECTIVIDAD diferente confirma la identidad del analito
Alternativamente, el uso de GC/MS o HPLC/MS corrobora la
identidad.
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Precisión
Las mediciones tienen baja dispersión
• Repetibilidad
Una vez fijas las condiciones de trabajo, al realizar n
veces la medición de una muestra la dispersión de
los resultados es aceptable. (mismas condiciones,
mismo operador)
• Reproducibilidad (intra e inter-laboratorio)
Si se cumplen las condiciones del método, se logran
resultados similares, independientemente del
operador, el lugar, el instrumento o los materiales.
FRC
Precisión
•
•
•
•
La precisión se evalúa a tres niveles:
Repetibilidad: El análisis repetido de una muestra, por el mismo
analista, con el mismo instrumento en un lapso corto de tiempo. La
mayoría de las normas aceptan valores del 2% relativo o menores.
Reproducibilidad intra laboratorio: El análisis repetido de la misma
muestra por diferentes analistas, con instrumentos diferentes, en
diferentes días, en el mismo laboratorio, en un intervalo de tiempo
amplio. La AOAC le llama “ruggedness”, variabilidad.
Reproducibilidad ínter laboratorios: El análisis repetido de la misma
muestra en laboratorios diferentes, con analistas y equipos
diferentes, en un intervalo amplio de tiempo
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Exactitud
• Mide la diferencia entre el
valor real, o aceptado como
tal, y el valor obtenido por el
método propuesto
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Exactitud
• Es la medida de que los resultados obtenidos
son comparables con los valores aceptados de
un material de referencia o estándar certificado.
• Si no existen materiales de referencia, es
posible usar materiales propios, perfectamente
caracterizados.
• La exactitud nos permite garantizar la ausencia
de errores sistemáticos.
FRC
Aspectos generales:
Trazabilidad
La trazabilidad es importante, ya que permite la comparación de los
resultados propios con los de otros laboratorios.
La trazabilidad se logra:
• Usando estándares para la calibración del equipo (materiales de
referencia, balanzas certificadas, etc.)
• Usando materiales de referencia puros, trazables a estándares
internacionales (p. ej. NIST).
• Usando materiales de referencia certificados en matrices
apropiadas, también trazables a estándares internacionales.
• Usando un método validado ya publicado.
• Comparando los resultados logrados contra los de un método
publicado.
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Trazabilidad
• Al adquirir materiales de referencia puros y/o
certificados, vienen acompañados de certificado
impreso, con pureza y contenidos.
• Si no existen materiales de referencia, se deben
adquirir los de mayor pureza disponible.
• Si no existen en el mercado, solo entonces es
posible utilizar muestras propias.
FRC
FRC
Exactitud
• Para implementar métodos oficiales de
análisis (EPA, AOAC, ASTM, USP, etc.)
Usar materiales de referencia (p. ej. NIST),
preferentemente uno de baja concentración y
otro de alta concentración.
FRC
Exactitud
• Para métodos de uso interno:
Se estudian muestras enriquecidas con un
estándar puro del compuesto de interés y se
demuestra que la cantidad adicionada y la
medida son iguales en todo el intervalo de
trabajo.
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Linealidad
• Se necesita un mínimo de seis puntos de
calibración MAS el blanco, espaciados
uniformemente en todo el intervalo de trabajo.
• El factor de correlación r2 debe ser mayor de
0.99
• Es obligatorio trazar el gráfico de residuales y
observar una distribución aleatoria en el.
• La frecuencia de re-evaluación es variable.
• Al desarrollar métodos es necesario evaluar el
intervalo lineal y el intervalo de trabajo
FRC
Linealidad
• Linealidad del sistema
La respuesta del proceso de medición es
lineal en el intervalo de concentraciones
requerido. Determinar intervalo lineal e
intervalo de trabajo.
• Linealidad del método:
Es la exactitud de la medición en todo el
intervalo de trabajo.
FRC
Linealidad
• Intervalo lineal: Intervalo, desde el límite
de detección, hasta la máximo
concentración en que la respuesta del
método se comporta linealmente.
• Intervalo de trabajo: El intervalo que se
utilizará en el trabajo rutinario, las
muestras estarán dentro de los límites de
este y debe ser menor al intervalo lineal.
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Linealidad, intervalos de trabajo
Tipo de análisis
Intervalo de trabajo
Compuesto principal
70 – 130% de la
concentración de las
muestras
50 – 120% del contenido
máximo aceptable
Impurezas
Compuestos cuyo
contenido varía
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Desde 20% por debajo de
la especificación mínima
hasta un 20% por encima
de la máxima
Definiciones de límites
•Límite de decisión (Lc)
Aquella cantidad que si decimos que está presente
podríamos equivocarnos, pues probablemente no esté
presente. POR DEBAJO DEL LÍMITE DE DECISIÓN EL
RESULTADO ES CERO.
•Límite de detección (Ld)
Cantidad que si decimos que no hay, podríamos
equivocarnos, lo mas probable es que sí esté presente. POR
ENCIMA DEL LIMITE DE DETECCIÓN ESTAMOS
SEGUROS DE LA PRESENCIA DEL ANALITO.
•Límite de cuantificación (Lq)
Cantidad que podemos reportar con una incertidumbre
máxima aceptable.
FRC
Límite de decisión (Lc)
• Límite de decisión (Lc)
Aquella cantidad que si decimos que está
presente podríamos equivocarnos, pues
probablemente no esté presente. POR
DEBAJO DEL LÍMITE DE DECISIÓN EL
RESULTADO ES CERO.
n −1
α
blanco
FRC
Lc
Lc = tα
s
n
Límite de detección (Ld)
Cantidad que si decimos que no hay, podríamos
equivocarnos, lo mas probable es que sí esté
presente. POR ENCIMA DEL LIMITE DE
DETECCIÓN ESTAMOS SEGUROS DE LA
PRESENCIA DEL ANALITO
blanco
n −1
Ld = 2tα
α
Ld
FRC
s
n
Límite de cuantificación
• La cantidad mas pequeña que podemos
reportar con determinada variación
máxima.
Lq = µq ± ICq
tal que :
ICq
≤ variacion aceptable (E %)
µq
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100
σˆ
Lq =
tα
E% 2 n
Límite de detección, cálculo
• Diferentes opciones, dan diferentes
resultados.
– 3 veces el nivel del ruido (α=0.04%)
– Estimado a partir de la curva de calibración
– Usando la incertidumbre de un estándar
cercano al Ld (EPA, CFR).
– Usando la incertidumbre del blanco
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Robustez
• En que medida el método analítico resiste cambios
pequeños, pero deliberados de sus parámetros
operacionales. Nos da información de su confiabilidad
durante el uso rutinario.
• Nos indica como se comportará el método si no se
implementan perfectamente sus condiciones
experimentales.
• Prueba cuáles son las variables críticas del método,
generalmente estas se identificaron durante el
desarrollo.
• Si el método involucra extracciones, es obligatorio
evaluar el recobro
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Evaluación de la Robustez
FRC
Procedimiento
Cálculos
Notas
Listar variables críticas y
normales. Diseñar
experimentos que prueben los
efectos sobre exactitud y
precisión
Cuantificar efectos relativos de
cada variable, ordenarlas en
función de la magnitud del
efecto.
Garantizar que en todo el
experimento las variables
críticas permanecen bajo
control.
En cromatografía es necesario
probar la validez del método
(Especificidad).
Todos los parámetros
cromatográficos
Resolución > 2
Coleo < 1.8
Número de platos acorde a la
técnica y dimensiones de la
columna
Robustez, efecto de la
concentración del analito
FRC
Procedimiento
Cálculos
Notas
Analizar matriz, muestras
puras y enriquecidas a
diferentes concentraciones, por
lo menos seis veces cada una.
% Recobro = (Ci — C2)/ C3 x
100
C1 = concentración medida en
la muestra o matriz
enriquecidas.
C2 = Concentración medida en
la muestra, o matriz sin
enriquecer.
C3 = Concentración
adicionada.
si usa un estándar certificado,
calcule el recobro en base al
valor certificado.
Generalmente se obtienen
resultados superiores a los de
muestras reales, ya que en
estas últimas el analito está
generalmente mas retenido por
la matriz.
Pueden resultar recobros
mayores al 100% dada la
relativa falta de exactitud y/o
precisión del método
Incertidumbre combinada
(Propagación del error)
• Al realizar una medición se involucran diversos
pasos, cada uno de ellos tiene una determinada
incertidumbre, y los errores de cada paso se
van acumulando hasta afectar la incertidumbre
d ela medición final.
FRC
Incertidumbre combinada
(Propagación del error)
•
•
•
•
•
Cuatro pasos para estimarla:
1: Definir el mesurando
2: Identificar las fuentes de incertidumbre
3: Cuantificar cada fuente de incertidumbre.
4: Calcular la incertidumbre combinada.
FRC
Fuentes típicas de incertidumbre
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Muestreo
Almacenamiento
Instrumentos de medición
Pureza de reactivos
En pruebas microbiológicas, eficiencia del medio
Condiciones de medición (T, P, g, ASNM, hora, etc)
Efectos de matriz
Cálculos numéricos (dígitos de cálculo de ordenador y redondeo)
Aproximaciones
Blanco
Operador
Efectos aleatorios
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Expresión del Resultado Final
• Reporte sus resultados junto con la
incertidumbre como:
• ‘Resultado’ ± ‘Incertidumbre combinada con
factor de cobertura’ ‘unidades’ con un `nivel de
confianza’
• Ejemplo: Silicio, 87.65 ± 0.11 mg/L al 95 % de
nivel de confianza
• Exprese la incertidumbre combinada con
máximo dos dígitos.
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