Tesis Hugo Alonso Cantabrana

Departamento de Biología Aplicada
División de Genética
Caracterización de nuevas funciones
génicas implicadas en el desarrollo del
gineceo y la fructificación en
Arabidopsis thaliana.
Hugo Alonso Cantabrana
Sant Joan d’Alacant, 2005
Caracterización de nuevas funciones
génicas implicadas en el desarrollo del
gineceo y la fructificación en
Arabidopsis thaliana.
Trabajo realizado por el Licenciado Hugo Alonso Cantabrana, en la División de
Genética del Departamento de Biología Aplicada de la Universidad Miguel Hernández
de Elche, para optar al Grado de Doctor.
Sant Joan d’Alacant, 12 de noviembre de 2005
Departamento de Biología Aplicada
Universidad Miguel Hernández – Campus de Sant Joan d’Alacant
Dr. Antonio Vera Tornel, Profesor Titular de Genética de la Universidad Miguel Hernández
de Elche,
CERTIFICA
que el Licenciado D. Hugo Alonso Cantabrana ha realizado bajo su dirección y supervisión la
Tesis Doctoral que con el título Caracterización de nuevas funciones génicas implicadas en
el desarrollo del gineceo y la fructificación en Arabidopsis thaliana presenta para optar al
Grado de Doctor. El trabajo reflejado en la presente memoria se ha desarrollado íntegramente
en la División de Genética de la Universidad Miguel Hernández de Elche.
Y para que así conste y surta los efectos oportunos, firmo el presente certificado en Sant Joan
d’Alacant a 12 de noviembre de 2005.
Fdo.: Dr. Antonio Vera Tornel
Universidad Miguel Hernández, Campus de Sant Joan, Ctra. Alicante-Valencia Km. 87, 03550 San Juan, Alicante. España
Tel: 34 96 591 9542 – Fax: 34 96 591 9568 – e-mail: [email protected] – URL: http://biolapli.umh.es
Departamento de Biología Aplicada
Universidad Miguel Hernández – Campus de Elche
Prof. Dr. D. José Luis Micol Molina, Catedrático de Universidad y Director del Departamento
de Biología Aplicada de la Universidad Miguel Hernández de Elche,
INFORMA
Que la Tesis Doctoral titulada Caracterización de nuevas funciones génicas implicadas en el
desarrollo del gineceo y la fructificación en Arabidopsis thaliana ha sido realizada por el
licenciado D. Hugo Alonso Cantabrana, bajo la inmediata dirección y supervisión del Prof. D.
Antonio Vera Tornel, y que el Departamento de Biología Aplicada ha dado su conformidad
para que sea presentada ante la comisión de doctorado.
Elche, a 15 de noviembre de 2005
Fdo.: José Luis Micol Molina
Universidad Miguel Hernández, Campus de Elche, Edificio Vinalopó, Avenida del Ferrocarril s/n, 03202 Elche, Alicante. España.
Tel: 34 96 665 8504 – Fax: 34 96 665 8511 – e-mail: [email protected] – URL: http://biolapli.umh.es
AGRADECIMIENTOS
Los cinco años que he trabajado en el laboratorio de Genética, y que han dado
como fruto, de momento, esta Tesis Doctoral, han sido una experiencia inigualable que
me ha formado no sólo como científico, sino también como persona. Por este motivo,
quiero dar las gracias a todos los que han convivido conmigo en el laboratorio durante
este periodo y que, de un modo u otro, han participado en este proyecto: Antonio Vera y
Antonio Martínez, cabezas pensantes del grupo; Cristina Ferrándiz, cuyo paso por el
laboratorio fue breve pero intenso; Juanjo, Isabel y Santi, doctorandos y doctores en
distintos estadios de su desarrollo; y Asun y Ade, técnicos de laboratorio. También
deseo incluir en este apartado a todos los miembros del equipo de José Luis Micol y
María Rosa Ponce.
Agradezco a Miguel Ángel Pérez Amador y Eavan Dorcey, del IBMCP, su
inestimable colaboración en la realización de los estudios transcriptómicos. Igualmente
valiosa para el avance de este trabajo ha sido la labor de Eugenio Grau en el Servicio de
Secuenciación de ADN del mismo Instituto.
Agradezco a mis amigos del mundo exterior su capacidad para hacerme olvidar el
laboratorio de vez en cuando.
Por supuesto, debo agradecer a mis padres su apoyo incondicional, sus consejos y
su respeto hacia todas las decisiones que he tomado.
Y por último, dar las gracias a Marina, a la que podría incluir en todos los apartados
anteriores como colega científica, como amiga y como casi de la familia, pero se merece
un párrafo especial por haberme sufrido más que nadie.
La realización de esta Tesis ha sido posible gracias a la concesión de una beca
predoctoral de la Consellería de Cultura i Educació de la Generalitat Valenciana.
Índices
ÍNDICES
I
ÍNDICE DE MATERIAS
I.- INTRODUCCIÓN GENERAL .................................................................................1
1- EL DESARROLLO VEGETAL ...................................................................................3
1.1- Formación de nuevos órganos a partir del meristemo ......................................5
1.2- Producción de flores a partir del meristemo floral ...........................................6
1.3- La fructificación y el fruto ................................................................................6
1.4- Hormonas vegetales..........................................................................................7
2- Arabidopsis thaliana COMO ORGANISMO MODELO PARA EL ESTUDIO
DEL DESARROLLO VEGETAL ....................................................................................8
2.1- Aspectos generales............................................................................................8
2.2- Morfología y ciclo vital ..................................................................................10
2.3- Morfología de la flor.......................................................................................12
2.4- Estructura del pistilo y del fruto .....................................................................13
3- GENÉTICA DEL DESARROLLO REPRODUCTIVO EN Arabidopsis ..................15
3.1- Control genético del desarrollo a partir del meristemo apical del tallo ..........15
3.1.1- WUS y los genes CLAVATA (CLV) mantienen la homeostasis
del meristemo ...............................................................................................16
3.1.2- STM impide la diferenciación prematura en el meristemo.................17
3.1.3- Los genes KNAT son parcialmente redundantes con STM .................17
3.1.4- AS1, AS2 y los genes YABBY promueven la diferenciación
regulando negativamente a los genes KNOX................................................... 17
3.1.5- Función de los genes AGAMOUS (AG) y LEAFY (LFY) en la
determinación del meristemo floral ..............................................................18
3.2- Especificación de los órganos florales: el modelo ABC ................................19
3.2.1- Genes de clase A: APETALA1 (AP1) y AP2 ......................................20
3.2.2- Genes de clase B: AP3 y PISTILLATA (PI) .......................................20
3.2.3- Genes de clase C: AG .........................................................................21
3.2.4- Una nueva incorporación al modelo ABC: los genes de la
clase E...........................................................................................................21
3.3- Genes que intervienen en el desarrollo del gineceo........................................21
3.3.1- AG especifica la identidad de los carpelos .........................................21
II
ÍNDICES
3.3.2- FRUITFULL (FUL) impide la expresión en la valva de genes de
la zona de dehiscencia ..................................................................................23
3.3.3- Las funciones de SHP, INDEHISCENT (IND) y ALCATRAZ
(ALC) son necesarias para la dehiscencia de las valvas ...............................23
3.3.4- REPLUMLESS (RPL) impide la expresión en el replum de
genes de la zona de dehiscencia....................................................................24
3.3.5- SPATULA (SPT) participa en la diferenciación de la región
apical del gineceo y promueve la identidad carpelar....................................25
3.3.6- CRABS CLAW (CRC) interacciona con SPT y confiere
identidad carpelar .........................................................................................25
3.3.7- Los genes STYLISH1 (STY1), STY2 y TOUSLED (TSL) están
implicados en la formación de los tejidos apicales del gineceo ...................26
3.3.8- ETTIN (ETT) está relacionado con la respuesta a auxinas y la
regionalización del gineceo ..........................................................................26
3.3.9- Las mutaciones en los genes CLV provocan la aparición de
carpelos supernumerarios .............................................................................27
3.3.10- erecta (er) afecta al tamaño del fruto y la morfología del estilo......27
3.4- Nuevas funciones génicas implicadas en el desarrollo del pistilo ..................28
II.- MATERIALES Y MÉTODOS ..............................................................................29
1- CULTIVO Y MANIPULACIÓN DE PLANTAS ......................................................31
1.1- Nomenclatura utilizada en la denominación de genes, mutaciones y
fenotipos de Arabidopsis........................................................................................31
1.2- Líneas de Arabidopsis.....................................................................................31
1.3- Cultivo de plantas ...........................................................................................32
1.4- Realización de cruzamientos ..........................................................................33
1.5- Mutagénesis de semillas con EMS (metanosulfonato de etilo) ......................34
1.6- Amplificación y escrutinio de las líneas mutagenizadas con EMS ................34
2- CULTIVO Y MANIPULACIÓN DE BACTERIAS ..................................................35
2.1- Cultivo de bacterias ........................................................................................35
2.2- Transformación...............................................................................................36
3- TÉCNICAS DE HISTOLOGÍA VEGETAL ..............................................................36
3.1- Inclusión de muestras en resina JB4 ...............................................................36
ÍNDICES
III
3.2- Inclusión de muestras en parafina...................................................................36
3.3- Obtención de cortes histológicos ....................................................................37
3.4- Tinción GUS ...................................................................................................37
3.5- Tinción con floroglucinol ...............................................................................37
4- OBSERVACIÓN Y FOTOGRAFÍA A BAJO AUMENTO
5- TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA...............................................................................38
5.1- Microscopía óptica..........................................................................................38
5.2- Microscopía electrónica de barrido.................................................................38
6- OBTENCIÓN Y MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ............................38
6.1- Obtención de DNA genómico de Arabidopsis ...............................................38
6.2- Obtención de RNA total de Arabidopsis ........................................................39
6.3- Obtención de DNA plasmídico.......................................................................39
6.4- PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) .................................................39
6.5- Digestión enzimática de DNA ........................................................................40
6.6- Reacciones de ligación de DNA .....................................................................40
6.7- Electroforesis en geles de agarosa ..................................................................40
6.8- Electroforesis en geles de acrilamida .............................................................41
6.9- Secuenciación de DNA...................................................................................41
6.10- Análisis informático de las secuencias de ácidos nucleicos .........................41
7-
CARTOGRAFÍA
DE
MUTACIONES
MEDIANTE
ANÁLISIS
DE
LIGAMIENTO A MARCADORES MOLECULARES POLIMÓRFICOS ..................41
7.1- Cartografía manual .........................................................................................41
7.2- Cartografía semiautomatizada ........................................................................42
8- ANÁLISIS GENÓMICO CON MICROMATRICES DE DNA ................................42
9- ESTUDIOS DE EXPRESIÓN MEDIANTE HIBRIDACIÓN IN SITU ....................43
9.1- Generación de ribosondas marcadas con digoxigenina ..................................43
9.2- Cuantificación de las sondas...........................................................................44
9.3- Prehibridación e hibridación...........................................................................45
9.4- Inmunodetección colorimétrica de la señal ....................................................46
Anexo II-1. Oligonucleótidos empleados como cebadores .............................................48
IV
ÍNDICES
III.- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE zeppelin, UN NUEVO
MUTANTE DE Arabidopsis thaliana CON ALTERACIONES EN LA
MORFOLOGÍA DEL GINECEO ...............................................................................49
ANTECEDENTES Y OBJETIVOS.............................................................................51
RESULTADOS ..............................................................................................................55
1- Escrutinio de la población mutagenizada y aislamiento de mutantes................55
2- Aislamiento del mutante zeppelin (zpl) .............................................................56
3- zpl se comporta como una mutación monogénica y de carácter recesivo .........58
4- Caracterización fenotípica del mutante zpl........................................................58
5- Cartografía genética de la mutación zpl.............................................................61
6- Análisis de las interacciones genéticas de zpl....................................................64
6.1- La longitud de los frutos zpl ful disminuye respecto a ful, pero su
crecimiento radial no varía ...........................................................................64
6.2- Las mutaciones zpl y crc muestran una relación de aditividad .............65
7- Análisis transcriptómico del mutante zpl...........................................................67
DISCUSIÓN ...................................................................................................................71
1- Distintos factores dificultan el aislamiento de mutantes partenocárpicos .........71
2- La mutación zpl altera la dirección del crecimiento celular en el exocarpo ......72
3- ZPL interviene en la función de los meristemos................................................73
4- La formación de valvas incompletas en zpl sugiere la implicación de ZPL
en la especificación de la identidad de las células del ovario ................................74
5- El efecto de la mutación zpl es parcialmente independiente de la actividad
FUL ........................................................................................................................75
6- ZPL y CRC participan en procesos complementarios durante el desarrollo
del fruto ..................................................................................................................75
7- La mutación zpl parece afectar a la región reguladora situada entre los
genes At5g16210 y At5g16220..............................................................................76
7.1- At5g16210 codifica una proteína presuntamente involucrada en la
dinámica del citoesqueleto............................................................................77
7.2- La función de At5g16220 no puede deducirse a partir de sus
dominios estructurales ..................................................................................78
ÍNDICES
V
8- El estudio transcriptómico sugiere alteraciones en la composición de la
membrana y la pared celular en el mutante zpl ......................................................78
IV.- ESTUDIO DE LAS FUNCIONES DE AS1 Y KNAT1/BP EN EL
DESARROLLO DEL GINECEO DE Arabidopsis thaliana ......................................81
ANTECEDENTES Y OBJETIVOS.............................................................................83
RESULTADOS ..............................................................................................................85
1- Aislamiento y caracterización del doble mutante 260-4....................................85
1.1- Las silicuas en 260-4 presentan el replum ensanchado y las valvas
reducidas .......................................................................................................85
1.2- Las plantas 260-4 muestran rasgos similares a los mutantes
asymmetric leaves 1 (as1).............................................................................86
2- La línea 260-4 es un doble mutante as1 ful-1....................................................87
3- Caracterización molecular de as1-104, un nuevo alelo de pérdida de
función del gen AS1 ...............................................................................................88
4- Caracterización fenotípica de los frutos as1-1...................................................89
4.1- El replum está alterado en los frutos del mutante simple as1-1............90
4.2- Las silicuas as1-1 presentan una alteración en el número de
células del replum y de la valva....................................................................91
5- El patrón de expresión de AS1 en el gineceo es coherente con los
fenotipos observados..............................................................................................92
6- La desrepresión de KNAT1 está implicada en el fenotipo de as1 en el
gineceo ...................................................................................................................93
7- El patrón de expresión de KNAT1 está alterado en el gineceo de los
mutantes as1...........................................................................................................95
8- La expresión de RPL se extiende a todo el ovario en las plantas
35S::KNAT1 ...........................................................................................................98
9- La pérdida de función de AS1 en el mutante rpl restaura el fenotipo
silvestre ..................................................................................................................99
10- AS2 también interviene en la formación de la silicua....................................100
VI
ÍNDICES
11- La pérdida de función de KNAT2 no afecta al fenotipo de la silicua en
los mutantes as1 ...................................................................................................101
12- El patrón de lignificación y la dehiscencia no están alterados en as1 ...........102
13- Los mutantes as1, bp y pny muestran alteraciones en el estilo .....................103
14- La mutación er afecta al número de células en la valva y el replum ............105
DISCUSIÓN .................................................................................................................107
1- La mutagénesis en un fondo ful facilita la identificación de mutantes del
replum ..................................................................................................................107
2- AS1 y AS2 reprimen la expresión de genes KNOX en el gineceo ...................107
3- Varios genes KNOX podrían actuar de forma redundante en el replum .........108
4- El replum presenta características propias del meristemo ...............................109
5- Los genes AS1 y KNAT1 están implicados en la regionalización del
ovario ...................................................................................................................110
6- KNAT1 es un gen de identidad de replum .......................................................112
7- La función de la proteína KNAT1 es inhibida por productos génicos de la
valva .....................................................................................................................113
8- El margen de valva se desplaza al expresar ectópicamente KNAT1................115
9- La relación funcional entre los genes AS1, KNAT1 y RPL en el estilo es
diferente a la que muestran en el replum .............................................................116
10- Implicaciones evolutivas del caracter meristemático del replum ..................117
11- Nuevas perspectivas.......................................................................................118
V.- CONCLUSIONES .................................................................................................121
VI.- BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................125
ÍNDICES
VII
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. I-1. Representación esquemática del meristemo apical del tallo ...............................5
Fig. I-2. Representación esquemática de los cromosomas de Arabidopsis .......................9
Fig. I-3. Diferentes estadios del desarrollo de Arabidopsis.............................................11
Fig. I-4. Ciclo vital de Arabidopsis .................................................................................11
Fig. I-5. La flor de Arabidopsis .......................................................................................13
Fig. I-6. El gineceo de Arabidopsis en distintos estadios del desarrollo
postfertilización ...............................................................................................................13
Fig. I-7. Estructura externa del pistilo de Arabidopsis ....................................................14
Fig. I-8. Estructura interna del fruto de Arabidopsis.......................................................14
Fig. I-9. Micrografía electrónica de barrido de un fruto en estadio 17............................15
Fig. I-10. Modelo de la relación entre los genes que participan en el
mantenimiento del meristemo y la diferenciación de los órganos laterales ....................17
Fig. I-11. Modelo de la terminación del meristemo floral ..............................................19
Fig. I-12. El modelo ABC para la determinación de los órganos florales.......................20
Fig. I-13. Mutantes afectados en la morfología del gineceo ...........................................22
Fig. I-14. Modelo de la delimitación de la valva, el replum y la zona de
dehiscencia ......................................................................................................................23
Fig. I-15. Gradiente de auxinas en el gineceo .................................................................27
Fig. II-1. Dos métodos de cultivo de Arabidopsis...........................................................33
Fig. II-2. Esquema de la estrategia de mutagénesis y escrutinio.....................................35
Fig. II-3. Plásmido pGEM-T ...........................................................................................44
Fig. II-4. Cuantificación de ribosondas ...........................................................................45
Fig. III-1. Frutos Ler y cer6 en distintas condiciones .....................................................55
Fig. III-2. Pistilos no polinizados de plantas cer6-2 y 71-1 ............................................57
Fig. III-3. Distintos aspectos del fenotipo Zpl en el fruto ...............................................57
Fig. III-4. Alteración del patrón de filotaxia en una planta zpl .......................................58
Fig. III-5. Micrografías electrónicas de barrido de frutos zpl..........................................59
Fig. III-6. Detalle de las ondulaciones en las valvas de frutos zpl ..................................59
Fig. III-7. Micrografías electrónicas de barrido de la región media de silicuas Ler
y zpl .................................................................................................................................60
Fig. III-8. Secciones longitudinales de silicuas Ler y zpl................................................60
Fig. III-9. Secciones transversales de frutos Ler y zpl ....................................................61
VIII
ÍNDICES
Fig. III-10. Frutos en estadio 17 de plantas Col-0 y zpl ..................................................62
Fig. III-11. Cartografía genética de la mutación zpl........................................................63
Fig. III-12. Frutos del mutante simple ful-1 y del doble mutante ful-1 zpl .....................65
Fig. III-13. Frutos zpl, crc-1 y zpl crc-1 ..........................................................................66
Fig. III-14. Micrografías electrónicas de barrido de frutos crc-1 y zpl crc-1..................66
Fig. III-15. Expresión de CRC en el meristemo de inflorescencia ..................................67
Fig. III-16. Hipótesis acerca de la aparición de valvas extra incompletas en los
frutos zpl ..........................................................................................................................74
Fig. IV-1. Distintos aspectos de las silicuas ful-1 y 260-4 ..............................................86
Fig. IV-2. Rosetas ful-1, 260-4 y as1-1 ...........................................................................87
Fig. IV-3. Secuencia de nucleótidos de AS1, y su traducción a aminoácidos .................89
Fig. IV-4. Distintos aspectos de frutos silvestres Col-0 y as1-1 .....................................90
Fig. IV-5. Detalle del replum en el silvestre Col-0 y en el mutante as1-1 ......................91
Fig. IV-6. Representación gráfica del número de células en la epidermis de la
valva y el replum .............................................................................................................92
Fig. IV-7. Análisis de la expresión de AS1 mediante hibridación in situ ........................93
Fig. IV-8. Distintos aspectos de las silicuas Col-0, as1, 35S::KNAT1, 260-4, as1-1
bp-1 y 35S::KNAT1 ful-1.................................................................................................94
Fig. IV-9. Rosetas as1-1, as1-1 bp-1 y as2-1..................................................................95
Fig. IV-10. Expresión de líneas KNAT1::GUS ................................................................96
Fig. IV-11. Expresión de KNAT1::GUS-18 en secciones transversales de ovarios.........97
Fig. IV-12. Expresión de la línea BLR::GUS...................................................................98
Fig. IV-13. Replum de una silicua bp-1 pny-40126 ........................................................99
Fig. IV-14. Detalle del replum en cortes transversales de frutos Col-0, as1-1, rpl-1
y as1-1 rpl-1 ...................................................................................................................99
Fig. IV-15. Silicuas as1-1, as2-1, 35S::KNAT1 ful-1 y as2-1 ful-1 ..............................100
Fig. IV-16. Silicuas knat2 y as1 knat2 ..........................................................................102
Fig. IV-17. Cortes transversales de frutos Col-0 y as1-1, teñidos con floroglucinol....102
Fig. IV-18. Expresión de SHP2::GUS ...........................................................................103
Fig. IV-19. Región del estilo en frutos as1-1 y Col-0 ...................................................103
Fig. IV-20. Secciones transversales del estilo de frutos Col-0, as1-1, 35S::KNAT1,
bp-1, pny-40126, as1-1 bp-1 y bp-9 pny-40126 ............................................................104
Fig. IV-21. Representación gráfica del número de células en la epidermis de la
valva y el replum de frutos Col-0 y Ler ........................................................................105
ÍNDICES
IX
Fig. IV-22. Modelo de la regionalización del ovario propuesto en Dinneny et al.
(2005) ............................................................................................................................111
Fig. IV-23. Dos modelos hipotéticos mostrando las relaciones entre los genes que
participan en la regionalización del ovario....................................................................114
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I-1. Etapas del desarrollo floral en Arabidopsis ....................................................12
Tabla II-1. Líneas de Arabidopsis utilizadas en la presente Tesis...................................32
Tabla III-1. Porcentaje de germinación y de aparición de rosetas albinas tras la
mutagénesis .....................................................................................................................56
Tabla III-2. Análisis transcriptómico del mutante zpl .....................................................69
Tabla IV-1. Segregaciones fenotípicas obtenidas en la descendencia de distintos
cruzamientos....................................................................................................................88
I
Introducción general
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
3
El desarrollo puede definirse esencialmente como la formación de estructuras
organizadas a partir de un grupo de células inicialmente muy simple (Wolpert et al.,
2002). Implica procesos de diferenciación (generación de diversidad celular),
morfogénesis (organización espacial de las células en tejidos y órganos), crecimiento
(aumento de tamaño del organismo) y reproducción (producción de gametos). Estos
fenómenos ocurren de forma coordinada y están sometidos en último término a un
estrecho control genético para dar lugar a niveles de organización sucesivamente más
complejos, desde el establecimiento de los ejes principales del embrión hasta la
formación de órganos muy especializados en la posición precisa y en el momento
adecuado. Pese a la enorme diversidad existente entre los seres vivos, muchos de los
mecanismos que intervienen en el desarrollo son comunes a todos o a grandes grupos de
ellos. Esto permite que los conocimientos adquiridos a partir de la investigación en unos
pocos organismos modelo puedan extrapolarse a procesos similares que ocurren en otras
especies aparentemente muy alejadas. En la actualidad los mayores esfuerzos en este
campo se centran en la identificación y caracterización de las funciones génicas que
subyacen a los distintos procesos del desarrollo.
1- EL DESARROLLO VEGETAL.
Aunque los estudios en Biología del Desarrollo han estado históricamente
concentrados en los animales, el desarrollo vegetal ha ido despertando un interés
creciente debido, en parte, a las aplicaciones biotecnológicas que pueden derivarse de
las investigaciones en este terreno.
El reino vegetal comprende una enorme variedad de organismos, desde las algas
unicelulares hasta las plantas terrestres, que se presentan en una gran diversidad de
formas. El desarrollo pluricelular evolucionó de forma independiente en los animales y
en las plantas, siendo su último ancestro común un eucariota unicelular (Meyerowitz,
2002). Por este motivo, aunque sus células comparten muchas características
estructurales y bioquímicas, existen importantes diferencias en los procesos que
determinan el desarrollo de los animales y los vegetales pluricelulares. Una
característica fundamental que comparten los vegetales y los diferencia de los animales
es la autotrofía, conferida por la presencia en sus células de cloroplastos, donde tiene
lugar la fotosíntesis.
4
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
A pesar de que las plantas son organismos sésiles, su desarrollo es extremadamente
plástico, característica que les confiere una gran versatilidad adaptativa frente a las
condiciones cambiantes del ambiente. Sus patrones de crecimiento se ven
profundamente influenciados por señales exógenas como la luz y la gravedad,
información que se integra con los programas endógenos del desarrollo (Leyser y Day,
2003). Otro reflejo, y a la vez causa, de esta plasticidad es la totipotencia que presentan
casi todas las células vegetales, siendo capaces de desdiferenciarse y regenerar una
planta completa si se someten a los estímulos hormonales adecuados (Lyndon, 1990).
La estructura de las plantas es relativamente simple, con unos 40 tipos celulares
diferentes frente a los más de 100 que pueden aparecer en los animales. Las células
vegetales están rodeadas por una pared celular rígida formada por polisacáridos y
proteínas que impide las migraciones celulares; además, los procesos de apoptosis no
son comunes en la regulación del desarrollo vegetal, de modo que la organogénesis y la
organización de tejidos en las plantas dependen, fundamentalmente, de las tasas de
división celular, el lugar y el plano en el que se producen las divisiones, y el aumento
dirigido del tamaño de las células (Meyerowitz, 1997). Sin embargo, la pared celular no
aísla a las células de su entorno, ya que es permeable a moléculas pequeñas, incluso a
algunas fitohormonas, y además existen canales intercelulares llamados plasmodesmos
que permiten el paso de otras mayores (Leyser y Day, 2003). Esta comunicación
intercelular es crítica durante el desarrollo vegetal ya que, en general, el destino celular
está determinado por la posición que ocupan las células y no por su linaje, por lo que
deben ser capaces de recibir información precisa acerca de su posición espacial y las
características de su entorno.
Por otra parte, el desarrollo vegetal es fundamentalmente postembrionario. En el
embrión se establece un esbozo básico del plan corporal de la planta, pero los órganos
que aparecen en el adulto se desarrollan a lo largo de su ciclo vital de forma continua e
iterativa a partir de los meristemos (Lyndon, 1990). Los meristemos contienen células
que se mantienen en estado indiferenciado (células madre o stem cells) y se dividen
durante toda la vida del individuo, produciendo nuevas células que pueden diferenciarse
para dar lugar a las distintas estructuras de la planta en las posiciones adecuadas. Son,
por tanto, estructuras clave en el desarrollo, ya que van a generar todos los órganos,
determinando la morfología final de éstos y la arquitectura general de la planta
(Bowman, 1994).
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
5
1.1- Formación de nuevos órganos a partir del meristemo.
Durante la embriogénesis se establecen los dos meristemos principales que van a
generar el eje apical-basal de la planta: el meristemo apical del tallo (shoot apical
meristem o SAM), que dará lugar a las partes aéreas de la planta, y el meristemo apical
de la raíz (root apical meristem o RAM), que originará las raíces (Lyndon, 1990).
El SAM está organizado estructuralmente en tres capas de células indiferenciadas.
Las capas epidérmica y subepidérmica, denominadas L1 y L2 respectivamente, forman
la túnica, y por debajo de ésta encontramos el corpus o capa L3. Las células de las capas
L1 y L2 se dividen anticlinalmente, de forma perpendicular a la superficie del
meristemo, mientras que en la capa L3 las divisiones ocurren en todos los planos
(Fig. I-1A; Fletcher y Meyerowitz, 2000; Fletcher, 2002). Las tres capas contribuyen a
la formación de distintas regiones de los nuevos órganos en desarrollo.
A
B
Fig. I-1. Representación esquemática del meristemo apical del tallo. A: capas celulares del
meristemo. Las flechas indican la dirección de la expansión de cada capa. B: regiones funcionales del
meristemo. ZC: zona central; ZP: zona periférica; ZM: zona medular. Tomado de Fletcher y
Meyerowitz (2000), con modificaciones.
En el SAM también pueden distinguirse tres dominios funcionales: la zona central,
formada por células indiferenciadas y totipotentes; la zona periférica, a partir de la cual
se forman los primordios de los distintos órganos; y la zona medular, que dará lugar al
tallo en crecimiento (Fletcher, 2002). La zona periférica recibe un aporte constante de
células procedentes de la zona central, y puede considerarse una región de transición en
la que la totipotencia de las células comienza a restringirse. Es necesaria una continua
comunicación entre las células vecinas de las distintas zonas para que las divisiones
6
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
celulares se produzcan de forma coordinada y se mantenga una población constante de
células indiferenciadas (Fig. I-1B; Fletcher y Meyerowitz, 2000).
Tras la germinación de la semilla y la emergencia de la plántula, en el desarrollo de
las partes aéreas pueden distinguirse dos fases: la vegetativa y la reproductiva. Durante
el desarrollo vegetativo el SAM produce únicamente hojas, que se distribuyen en un
patrón radial característico de cada especie y que recibe el nombre de filotaxia.
Posteriormente la integración de señales ambientales como la luz, la temperatura y la
disponibilidad de nutrientes, junto con señales endógenas como el incremento de la
producción de algunas hormonas, fundamentalmente giberelinas, dispara la transición a
la fase reproductiva (Chuck y Hake, 2005). A partir de este momento el SAM se
convierte en meristemo de inflorescencia y es capaz de producir meristemos laterales,
que dan lugar a ramificaciones del tallo, y meristemos florales, a partir de los cuales se
desarrollan las flores.
1.2- Producción de flores a partir del meristemo floral.
Los meristemos florales son estructuralmente muy similares al SAM, pero se
diferencian de éste en dos aspectos fundamentales. Por un lado, los órganos que se
producen a partir del meristemo floral se organizan generalmente en varios verticilos
concéntricos. Además, mientras que la actividad del SAM es indeterminada en muchas
especies y puede producir un número indefinido de órganos, la actividad del meristemo
floral es determinada y deja de generar nuevas estructuras cuando se ha completado la
formación de todos los órganos florales (Steeves y Sussex, 1989).
En la mayoría de las dicotiledóneas, los meristemos florales producen cuatro tipos
de órganos. Los dos verticilos más externos de la flor están formados por los órganos no
reproductivos que constituyen el perianto, con los sépalos en el primero y más externo
de ellos y los pétalos en el segundo. En el tercer verticilo se sitúan los órganos
reproductores masculinos o estambres, que producirán el polen. En la parte central de la
flor se encuentra el cuarto verticilo, formado por el pistilo o gineceo, que contiene los
óvulos que darán lugar a las semillas tras su fertilización (Lyndon, 1990).
1.3- La fructificación y el fruto.
El fruto es un órgano muy especializado cuya función es proteger las semillas
durante su desarrollo y finalmente permitir su dispersión. Se desarrolla a partir del
pistilo (y en ocasiones de otros órganos de la flor) en un proceso denominado
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
7
fructificación, durante el cual se produce un aumento general del tamaño del órgano y la
diferenciación de nuevas estructuras. Este crecimiento se consigue mediante una fase
inicial de divisiones celulares y la posterior expansión de las células. El desarrollo del
fruto y la formación de las semillas son procesos coordinados y se inician cuando llegan
al ovario una serie de señales desencadenadas por la polinización del pistilo y la
posterior fertilización de los óvulos, como el aumento localizado de los niveles de
auxinas y giberelinas (Gillaspy et al., 1993; Vivian-Smith y Koltunow, 1999). De
hecho, es posible promover la fructificación mediante la aplicación exógena de estas
hormonas. Sin estos estímulos el pistilo entra en fase de senescencia y degenera
(García-Martínez y Carbonell, 1980; Vercher y Carbonell, 1991). La excepción a esta
dicotomía son las plantas que producen frutos partenocárpicos, en las que los procesos
de fertilización y fructificación están desacoplados de forma que son capaces de
producir frutos sin semillas en ausencia de polinización.
1.4- Hormonas vegetales.
Las hormonas vegetales o fitohormonas son pequeñas moléculas orgánicas
producidas por las plantas que, a bajas concentraciones, influyen sobre procesos
fisiológicos relacionados principalmente con el crecimiento, la diferenciación y el
desarrollo (Davies, 2004). La síntesis de hormonas vegetales puede ser localizada, como
ocurre con las hormonas animales, o producirse en una amplia gama de tejidos y
células. Aunque pueden ser transportadas y actuar a larga distancia, en muchos casos
ejercen su función sobre el mismo tejido o célula que las sintetiza. A continuación se
describen las características principales de algunos grupos representativos de
fitohormonas.
Auxinas
La más importante es el ácido indolacético (IAA). Se sintetizan principalmente en
los primordios de las hojas, en las hojas jóvenes y en las semillas en desarrollo, y son
transportadas hasta la raíz. Los principales efectos de las auxinas son el agrandamiento
y la división celulares, el crecimiento del tallo, la diferenciación de tejidos vasculares y
la iniciación de la raíz. También están implicadas en el mantenimiento de la dominancia
apical, ya que la síntesis de auxinas desde el SAM inhibe la formación de meristemos
laterales. Además, las auxinas inducen la fructificación y estimulan el crecimiento del
fruto (Davies, 2004).
8
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
Giberelinas
Las giberelinas son un grupo de diterpenos que se sintetizan en tejidos jóvenes del
tallo y en las semillas en desarrollo (Davies, 2004). Están involucradas en el
crecimiento del tallo a través del estímulo de la división y el crecimiento celular, así
como en la inducción de la germinación de las semillas. Al igual que las auxinas, las
giberelinas participan en la iniciación de la fructificación y el crecimiento del fruto.
Existe una comunicación entre las vías de señales de ambas hormonas, habiéndose
demostrado que las giberelinas pueden afectar a la biosíntesis y al transporte de las
auxinas (Ogawa et al., 2003).
Citoquininas
La mayoría de las citoquininas son derivados de bases púricas que se sintetizan en
el ápice de la raíz y en las semillas en desarrollo. Estimulan la división celular en
presencia de auxinas, y promueven la iniciación del tallo, el crecimiento de meristemos
laterales y la expansión de las hojas por agrandamiento celular. También inducen la
fructificación, aunque en menor medida que las auxinas y las giberelinas (Davies,
2004).
Etileno
El etileno es un gas que se sintetiza en casi todos los tejidos en respuesta a
situaciones de estrés, estimulando distintos mecanismos defensivos y alterando el
crecimiento de la planta. Interviene también en la maduración del fruto y la abscisión de
hojas y órganos florales (Davies, 2004).
2- Arabidopsis thaliana COMO ORGANISMO MODELO PARA EL
ESTUDIO DEL DESARROLLO VEGETAL.
2.1- Aspectos generales.
Hasta bien entrado el siglo XX, la mayoría de los estudios en plantas se realizaron
con especies de interés económico con el fin de mejorar sus cultivos. Entre estas
especies se encuentran el maíz (Zea mais), el tomate (Lycopersicon esculentum), el
guisante (Pisum sativum) o el tabaco (Nicotiana tabacum). Sin embargo, estas plantas
presentan muchos inconvenientes que dificultan el análisis y la manipulación en el
laboratorio, como es su tamaño relativamente grande, su largo tiempo de generación o,
en lo referente al material genético, sus grandes genomas con elevados niveles de
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
9
ploidía. Por este motivo, desde mediados de los años 80 se ha generalizado la
utilización de Arabidopsis thaliana para la investigación del desarrollo vegetal
(Somerville y Koornneef, 2002). Arabidopsis es una angiosperma dicotiledónea
perteneciente a la familia de las crucíferas o brasicáceas, a la que también pertenecen
especies como la col (Brassica oleracea), el rábano (Raphanus sativus) y las mostazas
(Sinapis sp.; Strasburger et al., 1994). Aunque no tiene valor económico, sus
características la convierten en un organismo modelo muy apropiado para su estudio en
el laboratorio. Presenta un tamaño pequeño, con alrededor de treinta centímetros de
altura máxima, lo que permite siembras de alta densidad; su arquitectura es
relativamente simple, y su ciclo vital, de unos dos meses, resulta corto para una planta
con flores. Además es autógama, es decir, se autopoliniza sin intervención externa, y
produce un gran número de semillas, lo que facilita la propagación de las diversas
líneas. También resulta relativamente fácil realizar cruzamientos entre distintas plantas.
Las semillas pueden almacenarse durante varios años a temperatura ambiente sin perder
viabilidad (Somerville y Koornneef, 2002).
Fig. I-2. Representación esquemática de los cromosomas de Arabidopsis, con el tamaño en
megabases de las regiones secuenciadas en cada uno de ellos (TAGI, 2000). La posición del
centrómero, en rojo, es aproximada.
Arabidopsis es una planta diploide, cuyo genoma, que ha sido totalmente
secuenciado (TAGI, 2000), está organizado en cinco cromosomas y es muy apropiado
para los estudios moleculares por su pequeño tamaño (125 Mb) y su escaso contenido
en DNA repetitivo (Fig. I-2). Su uso intensivo en investigación ha propiciado la
creación de bases de datos de dominio público en las que se ofrecen gran cantidad de
herramientas informáticas, así como información acerca de mutantes, polimorfismos de
10
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
DNA, protocolos de laboratorio, etc. Una de las más importantes es el TAIR (The
Arabidopsis Information Resource, http://www.arabidopsis.org).
Existen numerosas estirpes de Arabidopsis aisladas en localizaciones concretas y
que presentan algunas diferencias morfológicas entre sí, que reciben el nombre de
ecotipos o accesos y son tomados como referencia para definir la morfología normal
(silvestre o wild type) de las plantas (Alonso-Blanco y Koornneef, 2000). Los más
utilizados son Columbia-0 (Col-0) y Landsberg erecta (Ler), pese a que este último es
homocigótico para la mutación erecta, que afecta de forma notable a la arquitectura
general de la planta (Tsukaya et al., 1993 y 1995). Los polimorfismos existentes entre
distintos ecotipos suponen una fuente muy importante de marcadores genéticos y
moleculares que facilitan en gran medida la cartografía de las mutaciones obtenidas y la
clonación posicional de los genes afectados por éstas (Alonso-Blanco y Koornneef,
2000).
2.2- Morfología y ciclo vital.
Al final de la embriogénesis queda definido un esbozo de la estructura corporal de
la planta, con los dos meristemos principales establecidos, una radícula y dos
cotiledones u hojas embrionarias cuya función principal es servir de órganos de reserva
durante las primeras etapas tras la germinación (Figs. I-3A y I-4; Bowman, 1994;
Wolpert et al., 2002).
Durante toda la fase vegetativa, el SAM produce únicamente hojas dejando una
escasa distancia entre ellas denominada entrenudo, lo que da como resultado una roseta
compacta (Figs. I-3B y I-4). La duración de esta etapa, y por tanto el número final de
hojas de la roseta, depende de las condiciones de cultivo y del ecotipo (Bowman, 1994).
Durante la fase reproductiva, a partir del meristemo de inflorescencia se forma el
tallo principal debido a un incremento de la longitud de los entrenudos (Figs. I-3C y
I-4). La aparición de meristemos laterales asociados a las axilas de las hojas caulinares
genera ramificaciones del tallo. En los extremos del tallo principal y sus ramificaciones
se forman las inflorescencias, con las flores dispuestas en racimo (Figs. I-3D y I-4).
Durante la fase de antesis (Tabla I-1), la flor alcanza la madurez y tiene lugar la
autopolinización y la fertilización de los óvulos, que desencadenan el desarrollo de las
semillas y la fructificación (ver apartado 1.3). Al final de la fase reproductiva, la planta
se seca permitiendo la liberación de las semillas contenidas en sus frutos (Bowman,
1994; Wolpert et al., 2002).
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
A
B
C
11
D
Fig. I-3. Diferentes estadios del
desarrollo de Arabidopsis. Embrión
maduro (A), roseta vegetativa (B),
planta adulta (C), detalle de la
inflorescencia (D).
Fig. I-4. Ciclo vital de Arabidopsis. Se indican los principales eventos y las estructuras más relevantes
de cada estadio. Modificado a partir de Wolpert et al. (2002).
12
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
2.3- Morfología de la flor.
La flor de Arabidopsis mide unos 2 mm. y consta de cuatro verticilos concéntricos
de órganos, que presentan la organización típica de las crucíferas (Fig. I-5; Bowman,
1994). Los dos primeros verticilos están compuestos por cuatro sépalos y cuatro pétalos
respectivamente. El tercero está formado por seis estambres, consistentes en un
filamento que sostiene la antera, en la que se forma y madura el polen. Por último, en el
cuarto verticilo dos carpelos fusionados dan lugar al pistilo o gineceo. En la Tabla I-1 se
describen los principales eventos del desarrollo floral, prestando especial atención al
desarrollo del pistilo (Fig. I-6).
Tabla I-1. Etapas del desarrollo floral en Arabidopsis, con los marcadores morfológicos que caracterizan
el inicio de cada estadio y el progreso del desarrollo del gineceo. Modificado a partir de Ferrándiz et al.
(1999).
Estadio
Marcador morfológico
1
Aparición del meristemo floral.
Formación del primordio de la flor y separación
2
del meristemo de inflorescencia.
3
Aparición de los primordios de los sépalos.
4
Los sépalos sobrepasan el meristemo floral.
Aparición de los primordios de los pétalos y los
5
estambres.
6
Los sépalos envuelven la yema floral.
7
Los estambres desarrollan un pedúnculo basal.
8
Aparición de lóculos en los estambres.
9
Los pétalos desarrollan un pedúnculo basal.
10
Los pétalos se igualan con los estambres cortos.
11
Aparición de las papilas estigmáticas.
12
Los pétalos se igualan con los estambres largos.
13
Antesis.
14
Los estambres largos sobrepasan el estigma.
15
16
El estigma sobrepasa los estambres largos.
Degeneración de pétalos y sépalos.
17A
Caen los órganos de los tres verticilo externos
de la flor.
17B
La silicua alcanza su tamaño final.
18
La silicua amarillea.
19
20
Dehiscencia de las valvas.
Las semillas caen.
Desarrollo del gineceo
Aparición del primordio del gineceo.
Crecimiento del primordio del gineceo como un
cilindro abierto.
Aparición de la placenta. Diferenciación de los
haces vasculares principales
Aparición de los primordios de los óvulos.
Diferenciación de las capas de los carpelos.
Aparición de los haces vasculares laterales
Cierre del gineceo. Formación del septo.
Diferenciación de la epidermis del estilo y las dos
capas del endocarpo. Ramificación del haz
vascular principal en el extremo del gineceo. Los
óvulos desarrollan el funículo.
Crecimiento general. Diferenciación del tracto
transmisor.
Polinización.
Fertilización. Suturas visibles a ambos lados del
replum.
Lignificación del xilema.
Expansión general.
Formación de la capa de separación. Desarrollo de
la cutícula externa del exocarpo; las células del
endocarpo b (enb) forman el esclerénquima.
Lignificación del enb y la capa de separación.
Degeneración del ena y lignificación total del enb.
Secado del mesocarpo.
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
13
Fig. I-5. Micrografía electrónica de barrido coloreada
de una flor de Arabidopsis. Se señalan los 4 tipos de
órganos principales. Tomado de Science Photo
Library (www.sciencephoto.com) con modificaciones.
Fig. I-6. Fotografías del gineceo de
Arabidopsis en distintos estadios del
desarrollo postfertilización, que se
indican en la parte inferior. Barra de
escala: 2 mm. Modificado a partir de
Ferrándiz et al. (1999).
2.4- Estructura del pistilo y del fruto.
La morfología del pistilo y del fruto de Arabidopsis es relativamente simple, lo que
los hace muy apropiados para la investigación de procesos básicos del desarrollo
(Fig. I-7). Presentan la misma estructura básica en las más de 3.000 especies de
brasicáceas, que además es similar a la que se presenta en otras familias como las
leguminosas, ofreciendo la posibilidad de extrapolar los resultados obtenidos a muchas
especies (Bowman, 1994; Ferrándiz et al., 1999).
En el pistilo maduro (estadio de antesis; Tabla I-1) pueden distinguirse
externamente tres regiones: el estigma, el estilo y el ovario. Éste se une al pedúnculo de
la flor a través de un corto entrenudo denominado ginóforo. En la región más apical del
pistilo se encuentra el estigma, con unas células epidérmicas alargadas denominadas
papilas estigmáticas en las que se deposita y germina el polen (Kandasamy et al., 1994).
14
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
Debajo se encuentra el estilo, que al igual que el estigma presenta simetría radial. Su
superficie externa está formada por células cuadrangulares que muestran depósitos de
ceras, con estomas intercalados (Sessions y Zambryski, 1995). Por la zona central del
estilo discurre el tracto transmisor, que facilita el avance del tubo polínico hacia el
ovario y los óvulos (Bowman, 1994).
Fig. I-7. Micrografía electrónica de barrido de un pistilo en
fase de antesis, en el que se indican las principales
estructuras externas. Modificado a partir de Ferrándiz
(2002).
El ovario está compuesto por dos valvas, separadas por dos repla que internamente
están unidos mediante un falso septo por el cual desciende el tracto transmisor (Fig. I-8;
Bowman, 1994). El septo se considera falso porque no deriva de las paredes laterales de
los carpelos, sino del crecimiento y la fusión de sus márgenes durante la ontogenia del
pistilo (Bowman et al., 1989). Esta estructura divide longitudinalmente el ovario en dos
cavidades o lóculos en las que se alojan los óvulos, unidos a través del funículo a
regiones de tejido placentario del septo.
Fig. I-8. Corte transversal de un
fruto en estadio 17, en el que se
indican las principales estructuras.
Barra de escala: 200 µm.
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
15
Las valvas consisten en seis capas de células que comprenden cuatro tipos celulares
diferentes: la epidermis abaxial o exterior, también llamada exocarpo; tres capas de
células del clorénquima o mesocarpo; y dos capas de endodermo o endocarpo, enb y
ena, siendo esta última la capa más adaxial o interior (Fig. I-8; Sessions y Zambrisky,
1995).
El fruto de Arabidopsis conserva las mismas estructuras que se han descrito para el
ovario, pero durante su desarrollo se diferencia además la zona de dehiscencia en el
margen entre la valva y el replum (Dinneny y Yanofsky, 2004; Fig. I-8). La superficie
externa de las valvas está formada por células alargadas e irregulares con estomas
intercalados. En el replum, en cambio, no existen estomas y las células son mucho más
compactas y pequeñas, presentando una morfología rectangular más regular (Fig. I-9).
La zona de dehiscencia se lignifica junto con la capa enb al final del desarrollo del fruto,
lo que genera una tensión mecánica que finalmente provoca la apertura de las valvas y
la liberación de las semillas (Bowman, 1994; Ferrándiz et al., 1999). Este tipo de fruto
dehiscente derivado de un pistilo bicarpelar se denomina también silicua.
Fig. I-9. Micrografía electrónica de barrido de
un fruto en estadio 17. La flecha blanca señala
un estoma. V: valvas; R: replum. Barra de
escala: 100 µm.
3- GENÉTICA DEL DESARROLLO REPRODUCTIVO EN Arabidopsis.
3.1- Control genético del desarrollo a partir del meristemo apical del tallo.
Los órganos laterales de las partes aéreas de las plantas, entre los que se incluyen
los órganos reproductivos, se producen a partir de la zona periférica de los meristemos.
Las células indiferenciadas de la zona central se encargan de mantener la homeostasis
celular en el meristemo, proporcionando nuevas células a la zona periférica sin que
16
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
varíe de forma notable la población de células de la propia zona central. Por tanto, debe
existir un estrecho control del tamaño de las distintas regiones del meristemo, lo que
implica una íntima comunicación entre ellas.
Los análisis genéticos en Arabidopsis han permitido identificar dos genes clave en
la
formación
y
el
mantenimiento
del
meristemo,
WUSCHEL
(WUS)
y
SHOOTMERISTEMLESS (STM), que codifican factores de transcripción con
homeodominio y actúan desde la embriogénesis durante todo el desarrollo de la planta.
3.1.1- WUS y los genes CLAVATA (CLV) mantienen la homeostasis del
meristemo.
La expresión de WUS se restringe a un pequeño grupo de células en la parte inferior
de la zona central del meristemo denominado centro organizador, y es necesaria para
promover la formación de células indiferenciadas en la parte superior de la zona central
(Fig. I-10; Mayer et al., 1998). En los mutantes wus la población de células madre es
incapaz de automantenerse; el meristemo se forma pero sus células se incorporan a los
nuevos órganos sin que se renueve la población de células indiferenciadas, por lo que
disminuye progresivamente de tamaño hasta desaparecer. El dominio de expresión de
WUS, y por tanto el tamaño del meristemo, se mantiene constante gracias a un bucle de
retroalimentación negativo que implica a la vía de señalización extracelular formada por
los genes CLV1, CLV2 y CLV3 (Carles y Fletcher, 2001). Las mutaciones en estos genes
provocan un aumento del tamaño del meristemo debido a la expresión de WUS en un
dominio mayor, lo que afecta a la morfología del tallo y los órganos laterales (Clark et
al., 1993; Clark et al., 1995; Kayes y Clark, 1998). CLV1 y CLV2 codifican dos
componentes de un receptor con actividad quinasa (Jeong et al., 1999) que se activa al
unirse CLV3 (Rojo et al., 2002), un pequeño péptido secretado, reprimiendo entonces
de forma indirecta la expresión de WUS. La proteína CLV3 es producida por las células
madre del meristemo y difunde en todas direcciones, pero su movimiento hacia el centro
del meristemo está limitado por CLV1, que secuestra a CLV3 e impide que llegue a
reprimir la expresión de WUS en el centro organizador. WUS, por su parte, es capaz de
inducir la expresión de CLV3 en las células indiferenciadas, lo que da lugar a un
equilibrio dinámico entre ambos mediante el cual cualquier cambio en el tamaño del
meristemo es detectado y compensado (Lenhard y Laux, 2003).
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
17
Fig. I-10. Modelo orientativo de la expresión de los principales genes que participan en el
mantenimiento del meristemo y la diferenciación de los órganos laterales, con las relaciones entre
ellos. El área en verde representa el centro organizador. ZC: zona central; ZP: zona periférica.
3.1.2- STM impide la diferenciación prematura en el meristemo.
STM pertenece a la clase I de la familia de los genes KNOX (KNOTTED1-like
homeobox; Kerstetter et al., 1994). Estos genes codifican factores de transcripción con
homeodominio, un dominio de unión a DNA evolutivamente muy conservado (Lincoln
et al., 1994; Gehring et al., 1990). El dominio de expresión de STM abarca todo el SAM,
pero está excluido de los primordios de los órganos incipientes (Fig. I-10; Long et al.,
1996). Su función principal es impedir la diferenciación prematura de las células del
meristemo mediante la represión de genes que promueven la determinación, como
ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) y AS2, pero su actividad también es necesaria junto con
la de WUS para mantener elevados niveles de expresión de CLV3 (Gallois et al., 2002).
Los mutantes stm son incapaces de establecer y mantener el SAM, de forma que no se
desarrollan órganos laterales tras la formación de los cotiledones (Barton y Phoetig,
1993). Sin embargo las mutaciones as1 y as2 rescatan el fenotipo de stm, de donde se
deduce que dicho fenotipo está provocado por la expresión ectópica de AS1 y AS2 en el
meristemo y que, en ausencia de alguno de ellos, el meristemo puede mantenerse sin la
función de STM (Byrne et al., 2002).
3.1.3- Los genes KNAT son parcialmente redundantes con STM.
Otros tres genes KNOX de clase I en Arabidopsis, KNAT1, KNAT2 y KNAT6, se
expresan en la zona periférica del meristemo y funcionan de forma parcialmente
redundante con STM para restringir la expresión de los genes AS1 y AS2 a los
primordios de los órganos (Fig. I-10; Byrne et al., 2002; Semiarti et al., 2001). La
pérdida de la función de KNAT1 en el mutante nulo brevipedicellus (bp) no perturba el
18
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
mantenimiento del meristemo, pero tiene como resultado plantas con entrenudos cortos
y con las flores y los frutos inclinados hacia abajo (Venglat et al., 2002), debido a que
este gen también interviene en el establecimiento de la polaridad abaxial-adaxial
(ventral-dorsal) de los órganos (Smith y Hake, 2003). Su sobreexpresión bajo el control
de un promotor constitutivo 35S provoca la formación de hojas lobuladas con
crecimiento ocasional de meristemos ectópicos (Chuck et al., 1996), es decir, aumenta
la indeterminación de las células de la hoja. No se ha observado ningún fenotipo en los
mutantes de pérdida de función de KNAT2, lo que podría deberse a una estrecha
redundancia con KNAT6, con el que guarda una identidad del 71% y del que no se han
descrito mutantes nulos (Byrne et al., 2002).
3.1.4- AS1, AS2 y los genes YABBY promueven la diferenciación regulando
negativamente a los genes KNOX.
AS1 y AS2 regulan negativamente a los genes KNOX impidiendo su expresión en
los primordios (Ori et al., 2000), promoviendo así la diferenciación de los órganos
laterales en la zona periférica del meristemo (Fig. I-10). Por otra parte, estudios
recientes sugieren que AS1 también participa en la diferenciación a lo largo del eje
proximodistal en la lámina foliar y el peciolo, mientras que AS2 parece estar implicado
en la especificación de la identidad adaxial en las hojas (Xu et al., 2003). AS1 codifica
un factor de transcripción con dominio MYB (Byrne et al., 2000), y AS2 un factor de
transcripción con un dominio de cremallera de leucina (Iwakawa et al., 2002). La
pérdida de función de cualquiera de estos dos genes provoca un desarrollo asimétrico de
las hojas y una morfología aberrante en los pétalos y sépalos, debido en parte a la
expresión ectópica de los genes KNOX. Publicaciones recientes demuestran que ambos
genes pueden interaccionar físicamente, lo que explica la similitud de los fenotipos de
los mutantes as1 y as2, aunque también parecen tener funciones independientes en lo
que respecta al desarrollo de los órganos florales (Xu et al., 2003).
Otros genes que están implicados en la represión de los genes KNOX en los
órganos laterales son los miembros de la familia YABBY (Fig. I-10; Kumaran et al.,
2002), entre los que se encuentran FILAMENTOUS FLOWER (FIL), YABBY2 (YAB2) y
YAB3 (Bowman, 2000). Estos genes codifican factores de transcripción y promueven la
abaxialización de los órganos laterales. Entre los miembros de esta familia existe una
gran redundancia funcional, pero se ha podido detectar la expresión ectópica de los
genes KNOX en las hojas de los dobles mutantes fil yab3 (Kumaran et al., 2002).
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
19
3.1.5- Función de los genes AGAMOUS (AG) y LEAFY (LFY) en la
determinación del meristemo floral.
Las flores se desarrollan a partir de meristemos laterales originados desde el SAM.
Los meristemos florales y los apicales son sistemas homólogos y su comportamiento
está regulado por grupos de genes coincidentes. Sin embargo, el meristemo floral
constituye un caso especial en el que la actividad de las células indiferenciadas debe
cesar para que se complete la morfogénesis de la flor. Produce secuencialmente los
primordios de los sépalos, los pétalos y los estambres a partir de las células de la zona
periférica, tras lo cual las células indiferenciadas que quedan en el centro del meristemo
floral se diferencian y forman los carpelos (Fletcher, 2002). Para que se produzca esta
diferenciación final del meristemo floral es necesaria la función de AG, un factor de
transcripción con dominio MADS-box implicado en la especificación de los órganos
florales (Yanofsky et al., 1990). En estadios muy tempranos del desarrollo floral, WUS
activa la transcripción de AG, el cual, junto con otros factores aún por determinar,
provoca posteriormente la represión de WUS (Fig. I-11; Lenhard et al., 2001; Lohmann
et al., 2001). Esto conlleva el fin de la actividad del centro organizador y la
diferenciación de las últimas células del meristemo. La activación de AG por WUS
requiere la presencia de un tercer elemento, el factor de transcripción LEAFY (LFY),
que especifica la identidad del meristemo floral y no se expresa en el SAM (Blázquez et
al., 1997; Weigel et al., 1992).
A
B
Fig. I-11. Modelo de la terminación del
meristemo floral. En estadios tempranos
del desarrollo floral, WUS y LFY inducen
la expresión de AG en el centro del
meristemo (A). A partir del estadio 6, AG,
junto con otros factores (X), reprime a
WUS (B). Modificado a partir de Lenhardt
et al. (2001).
3.2- Especificación de los órganos florales: el modelo ABC.
Existe un conjunto de reguladores transcripcionales que determinan la identidad de
los distintos órganos florales, actuando de modo equivalente a los genes selectores
homeóticos en los animales (Wolpert et al., 2002). Las mutaciones homeóticas que se
han encontrado en Arabidopsis tienen como resultado el desarrollo de flores anormales
20
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
en las que un tipo de órgano floral es sustituido por otro. El análisis genético de estos
mutantes permitió elaborar el denominado modelo ABC (Cohen y Meyerowitz, 1991),
que propone que la combinación de tres tipos de actividades génicas, A, B y C,
especifica cada uno de los cuatro verticilos florales (Fig. I-12). La actividad A
especifica los sépalos, A+B los pétalos, B+C los estambres y C los carpelos. El modelo
propone que las actividades A y C se excluyen mutuamente.
Fig. I-12. Modelo ABC para la determinación de
los órganos florales. Diagrama floral de
Arabidopsis representando una sección transversal
de la flor (arriba). Patrón de expresión de los
genes de las clases A, B y C con los órganos que
determinan (abajo). Modificado a partir de
Wolpert et al. (2002).
3.2.1- Genes de clase A: APETALA1 (AP1) y AP2.
En Arabidopsis, los genes AP1 y AP2 pertenecen a la clase A (Bowman et al.,
1993). AP1 codifica un factor de transcripción con dominio MADS-box; inicialmente se
expresa por todo el meristemo y en etapas posteriores se restringe su expresión al primer
y segundo verticilo (Mandel et al., 1992). AP2 codifica una proteína de unión a DNA y
regula negativamente a AG, que tiene función C, restringiendo su expresión al tercer y
cuarto verticilo (Riechmann y Meyerowitz, 1998). La pérdida de función de los genes
de clase A permite la expresión de los genes de la función C por todo el primordio,
generando flores con estructura carpelo-estambre-estambre-carpelo.
3.2.2- Genes de clase B: AP3 y PISTILLATA (PI).
AP3 y PI son genes de clase B, y codifican factores de transcripción con dominio
MADS-box (Goto y Meyerowitz, 1994; Jack et al., 1992). Los mutantes de pérdida de
función ap3 y pi presentan sépalos en el segundo verticilo y carpelos en el tercero
(Bowman et al., 1989).
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
21
3.2.3- Genes de clase C: AG.
En la clase C encontramos otro factor de transcripción MADS-box, AG (Yanofsky
et al., 1990), que además de su papel en la terminación del meristemo es necesario para
la especificación de la identidad de los verticilos 3 y 4. En los mutantes ag el meristemo
floral se transforma en indeterminado, generando una repetición continua de órganos
con alternancia de sépalos y pétalos (Fig. I-13b; Bowman et al., 1989).
3.2.4- Una nueva incorporación al modelo ABC: los genes de la clase E.
Los genes de tipo MADS-box SEPALLATA (SEP1, SEP2, SEP3 y SEP4) han sido
recientemente incorporados al modelo ABC formando la clase E, ya que su actividad es
imprescindible para que los genes de clase B y C puedan determinar la formación de los
tres verticilos interiores. Los genes SEP son muy redundantes, por lo que es necesario
eliminar la función de al menos tres de ellos para observar un fenotipo evidente, con
flores formadas únicamente por sépalos (Ditta et al., 2004; Pelaz et al., 2000).
3.3- Genes que intervienen en el desarrollo del gineceo.
Se han identificado numerosos genes implicados en el desarrollo de los carpelos.
Algunos, a tenor de los fenotipos observados en los distintos mutantes de pérdida de
función, tienen un papel muy específico en la ontogenia del gineceo, mientras que otros
están implicados en procesos generales del desarrollo de la planta que afectan también a
este órgano.
En la fase de antesis, antes de la polinización del pistilo, ya se han diferenciado casi
todas las estructuras que van a estar presentes en el fruto, lo que implica que muchos de
los genes que determinan la estructura final del gineceo deben actuar en etapas muy
tempranas del desarrollo floral. A continuación se describen algunas de las funciones
génicas más relevantes en la morfogénesis de los carpelos.
3.3.1- AG especifica la identidad de los carpelos.
La función del gen AG es necesaria y suficiente para la especificación de los
carpelos, como se deduce del fenotipo de los mutantes ag, que son los únicos que
carecen por completo de carpelos (Fig. I-13b), y de los estudios de expresión ectópica
(Mandel et al., 1992; Yanofsky et al., 1990). En etapas muy tempranas del desarrollo
floral, el RNA de AG se acumula en el grupo de células que darán lugar a los estambres
y los carpelos. Posteriormente su expresión se restringe a tipos celulares concretos
22
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
dentro de estos órganos, por lo que probablemente tiene un papel en su diferenciación
además de en la especificación de los verticilos tercero y cuarto (Drews et al., 1991).
Fig. I-13. Micrografías electrónicas de barrido del gineceo silvestre Col-0 (a, d y f) y los mutantes ag
(b), ful (c), shp1 shp2 (e), rpl (g), spt (h), crc (i), spt crc (j), sty1 sty2 (k), ett (l), clv1 (m) y er (n). En
f y g, las puntas de flecha negras señalan el margen de valva (vm), la “r” indica la posición del replum
y la “v” denota las valvas. Barras de escala: 500 µm (a, b, c, h, i, l, m, n), 100 µm (d, e, j, k) y 20 µm
(f, g). Imágenes modificadas a partir de Álvarez y Smyth (1999), Ferrándiz et al. (1999), Kuusk et al.
(2002), Liljegren et al. (2000) y Roeder et al. (2003).
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
23
3.3.2- FRUITFULL (FUL) impide la expresión en la valva de genes de la zona
de dehiscencia.
El gen FUL fue inicialmente identificado por su similitud con AG (Mandel y
Yanofsky, 1995). Codifica un factor de transcripción de tipo MADS-box cuya expresión
se restringe a todas las capas celulares de la valva (Gu et al., 1998). El RNA de FUL
también se acumula en los meristemos florales, las hojas caulinares, la vasculatura del
tallo y el pedicelo floral. De acuerdo con este patrón de expresión, la mutación ful
ocasiona hojas caulinares anormales y afecta a la estructura general de la planta,
poniendo de manifiesto las múltiples actividades de este gen durante el desarrollo
(Ferrándiz et al., 2000a). Los frutos de los mutantes ful presentan valvas de tamaño
reducido debido a que sus células no se alargan tras la fertilización (Fig. I-13c). Esto
provoca que los frutos sean de pequeño tamaño y estén repletos de semillas viables pero
también pequeñas. El septo y el replum se desarrollan normalmente, adquiriendo éste un
característico patrón en zigzag para acomodarse a la morfología de las valvas (Gu et al.,
1998). La actividad principal de FUL en el gineceo es la represión de genes específicos
de la zona de dehiscencia y el margen de valva, como SHATTERPROOF1 (SHP1) y
SHP2, que se describen más adelante (Fig. I-14; Ferrándiz et al., 2000b; Liljegren et al.,
2000). El fenotipo en el fruto de los mutantes ful parece deberse a que las células de la
valva adquieren identidad de margen de valva (Gu et al., 1998).
Fig. I-14. Modelo de la delimitación de la valva,
el replum y el margen de valva. Modificado a
partir de Roeder et al. (2003).
El solapamiento de los patrones de expresión tempranos de FUL y AG en el cuarto
verticilo, la necesidad de AG para la correcta formación de los carpelos y la expresión
de AG y FUL en las estructuras carpeloides producidas por algunos mutantes sugieren
que FUL podría estar regulado por AG en el gineceo (Ferrándiz et al., 1999).
3.3.3- Las funciones de SHP, INDEHISCENT (IND) y ALCATRAZ (ALC) son
necesarias para la dehiscencia de las valvas.
SHP1 y SHP2, también pertenecientes a la familia de los genes MADS-box,
presentan un patrón de expresión totalmente solapante que se restringe al margen de las
24
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
valvas, y son funcionalmente redundantes (Liljegren et al., 2000 y 2004). Los mutantes
simples shp1 y shp2 no presentan ningún fenotipo, mientras que los frutos del doble
mutante shp1 shp2 son indehiscentes, es decir, sus valvas no se separan cuando se
completa la maduración del fruto (Fig. I-13e). En estos frutos no se diferencia la zona
de dehiscencia y disminuye la lignificación del margen de la valva, necesaria para la
apertura del fruto (Liljegren et al., 2000).
Otros genes involucrados en la dehiscencia de las valvas son IND y ALC, que
codifican factores de transcripción de tipo básico hélice-giro-hélice (bHLH; Liljegren et
al., 2004; Rajani y Sundaresan, 2001). Las mutaciones de pérdida de función en estos
genes provocan un fenotipo indehiscente similar al del doble mutante shp1 shp2. IND se
expresa en el margen de la valva y en la capa enb de la valva, participando en la
lignificación de ambas regiones. La lignificación de la capa enb es importante en el
mecanismo de muelle que permite la dehiscencia. ALC se expresa sólo en el margen de
la valva y promueve la diferenciación de una capa muy frágil de células no lignificadas
situadas entre capas de células que sí lo están. La expresión de IND y ALC se extiende
por toda la valva en los mutantes ful del mismo modo que SHP1 y SHP2, y es la
expresión ectópica de todos estos genes la que provoca el fenotipo Ful en el fruto
(Liljegren et al., 2004).
3.3.4- REPLUMLESS (RPL) impide la expresión en el replum de genes de la
zona de dehiscencia.
RPL (Roeder et al., 2003), al que también se ha llamado PENNYWISE (PNY; Smith
y Hake, 2003), BELLRINGER (BLR; Byrne et al., 2003) o VAAMANA (VAN; Bhatt et
al., 2004), pertenece a la clase BELL (BEL1-like) de factores de transcripción con
homeodominio. Su expresión en el fruto se restringe al replum y al estilo, pero también
se expresa con niveles elevados en el tallo, el meristemo de inflorescencia y las yemas
florales. En los mutantes de pérdida de función se reduce drásticamente el tamaño del
replum (Fig. I-13g), donde RPL realiza una función similar a la de FUL en la valva,
impidiendo la expresión de los genes de la zona de dehiscencia (Fig. I-14; Roeder et al.,
2003). Estos mutantes presentan también importantes errores de filotaxia y un porte
alterado, en concordancia con el patrón de expresión descrito para este gen. Además se
ha demostrado que RPL es capaz de interaccionar físicamente con KNAT1 en el
meristemo, formando un complejo que intervendría en el desarrollo de los entrenudos
del tallo (Byrne et al., 2003; Smith y Hake, 2003).
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
25
3.3.5- SPATULA (SPT) participa en la diferenciación de la región apical del
gineceo y promueve la identidad carpelar.
SPT codifica un factor de transcripción de tipo bHLH (Heisler et al., 2001) con un
patrón de expresión muy amplio que se extiende a casi todos los órganos de la planta.
Sin embargo, los mutantes spt sólo presentan alteraciones en el gineceo, donde
disminuye la cantidad de tejido estigmático y desaparece el tracto transmisor, ya que
SPT promueve la producción de tejidos derivados del margen de la valva, incluyendo el
septo, el estilo y el estigma (Fig. I-13h; Álvarez y Smyth, 2002). La expresión ectópica
de SPT genera la adquisición de rasgos carpeloides en otras estructuras de la flor
independientemente de la función de AG, de modo que resulta verosímil que SPT actúe
paralelamente a AG en la generación de identidad carpelar (Álvarez y Smyth, 1999). En
esta ruta estaría implicada la señalización por auxinas, ya que los inhibidores de la
respuesta a estas hormonas rescatan el fenotipo silvestre en los frutos spt (Nemhauser et
al., 2000).
3.3.6- CRABS CLAW (CRC) interacciona con SPT y confiere identidad
carpelar.
CRC es un factor de transcripción de la familia YABBY, y al igual que otros
miembros de esta familia está implicado en el establecimiento de la polaridad abaxialadaxial en los órganos laterales (Bowman y Smyth, 1999; Siegfried et al., 1999). Se
expresa en la epidermis abaxial de los carpelos y en dominios internos del gineceo, con
un patrón dinámico y complejo, e interviene en la especificación de los carpelos y los
nectarios, que son órganos productores de néctar situados en la base del gineceo
(Bowman y Smyth, 1999). Además limita la expansión radial del gineceo y promueve
su crecimiento longitudinal, contribuyendo a su forma estrecha y alargada. Los frutos de
los mutantes crc son más cortos y más anchos que los del silvestre (Fig. I-13i), y su
fertilidad es reducida. Presentan una disminución de la región del estilo y problemas de
fusión apical, junto con una diferenciación anormal de las células de la valva, y carecen
por completo de nectarios. La mutación crc también afecta a la determinación del
gineceo, como se desprende de la aparición ocasional de valvas extra en los frutos crc
(Álvarez y Smyth, 1999; Bowman y Smyth, 1999).
Los frutos del doble mutante crc spt muestran defectos mucho más severos que la
combinación de los fenotipos de los respectivos mutantes simples (Fig. I-13j; Álvarez y
Smyth, 2002). Los carpelos exhiben una forma más similar a la de las hojas y solamente
26
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
se fusionan en la base, coincidiendo con la única producción significativa de septo y
replum. La determinación de la flor también se ve perturbada, pudiendo desarrollarse
estambres desde dentro del gineceo. Sin embargo, los patrones de expresión de CRC y
SPT no se solapan en ningún momento del desarrollo, por lo que este fenotipo no
aditivo en el doble mutante parece deberse a una interacción indirecta entre ambas
funciones génicas (Álvarez y Smyth, 2002).
3.3.7- Los genes STYLISH1 (STY1), STY2 y TOUSLED (TSL) están implicados
en la formación de los tejidos apicales del gineceo.
STY1 y STY2, dos genes estrechamente relacionados, actuan junto con SPT y CRC
en la formación de los tejidos de la región apical del gineceo (Kuusk et al., 2002).
Codifican proteínas con un motivo RING-finger-like (Really Interesting New Genes) y
se expresan en las regiones apicales del gineceo. Los frutos en sty1 muestran el estilo
ensanchado, con un crecimiento descoordinado de sus células que provoca la
desorganización de las papilas estigmáticas. El replum también aparece ensanchado en
su porción más apical. Pese a que las mutaciones sty2 no provocan defectos visibles en
el gineceo, sí que incrementan el fenotipo de sty1 (Fig. I-13k), lo que indica que ambos
genes tienen funciones parcialmente redundantes (Kuusk et al., 2002).
TSL, por otra parte, codifica una quinasa que participa probablemente en una vía
reguladora general durante el desarrollo de toda la planta, dado su amplio rango de
expresión y el fenotipo pleiotrópico de los mutantes de pérdida de función (Roe et al.,
1993; Roe et al., 1997). En lo que respecta al gineceo, los mutantes tsl presentan los
carpelos parcialmente fusionados y prácticamente carecen de estilo y estigma.
3.3.8- ETTIN (ETT) está relacionado con la respuesta a auxinas y la
regionalización del gineceo.
ETT codifica un factor de transcripción de respuesta a auxinas, ARF3 (Auxin
Response Factor3), implicado en la especificación del tamaño relativo de cada región
del gineceo a lo largo del eje basal-apical en respuesta a las señales de auxinas (Sessions
et al., 1997). Las mutaciones ett afectan a toda la flor, pero de forma más acusada al
gineceo, donde provocan la reducción del tamaño del ovario y el desarrollo de tejidos
del estilo y del estigma en posiciones anormales, debido a la expresión ectópica de SPT
(Fig. I-13l; Heisler et al., 2001; Sessions y Zambrisky, 1995).
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
27
Se ha propuesto que las auxinas actúan en el gineceo como un morfógeno,
controlando la distribución de tejidos en el eje apical-basal de forma dependiente de su
concentración (Fig. I-15; Dinneny y Yanofsky, 2004; Nemhauser et al., 2000). Los
niveles de auxinas parecen ser más elevados en las regiones apicales del gineceo, donde
promoverían la formación del estilo y el estigma (Benkova et al., 2003).
Concentraciones moderadas de auxinas darían lugar al desarrollo del ovario, mientras
que las concentraciones más bajas, en la región basal del gineceo, generarían el
desarrollo del ginóforo. En esta señalización estarían implicados ETT y SPT (Dinneny y
Yanofsky, 2004; Nemhauser et al., 2000).
Fig. I-15. Modelo que ilustra el gradiente
propuesto de auxinas y su papel en la
distribución de las estructuras del gineceo.
Modificado a partir de Dinneny y Yanofsky
(2004).
3.3.9- Las mutaciones en los genes CLV provocan la aparición de carpelos
supernumerarios.
Los mutantes clv, como se ha mencionado anteriormente (apartado 3.1.1), presentan
una acumulación de células indiferenciadas en el meristemo, que por tanto tiene un
mayor tamaño. Una consecuencia de esta alteración en el meristemo es la formación de
valvas extra en los frutos de los mutantes clv (Fig. I-13m; Clark et al., 1993 y 1995;
Kayes et al., 1998).
3.3.10- erecta (er) afecta al tamaño del fruto y la morfología del estilo.
El gen ER codifica un receptor de membrana con actividad quinasa que presenta
cierta semejanza con CLV1 (Torii et al., 1996). Las mutaciones er, como la que porta
en homocigosis la estirpe de referencia Landsberg erecta (Ler), provocan un fenotipo
pleiotrópico que incluye el desarrollo de tallos más recios, inflorescencias compactas y
silicuas de longitud inferior a la de plantas silvestres, debido a la disminución de la tasa
28
I- INTRODUCCIÓN GENERAL
de división celular (Fig. I-13n; Tsukaya et al., 1993 y 1995). En los frutos er, además, la
región que ocupa el estilo es menor. Se ha propuesto que las funciones de ER y KNAT1
podrían estar relacionadas, especialmente en lo referente a la arquitectura de la
inflorescencia y la vasculatura del tallo, ya que el fenotipo de bp, un mutante nulo de
KNAT1, se ve incrementado en presencia de la mutación er (Douglas et al., 2002).
3.4- Nuevas funciones génicas implicadas en el desarrollo del pistilo.
A pesar del gran progreso que ha tenido lugar en los últimos años, aún perduran
numerosos interrogantes acerca de la morfogénesis del gineceo y la fructificación. Una
manera obvia de contribuir al esclarecimiento de estas cuestiones es desvelar la
participación de nuevos moduladores genéticos, cuyas alteraciones provoquen
perturbaciones morfológicas visibles. Con esta intención se emprendió el estudio de las
estirpes mutantes, derivadas de distintos esfuerzos de mutagénesis, que se detalla en los
siguientes capítulos de esta Tesis.
II
Materiales y métodos
II- MATERIALES Y MÉTODOS
31
1 – CULTIVO Y MANIPULACIÓN DE PLANTAS.
1.1- Nomenclatura utilizada en la denominación de genes, mutaciones y
fenotipos de Arabidopsis.
Se han seguido las directrices propuestas por Meinke y Koornneef (1997) para la
denominación de genes, mutantes y fenotipos de Arabidopsis. Esta normativa se recoge
y actualiza en la página web http://mutant.Lse.okstate.edu/genepage/namerule.html.
Los genes se denominan con su nombre completo en mayúsculas y con letra
cursiva, o con una abreviatura de tres letras en mayúsculas y cursiva. Los alelos de un
gen se indican mediante el nombre completo del gen o la abreviatura de tres letras de
éste, siempre en cursiva, con mayúsculas en el caso del alelo silvestre y minúsculas si se
trata de un alelo mutante. Los distintos alelos mutantes de un gen se denotan utilizando
números separados por un guión, correspondientes habitualmente al orden de
aislamiento. La proteína codificada por el gen se indica mediante la misma abreviatura,
con letras mayúsculas y tipografía normal. Para referirnos a un fenotipo mutante, se
escribe la abreviatura del gen en tipografía normal y con la letra inicial en mayúscula.
La anotación de los genes en el genoma de Arabidopsis se ajusta a la
nomenclatura determinada por el AGI (Arabidopsis Genome Initiative). Por ejemplo,
At5g16210 hace referencia al gen numerado como 16.210 en el cromosoma 5 de
Arabidopsis thaliana. Versiones actualizadas de las anotaciones se pueden encontrar en
http://www.arabidopsis.org/info/guidelines.jsp#alia.
1.2- Líneas de Arabidopsis.
Los ecotipos silvestres utilizados fundamentalmente durante este trabajo fueron
Columbia-0 (Col-0) y Landsberg erecta (Ler).
Los mutantes zpl y pau fueron generados en nuestro laboratorio mediante
mutagénesis con metanosulfonato de etilo (EMS) sobre semillas de la estirpe mutante
cer6-2. El alelo as1-104 fue obtenido en el laboratorio de Martin F. Yanofsky
(Universidad de California, San Diego) mediante mutagénesis con EMS sobre semillas
ful-1 (Gu et al., 1998). Las líneas silvestres y el resto de mutantes de Arabidopsis
utilizadas en esta Tesis fueron proporcionadas por el NASC (Nottingham Arabidopsis
Stock Center, http://arabidopsis.info/) o el ABRC (Arabidopsis Biological Resource
Center, http://www.biosci.ohio-state.edu/~plantbio/), excepto pny-40126, el doble
mutante bp-9 pny-40126, la línea portadora de la construcción KNAT1::GUS-18 y la
32
II- MATERIALES Y MÉTODOS
línea as1-1 KNAT1::GUS-18, que fueron proporcionados por Sarah Hake (Universidad
de California, Berkeley). La Tabla II-1 recoge un listado con todas las líneas utilizadas y
sus principales características.
Tabla II-1. Líneas de Arabidopsis utilizadas en la presente Tesis.
Línea
Col-0
Ler
La-0
as1-1
as2-1
blr-1
bp-1
cer6-2
crc-1
ful-1
ful-2
knat2
pny-40126
rpl-1
shp1-1
shp2-1
35S::KNAT1
BLR::GUS
KNAT1::GUS-1
KNAT1::GUS-18
SHP2::GUS
CRC::GUS
Código
N1092
NW20
N3177
N3374
N3117
GT7797
NW30
N6242
N3814
N3759
GT7953
N540126
N3841
N3845
N3821
N6141
-
Ecotipo
Mutágeno
Líneas silvestres
Líneas mutantes
Col-1
Rayos X
An
Rayos X
Ler
Transposón Ds
Ler
EMS
Ler
Nitrosourea de etilo
Ler
EMS
Ler
Transposón Ds
Col-0
EMS
C-24
Transposón Ds
Col-0
T-DNA
Ler
EMS
Ler
T-DNA
Ler
T-DNA
Líneas transgénicas
No-0
T-DNA
Ler
T-DNA
Col-0
T-DNA
Col-0
T-DNA
No-0
T-DNA
Ler
T-DNA
Referencia
Redei, 1962
Redei, 1962
Redei, 1962
Redei y Hirono, 1964
Fabri y Schäffner, 1994
Byrne et al., 2003
Koornneef et al., 1983
Preuss et al., 1993
Álvarez y Smyth, 1999
Gu et al., 1998
Ferrándiz et al., 2000a
Byrne et al., 2002
Smith y Hake, 2003
Roeder et al., 2003
Liljegren et al., 2000
Kempin et al., 1997
Lincoln et al., 1994
Byrne et al., 2003
Ori et al., 2000
Ori et al., 2000
Savidge et al., 1995
Baum et al., 2001
1.3- Cultivo de plantas.
Las semillas se esterilizaron en una solución de lejía comercial al 40% y TritonX100 al 0,1% durante 8 minutos y se lavaron tres veces con agua bidestilada estéril
(Weigel y Glazebrook, 2002). Posteriormente se sembraron en placas de Petri de
150 mm con agar y medio GM (Germination Medium: sacarosa 1% y medio MS 0,5X;
Murashige y Skoog, 1962), a las que se añadió kanamicina (20-50 µg/ml) cuando se
requirió la selección de líneas resistentes a este antibiótico, y se almacenaron durante
una noche a 4ºC para favorecer una germinación homogénea. Tras esta estratificación se
incubaron en una cámara de crecimiento Sanyo MLR-350-H a 20ºC con iluminación
continua (7.000 lux) durante dos o tres semanas. Las rosetas, salvo en casos
excepcionales, se trasplantaron entonces a cestillos con sustrato, consistente en una
II- MATERIALES Y MÉTODOS
33
mezcla de perlita, vermiculita y turba (2:2:1) previamente autoclavada. Los cestillos se
colocaron en bandejas de plástico con alveolos, que a su vez se introdujeron en cubetas
de plástico conteniendo en todo momento agua o solución de riego ATM (Arabidopsis
thaliana Medium: KNO3 5 mM; KH2PO4 2,5 mM; MgSO4 2 mM; Ca(NO3)2 2 mM;
FeNaEDTA 51 µM; H3BO3 70 µM; MnCl2 14 µM; CuSO4 0,5 µM; ZnSO4 1 µM;
NaMoO4 0,2 µM; NaCl 10 µM; CoCl2 0,01 µM; Kranz y Kirchheim, 1987). Se realizó un
primer riego con solución ATM y posteriormente se regó con agua dos veces por
semana. Para independizar las plantas durante su crecimiento, se colocaron soportes y
cilindros de plástico del sistema aracón (Arabidopsis condom, Beta Tech; Fig. II-1). Las
plantas crecieron en una cámara de cultivo a 20ºC bajo luz continua (7.000 lux) hasta
completar su ciclo vital.
Las plantas mutantes ecceriferum6 (cer6-2) son androestériles en las condiciones
normales de cultivo de Arabidopsis, debido a la carencia de ciertos lípidos en el polen que
impiden la correcta interacción entre éste y el pistilo (Fiebig et al., 2000; Preuss et al.,
1993). Sin embargo, la polinización se restaura aumentando localmente la humedad
relativa del aire hasta el 95%, lo que se consiguió cubriendo las plantas con aracones o
con una urna de metacrilato perforada (ver apartado 1.6 y Fig. II-1).
Fig. II-1. Dos métodos de cultivo de Arabidopsis: plantas individualizadas con aracones (izquierda) y
plantas cer6-2 cubiertas con una urna de metacrilato para incrementar la humedad relativa (derecha).
1.4- Realización de cruzamientos.
Para la realización de cruzamientos entre diferentes líneas de Arabidopsis, se
emascularon las flores receptoras con unas pinzas finas retirando todos los órganos
34
II- MATERIALES Y MÉTODOS
florales excepto el pistilo, sobre el cual se depositó polen procedente de las plantas
donantes. Todas las semillas se conservaron en tubos Eppendorf a 4ºC.
1.5- Mutagénesis de semillas con EMS (metanosulfonato de etilo).
El EMS es un agente alquilante que provoca mutaciones puntuales, principalmente
transiciones de GC a AT (Redei y Koncz, 1992). La frecuencia de mutación del EMS es
variable, registrándose tasas que oscilan entre 1/300 y 1/30.000 mutaciones por locus, lo
que, unido a otros factores, ha permitido estimar que para generar una mutación en un
locus concreto con una probabilidad del 99% son necesarias entre 700 y 70.000 plantas
mutagenizadas (M1). En la práctica, la mayoría de los escrutinios basados en una
mutagénesis con este producto parten de 2.000 a 3.000 plantas M1 tras tratar las semillas
de las que proceden durante 12 horas con 15-20 mM de EMS (Redei y Koncz, 1992;
Page y Grossniklaus, 2002).
Se llevó a cabo una mutagénesis con EMS sobre semillas del mutante cer6-2
(Fiebig et al., 2000; Preuss et al., 1993) siguiendo el protocolo de Weigel y Glazebrook
(2002) con algunas modificaciones. Se incubaron 50.000 semillas con agitación suave
en una solución de EMS al 0,2% durante 15 horas. Transcurrido este tiempo, las
semillas mutagenizadas (M1) se lavaron 8 veces con agua destilada para eliminar el
mutágeno.
1.6- Amplificación y escrutinio de las líneas mutagenizadas con EMS.
Las semillas cer6-2 M1, que son presumiblemente portadoras de nuevas mutaciones
recesivas en heterocigosis, se cultivaron en placa, como se ha descrito, durante dos o
tres semanas. Posteriormente, se transplantaron las rosetas en grupos de 20 a macetas
cuadradas de 12 x 12 x 5 cm que se colocaron en cubetas de plástico conteniendo en
todo momento agua o ATM. Para permitir la autopolinización de las plantas M1, se
incrementó localmente la humedad cubriendo las cubetas con una urna de metacrilato
con perforaciones laterales para permitir cierta ventilación (Fig. II-1). Al final de su
ciclo vital, se recogieron las semillas M2 formando grupos parentales compuestos por la
descendencia de las 20 plantas M1 de cada maceta. En estas semillas, las mutaciones
pueden encontrarse en homocigosis y manifestarse en el fenotipo (Fig. II-2). Se
analizaron aproximadamente 200 individuos de cada uno de los grupos parentales,
sembrándolos en placas y posteriormente trasplantando las rosetas a una cubeta
totalmente rellena con sustrato (ver apartado 1.3). Estas plantas se cultivaron en
II- MATERIALES Y MÉTODOS
35
condiciones restrictivas para impedir la fertilización, de forma que cualquier planta que
desarrollara frutos en estas condiciones fuera presumiblemente un mutante
partenocárpico; sus frutos no contendrían semillas al no haber tenido lugar la
fertilización.
Fig. II-2. Esquema de la estrategia de mutagénesis y escrutinio. HR: humedad relativa.
Se seleccionaron para su estudio aquellas plantas M2 cultivadas en condiciones
restrictivas cuyo ovario presentara un crecimiento superior al de las plantas cer6-2
sometidas a las mismas condiciones, o bien una morfología claramente distinta del
fondo parental. Estas plantas de interés se trasladaron a condiciones permisivas
cubriéndolas con un aracón para aumentar localmente la humedad ambiental y permitir
su autofertilización y la obtención de su descendencia.
2- CULTIVO Y MANIPULACIÓN DE BACTERIAS.
2.1- Cultivo de bacterias.
Se utilizó la estirpe DH5α de Escherichia coli (Hanahan et al., 1983), que permite
la selección blancas/azules (Φ80dlacZ∆M15) y es incapaz de recombinar (recA-).
Los cultivos líquidos se llevaron a cabo en medio LB [Luria-Bertani: NaCl 1%
(m/v); extracto de levadura 0,5% (m/v, Scharlau); bacto-triptona 1% (m/v, Scharlau);
pH 7,5], enriquecido con ampicilina (100 µg/ml) cuando fue necesario seleccionar
colonias resistentes al antibiótico. Se incubaron durante una noche a 37ºC en agitación
continua (225 rpm) en un incubador con agitación orbital Sanyo MIR222-RL.
36
II- MATERIALES Y MÉTODOS
Para la elaboración de medios de cultivo sólido se agregó al medio líquido agar
bacteriológico europeo (Scharlau) a una concentración final del 1,5% (m/v). Los
cultivos en medio sólido se incubaron durante una noche en una estufa a 37ºC.
Para la conservación de estirpes bacterianas, a 1 ml de cultivo en medio líquido se
le añadieron 500 µl de glicerol al 80% (v/v) y se almacenó a –80ºC.
2.2- Transformación.
Se prepararon células competentes de la estirpe DH5α de E. coli y se llevaron a
cabo transformaciones mediante choque térmico, como se describe en Sambrook y
Russell (2001). Las cantidades de DNA empleadas para transformar oscilaron entre 1 y
10 ng.
3- TÉCNICAS DE HISTOLOGÍA VEGETAL.
3.1- Inclusión de muestras en resina JB4.
Para la inclusión en resina JB4 (Electron Microscopy Sciences), las muestras se
fijaron en FAE (Etanol 45%; ácido acético glacial 5%; formalina 5%; Triton-X100 1%)
al vacío (400 mm Hg) durante 1 o 2 horas. A continuación se deshidrataron en series de
etanol en concentraciones crecientes (70%, 80%, 90%, 95%) de 2 horas cada una, para
después incubar durante más de 8 horas en una solución 1:1 de etanol 95% y resina
activa (1,25 g de catalizador C, compuesto por peróxido de benzoilo, en 100 ml de
resina A). Transcurrido este tiempo, las muestras se transfirieron a resina activa durante
8 horas. Finalmente, se dispusieron en moldes a los que se añadió resina activa con
polimerizador B (1/25 v/v), se colocó un soporte de aluminio y se dejó polimerizar a
temperatura ambiente durante varias horas.
3.2- Inclusión de muestras en parafina.
Se procedió a fijar y deshidratar las muestras como en el apartado 3.1, pero
llevándolas hasta etanol 100% y tiñendo finalmente el tejido en Eosina-Y al 0,2% en
etanol. El aclarado o diafanización del tejido se llevó a cabo con series de 2 horas en
concentraciones crecientes de Histoclear (25%, 50%, 75% y dos al 100%; National
Diagnostics), compuesto básicamente de limoneno, en etanol. Se añadió entonces un
volumen igual de parafina Paraplast-Plus (Sherwood Medical) fundida a 58ºC y se
incubó durante más de 8 horas a esa temperatura. A continuación se sustituyó la mezcla
II- MATERIALES Y MÉTODOS
37
por parafina 100%, realizando cambios con parafina nueva cada 3 horas hasta la total
eliminación del Histoclear. Por último las muestras se dispusieron en la orientación
deseada en moldes de aluminio (Selecta) con parafina líquida, montando encima un
soporte de plástico, y se dejó solidificar a temperatura ambiente.
3.3- Obtención de cortes histológicos.
Se utilizó un microtomo Microm HM350-S para la obtención de cortes
histológicos. En el caso de muestras incluidas en resina, se realizaron cortes de 4 µm de
grosor usando cuchillas Histoknife H (Heraeus Kulzer) y se tiñeron con Azul de
Toluidina al 0,1%.
Para las muestras incluidas en parafina, los cortes se realizaron a 8 µM con
cuchillas Accu-Edge (Bakura) y se extendieron en un baño con agua destilada a 42ºC
antes de colocarlos en el portaobjetos. Las secciones se desparafinaron con Histoclear
(National Diagnostics) y se visualizaron al microscopio óptico (apartado 5.1).
3.4- Tinción GUS.
Se siguió el protocolo descrito en Weigel y Glazebrook (2002). Los frutos e
inflorescencias de plantas portadoras de construcciones con el gen testigo de la βglucuronidasa se incubaron en acetona durante 15 minutos en hielo. A continuación se
enjuagaron con solución de revelado (tampón fosfato sódico 25 mM pH 7; ferricianuro
potásico 1,25 mM; ferrocianuro potásico 1,25 mM; Tritón-X100 0,25 mM) y por último
se incubaron en solución de revelado con sustrato (X-Gluc 2 mM) durante una noche a
37ºC y en oscuridad. Las muestras se observaron y fotografiaron mediante una lupa
binocular equipada con una cámara digital (ver apartado 4), previa diafanización del
tejido con hidrato de cloral al 30%, o se procedió a su inclusión en parafina para la
obtención de cortes histológicos (ver apartados 3.2, 3.3 y 5.1).
3.5- Tinción con floroglucinol.
El floroglucinol tiñe las ligninas de color rojo. Tras realizar cortes en parafina de
órganos vegetales (ver apartados 3.2 y 3.3), los portas se sumergieron durante 30
minutos en floroglucinol (Sigma) al 2% en etanol 95%. A continuación se aclararon en
HCl al 50% y se examinaron al microscopio óptico (ver apartado 5.1).
38
II- MATERIALES Y MÉTODOS
4- OBSERVACIÓN Y FOTOGRAFÍA A BAJO AUMENTO.
Para obtener imágenes a bajo aumento de los distintos rasgos fenotípicos se utilizó
una cámara digital CoolPix 5400 (Nikon).
Para la obtención de imágenes a mayor aumento, nos servimos de lupas binoculares
Nikon SMZ 800 y Nikon SMZ 1500, provistas de una unidad de iluminación externa de
luz blanca fría (Volpi Intralux 5000-1) y conectadas a una cámara digital DXM1200F
(Nikon). La cuantificación de algunos parámetros en estas imágenes se llevó a cabo
utilizando el software de análisis de imagen AnalySIS 3.2 (Soft Imaging System).
5- TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA.
5.1- Microscopía óptica.
Los cortes histológicos fueron observados y fotografiados mediante un microscopio
Nikon Eclipse E-800 con iluminación de campo claro acoplado a una cámara
fotográfica digital Colorview-III (Nikon) y un ordenador con el software de análisis de
imagen AnalySIS 3.2 (Soft Imaging System), que facilitó la toma de medidas y
recuentos del número de células sobre las imágenes obtenidas.
5.2- Microscopía electrónica de barrido.
Se deshidrataron los órganos vegetales en metanol 100% durante 10 minutos para
luego almacenarlos en etanol 100%. Posteriormente se procedió al secado de las
muestras mediante punto crítico, consistente en la sustitución total del etanol por CO2
utilizando un aparato EM5850 (Electron Microscopy Sciences). Las muestras se
pegaron a un soporte metálico con cinta de carbono adhesiva por ambas caras (Electron
Microscopy Sciences). Se recubrieron con oro mediante un Sputter Coater SCD004
(Balzers) y fueron examinadas y fotografiadas bajo un microscopio electrónico de
barrido JEOL JSM-840 usando un voltaje de aceleración de 20 kV.
6- OBTENCIÓN Y MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
6.1- Obtención de DNA genómico de Arabidopsis.
El material se homogeneizó con un mortero en tubos Eppendorf. A continuación se
incubó en tampón de lisis (NaCl 350 mM; Tris 1 mM pH 7,6; EDTA 50 mM pH 8; urea
II- MATERIALES Y MÉTODOS
39
7 M; Sarcosyl 2%) durante 10 minutos a 37ºC en agitación. Se añadió 1/2 volumen de
fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (24:25:1) y se incubó 10 minutos a 37ºC en
agitación. Tras centrifugar la muestra, se recuperó la fase acuosa y se precipitó el DNA
en isopropanol y acetato sódico (concentración final 130 mM) durante más de 30
minutos a -20ºC. Finalmente se centrifugó la muestra, se lavó el precipitado con etanol
70% y se resuspendió en agua destilada estéril.
6.2- Obtención de RNA total de Arabidopsis.
Se utilizó el sistema RNeasy Plant Minikit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Este kit se basa en la unión selectiva del RNA a membranas acopladas a
columnas de centrifugación. Tras la elución final se trató el RNA obtenido con 10 U de
DNAsa, junto con 20 U de inhibidor de RNAsa, durante 30 minutos a 37ºC. Se
realizaron dos extracciones con cloroformo y se precipitó con etanol y acetato sódico
3 M. Tras resuspender, se cuantificó la concentración de una dilución 1/50 en un
espectrofotómetro Biophotometer (Eppendorf).
6.3- Obtención de DNA plasmídico.
Para la obtención de preparaciones a pequeña escala (minipreps) de DNA
plasmídico de pequeño tamaño, se partió de cultivos bacterianos de 3 ml de medio
líquido LB. Empleamos el sistema Concert Rapid Plasmid Miniprep System (Roche),
basado en el método clásico de la lisis alcalina, siguiendo las instrucciones del
fabricante. Se verificó el rendimiento de la extracción mediante electroforesis en un gel
de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (apartado 6.7).
En los aislamientos de DNA plasmídico a mayor escala y en la obtención de BAC
de estirpes de E. coli, se empleó el método de lisis alcalina, realizando la precipitación
con polietilenglicol y NaCl de acuerdo con Sambrook y Russell (2001). Finalmente, se
resuspendió el precipitado en 100 µl de TE pH 7,6 o en agua.
6.4- PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).
Para la amplificación de secuencias específicas de DNA se realizaron reacciones de
PCR en las siguientes condiciones: 0,2 µM de cada cebador; 0,2 mM de una mezcla
equimolar de cada desoxirribonucleótido; MgCl2 2 mM; 1 U Taq DNA polimerasa
(Ecogen); Tampón de PCR 1X (Ecogen) y DNA molde en concentración variable. La
40
II- MATERIALES Y MÉTODOS
reacción se llevó a cabo en un termociclador Mastercycler (Eppendorf), con un paso
inicial de 2 minutos a 93ºC seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 93ºC, 30 segundos a
la temperatura óptima de hibridación de los cebadores (52-58ºC) y entre 20 y 90
segundos a 71ºC. Como paso final se programó una elongación de 7 minutos a 71ºC.
Los oligonucleótidos empleados como cebadores fueron sintetizados por la empresa
TIB-MOLBIOL (http://www.TIB-MOLBIOL.com) con grado de purificación máximo
(HPR3) y en la escala 0,01 µM, o 0,02 µM si estaban modificados en uno de sus
extremos o eran mayores de 30 pares de bases (pb). En el Anexo II-1 se recogen todos
los cebadores empleados en esta Tesis.
6.5- Digestión enzimática de DNA.
Se utilizaron 2 U de endonucleasa de restricción por cada µg de DNA a digerir,
junto con el tampón proporcionado por el fabricante diluido a una concentración 1X.
Las digestiones se realizaron durante toda la noche a la temperatura óptima de las
enzimas. Finalizada la reacción, las enzimas se inactivaron mediante un tratamiento a
70ºC durante 15 minutos y se verificó el resultado de la digestión mediante
electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida (apartados 6.7 y 6.8).
6.6- Reacciones de ligación de DNA.
Para la clonación de un inserto en un plásmido, se llevaron a cabo reacciones de
ligación en un volumen de 10 a 15 µl, usando de 1 a 2,5 U de enzima ligasa del
bacteriófago T4 (Fermentas) y el tampón proporcionado por el fabricante a una
concentración 1X. Se utilizó una relación molar vector:inserto de entre 1:3 a 1:6. Los
tubos de reacción se incubaron 3 horas a temperatura ambiente o toda la noche a 16ºC.
6.7- Electroforesis en geles de agarosa.
Los geles se prepararon con agarosa de punto medio de electroendósmosis
(Ecogen) al 1% o al 2% en TAE 1X (stock preparado 50X: Tris-HCl 2 M; ácido acético
5,71%; EDTA 50 mM; pH 8,0) y con bromuro de etidio 0,5 µg/ml. Para cargar las
muestras, se les añadió 1,5 µl de tampón de carga (glicerol 30%; azul de bromofenol
0,25% m/v; xilenecianol 0,25% m/v) por cada 10 µl.
Las electroforesis se realizaron a un voltaje constante de 100 V, y los productos de
DNA se visualizaron mediante irradiación con luz UV en un transiluminador GeneDoc
con cámara digital (Vilmer Lourmat).
II- MATERIALES Y MÉTODOS
41
6.8- Electroforesis en geles de acrilamida.
La resolución de fragmentos de DNA de pequeño tamaño o muy similares entre sí
se llevó a cabo en geles de acrilamida:bisacrilamida (29:1) entre el 6% y el 12% con
tampón TAE 1X. Las muestras se prepararon como en el apartado 6.7. La electroforesis
se realizó a un voltaje constante de 200 V, y una vez finalizada se procedió a teñir el gel
sumergiéndolo en una solución de bromuro de etidio (2 µg/ml) durante 10 minutos. Los
productos de DNA fueron visualizados como en el apartado 6.7.
6.9- Secuenciación de DNA.
Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo en el Servicio de Secuenciación
de DNA del Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (Universidad
Politéncina de Valencia - CSIC), donde se utilizó un termociclador Mastercycler
(Eppendorf) siguiendo las instrucciones propuestas en el kit BigDye Terminator Cycle
Sequencing v2.0 Ready Reaction (ABI PRISM), utilizando como molde 300-500 ng de
productos de PCR de menos de 700 pb y 1 µM de cebador. Las electroforesis de los
productos se realizaron en un secuenciador automático ABI PRISM 377.
6.10- Análisis informático de las secuencias de ácidos nucleicos.
El análisis de las secuencias de ácidos nucleicos se realizó a través de Internet,
utilizando los programas BLAST (Altschul et al., 1997) del EBI (European
Bioinformatic Institute; http://www.ebi.ac.uk/blast2/index.html), del TAIR (The
Arabidopis Information Resource; http://www.arabidopsis.org/wublast/index2.jsp) y
del
NCBI
(National
Center
for
Biotechnology
Information;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Para los alineamientos de secuencias se utilizó
el programa CLUSTAL-W (Thompson et al., 1994) a través del EBI.
7- CARTOGRAFÍA DE MUTACIONES MEDIANTE ANÁLISIS DE
LIGAMIENTO A MARCADORES MOLECULARES POLIMÓRFICOS.
7.1- Cartografía manual.
Se extrajo DNA genómico (ver apartado 6.1) de individuos con fenotipo mutante
procedentes de la generación F2 de un cruzamiento entre el mutante, en fondo Ler, y la
estirpe silvestre Col-0. Estos ecotipos presentan múltiples polimorfismos moleculares,
muchos de los cuales se recogen en la base de datos de Cereon Genomics (Monsanto
42
II- MATERIALES Y MÉTODOS
Company, http://www.arabidopsis.org/Cereon). A continuación, los individuos de la
población cartográfica fueron genotipados para determinados polimorfismos, que se
eligieron procurando que fueran fácilmente distinguibles mediante PCR y electroforesis
en gel de agarosa o poliacrilamida, como los de tipo SSLP (Single Sequence Lenght
Polymorphism). Cuando esto no fue posible, debido a la pequeña diferencia entre los
productos generados, se secuenciaron dichos productos o bien se utilizaron cebadores
marcados con fluorescencia (TIB-MOLBIOL) y se visualizaron los fragmentos
cargando las muestras en un secuenciador automático ABI PRISM 377.
7.2- Cartografía semiautomatizada.
Se recogió material de plantas con fenotipo mutante de la generación F2 de un
cruzamiento entre una planta portadora de la mutación en homocigosis, en fondo Ler, y
el silvestre Col-0. Este material fue procesado en el servicio de cartografía
semiautomatizada de la Unidad de Genética del Instituto de Bioingeniería en la
Universidad Miguel Hernández siguiendo el protocolo descrito en Ponce et al. (1999),
basado en la utilización de un secuenciador automático para el análisis simultáneo de un
elevado número de marcadores moleculares polimórficos entre los ecotipos Ler y Col-0
depositados en la base de datos de Cereon Genomics (Monsanto Company) o del TAIR
(The Arabidopsis Information Resource). La frecuencia de recombinación y su error
estándar se calcularon como se describe en Koornneef y Stam (1992). Se utilizó el
programa informático Mapmaker (Lander et al., 1987) para establecer la posición
relativa de la mutación cartografiada respecto a sus marcadores vecinos, aplicando la
función de Kosambi para el cálculo de las distancias de mapa (Kosambi, 1944).
8- ANÁLISIS GENÓMICO CON MICROMATRICES DE DNA.
Se siguió el protocolo descrito en Pérez-Amador et al. (2001), con modificaciones.
En primer lugar se realizaron extracciones de RNA total (ver apartado 6.2) de
inflorescencias del mutante y de la estirpe de referencia. Partiendo de 0,5 µg de este
RNA total, se amplificó el RNA poliA utilizando el sistema MessageAmp aRNA Kit
(Ambion) siguiendo las instrucciones del fabricante. Básicamente, se sintetiza cDNA a
partir de todo el mRNA presente en la muestra mediante una retrotranscripción, en la
que se utilizan cebadores T7-oligo-dT. Estos cebadores son oligos polidT que
incorporan en su extremo 5’ la secuencia del promotor de la T7-RNA polimerasa. A
II- MATERIALES Y MÉTODOS
43
partir del cDNA, mediante una transcripción in vitro catalizada por la T7-RNA
polimerasa, se genera un elevado número de copias de mRNA. La mezcla de
ribonucleótidos trifosfato utilizada en la transcripción in vitro contiene aminoalil-UTP
en lugar de UTP, de modo que el mRNA pueda marcarse fácilmente a continuación con
fluoróforos derivados de N-hidroxisuccinimidil éster (NHS éster), como el Cy3 (verde)
y el Cy5 (rojo). Se utilizan fluoróforos diferentes para las muestras procedentes del
mutante y de la estirpe de referencia.
Los mRNAs marcados del mutante y el silvestre se mezclaron a igual
concentración,
cuantificada
como
la
intensidad
de
fluorescencia
en
un
espectrofotómetro NanoDrop (Ambion), y se fragmentaron mediante una incubación en
Fragmentation Buffer 1X (Ambion) a 70ºC durante 15 minutos.
La mezcla de mRNAs marcados se hibridó con la versión 3.0 del Arabidopsis
Oligonucleotide Microarray, impreso en la Universidad de Arizona. Esta versión
contiene 29.000 pocillos (spots) con sondas de DNA de 70 nucleótidos, incluidos en el
kit Arabidopsis Array-Ready Oligo Set (Qiagen-Operon). De forma resumida, en primer
lugar se trató el porta con solución de prehibridación [SSC 3X (stock preparado 20X:
NaCl 3 M; citrato sódico 0,3 M; pH 7,0); SDS 0,1%; BSA 0,1 mg/ml] durante 30
minutos a 42ºC en una cámara de hibridación (Telechem). A continuación se hibridó
durante una noche a 37ºC en solución de hibridación [formamida desionizada (Sigma)
50%; SSC 6X; solución Denhardt’s (Sigma) 5X; SDS 0,5%], conteniendo el mRNA
marcado. Finalmente el porta se lavó durante 5 minutos en SSC 2X, SDS 0,1% a 30ºC;
5 minutos en SSC 0,2X, SDS 0,1% a 30ºC; 2 minutos en SSC 0,1X a 28ºC; 1 minuto en
SSC 0,1X a 28ºC; y 10 segundos en SSC 0,01X a temperatura ambiente.
El porta se examinó en un escáner Genepix 4000B (Axon Instruments), y los
resultados obtenidos fueron analizados utilizando el software GenePix 6.0 (Axon
Instruments). Sólo se consideraron como significativos aquellos pocillos en los que la
señal obtenida fue 200 unidades superior al ruido generado por la fluorescencia
inespecífica en cada canal.
9- ESTUDIOS DE EXPRESIÓN MEDIANTE HIBRIDACIÓN IN SITU.
9.1- Generación de ribosondas marcadas con digoxigenina.
Se amplificó mediante PCR (ver apartado 6.4) un fragmento de 404 pb del gen AS1
(At2g37630) utilizando los cebadores AS1-5 y AS1-6 (ver Anexo II-1), y el producto
44
II- MATERIALES Y MÉTODOS
Fig. II-3. Plásmido pGEM-T. Confiere resistencia a la ampicilina (Ampr), presenta un sitio de
clonación múltiple dentro del gen de la β-galactosidasa (LacZ) y posee promotores para las
polimerasas de RNA de los bacteriófagos T7 y SP6. El origen de replicación se indica como ori.
resultante se clonó en el plásmido pGEM-T (Fig. II-3; Promega). Este plásmido posee
los promotores para las polimerasas de RNA de los bacteriófagos SP6 y T7 a cada lado
del sitio de clonación múltiple, por lo que se linearizó el plásmido con las enzimas
apropiadas y se utilizó como molde de transcripción in vitro para generar las ribosondas
sentido (control negativo) y antisentido. Se usaron 2 µg de plásmido cortado como
molde para una reacción de 20 µl en presencia de digoxigenina-11-dUTP de la mezcla
DIG-RNA labeling mix (Roche Diagnostics), 40 U de inhibidor de RNasas, 20 U de la
polimerasa de RNA (T7 o SP6, Roche Diagnostics) y 2 µl del tampón 10X
correspondiente (Roche Diagnostics). La reacción tuvo lugar a 37ºC durante 90
minutos.
Tras la incubación se añadieron 10 U de DNasaI libre de RNasas (Roche
Diagnostics) a la mezcla de reacción y se mantuvo 15 minutos a 37ºC. Se precipitó la
sonda con tRNA de levadura (1 µg/µl, Roche Diagnostics), acetato amónico 0,6 M y
220 µl de etanol absoluto, y se almacenó a -20ºC hasta el momento de cuantificar el
rendimiento del marcaje de la sonda. La verificación de la integridad de la sonda se
llevó a cabo mediante electroforesis en geles de agarosa (apartado 6.7).
9.2- Cuantificación de las sondas.
Se centrifugó la sonda a 4ºC y 13.000 rpm durante 15 minutos, se eliminó el
sobrenadante, se lavó el precipitado con etanol 70%, se dejó secar al aire y se
II- MATERIALES Y MÉTODOS
45
resuspendió en 10 µl de agua tratada con DEPC. Con 1 µl de esta disolución se
prepararon las diluciones empleadas en la cuantificación (1/20, 1/250, 1/1.000 y
1/2.500). Se aplicó 1 µl de cada una de las diluciones anteriores a una membrana de
nailon (dot blot) que, tras secarse, se irradió con luz UV. El revelado de esta membrana
se realizó junto con una tira control con distintas concentraciones de RNA marcado con
digoxigenina (RNA Scripts Test, Roche Diagnostics; Fig. II-4). Se mojaron las tiras en
Tira
control
*
Fig. II-4. Cuantificación simultánea de varias
ribosondas (A-E). En la parte superior aparece una tira
control que contiene cantidades estandarizadas de RNA
marcado con digoxigenina. La concentración de sonda
cuya mancha se aproxime al penúltimo punto de la tira
(asterisco) es, en principio, la más adecuada.
TBS 1X (stock preparado a concentración 10X: Tris-HCl 1 M; NaCl 4 M; pH 7,5)
durante 2 minutos, y a continuación se incubaron 10 minutos en TBS 1X con agente
bloqueante 0,5% (m/v, Roche Diagnostics). Se incubaron durante 15 minutos en TBS
1X con el anticuerpo anti-DIG-ab (1/3.000, Roche Diagnostics), y se lavaron 1
minuto en tampón de detección 1X sin sustratos (stock preparado 10X: Tris-HCl 1 M;
NaCl 1 M; MgCl2 0,5 M; pH 9,5). Por último, se reveló incubando con tampón de
detección 1X con sustrato [150 µl de NBT (100 mg/ml) y 150 µl de BCIP (50 mg/ml)
por cada 100 ml de tampón; Roche Diagnostics] durante el tiempo suficiente para que se
viera el último punto de la tira control.
Determinamos empíricamente la concentración de sonda a utilizar en cada caso.
9.3- Prehibridación e hibridación.
Se obtuvieron cortes histológicos de las muestras vegetales previamente incluidas
en parafina (ver apartados 3.2 y 3.3). A continuación se procedió como se describe en
Ferrándiz y Sessions (2002). El tejido se desparafinó en los portas con histoclear, y a
continuación se rehidrató en series de etanol a concentraciones decrecientes de 2
46
II- MATERIALES Y MÉTODOS
minutos cada una. Se llevó a cabo la hidrólisis de las proteínas mediante un tratamiento
de 20 minutos en HCl 0,2 M, y posteriormente se sometió el tejido a una incubación con
proteinasa K (1 µg/µl) durante 30 minutos a 37ºC. Los portas se lavaron durante 2
minutos con PBS 1X (stock preparado a concentración 20X: NaCl 2,75 M; KCl 50 mM;
Na2HPO4 200 mM; KH2PO4 35 mM; pH 7,4) y se bloqueó la acción de la proteinasa K
incubando 2 minutos en 1X PBS con glicina (0,2% m/v). Tras dos lavados con PBS 1X
de 2 minutos cada uno, se refijó el tejido con una solución de PBS 1X y formaldehído
(3,7% v/v) a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de dos pasos de 5
minutos con PBS 1X. Se prosiguió con la deshidratación del tejido en series crecientes
de etanol de 2 minutos cada paso hasta llegar al etanol absoluto. Tras secar un poco los
portas, se sometieron a vacío durante 20 minutos a una presión de 100 mb.
Para la hibridación, se precalentaron los portas con el tejido en una placa
calefactora (Selecta) a 45ºC durante unos minutos. Las sondas se diluyeron en tampón
de hibridación [SSC 6X (stock preparado 20X: NaCl 3 M; citrato sódico 0,3 M; pH
7,0); SDS 1,5% (m/v); formamida 50% (v/v); tRNA de levadura (100 µg/ml)] hasta la
concentración deseada, y se desnaturalizaron a 80ºC durante unos minutos. Se aplicaron
300 µl de la solución de hibridación a cada porta con su muestra correspondiente,
disponiéndose éstos enfrentados dos a dos. Gracias al sistema Probe-On-Plus, entre los
tejidos de ambos portas se genera un espacio donde discurre la solución de hibridación
en contacto con el tejido. Los portas apareados se incubaron en una cámara húmeda
durante toda la noche a 55ºC.
9.4- Inmunodetección colorimétrica de la señal.
Tras realizar dos lavados de 90 minutos en una solución de SSC 2X con formamida
(50% v/v), los portas se incubaron en TBS 1X durante 5 minutos, luego 1 hora con
solución bloqueante [TBS 1X y agente bloqueante 0,5% (m/v; Roche Diagnostics)], y
30 minutos en TBS 1X, Tritón X-100 (0,3% v/v) y BSA (1% m/v). A continuación, se
incubaron 90 minutos en esta última solución con el anticuerpo anti-DIG-ab (dilución
1:3.000). Se realizaron tres lavados de 20 minutos cada uno con la misma solución sin
anticuerpo con el fin de eliminar su exceso. Para alcalinizar el medio incubamos con el
tampón de detección 1X sin sustratos (stock preparado 10X: Tris-HCl 1 M; NaCl 1 M;
MgCl2 0,5 M; pH 9,5) durante 5-10 minutos. Esta solución se reemplazó por el tampón
II- MATERIALES Y MÉTODOS
47
de detección con los sustratos. Por cada 100 ml de solución de detección se añadieron
150 µl de NBT (100 mg/ml) y otros 150 µl de BCIP (50 mg/ml). Se incubó en oscuridad
durante un periodo que osciló entre una noche y varios días. La reacción se detuvo
reemplazando la solución de detección por agua.
En el montaje de los portas se deshidrató el tejido en series de etanol crecientes
de forma rápida (2 minutos cada una), tras lo cuál se añadió una gota de Eukitt (O.
Kindler GmbH & Co) al portaobjetos y se dispuso el cubreobjetos. Las muestras se
visualizaron como se describe en el apartado 5.1.
48
II- MATERIALES Y MÉTODOS
Anexo II-1. Oligonucleótidos utilizados como cebadores, con sus principales características.
NOMBRE
AS1-1
AS1-2
AS1-3
AS1-4
AS1-5
AS1-6
AS1-7
AS1-8
dCER6-2R
dCER6-F
ERA1
ERA2
KNAT2-1F
KNAT2-1R
MQK4-1F*
MQK4-1R
MQK4-2F*
MQK4-2R
MQK4-3F*
MQK4-3R
MQK4-4F
MQK4-4R
T21H19-5F
T21H19-7F
T21H19-7R
T21H19-8F
T21H19-8R
T21H19-9F
T21H19-9R
T21H19-10F
T21H19-10R
T21H19-12F
T21H19-12R
T21H19-13F
T21H19-13R
T21H19-14F
T21H19-14R
T21H19-15F
T21H19-15R
T21H19-16F
T21H19-16R
T21H19-17F
T21H19-17R
T21H19-18F
T21H19-18R
T21H19-19F
T21H19-19R
T21H19-20F
T21H19-20R
T21H19-52R
T21H19-82R
CROM.
2
2
2
2
2
2
2
2
1
1
2
2
1
1
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
SECUENCIA 5'-3'
gagagcaaatctgtgtgatg
acaagatgccattctctcg
tgggaagaagtgatgtcagg
atcacaaccgttgcagcagc
ttctcgagagtttcgctgag
ttcctccaactctctacaacac
attgatcgcgtcttgtagtg
ctaagtaaacattggagacac
gtccatggttggtgtgggaggaatctaa
tcgtgtccccttcgcaactttcat
ctaatgtagtgatctgcgaggtaatc
gagtttattctgtgccaagtccctg
gacgtttcagtgtcgtactgg
caagcctcttggccatcaagc
FAM-gaggaacgtgtagaagagctg
ctagaaagtagctgctgactcg
FAM-ctagctatttgaaccgacgatatgg
gcacgaaatcgtattcgatctgg
FAM-gcagatactgatgggattcttgtc
ggtgctgtttgttcttgttactgc
gtaggtaactggagaccctgg
ctgccatttagagtgtcctgag
catgcgagcatcgatgatggatc
cacggttcacgatatccatacg
aggatgtatcactgcaaggag
ctccatgagcattcgtagtaggac
cagctgatatgcgatccgtctg
gaatcgaggactcggaggag
cgctcgggaatatcagtacatgg
catgcttctgttggagcggtg
cagcagctccattgccttcc
ctcaagcatagtgtgtctgtacctg
gttcttactctacgaacagcaacgac
gcatgtgagtgtgatggtagctc
gagcatagaagaataccttgtcactg
ctcatagcacattgcatttcctagac
ctagattcgcttatctccgtcgag
gtccatgatccaacctg aacac
cgtgatctctaccgtcactcg
catgccacaaaacccgaactgag
ctctcagtgtggttgagctgc
gagtagcaacacaaccagaaaagg
cgattgacaagtcagaaggtaatcc
gaagcatggctattttctcctgc
gtttttcttgtctgattggcaaacac
cttccaaggtctctgggtgag
gttgcactttgagcatttgcgag
gcattcacctgttcccagcac
caatggtacgttggagaaccag
gtcctctgggtttgcgttgg
gttttgagctgactccttttactg
CLON
F13M22
F13M22
F13M22
F13M22
F13M22
F13M22
F13M22
F13M22
T26J14
T26J14
T1D16
T1D16
F24J13
F24J13
MQK4
MQK4
MQK4
MQK4
MQK4
MQK4
MQK4
MQK4
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
T21H19
* Cebadores marcados con Fam (fluoresceína) en el extremo 5'.
APLICACIÓN
Secuenciación AS1
Secuenciación AS1
Secuenciación AS1
Secuenciación AS1
Secuenciación AS1. Sonda in situ.
Secuenciación AS1. Sonda in situ.
Secuenciación AS1
Secuenciación AS1
Genotipado cer6-2
Genotipado cer6-2
Genotipado erecta
Genotipado erecta
Genotipado inserción GT7953
Genotipado inserción GT7953
Cartografía zpl, marcador CER456818
Cartografía zpl, marcador CER456818
Cartografía zpl, marcador CER456820
Cartografía zpl, marcador CER456820
Cartografía zpl, marcador CER456825
Cartografía zpl, marcador CER456825
Cartografía zpl, marcador CER456817
Cartografía zpl, marcador CER456817
Cartografía zpl, marcador CER480067
Cartografía zpl, marcador CER480240
Cartografía zpl, marcador CER480240
Cartografía zpl, marcador CER480057
Cartografía zpl, marcador CER480057
Secuenciación AT5G16220
Secuenciación AT5G16220
Cartografía zpl, marcador CER480112
Cartografía zpl, marcador CER480112
Secuenciación AT5G16220
Secuenciación AT5G16220
Secuenciación AT5G16220
Secuenciación AT5G16220
Secuenciación AT5G16220
Secuenciación AT5G16220
Secuenciación AT5G16210
Secuenciación AT5G16210
Secuenciación AT5G16210
Secuenciación AT5G16210
Secuenciación AT5G16210
Secuenciación AT5G16210
Secuenciación AT5G16210
Secuenciación AT5G16210
Secuenciación AT5G16210
Secuenciación AT5G16210
Secuenciación AT5G16210
Secuenciación AT5G16210
Cartografía zpl, marcador CER480067
Secuenciación AT5G16210
III
Aislamiento y caracterización de
zeppelin, un nuevo mutante de
Arabidopsis thaliana con alteraciones
en la morfología del gineceo
III- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
51
ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
El fruto es probablemente el órgano más complejo en las plantas superiores. Está
formado por un gran número de tipos celulares distintos y exhibe un complicado patrón
de regionalización y diferenciación morfológica (Ferrándiz et al., 1999). Es, por tanto,
un órgano atractivo para la investigación de los procesos del desarrollo que dan lugar a
patrones complejos en los vegetales. En la actualidad, los mayores esfuerzos se centran
en el esclarecimiento de las bases genéticas que subyacen a su desarrollo. Estos trabajos
tienen, además, un importante interés aplicado, ya que son un paso previo a la
implantación de técnicas moleculares que permitan mejorar distintos aspectos de la
productividad de especies agrícolas.
El fruto de Arabidopsis es la silicua dehiscente típica de las Crucíferas, una familia
que engloba a más de 3.000 especies (Bowman, 1994; Strasburger et al., 1994). Su
estructura, comparada con la que presentan los frutos de otras familias, es relativamente
simple, lo que unido a las características propias de esta planta lo convierten en un
modelo muy apropiado para su estudio en el laboratorio (Somerville y Koornneef,
2002). Además, el conocimiento de los mecanismos moleculares que controlan el
desarrollo del fruto en Arabidopsis debería ser extrapolable a otras especies con interés
económico.
Tras la morfogénesis del gineceo, la fertilización desencadena el proceso de
fructificación, por el cual el pistilo da lugar al fruto mediante una etapa inicial de
divisiones celulares y el posterior crecimiento de las células, que provocan un aumento
general del tamaño del gineceo (Gillaspy et al., 1993). En ausencia de fertilización, la
alternativa a este programa de desarrollo es la senescencia del pistilo tras un ligero
crecimiento del ovario (Vercher y Carbonell, 1991). Sin embargo, la vinculación entre
la fertilización y el inicio del desarrollo del fruto puede alterarse mediante mutaciones
en los genes responsables de la coordinación entre ambos procesos, como pone de
manifiesto la existencia del fenómeno de la partenocarpia, que es la capacidad que
tienen los pistilos de algunas plantas de generar frutos sin que medie la fertilización,
dando lugar a frutos sin semillas. Los ejemplos de desarrollo partenocárpico son
relativamente escasos, si bien los frutos sin semillas son muy apreciados en la
agricultura. En la mayoría de los casos se trata de variedades de cultivos frutales y de
hortalizas en las que la mutación responsable surgió de forma espontánea y se
52
III- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
seleccionó y propagó mediante prácticas agrícolas tradicionales (Fos y Nuez, 1997; Fos
et al., 2000; George et al., 1984; Mazzucato et al., 1988).
El conocimiento actual acerca de los mecanismos moleculares implicados en los
procesos de la partenocarpia es muy escaso, aunque se ha demostrado que las hormonas
vegetales (fundamentalmente auxinas y giberelinas, y en menor medida citoquininas)
desempeñan un papel crucial en el proceso (Agüero et al., 1996; Cano-Medrano y
Darnell, 1997; García-Martínez y Carbonell, 1980; Pandolfini et al., 2002; Rotino et al.,
1997; Vivian-Smith y Koltunow, 1999). El esclarecimiento de las bases genéticas y
moleculares subyacentes al fenómeno de la partenocarpia permitiría, además de aportar
nuevos conocimientos acerca del desarrollo vegetal, aplicar nuevas estrategias
biotecnológicas para mejorar la producción de diferentes frutos de interés agrícola, que
se ve disminuida en muchos casos por la baja eficacia de la fertilización.
Parece verosímil que la conexión entre fertilización y fructificación implique la
existencia de funciones génicas encargadas de reprimir el crecimiento del pistilo en
ausencia de polinización. En este contexto, para inducir un fenotipo partenocárpico las
mutaciones en los genes responsables habrían de ser esencialmente nulas o hipomorfas.
Esta visión se ve sustentada por el carácter recesivo de diversas mutaciones espontáneas
en tomate (Fos y Nuez, 1997; Fos et al., 2000) y de una mutación inducida en
Arabidopsis, fruit without fertilization (fwf; Vivian-Smith et al., 2001), que provocan el
desarrollo de frutos partenocárpicos.
La obtención de mutantes de pérdida de función en los que la ontogenia del
gineceo, su morfología o su capacidad de responder a determinados estímulos estén
alterados, es una aproximación comúnmente empleada para la identificación de genes
que participan en los distintos aspectos del desarrollo de este órgano. Los mutágenos
más utilizados para este fin en Arabidopsis son de tipo físico (neutrones rápidos y rayos
X), químico (EMS) o insercional (como el T-DNA de Agrobacterium tumefaciens;
Meyerowitz, 2001; Weigel y Glazebrook, 2002). La elección de una estirpe apropiada
sobre la que llevar a cabo la mutagénesis es de gran importancia, ya que los fenotipos
provocados por algunas mutaciones pueden ser difícilmente detectables en
determinados fondos genéticos. Por este motivo, a menudo es preferible mutagenizar un
fondo mutante que permita poner de manifiesto con mayor facilidad los fenotipos de
interés.
Con el fin de contribuir a una disección genética de la partenocarpia, un objetivo
planteado durante esta Tesis Doctoral fue generar y aislar mutantes partenocárpicos de
III- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
53
Arabidopsis. Para ello, se diseñó una mutagénesis con EMS sobre una población de
semillas del mutante androestéril condicional ecceriferum6 (cer6; Fiebig et al., 2000;
Preuss et al., 1993). En este mutante, la polinización está impedida en las condiciones
normales de cultivo de Arabidopsis, de modo que no es necesario manipular la planta
para poner de manifiesto un posible fenotipo partenocárpico. Esta característica facilita
en gran medida la realización de un escrutinio intensivo de dichos fenotipos. Además,
una mutagénesis sobre cer6 también puede ser útil, ocasionalmente, para la obtención
de mutantes que, no siendo partenocárpicos, muestren alteraciones en la morfogénesis
del gineceo. El estudio de la población mutagenizada resultante se compondría de las
siguientes actuaciones:
1) Amplificación de la población mutagenizada mediante autofertilización en
condiciones permisivas para la polinización.
2) Caracterización inicial de los mutantes obtenidos, incluyendo el estudio de la
heredabilidad del fenotipo generado y su patrón de herencia.
3) Eliminación de la mutación cer6, mediante cruzamientos con estirpes silvestres,
para la caracterización de los mutantes simples.
4) Cartografía genética de las nuevas mutaciones, como antesala de la
identificación molecular de los genes afectados.
5) Estudio de las interacciones entre los mutantes aislados y otras estirpes
partenocárpicas o con otras perturbaciones en el desarrollo del fruto, mediante la
realización de cruzamientos y la obtención de dobles mutantes, con el fin de establecer
modelos genéticos acerca del papel de estos genes en la morfogénesis del gineceo y en
la coordinación entre fertilización y fructificación.
III- RESULTADOS
55
RESULTADOS
1- Escrutinio de la población mutagenizada y aislamiento de mutantes.
Con el objetivo de encontrar nuevos mutantes de Arabidopsis que presentaran
frutos con morfología anormal o desarrollo partenocárpico, se planteó una mutagénesis
química sobre semillas del mutante androestéril condicional ecceriferum6-2 (cer6-2), en
el fondo genético Landsberg erecta (Ler). La cubierta del polen de las plantas cer6-2
carece de los lípidos de cadena larga que permiten su hidratación, y tampoco presenta la
mayoría de las proteínas que intervienen en el proceso de interacción entre el polen y el
pistilo, lo que impide la fertilización y el posterior desarrollo del fruto (Fiebig et al.,
2000; Preuss et al., 1993). Esta característica permitiría la observación del fenotipo
partenocárpico sin necesidad de manipular las plantas para impedir la fertilización. Sin
embargo, la capacidad de fertilización del mutante cer6-2 se restaura en condiciones de
alta humedad (condiciones permisivas), lo que permite obtener semillas, cuando sea
necesario, simplemente cubriendo la planta con una estructura plástica para incrementar
localmente la humedad hasta el 95% (Fig. III-1; apartado 1.3 de Materiales y Métodos).
Fig. III-1. A: fruto Ler polinizado en estadio 17. B: fruto cer6 fertilizado en
estadio 17. C: pistilo cer6 no fertilizado 7 dias después de antesis. Barra de
escala: 5 mm.
Se generaron 94 grupos parentales de semillas M2, de los cuales se han escrutado
75, sembrándose aproximadamente 200 semillas de cada uno (Tabla III-1). Esto implicó
el análisis de alrededor de 1.500 plantas M1 y 15.000 M2. Se seleccionaron durante el
escrutinio 21 plantas con fenotipo potencialmente partenocárpico, que mostraban un
ligero incremento de tamaño del gineceo comparado con el de las plantas cer6-2 de
referencia. De entre estos presuntos mutantes, 15 fueron descartados por presentar un
fenotipo no heredable. Otros 5 fueron relegados por ser totalmente estériles, resultando
56
III- RESULTADOS
imposible su propagación y el estudio de la heredabilidad del fenotipo. Existe la
posibilidad de tratar de aislar de nuevo estos mutantes sembrando semillas M2 del grupo
parental en el que fueron encontrados, donde sería factible el aislamiento de individuos
heterocigóticos portadores de la mutación.
Tabla III-1. Porcentaje de germinación y de aparición de rosetas albinas entre las plantas
mutagenizadas (M1) y su descendencia (M2).
M1
M2
%
Sembradas germinación
1.500
93,5
15.000
82,8
%
albinas
0
3,2
Solamente uno de los individuos aislados, al que se denominó parthenocarpic
mutant (pau), mostró un fenotipo partenocárpico que se transmitía a su progenie y no
presentaba ningún problema de esterilidad, por lo que se abordó inicialmente el análisis
de este mutante. Sin embargo, tras eliminar el efecto de cer6 mediante la realización de
sucesivos cruzamientos con diversas estirpes silvestres y mutantes, observamos que el
fenotipo partenocárpico no se comporta como un rasgo monogénico, sino que parece
estar provocado por más de una mutación. Además, el fondo genético influye en gran
medida en la intensidad del fenotipo, es decir, en la longitud de los frutos no
polinizados. Estas características han hecho inviable por el momento el análisis
detallado del mutante pau, así como la cartografía genética de la mutación, por lo que su
estudio no se recoge en esta Tesis.
Por otra parte, en el transcurso del escrutinio se aislaron 4 mutantes cuyos gineceos,
sin presentar un desarrollo partenocárpico, mostraban una morfología anormal. Tres de
ellos se descartaron por la desaparición en la siguiente generación del fenotipo
observado. El estudio del cuarto de estos mutantes, al que se denominó inicialmente
71-1, queda reflejado a continuación.
2- Aislamiento del mutante zeppelin (zpl).
La mutagénesis realizada sobre el fondo androestéril condicional cer6-2 permitió
aislar un presunto doble mutante, denominado 71-1 en alusión al grupo parental en el
que fue identificado, que presentaba pistilos más cortos y más anchos que la estirpe
parental cer6-2 (Fig. III-2). La fertilidad de estas plantas en condiciones permisivas no
se ve afectada por la mutación, lo que permitió obtener semillas por autopolinización y
observar que los frutos fertilizados también presentan una menor longitud final que los
III- RESULTADOS
57
del fondo parental cer6-2, y una anchura incrementada (datos no mostrados). Se pudo
comprobar la heredabilidad y la penetrancia completa del fenotipo; los frutos de todas
las plantas descendientes del aislado original presentaron las mismas características.
Fig. III-2. Pistilos no polinizados de plantas cer6-2 (izquierda) y 71-1
(cer6-2 zpl; derecha). Barra de escala: 2 mm.
El hecho de que el fenotipo fuera detectado en un fondo cer6-2 en condiciones
restrictivas indica que las alteraciones se inician antes de antesis, durante la ontogenia
del pistilo, dado que la fertilización se ve impedida en esta situación.
Fig. III-3. A: frutos Ler (izquierda) y zpl
(derecha). B: Silicua zpl con valvas extra;
los asteriscos señalan las tres valvas
visibles desde esta perspectiva. C: región
apical de un fruto zpl con una valva extra
incompleta de pequeño tamaño. D: pistilo
zpl no polinizado con tres valvas. Barras de
escala: 2 mm (A y B) y 0,5 mm (C y D).
Se realizaron cruzamientos entre plantas de la estirpe mutante 71-1 y plantas
silvestres del ecotipo Ler, en el cual se encuentra el fondo mutante empleado para la
mutagénesis. Las plantas de la generación F1 de este cruzamiento mostraron un fenotipo
totalmente silvestre, y en la generación F2 identificamos plantas sin fenotipo Cer6 con
frutos cortos y anchos (Fig. III-3A), lo que indica que este fenotipo es independiente del
efecto de la mutación cer6-2. En estas plantas, encontramos con cierta frecuencia
silicuas con más de dos valvas, en las que las valvas extra pueden no abarcar toda la
58
III- RESULTADOS
longitud del ovario (Fig. III-3B y C). Tras emascular varias flores, observamos que los
pistilos no fertilizados son más cortos y más anchos que en el caso de las plantas Ler
cultivadas en las mismas condiciones, y también pueden presentar valvas extra (Fig.
III-3D). Debido al aspecto de sus silicuas, denominamos a este mutante zeppelin (zpl).
3- zpl se comporta como una mutación monogénica y de carácter recesivo.
Con el objetivo de eliminar la mutación cer6-2 y cualquier mutación adicional que
pudiera distorsionar el estudio, cruzamos de nuevo plantas zpl, procedentes del
retrocruzamiento anterior, por Ler. A continuación, seleccionamos plantas zpl sin
fenotipo Cer6 en la generación F2 y repetimos el cruzamiento una vez más, de modo que
obtuvimos plantas homocigóticas para el alelo silvestre CER6 y con silicuas de fenotipo
Zpl. Todos los aspectos del fenotipo mutante persisten tras estos tres lavados, de modo
que se utilizaron estas plantas para los estudios posteriores.
Durante el tercer cruzamiento de zpl por Ler, llevamos a cabo un estudio de la
segregación del fenotipo Zpl. Los individuos de la generación F1 presentaron aspecto
silvestre, mientras que en la generación F2 encontramos 142 plantas silvestres frente a
35 plantas mutantes. Estos resultados se ajustan a una segregación 3:1 (χ2=2,45), lo que
indica que el fenotipo Zpl se hereda como un carácter monogénico y recesivo.
Fig. III-4. Alteración del patrón de filotaxia en una planta zpl, con
tres frutos que surgen del mismo nudo del tallo.
4- Caracterización fenotípica del mutante zpl.
La mutación zpl afecta de manera muy concreta a la morfología del fruto. La
fertilidad del mutante zpl es normal en las condiciones de cultivo habituales para
Arabidopsis, y la morfología del resto de los órganos florales, así como de las hojas,
tampoco está afectada. Al margen del gineceo, el único defecto que muestran las plantas
zpl es la aparición de frecuentes errores de filotaxia. Todas las plantas muestran
III- RESULTADOS
59
alteraciones en la disposición normal de las ramificaciones, las flores y los frutos
(Fig. III-4).
Fig. III-5. Micrografías electrónicas de barrido de frutos zpl. A: pseudoreplum en una valva
convencional. B: pseudoreplum en una valva extra. C: replum ensanchado y con estomas por debajo de
una valva extra incompleta. Las flechas blancas señalan los pseudorepla en A y B. Barras de escala:
100 µm.
Aproximadamente el 10% de las silicuas del mutante zpl presenta valvas extra. En
estos frutos, el número total de valvas puede oscilar entre 3 y 5 (Fig. III-3B-D). Las
valvas extra son generalmente más cortas que el resto, faltando siempre la región basal
de la valva, que es sustituida por un territorio medio con apariencia de replum muy
ancho, pero con gran profusión de estomas (Figs. III-3C y III-5C). También es posible
encontrar en la superficie de la valva regiones que se asemejan a un replum incompleto
(Fig. III-5A y B). En estos pseudorepla, las células presentan la forma estrecha y
alargada característica de la epidermis del replum, pero aparecen estomas intercalados
entre ellas, circunstancia impropia de un replum auténtico. En estos casos no se forman
los márgenes de la valva ni las zonas de dehiscencia correspondientes. Por otra parte, la
región más apical de las valvas muestra frecuentemente un aspecto ondulado,
independientemente del número de carpelos que compongan el fruto (Fig. III-6).
Fig. III-6. A: region apical de un fruto zpl, con las valvas onduladas. B: detalle de la misma región,
observada al microscopio electrónico de barrido. Barras de escala: 2 mm (A) y 100 µm (B).
60
III- RESULTADOS
El estudio de la superficie de los frutos zpl mediante microscopía electrónica de
barrido puso de manifiesto otras alteraciones en la morfología celular. Por una parte, la
longitud promedio de las células epidérmicas de la valva parece menor, y su orientación
es más irregular, con células que no se disponen en paralelo al eje apical-basal de la
silicua como es característico en esta estructura (Fig. III-7). Además, pueden formarse
agrupaciones de células de pequeño tamaño en zonas con una elevada densidad de
estomas (Fig. III-7B).
Fig. III-7. Micrografías electrónicas de barrido de la región media de silicuas Ler (A) y zpl (B). Las
flechas blancas señalan regiones con elevada densidad de estomas. Barras de escala: 100 µm.
Con el fin de profundizar en el estudio de las alteraciones morfológicas que
presentan las células del gineceo en el mutante zpl, obtuvimos secciones longitudinales
y transversales de frutos Ler y zpl. En los cortes longitudinales se aprecia que las
células del exocarpo tienen en general una longitud menor en los frutos zpl (Fig. III-8).
Fig. III-8. Secciones longitudinales de silicuas Ler (A) y zpl (B). Barras de escala: 200 µm.
De hecho, al realizar el recuento del número de células del exocarpo en el ovario
silvestre obtuvimos un resultado medio de 13,52±3,02 células por mm de longitud,
mientras que en el caso del mutante el resultado fue de 19,4±2,8 células. Por tanto, estas
últimas son, como promedio, más pequeñas en el eje longitudinal, aunque muestran una
III- RESULTADOS
61
gran disparidad de tamaños (Fig. III-8). No obstante, en las capas interiores parece
haber un número menor de células por unidad de longitud en el mutante, siendo su
tamaño en este eje superior al del silvestre (Fig. III-8). En las secciones transversales, la
principal característica de las silicuas zpl es una cierta irregularidad en el tamaño de las
células del exocarpo (Fig. III-9), lo que es coherente con lo observado en las secciones
longitudinales. El número de células en el exocarpo es similar al de los frutos silvestres.
La disposición y el número de septos varía de forma acorde al número de valvas.
Así, en frutos con tres valvas se forma un septo completo que une dos de los repla, y
uno incompleto que parte del tercer replum y no llega a fusionarse. En frutos de cuatro
valvas es posible encontrar dos septos completos, lo que da lugar a un gran lóculo
central (Fig. III-9).
Fig. III-9. Secciones transversales de frutos Ler (A)
y zpl (B y C). El fruto en la imagen C muestra
cuatro valvas, y está dividido internamente por dos
septos completos. Barras de escala: 200 µm (A y B)
y 500 µm (C).
5- Cartografía genética de la mutación zpl.
La cartografía de mutaciones inducidas mediante EMS requiere la realización de un
análisis de ligamiento a marcadores conocidos en el genoma de Arabidopsis.
62
III- RESULTADOS
Actualmente, gracias al esfuerzo conjunto de entidades públicas y privadas, se dispone
de bases de datos que recogen numerosos polimorfismos moleculares, es decir, regiones
del genoma que varían entre distintos ecotipos, ya sea en el tamaño de la región (como
en el caso de los marcadores tipo SSLP, single sequence lenght polymorphism) o en la
identidad de determinados nucleótidos (como en los marcadores tipo SNP, single
nucleotide polymorphism). Las bases de datos del TAIR (http://www.arabidopsis.org) y
de Cereon Genomics (Monsanto Company, http://www.arabidopsis.org/Cereon)
recogen información acerca de una gran cantidad de regiones polimórficas entre los
ecotipos Ler y Col-0, lo que facilita la realización de los análisis de ligamiento en estos
fondos.
Con el objetivo de clonar posicionalmente la mutación zpl, se llevó a cabo su
cartografía genética. Para ello, generamos una población cartográfica mediante la
selección de plantas homocigóticas zpl en la generación F2 derivada de un cruzamiento
entre el mutante zpl (Ler) y la estirpe silvestre Col-0. El fenotipo mutante es fácilmente
detectable en un fondo híbrido, aunque en ausencia de la mutación er se suaviza el
aspecto ondulado de las valvas (Fig. III-10).
Fig. III-10. Frutos en estadio 17 de plantas
Col-0 (arriba) y zpl (abajo), esta última en
un fondo híbrido Col-0/La-0. Barra de
escala: 2 mm.
El material vegetal procedente de los individuos de la población cartográfica fue
procesado en el servicio de cartografía semiautomatizada de la Unidad de Genética del
Instituto de Bioingeniería, en la Universidad Miguel Hernández (Ponce et al., 1999), y
la cartografía se llevó a cabo en tres fases (Fig. III-11). En primer lugar, se realizó una
cartografía semiautomatizada de baja resolución partiendo de una población de 50
individuos, que permitió situar la mutación en el cromosoma 5 entre los marcadores
nga151 y nga76 (Fig. III-11A). A continuación se llevó a cabo, también en el
mencionado servicio, una cartografía de alta resolución utilizando el material
procedente de 434 individuos adicionales de la población cartográfica. Mediante este
procedimiento se situó la mutación zpl en el intervalo comprendido entre los
III- RESULTADOS
63
Fig. III-11. Cartografía genética de la mutación zpl, desarrollada en tres fases. A: cartografía
automatizada de baja resolución. B y C: cartografía automatizada de alta resolución. D: delimitación
final no automatizada del intervalo. Se indica la posición en centimorgans (cM) de los marcadores
empleados en la cartografía automatizada, y la frecuencia de recombinación (r), expresada en
porcentaje, para cada marcador. n: número de individuos de la población cartográfica utilizada en
cada caso.
marcadores T21H19, localizado en el BAC (Bacterial Artificial Chromosome) del
mismo nombre, y nga106, en el PAC (P1 Artificial Chromosome) MQK4 (Fig. III-11B
y C). En esta región hay 36 genes anotados en las bases de datos. Puesto que aún
disponíamos de tres individuos recombinantes para los marcadores T21H19 y nga106,
diseñamos cebadores para analizar en nuestro laboratorio, de forma no automatizada, su
64
III- RESULTADOS
genotipo para nuevos marcadores moleculares polimórficos de tipo SSLP situados
dentro del intervalo (Fig. III-11D). De este modo, pudimos acotar la posición de la
mutación zpl entre los marcadores CER480056 y CER480061, que delimitan una región
de 7.300 pb que incluye tan sólo dos genes, At5g16210 y At5g16220, orientados en el
mismo sentido (Fig. III-11D). At5g16210 codifica una proteína con repeticiones HEAT,
mientras que el producto de At5g16220 es una proteína con dominio PB1
(Octicosapéptido/Phox/Bem1p). Se desconoce, en principio, la función de ambas
proteínas.
Hemos secuenciado íntegramente la región codificante de los dos genes candidatos
en el mutante zpl, así como los intrones, sin encontrar ningún cambio en su secuencia.
Este resultado indica que la mutación zpl podría afectar a alguna región reguladora que,
dada la posición de los marcadores que acotan el intervalo de estudio, estaría situada
entre ambos genes, en posición 5’ respecto a At5g16210 y 3’ respecto a At5g16220
(Fig. III-11D).
6- Análisis de las interacciones genéticas de zpl.
Con el fin de obtener información acerca de los mecanismos y vías de desarrollo en
los que participa ZPL, iniciamos el estudio de las interacciones genéticas del alelo
mutante zpl con los de otros genes que participan en el desarrollo de la silicua de
Arabidopsis, como FUL (Gu et al., 1998), un gen clave en la diferenciación de las
valvas, y CRC (Álvarez y Smyth, 1999), que promueve el crecimiento longitudinal de la
silicua y restringe su crecimiento radial.
6.1- La longitud de los frutos zpl ful disminuye respecto a ful, pero su
crecimiento radial no varía.
Las mutaciones de pérdida de función en el gen FUL impiden el crecimiento de la
silicua después de la fertilización, dado que las células de la valva no se diferencian
correctamente y adquieren identidad de margen de valva (Gu et al., 1998). Para
comprobar si existe algún tipo de interacción entre las mutaciones ful y zpl, realizamos
un cruzamiento entre los mutantes simples ful-1 y zpl, ambos en el ecotipo Ler. En la
generación F2 de este cruzamiento encontramos plantas cuyos frutos mostraban fenotipo
Ful, pero su longitud era menor de lo habitual en este mutante (Fig. III-12). El
cruzamiento de estos individuos con el mutante simple zpl dio lugar a una descendencia
III- RESULTADOS
65
homogénea F1 con fenotipo Zpl, lo que demuestra que aquellas plantas F2 eran dobles
mutantes zpl/zpl ; ful-1/ful-1.
La menor longitud de los frutos del doble mutante zpl ful, que por otra parte
presentan todas las características de las silicuas ful, puede interpretarse como una
aditividad de los efectos de ambas mutaciones simples. Sin embargo, el grosor de los
frutos en el doble mutante no es mayor que en ful (Fig. III-12), lo que indica que la
función de FUL es necesaria para que se produzca el incremento del crecimiento radial
característico de las silicuas zpl.
Fig. III-12. Frutos del
mutante simple ful-1 (A) y
del doble mutante ful-1 zpl
(B). Barras de escala: 1
mm.
6.2- Las mutaciones zpl y crc muestran una relación de aditividad.
En los mutantes crc, el número de células que aparecen en el perímetro del gineceo
aumenta respecto a la estirpe silvestre de referencia, mientras que disminuye en la
dimensión longitudinal, debido a que el factor de transcripción CRC parece estar
implicado en la supresión del crecimiento radial temprano de la silicua y en la
activación del crecimiento longitudinal que tiene lugar posteriormente (Álvarez y
Smyth, 1999 y 2002; Bowman y Smyth, 1999). Estas características provocan que las
silicuas del mutante sean cortas y anchas. Todos los tipos celulares se diferencian en su
posición correcta en los gineceos crc, pero parecen hacerlo de forma prematura. Los
frutos crc siempre están abiertos en la región más apical, muestran alteraciones de la
vasculatura y carecen de nectarios en su base. Además, ocasionalmente presentan valvas
extra (Álvarez y Smyth, 1999 y 2002; Bowman y Smyth, 1999).
Las silicuas crc-1 son más cortas que las de zpl, aunque no tan anchas. Puesto que
existe cierto paralelismo entre los fenotipos de los dos mutantes, cruzamos zpl y crc-1,
ambos en fondo Ler, con el fin de obtener el doble mutante y averiguar si existe alguna
relación entre estas funciones génicas. En la generación F2 detectamos plantas cuyos
frutos presentaban apariencia Crc, con fallos de fusión en el extremo apical, pero su
longitud estaba aún más reducida y su anchura incrementada respecto a los del mutante
simple crc-1 (Fig. III-13; Fig. III-14A y C). La progenie de estas plantas reprodujo las
mismas características de forma totalmente uniforme. Tras realizar cruzamientos de
66
III- RESULTADOS
prueba con el mutante simple zpl, obtuvimos una descendencia F1 homogénea formada
por plantas con fenotipo Zpl, comprobando que, en efecto, se trataba de dobles mutantes
zpl crc-1.
Fig. III-13. De izquierda a derecha, frutos zpl, crc-1 y
zpl crc-1, totalmente desarrollados. Barra de escala: 2 mm.
Fig. III-14. Micrografías electrónicas de barrido de frutos crc-1 (A y C) y zpl crc-1 (B y D). Barras de
escala: 1 mm (A y B) y 100 µm (C y D).
Las silicuas del doble mutante son todavía más cortas que en el mutante simple
crc-1 y más anchas que en zpl, y presentan las características específicas de cada uno de
los mutantes simples: carecen de nectarios y sus valvas están separadas en la región
apical como en crc-1, y frecuentemente muestran ondulaciones en su superficie propias
de zpl (Fig. III-14). Las células de la superficie de la valva muestran células de tamaño y
orientación irregular, al igual que en zpl (Fig. III-14D). Por tanto, el fenotipo de las
III- RESULTADOS
67
silicuas del doble mutante zpl crc puede interpretarse como una relación de aditividad
entre ambas mutaciones, que afectarían a vías independientes de control de la expansión
longitudinal y radial del fruto.
Las plantas zpl crc aisladas inicialmente mostraron un porte muy reducido, rasgo
que no se presenta en ninguno de los mutantes simples (datos no mostrados). Este
fenotipo desapareció en generaciones posteriores, lo que sugiere que era debido a
factores ambientales o a características específicas de las plantas que lo presentaban. Sin
embargo, antes de comprobar que la reducción de la altura de las plantas no era debida a
la interacción entre ambas mutaciones, esa observación inicial nos pareció un indicio de
la posible implicación de CRC y ZPL en la función del meristemo, pese a que se ha
descrito que la expresión de CRC está restringida a las flores (Bowman y Smyth, 1999).
Por este motivo, llevamos a cabo un estudio preliminar del patrón de expresión de CRC
en el meristemo de inflorescencia, utilizando para ello plantas portadoras de una
construcción CRC::GUS (Baum et al., 2001). Como se aprecia en la figura III-15, en
nuestras condiciones observamos una señal intensa en el meristemo de inflorescencia, lo
que sugiere que el gen CRC desempeña un papel en el desarrollo o en el mantenimiento
de esta estructura, cuyo análisis habría que considerar en estudios posteriores.
Fig. III-15. Vista cenital de una inflorescencia apical
silvestre, mostrando la expresión del gen GUS bajo el
control del promotor de CRC. Barra de escala: 0,5 mm.
7- Análisis transcriptómico del mutante zpl.
Con el fin de obtener información adicional sobre los efectos de la mutación zpl,
hemos iniciado un estudio comparativo de los perfiles de expresión del genoma
completo de Arabidopsis en inflorescencias de la estirpe silvestre Ler y del mutante zpl.
Para ello, hemos realizado por el momento un único experimento con micromatrices de
DNA, en el que se utilizó como muestra RNA procedente de inflorescencias con
primordios florales en momentos de su desarrollo anteriores al estadio 10.
68
III- RESULTADOS
Arbitrariamente, establecimos un sesgo muy restrictivo por el que consideramos sólo
aquellos genes cuya expresión disminuyó o aumentó en el mutante más de 2,5 veces
respecto a la estirpe silvestre. Los resultados de este experimento se reflejan en la
Tabla III-2.
Entre los genes cuya expresión desciende en el mutante cabe señalar algunos que
codifican presuntos factores de transcripción (los dos que más disminuyen, At5g13920
y At3g55980; Tabla III-2), proteínas relacionadas con la progresión del ciclo mitótico
(At4g37490) y la integridad del DNA (At1g07745, At4g21100), así como distintos
productos con actividad quinasa de proteínas (At2g20850, At1g11350, At5g45810).
También encontramos un gen que codifica una pectinesterasa (At3g17060),
presuntamente involucrada en la modificación de la pared celular (Knox et al., 1990).
Es destacable la elevada proporción de secuencias génicas de función desconocida que
aparecen en este apartado.
La relación de genes con un aumento importante de su expresión transcripcional en
el mutante zpl es notablemente más numerosa (Tabla III-2). Resulta notoria la
abundancia de genes que codifican polipéptidos asociados a membranas (Tabla III-2, en
azul), uno de ellos presuntamente relacionado con la adhesión celular (At5g16920, casi
el quíntuple de la expresión del silvestre). También es destacable la presencia de varios
genes relacionados con el metabolismo de las ligninas (Tabla III-2, en rojo). Dos de
ellos codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de ligninas (At1g67980 y
At1g67990; Ye et al., 1994), mientras que un tercero codifica una glioxal oxidasa
(At3g57620) que podría estar implicada indirectamente en su degradación a través de la
producción de H2O2 (Kersten y Kirk, 1987). Por otra parte, resulta llamativa, por su
potencial relación con el gen candidato At5g16210 (ver Discusión), la inducción de la
expresión en el mutante de una profilina 3 (At4g29340), una proteína de bajo peso
molecular con capacidad de unirse a los monómeros de actina que participa en la
organización del citoesqueleto (Dos Remedios et al., 2003).
III- RESULTADOS
69
Tabla III-2. Análisis trancriptómico del mutante zpl. Se muestran aquellos genes cuyo nivel de
expresión aumenta o disminuye más de 2,5 veces en el mutante respecto del silvestre Ler. Se indica el
cociente entre la fluorescencia de la muestra procedente del mutante y la procedente del silvestre
(zpl/Ler).
Locus
At5g13920
At3g55980
At3g55600
At2g20850
At1g30100
At5g51960
At3g12430
At4g06676
At1g07745
At3g17060
At4g21100
At5g35430
At2g01260
At1g11350
At2g17990
At1g03730
At4g37490
At5g56680
At2g40780
At4g14360
At1g60640
At5g45810
At4g20060
Locus
At5g16920
At1g67990
At1g52680
At1g06260
At1g67980
At1g26820
At3g57620
At1g53480
At5g26730
At3g03430
At4g25040
At1g28430
At2g21490
At4g20420
At4g29340
At1g63060
At1g75930
At4g13560
At3g17210
At5g38760
zpl/Ler
Descripción
GENES REPRIMIDOS EN zpl
0.031
0.127
0.205
0.215
0.241
0.256
0.291
0.301
0.308
0.310
0.325
0.333
0.338
0.339
0.351
0.367
0.370
0.373
0.384
0.386
0.388
0.396
0.396
Proteína con nudillo de zinc
Proteína con dedos de zinc
Proteína expresada
Proteina quinasa con repeticiones ricas en leucina
9-cis-epoxicarotenoide dioxygenasa
Proteína expresada
Proteína expresada
Proteína expresada
Proteína de reparación de DNA
Pectinesterasa
Proteina de unión a DNA dañado por UV
Proteína expresada
Proteína expresada
Proteína quinasa de lectina (S-locus)
Proteína expresada
Proteína expresada
Ciclina específica de mitosis/G2 (CYC1)
Asparaginil-tRNA sintetasa 1
Proteína hipotética
Proteína de respuesta a deshidratación
Proteína expresada
Proteína quinasa 19 de interacción con CBL (CIPK19)
Proteína expresada
zpl/Ler
Descripción
GENES INDUCIDOS EN zpl
4.843
4.341
4.211
3.984
3.769
3.756
3.647
3.638
3.587
3.574
3.438
3.409
3.360
3.328
3.312
3.301
3.254
3.233
3.187
3.079
Proteína de adhesión celular
Caffeoil-CoA 3-O-metiltransferasa
Proteína abundante en la embriogénesis tardía (LEA)
Cisteína proteinasa, sistema de endomembranas
Caffeoil-CoA 3-O-metyltransferasa
Ribonucleasa 3 (RNS3)
Glioxal oxidasa,
Proteína expresada
Proteína expresada
Polcalcina
Proteína integral de membrana
Citocromo P450
Dehidrina
Proteína específica del tapetum
Profilina 3 (PFN3)
Proteína expresada
Lipasa extracelular 6 (EXL6)
Proteína abundante en la embriogénesis tardía (LEA)
Proteína estable 1, oxidorreductasa
Proteína inducida por frio (KIN1)
70
III- RESULTADOS
Tabla III-2 (continuación).
At3g28820
At2g23800
At1g77870
At2g03850
At5g07560
At1g74540
At1g04670
At3g26125
At2g41040
At2g05540
At1g02813
At5g07680
At2g03740
At1g72290
At5g49740
At5g62850
At3g28980
At1g23600
At5g07550
At5g61720
At1g53130
At1g68875
At1g75920
3.043
3.037
2.993
2.952
2.875
2.851
2.800
2.794
2.787
2.786
2.775
2.762
2.730
2.674
2.651
2.643
2.642
2.638
2.618
2.598
2.592
2.588
2.571
Proteína expresada
Geranilgeranil pirofosfato sintasa (GGPS)
Proteína geranilgeranilada
Proteína abundante en la embriogénesis tardía (LEA)
Oleosina rica en glicina (GRP20)
Citocromo P450
Proteína expresada
Citocromo P450
Metiltransferasa
Proteína rica en glicina
Proteína expresada
Proteína tipo NO APICAL MERISTEM (NAM)
Proteína abundante en la embriogénesis tardía (LEA)
Inhibidor de proteasa/tripsina
Reductasa férrica transmembrana
Nodulina
Proteína expresada
Proteína expresada
Oleosina rica en glicina (GRP19)
Proteína expresada
Proteína específica del estigma Stig1
Proteína expresada
Lipasa extracelular 5 (EXL5)
III- DISCUSIÓN
71
DISCUSIÓN
1- Distintos factores dificultan el aislamiento de mutantes partenocárpicos.
En nuestro planteamiento inicial sugeríamos la existencia de funciones represoras
respecto al desarrollo del fruto en ausencia de fertilización como uno de los mecanismos
de control de la fructificación, lo cual debería reflejarse en la aparición de mutaciones
causantes de partenocarpia con carácter recesivo. Así, el desarrollo del fruto estaría
reprimido en ausencia de ciertas señales inductoras propiciadas por la fertilización. Se
originaría partenocarpia cuando se produjera una desconexión entre ambos procesos,
fertilización y fructificación, que podría provocarse mediante mutaciones en los genes
que ejercen las funciones represoras o amortiguadoras. Esta concepción se ve apoyada
por la existencia de diversas mutaciones que provocan partenocarpia con carácter
monogénico y recesivo, como en algunos mutantes espontáneos de especies agrícolas
(Fos y Nuez, 1997; Fos et al., 2000; Yiao et al., 2001), o en el mutante inducido fwf de
Arabidopsis (Vivian-Smith et al., 2001).
Con este planteamiento, se diseñó una estrategia de mutagénesis química sobre un
fondo genético androestéril condicional de Arabidopsis, generando una colección de
semillas mutagenizadas que nos permitiera detectar este tipo de mutaciones y contribuir
a desentrañar el fenómeno de la partenocarpia desde una perspectiva genética. El
correspondiente escrutinio nos permitió aislar una estirpe, pau, que presenta
partenocarpia con carácter facultativo.
Desde el inicio del presente trabajo, hemos realizado un considerable esfuerzo de
mutagénesis y escrutinio, identificando muy pocas plantas candidatas a portar lesiones
moleculares que ocasionen partenocarpia. Nuestro diseño experimental y la naturaleza
del mutágeno utilizado suponen de por sí una restricción, ya que resulta poco probable
encontrar con este enfoque mutaciones que no sean recesivas y de pérdida de función.
Una estrategia complementaria es la mutagénesis de plantas silvestres mediante
activación por inserción (activation tagging), generando plantas portadoras de
promotores constitutivos que provoquen la sobreexpresión de los genes afectados
(Marsch-Martínez et al., 2002; Nakazawa et al., 2003). Esta aproximación ya ha sido
utilizada por otros autores, y ha permitido observar crecimiento partenocárpico debido a
72
III- DISCUSIÓN
la sobreexpresión de un citocromo P450 presuntamente implicado en la producción de
auxinas (Ito y Meyerowitz, 2000).
Aún así, resulta llamativo el bajo número de mutantes aislados en nuestro
escrutinio, aunque es congruente con la escasez de mutantes de este tipo descritos hasta
la fecha. De hecho, en Arabidopsis existe solamente un ejemplo descrito en la
bibliografía en el que una mutación recesiva, fwf, provoca partenocarpia con caracter
facultativo (Vivian-Smith et al., 2001). Las razones por las cuales se aíslan tan pocos
individuos con las características deseadas pueden ser muy diversas. A pesar de los
ejemplos existentes de mutantes espontáneos en variedades cultivadas, los productos
génicos que reprimen el desarrollo del fruto en Arabidopsis podrían ser escasos, o bien
su eliminación tener efectos deletéreos sobre las plantas. Además, la existencia de genes
cuyas mutaciones determinan simultáneamente un comportamiento aparentemente
partenocárpico y esterilidad serían difíciles de propagar, resultando su estudio muy
laborioso. Durante el escrutinio realizado se identificaron varias plantas con estas
características.
Otro factor a tener en cuenta es el grado importante de solapamiento funcional que
afecta a muchos procesos biológicos en las plantas, y que podría impedir la aparición de
un fenotipo evidente por la perturbación de una única función génica. Por ejemplo, el
gen FWF codifica el factor de transcripción ARF8 (Vivian-Smith, 2000), perteneciente
a una familia génica de 23 miembros. Se ha comprobado que, para la mayoría de ellos,
la pérdida completa de función no induce ningún defecto fenotípico aparente (Okushima
et al., 2005). La suma de lesiones en distintos genes para solventar este impedimento
podría tener un efecto deletéreo.
Por último, es concebible que el crecimiento partenocárpico sea debido, en parte, a
causas multifactoriales cuya disección no estaba prevista en el presente trabajo.
2- La mutación zpl altera la dirección del crecimiento celular en el exocarpo.
La mutagénesis química efectuada sobre el mutante androestéril condicional cer6-2
(Fiebig et al., 2000; Preuss et al., 1993) tenía como objetivo fundamental la
identificación de mutantes partenocárpicos. Sin embargo, era obvia la posibilidad de
aislar simultáneamente mutantes con un desarrollo aberrante del gineceo durante el
mismo escrutinio. Así, la línea 71-1, portadora de las mutaciones zpl y cer6-2 en
homocigosis, fue seleccionada por presentar pistilos más cortos y más anchos que los de
la estirpe mutante parental en condiciones que impedían la polinización. Tras eliminar
III- DISCUSIÓN
73
la mutación cer6-2 mediante sucesivos cruzamientos con el ecotipo Ler, pudimos
comprobar que este fenotipo se mantiene, siendo observable en el pistilo y
posteriormente en el fruto.
La disminución de la longitud de las células del exocarpo parece estar involucrada
en la supresión del crecimiento longitudinal del gineceo en el mutante zpl. Se sabe que
los pistilos sin polinizar de las plantas silvestres experimentan un ligero crecimiento tras
la fase de antesis y antes del inicio de su senescencia, que se refleja en el aumento del
tamaño de las células del exocarpo (Vivian-Smith, 2000). Es probable que la reducción
de la longitud del pistilo observada en las plantas cer6-2 zpl (Fig. III-2), o tras
emascular flores del mutante simple zpl, se deba a la abolición total o parcial de este
alargamiento final. Sin embargo, la diferencia de tamaño es mucho más notable cuando
se comparan frutos silvestres Ler y zpl totalmente desarrollados (Fig. III-3). Durante el
desarrollo normal del fruto tras la fertilización, la mayor contribución a su crecimiento
longitudinal es el aumento del tamaño de las células del ovario; solamente en las
primeras fases tienen lugar divisiones celulares (Ferrándiz et al., 1999). Por este motivo,
resulta plausible que el crecimiento celular postfertilización también esté restringido
parcialmente en el mutante zpl, resaltando en mayor medida el acortamiento del
gineceo.
El incremento del crecimiento radial del gineceo en el mutante zpl no se refleja en
un aumento del número de células en el plano transversal, por lo que dichas células
deben tener un tamaño mayor como promedio. Por tanto, la alteración de las
proporciones del fruto en este mutante parece deberse a un cambio en la dirección de
crecimiento de las células del ovario, al menos en lo que respecta al exocarpo, cuya
anchura aumenta en detrimento de su longitud. Las ondulaciones que muestran las
valvas en muchos frutos zpl podrían estar causadas por la irregularidad en el tamaño de
las células del exocarpo y su disposición un tanto desordenada, lo que generaría
tensiones o compresiones en determinadas áreas de la valva. Además, algunas de estas
células presentan un gran tamaño en el eje radial, rasgo que también podría contribuir al
fenotipo.
3- ZPL interviene en la función de los meristemos.
Una característica destacable de las plantas mutantes zpl es la presencia de valvas
supernumerarias en una cierta proporción de ovarios. Este rasgo también aparece,
aunque con mayor penetrancia, en los mutantes de pérdida de función de los genes
74
III- DISCUSIÓN
CLAVATA (CLV), en los que se ha demostrado que la producción masiva de células
indiferenciadas en el meristemo floral provoca la formación de frutos con más de dos
valvas (Clark et al., 1993 y 1995; Kayes y Clark, 1998). Este fenotipo tendría, por tanto,
un origen muy temprano durante el desarrollo del gineceo que se remonta a la
organización del meristemo floral, predeterminando la estructura del fruto tras la
fertilización; por tanto, la función de ZPL sería necesaria durante los estadios iniciales
de la ontogenia del pistilo para el correcto desarrollo de este órgano.
Asimismo, los errores de filotaxia que presentan las plantas zpl son otro indicio de
la implicación de ZPL en la función del meristemo de inflorescencia, puesto que la
posición y el momento en el que se forman los primordios de los órganos laterales se
establecen en el meristemo (Jackson y Hake, 1999; Steeves y Sussex, 1989).
4- La formación de valvas incompletas en zpl sugiere la implicación de ZPL en
la especificación de la identidad de las células del ovario.
La aparición de valvas extra incompletas en la región apical de algunos frutos zpl
requiere que la expresión de genes que especifican la identidad del replum y el margen
de valva, como RPL o SHP, se inicie dentro del territorio correspondiente a la valva.
Esto podría provocar la aparición de dichas estructuras, aislando un fragmento de valva
para dar lugar a una valva nueva (Fig. III-16). Previamente, debería producirse en esas
regiones un descenso de la expresión de genes específicos de la valva, como FUL. La
presencia de repla incompletos en algunas silicuas mutantes, sin zonas de margen y con
Fig. III-16. Hipótesis acerca de la aparición de valvas extra incompletas en los frutos zpl. La
expresión de genes del replum (en verde) y/o las zonas de dehiscencia en la valva termina generando
una valva incompleta.
estomas intercalados, podría deberse al solapamiento de señales de identidad de valva y
de identidad de replum. En cualquier caso, estas características suponen un indicio de
que la mutación zpl puede afectar a la adquisición de destino de las células del gineceo.
III- DISCUSIÓN
75
El estudio de la expresión de genes como FUL, RPL y SHP en estadios tempranos del
desarrollo del pistilo en el mutante zpl permitirá comprobar esta hipótesis.
5- El efecto de la mutación zpl es parcialmente independiente de la actividad
FUL.
El doble mutante zpl ful-1 presenta frutos de morfología Ful pero con una longitud
reducida respecto al mutante simple ful. Dado que la función de FUL es necesaria para
la adquisición de la identidad de valva por parte de las células correspondientes en el
ovario (Gu et al., 1998; Dinneny y Yanofsky, 2004), este resultado indica que el efecto
de la mutación zpl sobre la longitud del gineceo es independiente de la identidad que
adquieran dichas células, provocando el acortamiento del fruto en cualquier
circunstancia. Una posible explicación para este resultado es que la pérdida de función
del gen ZPL provoque la reducción del crecimiento longitudinal de todos los tipos
celulares del gineceo, de forma que aunque las células de la valva adquieran identidad
del margen de valva su longitud disminuya por efecto de la falta de función ZPL. El
hecho de que en el mutante simple zpl el tamaño del replum mantenga las proporciones
adecuadas, sin sufrir distorsiones espaciales como ocurre en ful (Gu et al., 1998), parece
apoyar esta hipótesis, ya que implica que la longitud del replum disminuye de manera
proporcional a la de las valvas. El estudio detallado de los frutos del doble mutante
zpl ful-1 permitirá establecer cuál es la base celular de su fenotipo. Asimismo, será
necesario determinar cómo afecta la pérdida de función de ZPL al tamaño de las células
del replum y el margen de la valva.
Por otra parte, hemos descrito que el crecimiento radial de las silicuas zpl ful es
similar al observado en el mutante simple ful. La función de FUL parece ser, por tanto,
necesaria para que se produzca el incremento en el crecimiento radial del gineceo. Es
posible que las células de la región correspondiente a la valva en ful, que adquieren
identidad de margen de valva (Gu et al., 1998), no tengan la capacidad de aumentar su
tamaño, y por tanto el grosor de la silicua permanece invariable en las plantas zpl ful
con respecto a las del mutante simple ful.
6- ZPL y CRC participan en procesos complementarios durante el desarrollo
del fruto.
El gen CRC promueve el crecimiento longitudinal del gineceo y restringe su
crecimiento radial, como pone de manifiesto el fenotipo de los mutantes de pérdida de
76
III- DISCUSIÓN
función en este gen, cuyos frutos son cortos y anchos (Álvarez y Smyth, 1999 y 2002;
Bowman y Smyth, 1999). Estos defectos en la morfología del gineceo del mutante crc,
que son detectables en estadios muy tempranos de su desarrollo, se deben a una
alteración de la orientación de las divisiones celulares, lo que provoca el incremento del
número de células en el plano radial y su disminución a lo largo del eje longitudinal del
fruto (Álvarez y Smyth, 2002). En cambio, el fenotipo de los frutos zpl, aunque es
similar, parece ser debido principalmente a un cambio en la dirección del crecimiento
celular en el ovario. Por tanto, no resulta sorprendente la relación de aditividad
observada en los frutos del doble mutante zpl crc-1, ya que están aparentemente
involucrados en procesos diferentes cuya sincronización debe ser necesaria para
conseguir la morfología y las dimensiones normales del gineceo. Además, la
manifestación de características fenotípicas exclusivas de cada mutante simple (como la
carencia de nectarios y los fallos de fusión apical en crc) sugiere la participación
adicional de cada uno de estos genes en otros procesos de desarrollo sin ninguna
relación aparente entre sí.
Por otra parte, un resultado colateral de esta Tesis ha sido la detección de la
expresión transcripcional del gen CRC, cuya función se consideraba restringida al
gineceo, en el meristemo de inflorescencia. Esto que sugiere que CRC desempeña un
papel en el desarrollo o en el funcionamiento de dicha estructura. La ausencia de un
fenotipo relacionado con el meristemo asociado a las mutaciones crc probablemente sea
debida a la existencia de redundancia funcional con otras actividades génicas en el
meristemo que, sin embargo, no participan en el desarrollo del pistilo.
7- La mutación zpl parece afectar a la región reguladora situada entre los
genes At5g16210 y At5g16220.
La cartografía posicional de alta resolución que hemos llevado a cabo ha permitido
situar la mutación zpl en un estrecho intervalo de 7.300 pb que incluye únicamente dos
genes, At5g16210 y At5g16220. No hemos encontrado ninguna alteración en la
secuencia de la región codificante de estos genes en el mutante zpl, por lo que cabe
esperar que la mutación se encuentre en la región que los separa y que podría contener
secuencias reguladoras implicadas en el control de la expresión de cualquiera de los dos.
La secuenciación de esta región contribuirá a la identificación de la mutación
responsable. Además, hemos iniciado la elaboración de construcciones para intentar el
rescate fenotípico de plantas mutantes zpl mediante la transformación con las versiones
III- DISCUSIÓN
77
silvestres de ambos genes y sus regiones reguladoras. También estamos analizando el
fenotipo de plantas portadoras de inserciones de T-DNA en la región codificante de los
genes At5g16210 y At5g16220, y que generan presumibles mutaciones nulas. Estos
experimentos permitirán establecer con certeza la identidad del gen afectado por la
mutación zpl.
Aunque se desconoce la función de los genes candidatos, los dominios que
presentan las respectivas proteínas según las predicciones de las bases de datos permiten
especular acerca del papel que desempeñan.
7.1- At5g16210 codifica una proteína presuntamente involucrada en la
dinámica del citoesqueleto.
El gen At5g16210 codifica un polipéptido con 7 motivos HEAT, cuyo nombre
proviene de cuatro proteínas en las que se ha encontrado (Huntingtina, elongation factor
3, subunidad α de la fosfatasa 2A y TOR1; Andrade y Bork, 1995). El motivo HEAT se
caracteriza por contener repeticiones de aminoácidos hidrofóbicos organizados en dos
α-hélices, que generan un lugar de unión de sustratos y otros componentes moleculares,
generalmente proteínas (Neuwald y Hirano, 2000). Se conocen numerosas proteínas que
contienen este tipo de motivos, y sus funciones pueden ser diversas, como la
participación en complejos involucrados en funciones cromosómicas o el transporte
intracelular de proteínas mediado por los sistemas de endomembranas (Andrade y Bork,
1995; Neuwald y Hirano, 2000). También existen varias de estas proteínas que actúan
en asociación con el citoesqueleto, en particular con los microtúbulos (Inoue et al.,
2000; Lemos et al., 2000; Ohkura et al., 2001; Shoji et al., 2004). En algunos casos,
como las proteínas MAP (Mitotic associated protein), la presencia de múltiples motivos
HEAT permite la participación de estas moléculas en complejos de estructura modular,
uniéndose simultáneamente a los microtúbulos y a diferentes proteínas reguladoras, de
forma que las actividades que desempeñan pueden ser muy diversas, dependiendo de las
moléculas a las que se asocien (Ohkura et al., 2001).
Al margen de las repeticiones HEAT, la proteína que codifica el gen At5g16210
presenta otros motivos estructurales de función conocida, varios de ellos relacionados
con la dinámica y el mantenimiento del citoesqueleto. Por una parte, presenta cierta
homología con la familia de los filamentos intermedios, que son componentes
primordiales del citoesqueleto (Quinlan et al., 1995). Además, tiene dos dominios LisH
(Lissencephaly1-homology), que aparecen en proteínas involucradas en la regulación de
78
III- DISCUSIÓN
la dinámica de los microtúbulos (Emes y Ponting, 2001), y una repetición de tipo
armadillo, relacionada con proteínas que intervienen en la comunicación intracelular y
la regulación del citoesqueleto (Coates, 2003).
La presencia de diversos dominios relacionados con la función del citoesqueleto,
además de los motivos HEAT, sugieren que esta proteína actúa como nexo entre los
microtúbulos y otras moléculas reguladoras de identidad desconocida, formando
complejos de funciones diversas implicados en la dinámica del citoesqueleto. Resulta
verosímil que una perturbación en los niveles de expresión de una proteína de este tipo
esté involucrada en el fenotipo del mutante zpl, dado que dicho fenotipo parece estar, al
menos en parte, causado por alteraciones en la dirección del crecimiento celular, con el
que están estrechamente relacionados el desarrollo y la regulación del citoesqueleto.
7.2- La función de At5g16220 no puede deducirse a partir de sus dominios
estructurales.
El gen At5g16220 codifica una proteína con dominio PB1 (Phox/Bem1p), cuya
función es la formación de homodímeros o heterodímeros con otras proteínas con
domino PB1 (Ito et al., 2001). Este dominio se encuentra en una gran variedad de
proteínas de señalización, como las que dan nombre al dominio: p67phox, una oxidasa
presente en los neutrófilos humanos (Leto et al., 1990), y Bem1p, una proteína asociada
al citoesqueleto involucrada en la polarización celular en levaduras (Chenevert et al.,
1992). La diversidad de funciones que presentan las proteínas con dominio PB1
conocidas hasta la fecha no permite extraer conclusiones definitivas acerca de la posible
función de At5g16220. Además del motivo PB1, contiene un dominio Xrcc1
involucrado en la reparación de DNA de cadena sencilla (Marintchev et al., 1999), y
una región que presenta homología con la familia de la extensina-2. Las glicoproteínas
de la familia de las extensinas participan en el autoensamblaje de la pared celular, y en
la expansión y fijación de la forma final de la célula (Hall y Cannon, 2002). Esta última
función podría relacionarse con el fenotipo del mutante zpl, aunque no sea posible
determinar claramente su actividad.
8- El estudio transcriptómico sugiere alteraciones en la composición de la
membrana y la pared celular en el mutante zpl.
Aunque será necesario llevar a cabo nuevas réplicas del experimento realizado con
micromatrices de DNA, con un estudio estadístico que permita establecer si los
III- DISCUSIÓN
79
resultados obtenidos son significativos, es posible hacer algunas observaciones acerca
de los cambios en los niveles de expresión de algunos genes provocados por la
mutación zpl.
Puesto que el fenotipo observado en las silicuas de las plantas mutantes zpl parece
estar causado por una distorsión de la dirección de crecimiento de las células, es
destacable la alteración de los niveles de expresión en el mutante de algunos genes que
podrían estar implicados en este proceso. Por una parte, la sobreexpresión de proteínas
de membrana podría indicar alteraciones en la percepción de señales procedentes del
entorno, importantes para determinar la forma que va a adquirir la célula en
crecimiento. También tiene gran relevancia en este contexto la composición y la
dinámica de la pared celular rígida que rodea y da forma a las células vegetales. Las
ligninas son componentes de la pared en algunos tipos celulares, contribuyendo
fundamentalmente a aumentar la rigidez de la misma (Raven et al., 1992). Las pectinas
son también un componente importante de la pared celular, y están implicadas en la
cohesión entre las células (Knox, 1992; Willats et al., 2001), por lo que la represión en
el mutante zpl de una enzima pectinesterasa podría indicar algún tipo de alteración en la
unión intercelular. Además, encontramos elevados niveles de expresión de una proteína
de membrana relacionada con la adhesión celular, lo que parece apuntar en esa misma
dirección. Por último, la presencia de un gen que codifica la profilina 3 entre aquéllos
que se sobreexpresan en las inflorescencias zpl resultaría muy coherente si se confirma
que el gen afectado por la mutación es At5g16210, ya que ambos están involucrados,
aparentemente, en la organización del citoesqueleto (Dos Remedios et al., 2003).
Cabe mencionar que, puesto que ninguno de los dos genes candidatos a estar
afectados por la mutación zpl (At5g16210 y At5g16220) es un factor de transcripción,
los cambios en los niveles de expresión detectados mediante este experimento no son
probablemente un efecto directo de la mutación, sino más bien una respuesta indirecta
y/o compensatoria a las alteraciones que ésta provoca.
IV
Estudio de las funciones de
AS1 y KNAT1/BP en el desarrollo del
gineceo de Arabidopsis thaliana
IV- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
83
ANTECEDENTES Y OBJETIVOS.
Se han identificado numerosos mutantes en Arabidopsis que muestran alteraciones
en el desarrollo del gineceo, muchos de los cuales presentan efectos pleiotrópicos en
varios aspectos del desarrollo vegetal (Ferrándiz et al., 1999). El análisis de estos
mutantes y de los correspondientes genes afectados está produciendo grandes avances
en el esclarecimiento de la naturaleza molecular de los factores que intervienen en la
morfogénesis del carpelo y del fruto. No obstante, nuestra comprensión del proceso es
aún muy limitada, especialmente en lo referente a las interacciones entre los distintos
productos génicos que determinan la arquitectura final de este órgano.
Un gen importante para el desarrollo del fruto es FRUITFULL (FUL; Gu et al.,
1998), que codifica un factor de transcripción de la familia MADS-box cuya función es
necesaria para el correcto crecimiento y diferenciación de las células de la valva. La
proteína FUL impide la expresión en las valvas de genes específicos de la zona de
dehiscencia y el margen de la valva, como SHATTERPROOF1 (SHP1), SHP2,
ALCATRAZ (ALC) e INDEHISCENT (IND; Ferrándiz et al., 2000; Rajani y Sundaresan,
2001; Liljegren et al., 2004). Las células de la valva adoptan identidad de margen de
valva en los mutantes ful, lo que provoca una reducción de la longitud final de la silicua,
adoptando el replum una conformación en zigzag en respuesta a las tensiones mecánicas
que ello genera.
La pérdida de función de IND suprime en gran medida el fenotipo ful, efecto que es
aún mayor en el mutante múltiple ful shp1 shp2 ind alc (Liljegren et al., 2004), en el
que la longitud del fruto y su aspecto general se restaura casi por completo. Este
resultado, junto con los estudios de expresión realizados, demuestra que los defectos
descritos para los frutos ful están causados principalmente por la expresión ectópica de
los genes del margen de valva. Sin embargo, algunos trabajos recientes sugieren que
FUL tiene un papel adicional en la especificación de tipos celulares en el fruto, ya que
tanto en el mutante ful como en ful shp1 shp2 ind alc el endocarpo no se diferencia
correctamente (Liljegren et al., 2004). Además, en este quíntuple mutante la longitud
del fruto no se restaura por completo, ni tampoco otros aspectos del fenotipo ful. Otra
posible explicación para estas observaciones es la existencia de genes adicionales
involucrados en la regionalización de los carpelos, cuya expresión pudiera estar también
sujeta al control ejercido por FUL.
84
IV- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
Con el fin de buscar nuevas mutaciones modificadoras del fenotipo Ful, se llevó a
cabo una mutagénesis con EMS sobre semillas ful-1 en el laboratorio del Dr. Martin F.
Yanofsky (Universidad de California, San Diego). Esta estrategia también es apropiada
para la búsqueda de mutaciones que afecten al desarrollo del replum, dado que esta
estructura, que es difícil de observar en el silvestre sin la ayuda de una lupa, se
encuentra ensanchada en el mutante ful. Durante el escrutinio de la población M2 se
aislaron diversas estirpes, presumiblemente dobles mutantes, con un fenotipo diferente
al de ful. Uno de ellos carecía del patrón característico en zigzag que exhibe el replum
de los frutos ful. Esta nueva mutación, a la que se denominó replumless (rpl), provoca
una reducción acusada del replum como consecuencia de la expresión ectópica de los
genes del margen de valva en esa región. La caracterización de esta mutación permitió
identificar el gen RPL y dilucidar su función (Roeder et al., 2003).
En este contexto, y con el fin de aportar más información acerca de nuevas
funciones génicas involucradas en el desarrollo del gineceo, un objetivo de esta Tesis
Doctoral lo constituyó el estudio de una de las estirpes obtenidas en la mutagénesis
anteriormente citada. En su análisis se incluyeron los siguientes aspectos:
1) Caracterización fenotípica macroscópica y microscópica del doble mutante
aislado inicialmente, tanto en lo referente al fruto como a otros órganos que pudieran
verse afectados.
2) Separación de las mutaciones, mediante un cruzamiento con su ancestro silvestre
(Ler), para llevar a cabo la caracterización de los individuos portadores de la nueva
mutación en ausencia de ful.
3) Identificación del gen afectado por la nueva mutación. Comparación del fenotipo
observado con el de otros mutantes caracterizados previamente y realización de ensayos
de complementación para determinar posibles relaciones de alelismo. Si fuera necesario,
cartografía de la mutación para su clonación posicional, y búsqueda de genes candidatos
en las bases de datos.
4) Análisis de las interacciones entre la nueva mutación y alelos mutantes de genes
ya caracterizados, mediante la construcción de diversas combinaciones mutantes y el
estudio de su fenotipo, con el fin de dilucidar la función del gen afectado en el contexto
genético del desarrollo del fruto.
5) Estudios de expresión del gen afectado por la mutación, así como de otros cuya
función pudiera verse alterada indirectamente por la misma.
IV- RESULTADOS
85
RESULTADOS
1- Aislamiento y caracterización del doble mutante 260-4.
El escrutinio de las plantas M2 derivadas de semillas ful-1 mutagenizadas con EMS
permitió identificar un presunto doble mutante, al que denominamos 260-4, cuyos frutos
presentan un replum aún más ancho que el mutante simple y un estilo también mayor,
mientras que el territorio ocupado por las valvas está reducido (Fig. IV-1). Estas
características pueden interpretarse como un incremento del fenotipo Ful, motivo por el
que esta línea fue seleccionada para su estudio detallado como parte de la presente Tesis
Doctoral.
El fenotipo de las plantas 260-4 muestra penetrancia completa, manifestándose en
todos los frutos de todas las plantas de la generación M3 (descendientes por
autopolinización del individuo aislado inicialmente). Estas plantas son tan fértiles como
el mutante ful-1, en el que el número de semillas parece estar limitado únicamente por la
menor longitud de la silicua (Gu et al., 1999), permitiendo la amplificación de las
semillas de forma autógama y la realización de cruzamientos con otras estirpes.
1.1- Las silicuas en 260-4 presentan el replum ensanchado y las valvas
reducidas.
Las valvas en las silicuas del presunto doble mutante 260-4 son considerablemente
más estrechas y más cortas que en el mutante simple ful-1 (Fig. IV-1). La región apical
del fruto que deberían ocupar las valvas parece adquirir identidad de estilo, ya que esta
estructura es mayor en las silicuas 260-4 (Fig. IV-1D). El replum, en cambio, se
encuentra claramente ensanchado en las plantas 260-4 (Fig. IV-1E y F). Además, las
micrografías electrónicas de barrido de estas silicuas muestran una distribución alterada
de las células epidérmicas de la superficie del replum. Mientras que en el mutante
simple ful-1 estas células se organizan formando un patrón regular en zigzag
(Fig. IV-1B; Gu et al., 1999), en las silicuas 260-4 esta disposición se ve perturbada por
depresiones y protuberancias (Fig. IV-1E).
Se realizaron cortes histológicos transversales del ovario para caracterizar de forma
más precisa el fenotipo de los frutos 260-4. Puesto que la mutación ful-1 está causada
por un elemento transponible Ds portador de una construcción con el gen testigo GUS
(Ds-GUS; Gu et al., 1998; Sundaresan et al., 1995), pudimos analizar en esos mismos
86
IV- RESULTADOS
cortes histológicos el dominio de expresión de FUL en los frutos del mutante simple
ful-1 y de la línea 260-4. Como se ha descrito en trabajos anteriores, el dominio de
expresión de FUL en las silicuas silvestres coincide con la región correspondiente a las
valvas (Gu et al., 1998), donde ejerce su función como represor de genes del margen de
la valva (Dinneny y Yanofsky, 2004; Liljegren et al., 2004). Aunque en el mutante
simple ful-1 no hay función FUL y las valvas están muy alteradas, la expresión del gen
GUS se mantiene en la posición esperada. El patrón de expresión no cambia en los
frutos 260-4, pero pone de manifiesto de forma muy evidente en estos cortes
histológicos la drástica reducción de tamaño que sufre la región correspondiente a la
valva, y el incremento de anchura del replum (Fig. IV-1C y F).
Fig. IV-1. Silicuas ful-1 (A-C) y 260-4 (D-F). A y D: fotos en fresco mostrando la región
correspondiente a la valva. B y E: micrografías electrónicas de barrido mostrando el replum. C y F:
cortes transversales del ovario mostrando la expresión del gen testigo GUS bajo el control del
promotor de FUL. Barras de escala: 1 mm (A y D) y 200 µm (B, C, E y F).
1.2- Las plantas 260-4 muestran rasgos similares a los mutantes asymmetric
leaves 1 (as1).
Las plantas 260-4 muestran, al margen de los defectos descritos en el fruto, otro
fenotipo muy evidente, consistente en una roseta muy compacta con hojas de peciolo
corto en las que el margen foliar se curva hacia el envés, y cuyo limbo adopta forma
triangular (Fig. IV-2). Algunas de estas hojas vegetativas están lobuladas en la base.
Además, las hojas caulinares también están curvadas, y los sépalos y los pétalos son
cortos y se curvan hacia el envés (datos no mostrados). Estos fenotipos son coincidentes
con los descritos para as1, un mutante clásico afectado en la morfología foliar, pero del
IV- RESULTADOS
87
que no se habían descrito fenotipos alterados en el fruto (Fig. IV-2; Byrne et al., 2000;
Redei y Hirono, 1964; Redei, 1965; Reinholz, 1947; Serrano-Cartagena et al., 1999).
Fig. IV-2. Rosetas de 19 días ful-1 (A, con fenotipo silvestre), 260-4 (B) y as1-1 (C). Barras de
escala: 2 mm.
2- La línea 260-4 es un doble mutante as1 ful-1.
Dada la similitud observada entre nuestras plantas y los mutantes as1 en
determinados aspectos fenotípicos, aplicamos varias estrategias simultáneamente para
comprobar si la línea 260-4 era homocigótica para un alelo de pérdida de función del
gen AS1.
En primer lugar, llevamos a cabo cruzamientos entre plantas 260-4 y el acceso Ler,
que es el fondo genético en el que se encuentra el mutante ful-1 y, por tanto, también la
línea 260-4. Todas las plantas de la generación F1 mostraron fenotipo silvestre, mientras
que en la generación F2 segregaron plantas silvestres, plantas ful-1, plantas con fenotipo
As1 y plantas 260-4, aproximadamente en las proporciones esperadas para dos
mutaciones independientes con carácter monogénico y recesivo (9:3:3:1; Tabla IV-1).
Con el fin de confirmar la presencia en nuestras plantas de una mutación en el gen
AS1, realizamos una serie de cruzamientos con el mutante as1-1, portador del alelo más
utilizado en estudios anteriores. Se obtuvo mediante mutagénesis con rayos X sobre
semillas del ecotipo Col-1, y se ha descrito como un alelo de pérdida de función,
presumiblemente nulo, que se comporta de forma recesiva (Byrne et al., 2000; Ori et
al., 2000; Redei y Hirono, 1964). Se cruzó el mutante simple ful-1 con as1-1. Puesto
que ambas mutaciones son recesivas, todas las plantas F1 mostraron fenotipo silvestre.
En la generación F2 se encontraron plantas cuyos frutos mostraban un fenotipo idéntico
al observado en 260-4, con una frecuencia cercana a 1/16 (Tabla IV-1).
88
IV- RESULTADOS
De forma simultánea a los experimentos anteriores, cruzamos plantas 260-4 con el
mutante as1-1. Todas las plantas de la generación F1 presentaron fenotipo As1. En la
generación F2 de este cruzamiento, todas las plantas mostraron fenotipo As1 en la
roseta, y los frutos de aproximadamente 1/4 de ellas fueron similares a los de las plantas
260-4 (Tabla IV-1), con algunas pequeñas variaciones causadas por la presencia o
ausencia de la mutación erecta (er), que está presente en homocigosis en el ecotipo Ler
y afecta al porte de la planta y a algunos aspectos de la morfología del fruto (Torii et al.,
1996; Tsukaya et al., 1993 y 1995). Estas observaciones son compatibles con una
situación de ausencia de complementación entre as-1 y la mutación acompañante a ful-1
en la estirpe 260-4, lo que indica, junto a los resultados anteriores, que las plantas 260-4
son homocigóticas para un alelo de pérdida de función de AS1. El fenotipo observado en
los frutos 260-4 sugiere, por tanto, que el gen AS1 está implicado en el desarrollo del
gineceo.
Tabla IV-1. Segregaciones fenotípicas obtenidas en la descendencia de distintos cruzamientos. Se indica
la segregación que más se ajusta a los resultados, junto con el valor de χ2.
Fenotipo F2
Fenotipo
Cruzamiento
260-4 x Ler
ful-1 x as1-1
260-4 x as1-1
F1
Silvestre
Silvestre
As1
Silvestre
69
62
0
As1
21
19
86
Ful-1
25
23
0
260-4
5
4
22
Segregación
χ2
9:3:3:1
9:3:3:1
3:1
0,583
2,63
1,24
3- Caracterización molecular de as1-104, un nuevo alelo de pérdida de función
del gen AS1.
El gen AS1 está situado en el cromosoma 2, en el locus At2g37630 (Byrne et al.,
2000). Codifica un factor de transcripción con un dominio MYB de unión a DNA, y
presenta una elevada homología con los genes PHANTASTICA (PHAN; Waites y
Hudson, 1995) de Antirrhinum y ROUGH SHEATH2 (RS2; Schneeberger et al., 1998)
de maíz. Es un gen relativamente pequeño, con 1106 pb, y carece de intrones (Byrne et
al., 2000). Para comprobar definitivamente la identidad del gen afectado por la
mutación en 260-4, obtuvimos la secuencia completa de AS1 en estas plantas. Esto
permitió detectar un codón de parada de la traducción prematuro, provocado por una
transición de guanina a adenina en el nucleótido 242. Denominamos as1-104 a este
nuevo alelo de AS1, que es presumiblemente nulo dado que la mutación identificada
genera una proteína truncada con tan sólo 81 aminoácidos de los 367 que componen la
versión silvestre, lo que elimina incluso parte del dominio MYB (Fig. IV-3). Además,
IV- RESULTADOS
89
los fenotipos observados tras eliminar la mutación ful-1 mediante un cruzamiento con el
ecotipo Ler (ver apartado 2) son idénticos a los descritos para el alelo nulo as1-1.
Podemos concluir que las plantas 260-4 son homocigóticas para los alelos ful-1 y
as1-104, y que este último es muy probablemente nulo.
Fig. IV-3. Secuencia de nucleótidos de la región codificante de AS1, y su traducción a aminoácidos.
Se indica la sustitución G por A en el alelo as1-104, que provoca un codón de parada prematuro, y la
posición del nucleótido delecionado en as1-1 (#). La secuencia conservada del dominio MYB está
subrayada (Sun et al., 2002).
4- Caracterización fenotípica de los frutos as1-1.
Los trabajos publicados hasta la fecha no describen la presencia de defectos en el
gineceo de los mutantes as1, si exceptuamos as1-101 que, aunque se ha considerado
también como un alelo de pérdida de función, provoca un efecto muy pleiotrópico y con
alteraciones mucho más severas que los otros alelos estudiados (Sun et al., 2002).
Planteamos inicialmente dos hipótesis para explicar el fenotipo observado en los
frutos 260-4. Por una parte, podría darse una interacción sinérgica entre las mutaciones
as1 y ful, de forma que el mutante simple as1 no presentara ningún fenotipo en el fruto,
pero sí en combinación con ful. En un segundo supuesto, as1 tendría un fenotipo
90
IV- RESULTADOS
modesto en la silicua que resultaría más aparente en presencia del efecto de ful, bien
debido a la aditividad o a la sinergia entre ambas mutaciones. Para contrastar estas
posibilidades, el siguiente paso de nuestro estudio fue el análisis detallado de la
morfología de los frutos del mutante simple as1-1.
Fig. IV-4. Distintos aspectos de
frutos silvestres Col-0 (A-D) y
as1-1 (E-H) en estadio 17. A, B,
E y F: fotografías en fresco de
silicuas Col-0 (A, B) y as1-1 (E,
F). C y G: micrografías
electrónicas de barrido de la
región del replum de frutos Col-0
(C) y as1-1 (G). D y H: cortes
transversales del ovario en Col-0
(D) y as1-1 (H). Las puntas de
flecha señalan los límites entre el
replum y las valvas. Barras de
escala: 2 mm (A y E), 500 µm (B
y F), 100 µm (C, D, G y H).
4.1- El replum está alterado en los frutos del mutante simple as1-1.
La observación a la lupa de frutos frescos del silvestre Col-0 y de as1-1 permitió
detectar algunas diferencias entre ambos. El replum es considerablemente más grande
en el mutante, alcanzando hasta el triple de la anchura que presenta en la silicua
silvestre (Fig. IV-4B, F). Puesto que el replum normal es una estructura de alrededor de
50 µm de ancho, esta diferencia, aunque notable, es difícil de detectar a simple vista, lo
que presumiblemente ha provocado que pase desapercibida en estudios anteriores. Otra
característica de las silicuas as1-1 es el aspecto ondulado de sus valvas, que parecen
ceñirse a las semillas contenidas en el ovario (Fig. IV-4A, E).
IV- RESULTADOS
91
El ensanchamiento del replum resulta aún más evidente en micrografías
electrónicas de barrido (Fig. IV-4C, G), en las que además es posible observar la
presencia de estomas en el replum con cierta frecuencia (Fig. IV-5). En las silicuas
silvestres los estomas sólo aparecen en las valvas, el estilo y el ginóforo (Sessions y
Zambryski, 1995).
Fig. IV-5. Detalle del replum en el silvestre Col-0 (A) y en el mutante as1-1 (B), en la zona central de
silicuas en estadio 17. Las flechas blancas señalan estomas en el replum de as1-1. Barras de escala:
100 µm.
4.2- Las silicuas as1-1 presentan una alteración en el número de células del
replum y de la valva.
Con el fin de averiguar la base celular de los fenotipos observados, llevamos a cabo
cortes histológicos transversales de la zona central del ovario de 10 silicuas Col-0 y 10
silicuas as1-1 en estadio 17. En todos ellos se puede apreciar, de nuevo, el notable
aumento del tamaño del replum en el mutante (Fig. IV-4D, H). Utilizando dichas
secciones transversales, se realizó un recuento del número de células presentes en la
epidermis de las valvas y los repla. Como se refleja en la Fig. IV-6 (compárense las
columnas Col-0 y as1-1), el número de células es considerablemente mayor en el
replum de los frutos as1-1 y, además, estas células son más grandes que en el silvestre
(Fig. IV-4D, H). Sin embargo, en las valvas ocurre lo contrario, presentando el mutante
un número inferior de células (Fig. IV-6).
Estos resultados permiten concluir que en los frutos del mutante simple as1 el
replum se encuentra ensanchado debido a un incremento del número y del tamaño de
sus células. En las valvas, el número de células disminuye respecto al silvestre, lo que
probablemente reduce su tamaño y, por tanto, el espacio disponible en el interior del
92
IV- RESULTADOS
ovario. Las semillas, al crecer, ejercerían cierta presión contra las valvas, deformándolas
ligeramente y causando el aspecto ondulado que se ha descrito previamente
(Fig. IV-4E). En cualquier caso, la reducción del tamaño de la valva en el mutante as1
respecto al silvestre Col-0 es mucho menos acentuada que la que se observa al comparar
los frutos del doble mutante as1 ful con el mutante simple ful (Fig. IV-1C y F). El
fenotipo del doble mutante es más severo de lo que cabría esperar si fuera el resultado
de la suma de los fenotipos de ambos mutantes simples, lo que sugiere una relación de
sinergia entre las mutaciones ful y as1.
Fig. IV-6. Representación gráfica del número de células en la epidermis de la valva y el replum de
distintas líneas silvestres y mutantes, con su desviación estándar. Todas las líneas se encuentran en
fondo ER. El número en la base de cada barra es el valor medio.
5- El patrón de expresión de AS1 en el gineceo es coherente con los fenotipos
observados.
Llevamos a cabo experimentos de hibridación in situ para determinar el patrón de
expresión del gen AS1 en el gineceo de las plantas silvestres Col-0. El mRNA de AS1 se
detectó tanto en la valva como en el replum de estos frutos, aunque en esta última
región la señal fue más débil. En la valva, la señal más intensa se localizó en el
exocarpo y en el endocarpo (Fig. IV-7). También se observó expresión en los haces
vasculares y en el estilo (Fig. IV-7). Este patrón se pudo detectar en gineceos entre los
IV- RESULTADOS
93
estadios 10 a 15, es decir, se establece antes de antesis y permanece invariable durante
el desarrollo del fruto.
El patrón de expresión del gen AS1 en el gineceo resulta coherente con los
fenotipos observados, ya que coincide con las regiones que muestran alteraciones en los
mutantes as1.
Fig. IV-7. Análisis de la expresión de AS1 en silicuas silvestres mediante hibridación in situ. A:
control negativo usando sonda con sentido. B y C: hibridación con sonda antisentido en el ovario (B)
y el estilo (C). Barras de escala: 200 µm.
6- La desrepresión de KNAT1 está implicada en el fenotipo de as1 en el
gineceo.
La función principal de AS1 parece ser la represión de los genes KNAT1, KNAT2 y
KNAT6 en los primordios de los órganos laterales, restringiendo su expresión al
meristemo y permitiendo así la diferenciación celular (Byrne et al., 2000; Hake et al.,
2004; Kerstetter et al., 1994; Ori et al., 2000). De hecho, se ha detectado la expresión
ectópica de estos tres genes KNOX de clase I en las hojas y en los órganos florales del
mutante as1 (Byrne et al., 2000; Ori et al., 2000). Además, la pérdida de función de AS1
provoca fenotipos similares a la sobreexpresión de KNAT1 bajo el control de un
promotor constitutivo 35S (plantas 35S::KNAT1), con hojas lobuladas y asimétricas, de
peciolo corto, cuyo margen se curva hacia el envés, y flores con sépalos y pétalos de
menor longitud. En el caso de las plantas 35S::KNAT1 el fenotipo es más severo, con
hojas más lobuladas que, ocasionalmente, presentan meristemos ectópicos (Chuck et al.,
1996; Lincoln et al., 1994; Ori et al., 2000).
Planteamos varios experimentos para establecer el papel de KNAT1 en el fenotipo
de las silicuas as1. En primer lugar, realizamos un estudio detallado de la morfología de
94
IV- RESULTADOS
la silicua en las plantas 35S::KNAT1 (Lincoln et al., 1994). Observamos que el replum
está ensanchado en estos frutos, por lo que realizamos cortes histológicos transversales
del ovario y llevamos a cabo el recuento del número de células epidérmicas en las
diferentes regiones. Esto permitió establecer que el número de células en el replum es
mayor que en el ecotipo de referencia, mientras que en la valva es inferior (Fig. IV-6).
Los resultados obtenidos son, además, muy similares a los del mutante as1-1. El
ensanchamiento del replum es claramente visible en imágenes de microscopía
electrónica de barrido, así como la presencia de estomas en él, al igual que ocurría en el
mutante as1 (Fig. IV-8).
Fig. IV-8. A-C: micrografías electrónicas de barrido de la región del replum en silicuas Col-0 (A),
35S::KNAT1 (B) y as1-1 bp-1 (C). D: silicuas as1-1 (izquierda) y as1-1 bp-1 (derecha). E: fruto 260-4
(ful-1 as1-104). F: fruto 35S::KNAT1 ful-1. Las flechas blancas señalan estomas en el replum de
35S::KNAT1. Barras de escala: 100 µm (A-C), 0,5 mm (D) y 1 mm (E, F).
Por otra parte, mediante la realización de un cruzamiento obtuvimos plantas
35S::KNAT1 ful-1. Sus frutos muestran un fenotipo muy similar al que se ha descrito
para 260-4 o as1-1 ful-1 en lo referente al tamaño de las valvas y del replum, lo que
resulta coherente con los resultados anteriores (Fig. IV-8E, F).
Así mismo, se construyó el doble mutante as1-1 brevipedicellus-1 (bp-1), siendo
bp-1 un mutante nulo de KNAT1 provocado por la deleción completa del gen (Venglat
et al., 2002). Aunque las silicuas bp-1 no tienen fenotipo aparente, los frutos del doble
mutante as1-1 bp-1 muestran una cierta recuperación del fenotipo silvestre, con repla de
anchura aproximadamente normal (Fig. IV-8C, D), en los que en algunos casos hemos
detectado estomas inmaduros (datos no mostrados). En los cortes histológicos de estos
IV- RESULTADOS
95
frutos se pudo constatar que el número de células tanto del replum como de la valva se
recupera parcialmente (Fig. IV-6).
Todos estos resultados apoyan la hipótesis de que el fenotipo de los frutos as1 se
produce como consecuencia de la desrepresión de KNAT1 y, posiblemente, de otros
genes, dado que la ausencia de función de KNAT1 en el mutante as1 no da lugar a la
recuperación completa del fenotipo silvestre.
Un aspecto sorprendente de las plantas as1 bp examinadas es la suavización del
fenotipo As1 en la roseta (Fig. IV-9), ya que en trabajos anteriores se había descrito que
las hojas de este doble mutante no muestran diferencias significativas respecto a as1
(Byrne et al., 2002; Micol y Hake, 2003). En nuestras condiciones, las hojas vegetativas
de estas plantas presentan un peciolo más largo y el limbo foliar, aunque también está
curvado hacia el envés, adquiere una forma más alargada, aspectos que se asemejan al
fenotipo del mutante simple as2 (Fig. IV-9; Fabri y Schäffner, 1994; Semiarti et al.,
2001; Serrano-Cartagena et al., 1999).
Fig. IV-9. Rosetas as1-1 (A), as1-1 bp-1 (B) y as2-1 (C). Barras de escala: 2 mm.
7- El patrón de expresión de KNAT1 está alterado en el gineceo de los
mutantes as1.
Con el objetivo de definir la función que AS1 y KNAT1 ejercen en el desarrollo del
fruto, estudiamos el patrón de expresión de este gen KNOX en el gineceo. Para ello
utilizamos dos líneas transgénicas de Arabidopsis, KNAT1::GUS-1 y KNAT1::GUS-18,
portadoras de construcciones en las que el gen testigo GUS se expresa bajo el control
del promotor de KNAT1. Se ha descrito en trabajos anteriores que el patrón de expresión
del gen GUS es similar en ambas líneas, pero los niveles son más elevados en las
plantas KNAT1::GUS-18, lo que permite detectar la señal en estructuras donde su
expresión es más débil (Ori et al., 2000). En un fondo silvestre, la expresión en la línea
KNAT1::GUS-1 se localiza en el hipocotilo, el tallo, el meristemo apical y los
96
IV- RESULTADOS
meristemos florales, pero no en las hojas. Sin embargo, en las plantas KNAT1::GUS-18
es posible detectar señal en algunos haces vasculares de los cotiledones y de las hojas
(Ori et al., 2000). En cuanto a las flores, estos autores encuentran expresión en el estilo,
la placenta, los óvulos y el filamento de los estambres. También se ha descrito que la
expresión GUS en plantas as1-1 KNAT1::GUS-18 se localiza, además de en los órganos
mencionados, en los peciolos y los haces vasculares de las hojas, en algunas regiones
del limbo foliar y en los sépalos. La expresión de KNAT1::GUS-1 en el mutante as1-1
no había sido estudiada debido al estrecho ligamiento entre la inserción y el locus AS1,
que dificulta la obtención de estas plantas (Ori et al., 2000).
En primer lugar, estudiamos la expresión de KNAT1 en gineceos silvestres
utilizando ambas líneas. En nuestras condiciones, la expresión del gen GUS en la línea
KNAT1::GUS-1 quedó restringida al estilo, los nectarios y la región más apical del
replum hasta el estadio 15 (Fig. IV-10A y datos no mostrados). La señal fue
progresivamente más débil en frutos en estadios posteriores, hasta ser indetectable. En
cambio, la construcción KNAT1::GUS-18 dio lugar a una señal intensa en la región
correspondiente al replum y al margen de valva desde estadios muy tempranos del
desarrollo del gineceo, permaneciendo invariable hasta el estadio 17 (Fig. IV-10B-D;
Fig. IV-11A-C). También se detectó expresión del gen GUS en el estilo y los nectarios
(datos no mostrados).
Fig. IV-10. A: expresión de KNAT1::GUS-1 en una silicua silvestre en estadio 15. B-D: expresión de
KNAT1::GUS-18 en pistilos silvestres en estadio 10 (B), 11 (C) y 12 (D). E: expresión de
KNAT1::GUS-1 en una silicua as1-1 en estadio 15. F y G: expresión de KNAT1::GUS-18 en pistilos
as1-1 en estadio 11 (F) y 12 (G). Barra de escala: 0,5 mm (A y E) o 200 µm (B-D, F-G).
IV- RESULTADOS
97
Para estudiar la expresión de ambas construcciones en fondo as1-1, fue necesario
en primer lugar obtener plantas as1-1 KNAT1::GUS-1. Para ello se sembraron en placas
con kanamicina 300 individuos de la generación F2 de un cruzamiento entre as1-1 y
KNAT1::GUS-1, de los cuales aproximadamente 3/4 mostraron la resistencia al
antibiótico conferida por la inserción, y sólo una de las rosetas resistentes presentó
fenotipo as1. El patrón de expresión del gen GUS en el gineceo de estas plantas es
similar al del silvestre, pero es posible detectar señal en todo el replum, y ésta persiste
hasta estadios posteriores (Fig. IV-10E). En las plantas as1-1 KNAT1::GUS-18,
suministradas por la Dra. Sarah Hake (Universidad de California, Berkeley), las
diferencias respecto del silvestre son mayores. La expresión del gen testigo abarca todo
el ovario desde los estadios iniciales de su desarrollo, incluyendo las valvas, el septo,
los funículos y los óvulos (Fig. IV-10F y G; Fig. IV-11D-F). La señal se mantiene
después de la fertilización hasta el final del desarrollo de la silicua, aunque desaparece
de las semillas en desarrollo. Por tanto, la pérdida de función del gen AS1 provoca la
expresión ectópica de KNAT1 en todos los territorios del ovario y, a tenor del resultado
obtenido con la línea as1-1 KNAT1::GUS-1, probablemente permite un incremento de
su nivel de expresión en el replum.
Fig. IV-11. Expresión de KNAT1::GUS-18 en secciones transversales de ovarios en distintos estadios.
A-C: ovarios silvestres en estadio 10 (A), 12 (B) y 17 (C). D-F: ovarios as1-1 en estadio 10 (D),
12 (E) y 16 (F). Barras de escala: 50 µm (A, B, D y E) y 100 µm (C y F).
98
IV- RESULTADOS
8- La expresión de RPL se extiende a todo el ovario en las plantas 35S::KNAT1.
El gen REPLUMLESS (RPL), también llamado PENNYWISE (PNY), BELLRINGER
(BLR), o VAAMANA (VAN), es un factor clave para la correcta diferenciación del
replum, ya que reprime la expresión de genes específicos del margen de valva. Los
genes SHP, IND y ALC se expresan ectópicamente en el replum de los mutantes rpl,
provocando una gran reducción de la anchura de esta estructura debido a que adquiere
identidad de margen de valva y, por tanto, el tamaño y el número de las células
epidérmicas es mucho menor de lo normal (Byrne et al., 2003; Liljegren et al., 2004;
Roeder et al., 2003; Smith y Hake, 2003). Por tanto, el aumento de tamaño del replum
provocado por la expresión ectópica de KNAT1 en la valva debería ir precedido por un
incremento del dominio de expresión de RPL, al menos hasta ocupar el área que va a
dar lugar al replum en las plantas as1 o 35S::KNAT1.
Para comprobar este aspecto, llevamos a cabo un estudio de la expresión del gen
RPL, utilizando la línea BLR::GUS (Byrne et al., 2003) y plantas de la generación F1 de
un cruzamiento entre 35S::KNAT1 y BLR::GUS. En las plantas silvestres, la expresión
del gen testigo en el gineceo se restringe al replum, el funículo y los óvulos (Fig.
IV-12A). Sin embargo, sorprendentemente, en las plantas 35S::KNAT1 se observa señal
en todos los tejidos del ovario (Fig. IV-12B).
Fig. IV-12. Expresión de BLR::GUS en secciones transversales de un ovario silvestre (A) y un ovario
35S::KNAT1 (B), en estadio 12. Barras de escala: 100 µm.
Este resultado indica que KNAT1 es capaz de activar la expresión de RPL. Sin
embargo, la presencia de los productos de ambos genes en la valva no es suficiente para
transformarla en replum, lo que sugiere que existen en aquella región actividades
génicas que impiden su actividad. FUL participa probablemente en esta función, ya que
el fenotipo as1 aumenta notablemente en las silicuas del doble mutante as1 ful.
IV- RESULTADOS
99
9- La pérdida de función de AS1 en el mutante rpl restaura el fenotipo
silvestre.
Para profundizar en la interacción entre los genes RPL y KNAT1 en la
especificación de las regiones del gineceo, estudiamos el fenotipo de los frutos del
correspondiente doble mutante bp-9 pny-40126, cedido por la Dra. Sarah Hake
(Universidad de California, Berkeley). El replum presenta el mismo aspecto que en el
mutante simple rpl-1 (Fig. IV-13), lo que, unido a la ausencia de fenotipo en el replum
del mutante bp-1, sugiere que la actividad de KNAT1 no es indispensable para la
función de RPL en la especificación del replum. Este hecho podría explicarse por la
redundancia funcional de genes KNOX de clase I en el replum.
Fig. IV-13. Replum de una silicua bp-1 pny-40126
en estadio 17. Barra de escala: 100 µm.
Fig. IV-14. Detalle
del replum en cortes
transversales
de
frutos en estadio 17.
A: silvestre Col-0.
B: as1-1. C: rpl-1.
D: as1-1 rpl-1. Barras
de escala: 100 µm.
Por otra parte, obtuvimos el doble mutante as1-1 rpl-1 mediante la realización de
un cruzamiento. Los cortes transversales de las silicuas de estas plantas muestran repla
con fenotipos silvestres, tanto en lo referente al número de células como al tamaño de
100
IV- RESULTADOS
éstas (Fig. IV-14). Este rescate fenotípico indica que la transformación del replum en
margen de valva que tiene lugar en el mutante rpl está mediada por la función de AS1.
En la valva del doble mutante as1-1 rpl-1, en cambio, el número de células es
similar al que presentan los frutos as1 (datos no mostrados). Por tanto, ese fenotipo no
se debe a la expresión ectópica de RPL en la valva del mutante as1, sino a algún otro
efecto de KNAT1 en esta región.
10- AS2 también interviene en la formación de la silicua.
Se ha descrito en trabajos anteriores que la pérdida de función del factor de
transcripción AS2 tiene efectos fenotípicos similares a los que provocan las mutaciones
en AS1 (Fabri y Schäffner, 1994; Serrano-Cartagena et al., 1999). Además, en los
mutantes as2 también se ha detectado la expresión ectópica de genes KNOX de clase I
(Ori et al., 2000; Semiarti et al., 2001), y existen indicios de que AS1 y AS2
interaccionan físicamente para reprimir la expresión de KNAT1, KNAT2 y KNAT6 en las
hojas, lo que explicaría la similitud de los fenotipos mutantes (Xu et al., 2003).
Fig. IV-15. A: zona central de una silicua as1-1. B: zona central de una silicua as2-1. C: fruto
35S::KNAT1 ful-1. D: fruto as2-1 ful-1. Todos los frutos están en estadio 17. Barra de escala: 1mm.
El estudio superficial de los frutos del mutante as2-1 reveló un fenotipo muy
similar al observado en los mutantes as1 y en la línea 35S::KNAT1, con un notable
engrosamiento del replum y las valvas onduladas (Fig. IV-15A, B). Generamos además
el doble mutante as2-1 ful-1, cuyas silicuas mostraron un fenotipo equivalente al de los
frutos as1 ful y 35S::KNAT1 ful (Fig. IV-15C, D). Estos resultados sugieren que la
IV- RESULTADOS
101
función de AS2 también es necesaria para una correcta formación del gineceo,
probablemente colaborando con AS1 en la represión de genes KNOX.
11- La pérdida de función de KNAT2 no afecta al fenotipo de la silicua en los
mutantes as1.
El patrón de expresión de KNAT2 ha sido estudiado en trabajos anteriores. En las
plantas silvestres, dicho patrón es muy similar al de KNAT1, salvo que es posible
detectar niveles bajos de expresión en las hojas. En los mutantes as1 también se
comporta de forma parecida a KNAT1, expresándose de forma ectópica en las hojas y en
los sépalos (Byrne et al., 2000 y 2002; Lincoln et al., 1994; Ori et al., 2000; Semiarti et
al., 2001). La pérdida de función de KNAT2 no tiene aparentemente ningún efecto, y
tampoco altera el fenotipo en las hojas del mutante as1 (Byrne et al., 2002). En cambio,
su expresión ectópica bajo el control de un promotor inducible provoca alteraciones
muy similares a los fenotipos vegetativos descritos para las plantas 35S::KNAT1, dando
lugar además a profundas transformaciones en el gineceo (Pautot et al., 2001).
En vista de las características de KNAT2, y dado que además la ausencia de función
de KNAT1 no recupera por completo el fenotipo silvestre en las silicuas as1, decidimos
comprobar si la desrepresión de KNAT2 está implicada en el fenotipo de este mutante.
Utilizamos para ello la línea GT7953, homocigótica para un alelo nulo de KNAT2
provocado por la inserción de una construcción con el transposón Ds, que contiene
además el gen GUS, lo que permite estudiar su patrón de expresión de forma simultánea
(Byrne et al., 2002). Las silicuas de estas plantas knat2 muestran un fenotipo
completamente silvestre (Fig. IV-16A). Obtuvimos plantas as1 knat2 realizando el
cruzamiento entre as1-1 y GT7953, y genotipando mediante PCR plantas con fenotipo
As1 en la generación F2 para identificar aquéllas homocigóticas para la inserción (véase
Materiales y Métodos). Las silicuas de este doble mutante presentan el mismo fenotipo
que el mutante simple as1, con el replum claramente ensanchado (Fig. IV-16B). La
expresión del gen GUS conferida por la inserción resultó muy débil en el gineceo, tanto
en plantas silvestres como as1, excepto en el estigma y los nectarios (datos no
mostrados), impidiendo la extracción de conclusiones.
También generamos el triple mutante as1-1 bp-1 knat2, cruzando para ello los
dobles mutantes as1-1 bp-1 y as1-1 knat2. Tras analizar secciones transversales de sus
silicuas, concluimos que el número de células epidérmicas en el replum y la valva es
102
IV- RESULTADOS
similar al del doble mutante as1-1 bp-1 (Fig. IV-6), y no se observan diferencias que
pudieran estar provocadas por la presencia de la mutación knat2.
Estos resultados parecen indicar que la expresión ectópica de KNAT2 no participa
en el fenotipo descrito para el gineceo de los mutantes as1, o bien que existe
redundancia funcional con otros genes KNOX que enmascaran su efecto.
Fig. IV-16. Silicuas knat2
(A) y as1 knat2 (B). Barras
de escala: 0,5 mm.
12- El patrón de lignificación y la dehiscencia no están alterados en as1.
Los frutos as1 presentan una dehiscencia aparentemente normal; sus valvas se
separan del replum tras el secado de la silicua en el estadio 19, al igual que ocurre en las
silicuas silvestres (Ferrándiz et al., 1999). Para estudiar el patrón de lignificación de la
zona de dehiscencia y la capa enb, obtuvimos cortes de silicuas Col-0 y as1-1 en
estadio 18 y aplicamos una tinción con floroglucinol. Esta sustancia tiñe de color rojo
las ligninas, lo que permite la identificación de las regiones lignificadas. Como puede
apreciarse en la Fig. IV-17, no existen diferencias entre el silvestre y el mutante en
cuanto al patrón de lignificación.
Fig. IV-17. Cortes transversales de frutos Col-0 (A) y as1-1 (B) en estadio 18, teñidos con
floroglucinol. Las valvas se han separado ya del replum en la imagen B, mostrando una dehiscencia
normal. Barras de escala: 500 µm.
IV- RESULTADOS
103
Analizamos el patrón de expresión del gen SHP2 utilizando una línea portadora de
una construcción SHP2::GUS (Savidge et al., 1995). Este gen se expresa
específicamente en el margen de las valvas, determinando la identidad de esta región y
dirigiendo el desarrollo de la zona de dehiscencia (Liljegren et al., 2000 y 2004). No
encontramos diferencias apreciables en el patrón de expresión del gen testigo entre las
plantas silvestres y el mutante as1 (Fig. IV-18), pero esta tinción realza la diferencia de
tamaño entre sus repla (Fig. IV-18C).
Los resultados obtenidos indican que la función del gen AS1 no es imprescindible
para la especificación y la correcta formación del margen de valva y la zona de
dehiscencia, ni para que se produzca la lignificación necesaria para la dehiscencia.
Fig. IV-18. Expresión del gen GUS bajo el control del promotor de SHP2, en silicuas en estadio 15. A
y B: cortes transversales de frutos Col-0 (A) y as1-1 (B). C: región del replum de frutos Col-0
(izquierda) y as1-1 (derecha). Barras de escala: 200 µm (A y B) y 1 mm (C).
13- Los mutantes as1, bp y pny muestran alteraciones en el estilo.
Los frutos de las plantas as1 presentan un estilo de tamaño superior al de los
individuos silvestres (Fig. IV-19). Además, se había descrito en trabajos anteriores que
el estilo en las silicuas bp presenta una morfología anormal, con una sección ovalada en
lugar de circular (Fig. IV-20D; Venglat et al., 2002).
Fig. IV-19. Región del estilo en frutos as1-1 (izquierda) y
Col-0 (derecha). Barra de escala: 0,5 mm.
104
IV- RESULTADOS
Fig. IV-20. Secciones transversales del estilo de frutos Col-0 (A), as1-1 (B), 35S::KNAT1 (C), bp-1
(D), pny-40126 (E), as1-1 bp-1 (F) y bp-9 pny-40126 (G). Todas las líneas están en fondo ER. Barras
de escala: 200 µm.
Con el fin de establecer cuál es la función que ejercen en el desarrollo del estilo los
genes que especifican la morfología del replum, llevamos a cabo cortes histológicos
transversales del estilo de distintas líneas analizadas en esta Tesis. Como se puede
apreciar en la Fig. IV-20B, el estilo de los frutos as1-1 es considerablemente más ancho
que el de su ancestro silvestre Col-0. Al igual que ocurría en el replum, la mutación
bp-1 suprime el fenotipo As1 en estos frutos, ya que el estilo del doble mutante presenta
un tamaño similar al de bp-1 y sección aplanada (Fig. IV-20F). Sin embargo, al
contrario de lo esperado, el estilo en las silicuas de las plantas 35S::KNAT1 muestra un
tamaño aparentemente normal (Fig. IV-20C).
Para comprobar si la función de KNAT1 en el estilo es dependiente de RPL,
estudiamos el fenotipo del mutante simple pny-40126 y del doble mutante
bp-9 pny-40126. Los estilos del mutante pny-40126 muestran un fenotipo muy similar al
de as1-1, siendo más grandes que los del silvestre (Fig. IV-20E), pero en este caso la
mutación bp-1 no rescata el fenotipo. El estilo del doble mutante bp-9 pny-40126
presenta una aparente aditividad de fenotipos, ya que es mayor que en bp-1 pero
conserva el aspecto aplanado (Fig. IV-20G). Estos datos indican que KNAT1 y RPL
probablemente actúan en vías independientes en el estilo.
IV- RESULTADOS
105
14- La mutación er afecta al número de células en la valva y el replum.
Durante nuestro estudio, obtuvimos secciones transversales del ovario de frutos
silvestres del ecotipo Ler, y llevamos a cabo recuentos de células en su superficie
exterior. Al comparar los resultados obtenidos con los observados para Col-0, pudimos
constatar que las silicuas Ler presentan un mayor número de células tanto en la valva
Fig. IV-21. Representación gráfica del número
de células en la epidermis de la valva y el
replum de frutos Col-0 y Ler, con su
desviación estándar. El número en la base de
cada barra es el valor medio.
como en el replum (Fig. IV-21). Las silicuas de este ecotipo son más cortas y más
anchas que en otras estirpes de referencia como Col-0 o La-0, siendo esta última
genéticamente idéntica a Ler, excepto que es homocigótica para el alelo ER. Se ha
descrito que la mutación er tiene un efecto muy pleiotrópico provocado por una
disminución de la tasa de división celular (Tsukaya et al., 1993 y 1995), pero nuestros
resultados indican que dicha tasa no disminuye sino que aumenta en el eje medio-lateral
de las silicuas er, lo que provoca el incremento de anchura. Por este motivo, los
experimentos que se exponen en esta Tesis relacionados con el recuento de células de la
valva y el replum se llevaron a cabo en fondo ER.
IV- DISCUSIÓN
107
DISCUSIÓN
1- La mutagénesis en un fondo ful facilita la identificación de mutantes del
replum.
La ausencia de función del gen FUL provoca un desarrollo postfertilización muy
aberrante en la silicua, que tiene como resultado una importante reducción del tamaño
final del fruto (Gu et al., 1998). La causa principal del fenotipo en los mutantes ful es la
expresión ectópica en la valva de los genes que determinan la identidad del margen de
valva, provocando que adquiera características de esta región (Dinneny y Yanofsky,
2004; Liljegren et al., 2004). Las células de la valva no se expanden, lo que limita el
crecimiento de la valva y, por tanto, del fruto completo. El replum continúa su
desarrollo normal, pero la reducción de la longitud de la silicua obliga a sus células a
adoptar una disposición ondulante para adaptarse al espacio disponible, en lugar de
organizarse en líneas paralelas al eje apical-basal del fruto (Gu et al., 1998). Debido a
esta característica, el replum en los mutantes ful es considerablemente más ancho y más
visible que en las plantas silvestres, aspecto que lo convierte en un fondo muy
apropiado para su utilización en mutagénesis con el objetivo de encontrar nuevas
mutaciones que alteren el desarrollo de esta estructura. Esta aproximación se utilizó en
el trabajo de Roeder et al. (2003) para aislar el doble mutante rpl-1 ful-1, cuyos frutos
muestran una superficie continua en la que tanto las valvas como el replum adquieren
identidad de margen de valva.
En nuestro laboratorio hemos caracterizado el doble mutante 260-4, aislado en la
misma mutagénesis, cuyas silicuas muestran un fenotipo Ful aumentado, con un replum
más ancho y las valvas muy reducidas. Hemos demostrado que estas características se
deben a la ausencia de función del gen AS1, y que los mutantes simples as1 ya
presentan alteraciones en las proporciones de la valva y el replum que no habían sido
observadas anteriormente. La utilización de ful-1 como fondo en la mutagénesis fue
imprescindible para poner de manifiesto este efecto.
2- AS1 y AS2 reprimen la expresión de genes KNOX en el gineceo.
La función de los factores de transcripción AS1 y AS2 ha sido estudiada en
profundidad en trabajos anteriores. Ambos actúan impidiendo la expresión de genes
KNOX de clase I, concretamente KNAT1, KNAT2 y KNAT6, en los primordios de los
108
IV- DISCUSIÓN
órganos laterales, restringiendo su acción al meristemo (Byrne et al., 2000 y 2002; Ori
et al., 2000).
Las alteraciones que presentan los mutantes as1 y as2 en el fruto consisten en un
aumento del número de células en el replum y una reducción en la valva, que provoca
un cambio en las proporciones de estas estructuras. Hemos demostrado, al menos en el
caso de as1, que este fenotipo se debe a la expansión del dominio de expresión de
KNAT1, aunque deben estar implicados otros genes, dado que la pérdida de función de
éste no rescata completamente el fenotipo silvestre en las silicuas as1. Algo similar
ocurre en las rosetas del doble mutante as1 bp: aunque se había descrito que su fenotipo
era idéntico al del mutante simple as1 (Byrne et al., 2002), en nuestras condiciones
parece suavizarse, ya que los peciolos de las hojas son más largos y el limbo foliar, si
bien se curva hacia el envés, tiene una estructura más similar a la de las plantas
silvestres. Esto confiere a las rosetas del doble mutante as1 bp un aspecto parecido a las
del mutante simple as2.
3- Varios genes KNOX podrían actuar de forma redundante en el replum.
La redundancia funcional entre KNAT1 y otros genes KNOX de clase I, entre los
que existe una elevada similitud, podría explicar por qué el mutante bp no presenta
fenotipo en el replum, y por qué el fenotipo silvestre no se recupera por completo en la
roseta y en la silicua de las plantas as1 bp. Las proteínas KNAT1 y STM comparten un
44% de identidad en sus secuencias de aminoácidos, que se eleva hasta el 70% si se
comparan exclusivamente sus homeodominios (Byrne et al., 2002). Entre KNAT2 y
KNAT6 la identidad es del 70%, llegando al 89% entre sus homeodominios (Byrne et
al., 2002), y la expresión constitutiva de cualquiera de ellos provoca en las hojas
vegetativas fenotipos muy similares a los que muestran las plantas 35S::KNAT1 (Dean
et al., 2004; Pautot et al., 2001). La inducción de la expresión de KNAT2 en el gineceo
provoca defectos muy severos, como la formación de nuevos gineceos en lugar de
óvulos (Pautot et al., 2001). Sin embargo, el mutante simple knat2, al igual que bp, no
muestra alteraciones en la morfología del ovario. Además, hemos observado que, en las
silicuas as1, el fenotipo silvestre no se recupera completamente ni siquiera cuando
eliminamos de forma simultánea las funciones de KNAT1 y KNAT2 en ese fondo
mutante.
Estos resultados sugieren que otros genes KNOX de clase I se expresan en el
replum de las plantas silvestres, actuando de forma parcialmente redundante, y son
IV- DISCUSIÓN
109
reprimidos por AS1 en la valva. En las plantas as1, estos genes KNOX se expresarían
ectópicamente en la valva, provocando los fenotipos que se han descrito. El gen STM se
expresa en el replum, y además es capaz de reprimir la expresión de AS1 en el
meristemo (Long et al., 1996; Byrne et al., 2000). Sin embargo, al contrario de lo que
ocurre con KNAT1, AS1 no reprime a STM en los primordios de los órganos laterales,
sino que esta función la llevan a cabo productos génicos de la familia YABBY (Byrne
et al., 2000; Kumaran et al., 2002). Por tanto, no parece probable que el dominio de
expresión de STM se extienda a la valva en el mutante as1, sino que posiblemente STM
sea el responsable de mantener un bajo nivel de expresión de AS1, y quizá de AS2, en el
replum. Una vez descartado STM, KNAT6 parece el candidato más obvio para
expresarse ectópicamente en la valva del mutante as1 junto a KNAT1, y quizá también
KNAT2.
4- El replum presenta características propias del meristemo.
La expresión en el replum de genes que también actúan en el meristemo, como
STM (Long et al., 1996), RPL (Byrne et al., 2003), KNAT2 (Pautot et al., 2001) y
KNAT1 (esta Tesis), sugieren que esta estructura actúa como una región meristemática,
capaz de producir otros tejidos como la placenta y el septo (Long et al., 1996). La
función que estos genes ejercen en el replum es difícil de estudiar en algunos casos, ya
que las mutaciones de pérdida de función pueden provocar la desaparición del
meristemo y, por tanto, la imposibilidad de estudiar el fenotipo del ovario. Es el caso de
los genes CUP-SHAPED COTYLEDON1 (CUC1) y CUC2, que son necesarios de
forma redundante para el establecimiento del meristemo apical en el embrión y también
parecen estar implicados en el desarrollo del replum. El doble mutante cuc1 cuc2
presenta los cotiledones fusionados y carece de meristemo apical del tallo (Aida et al.,
1997), por lo que no es posible estudiar plantas adultas. No obstante, la regeneración de
tallos de este doble mutante mediante técnicas de cultivo in vitro ha permitido observar
que presenta defectos en la formación del septo y del replum, así como en la fusión de
los carpelos (Ishida et al., 2000).
Los carpelos, en cambio, pueden considerarse hojas muy modificadas (Honma y
Goto, 2001), de modo que la expresión en ellos de genes que participan en el desarrollo
foliar, como AS1 y AS2, no resulta sorprendente. Como sugieren nuestros datos, el
antagonismo que existe en el meristemo entre los genes que inducen la diferenciación y
los que mantienen el estado indeterminado también se conserva en el gineceo. Los
110
IV- DISCUSIÓN
patrones de expresión de estos genes se establecen probablemente en el meristemo floral
y se mantienen durante el desarrollo del gineceo.
Resulta llamativo que la expresión de AS1 y KNAT1 sea solapante en el replum, ya
que se trata de genes con actividades antagónicas. Sin embargo, la actividad de AS1 en
el replum es coherente con el fenotipo alterado que muestran en esa región los mutantes
as1. La expresión de AS1 detectada en el replum mediante técnicas de hibridación in
situ parece más débil que la observada en la valva, lo que sugiere que el efecto represor
que ejerce sobre KNAT1 es menor en el replum. La pérdida de función de AS1
probablemente provoca un incremento de los niveles de expresión de KNAT1 en el
replum, como pone de manifiesto el estudio realizado sobre la línea KNAT1::GUS-1,
que da lugar a una señal más intensa en el replum de los frutos as1 (Fig. IV-10E). Por
otra parte, se ha descrito previamente el solapamiento en la expresión de ambos genes
en los límites entre los órganos laterales y el meristemo apical del tallo, donde la acción
conjunta de AS1, AS2 y KNAT1 activa la expresión de LATERAL ORGAN
BOUNDARIES (LOB; Byrne et al., 2002; Shuai et al., 2002). Sería interesante
comprobar si AS2 se expresa en el replum, ya que su ausencia en esta región podría
implicar actividades diferentes de AS1, pero la semejanza entre los fenotipos de los
mutantes as1 y as2 en el ovario, aunque no se ha estudiado en detalle, sugiere que
ambos genes también actúan conjuntamente en este órgano.
5- Los genes AS1 y KNAT1 están implicados en la regionalización del ovario.
Algunos autores han propuesto un modelo que explica cómo las interacciones que
tienen lugar entre los genes FUL, SHP y RPL generan la formación de la valva, el
replum y el margen de valva en las posiciones adecuadas (Fig. I-14; Roeder et al., 2003;
Dinneny y Yanofsky, 2004). En este modelo, FUL y RPL actúan como represores de la
expresión de los genes SHP en la valva y el replum respectivamente, delimitando de
forma precisa las tres regiones principales de la superficie del ovario. Durante la fase
final de redacción de la presente Memoria, ha sido publicado un trabajo que aporta
importante información a este modelo (Dinneny et al., octubre de 2005; Fig. IV-22). En
él se pone de manifiesto que los genes YABBY3 (YAB3) y FILAMENTOUS FLOWER
(FIL), implicados en el establecimiento de la polaridad de los órganos laterales (Eshed
et al., 2004; Sawa et al., 1999; Siegfried et al., 1999), y JAGGED (JAG), un promotor
del crecimiento tisular (Dinneny et al., 2004; Ohno et al., 2004), dirigen el patrón de
expresión no solapante de FUL y los genes SHP (Fig. IV-22). Además, estos autores
IV- DISCUSIÓN
111
también demuestran que RPL es un regulador negativo de YAB3, FIL y JAG, ya que la
expresión de estos genes se extiende al replum en el mutante rpl. De hecho, las
mutaciones de pérdida de función en cualquiera de estos tres genes rescatan el fenotipo
Rpl, de modo similar a nuestras observaciones en as1 rpl. Por tanto, la regulación
negativa ejercida por RPL sobre los genes SHP se produce de forma indirecta, a través
de la represión de YAB3, FIL y JAG (Dinneny et al., 2005).
Fig. IV-22. Modelo propuesto en Dinneny
et al. (2005), con modificaciones, para
explicar la función de los genes que
intervienen en la regionalización del ovario.
Hemos demostrado que los genes AS1 y AS2 actúan en las valvas y restringen la
expresión de KNAT1 al replum, y que la expansión del dominio de expresión de este
gen KNOX provoca un aumento del tamaño del replum en detrimento de la valva. La
sinergia observada entre las mutaciones as1 y ful, junto con la constatación de la
actividad de KNAT1 como promotor de la expresión de RPL, indican que existe una
relación entre AS1, KNAT1 y los genes implicados en el establecimiento de la identidad
de las distintas estructuras externas del ovario. Puesto que los patrones de expresión de
los genes AS1 y KNAT1 deben establecerse muy temprano en el desarrollo del gineceo,
resulta verosímil que actúen en la especificación de las diferentes regiones del ovario
desde el inicio de su formación, interaccionando con otros genes implicados en el
establecimiento de la identidad de cada zona. En los estadios iniciales del desarrollo del
gineceo, las regiones en las que se expresan genes propios de la diferenciación de
órganos laterales darían lugar a las valvas, mientras que las que mantienen la expresión
de genes meristemáticos se diferenciarían hacia replum. Existen otros indicios de la
relación entre los genes meristemáticos y la regionalización del ovario. El gen WUS,
que controla el mantenimiento del meristemo, también activa la expresión de AG en el
centro del meristemo floral (Lenhard et al., 2001; Lohmann et al., 2001). AG, a su vez,
112
IV- DISCUSIÓN
parece ser capaz de activar la expresión de los genes SHP (Flanagan et al., 1996;
Savidge et al., 1995), con los que guarda una elevada similitud; de hecho, los genes
SHP1 y SHP2 fueron inicialmente denominados AGAMOUS-LIKE1 (AGL1) y AGL5.
Además, se ha demostrado que la proteína RPL es capaz de reprimir la expresión de AG
mediante su unión directa a regiones reguladoras de este gen (Bao et al., 2004).
6- KNAT1 es un gen de identidad de replum.
Se ha demostrado en trabajos recientes que los productos de los genes KNOX son
capaces de interaccionar físicamente con los factores de transcripción de la clase BELL
(Bellaoui et al., 2001; Muller et al., 2001; Smith y Hake, 2003). Concretamente, la
proteína RPL puede interaccionar con STM, KNAT1 y KNAT6, y esta unión es
necesaria para que se produzca su entrada al núcleo (Bhatt et al., 2004; Smith y Hake,
2003). Además, en este trabajo hemos demostrado que KNAT1 es capaz de activar la
expresión de RPL en todos los tejidos del gineceo. Dadas estas relaciones, resultaba
probable que la función que realiza KNAT1 en el replum estuviera mediada por RPL.
Hemos comprobado que, efectivamente, la función de RPL es necesaria para que se
produzca el aumento de tamaño del replum en las plantas as1.
Sin embargo, en las plantas as1 rpl el replum presenta un fenotipo silvestre. Existen
al menos dos explicaciones posibles para este resultado. Por un lado, RPL podría actuar
como regulador negativo de AS1 en el replum (Fig. IV-23A). La pérdida de función de
RPL permitiría un incremento de la expresión de AS1, YAB3, FIL y JAG en el replum, lo
que provocaría su transformación en margen de valva. La ausencia de función de uno
solo de estos genes sería suficiente para que no ocurriera dicha transformación. Por otra
parte, STM podría ser el represor de AS1 en el replum, ya que, como se ha comentado,
se expresa en esta región y además es capaz de ejercer ese papel en el meristemo (Fig.
IV-23B; Long et al., 1996; Byrne et al., 2000). En este contexto, la recuperación del
fenotipo silvestre en el replum as1 rpl podría deberse al incremento de los niveles de
expresión de KNAT1 en el replum; a niveles muy elevados, KNAT1 tendría actividad
represora sobre JAG, FIL y YAB3, o al menos sobre uno de ellos, impidiendo su acción
en el replum (Fig. IV-23B).
En cualquier caso, el patrón de expresión de KNAT1, su capacidad de activar la
transcripción de RPL, y el aumento de tamaño que experimenta el replum ante su
sobreexpresión, sugieren que es un gen de identidad de replum y que actúa en estadios
muy tempranos del desarrollo del gineceo. Nuestros resultados, junto con los de otros
IV- DISCUSIÓN
113
autores (Byrne et al., 2000 y 2002; Dean et al., 2004; Long et al., 1996; Pautot et al.,
2001), indican que los genes KNOX de clase I tienen funciones parcialmente
redundantes en el replum, por lo que es probable que actúen de forma conjunta para
establecer la identidad de esta región.
7- La función de la proteína KNAT1 es inhibida por productos génicos de la
valva.
La expresión ectópica de KNAT1 causa un fenotipo más acusado en ausencia de la
función de FUL, tanto en lo referente al incremento del territorio del replum como a la
disminución de la región correspondiente a la valva. Esto se pone de manifiesto en el
doble mutante as1 ful, que, comparado con el mutante simple ful, presenta una drástica
reducción de la región correspondiente a la valva, mientras que el replum aumenta de
manera notable. Esta sinergia entre las mutaciones as1 y ful sugiere que FUL es capaz
de ejercer una regulación negativa sobre el efecto de KNAT1 en la valva. La función de
RPL no interviene en la pequeña reducción de la valva que ocurre en el mutante as1, ya
que este fenotipo también aparece en el doble mutante as1 rpl, lo que sugiere que RPL
no es capaz de ejercer ningún efecto en la valva, al menos cuando está presente la
función de FUL. Por tanto, ese fenotipo estaría provocado por un efecto de la expresión
ectópica de KNAT1 en la valva no mediado por RPL. Probablemente, la ausencia de
función de FUL permite actuar a RPL en la valva, exacerbando el fenotipo As1, aunque
además también podría permitir una mayor actividad de KNAT1.
FUL no actúa como un represor transcripcional de KNAT1 o RPL, ya que en el
mutante simple as1 la expresión de KNAT1 se extiende casi por toda la valva, y la
expresión de RPL también ocupa la valva en plantas 35S::KNAT1. Por tanto, el efecto
de FUL sobre estos genes parece debido a un fenómeno de supresión fenotípica. El
concepto de supresión fenotípica fue propuesto por González-Reyes y Morata (1990)
tras observar que la expresión generalizada de un gen homeótico en la mosca
Drosophila sólo tiene efecto fenotípico en las regiones corporales anteriores a su
dominio normal de expresión. La falta de efecto en las regiones posteriores puede
explicarse por la inactivación funcional de la proteína debido a los productos de los
genes homeóticos residentes (González-Reyes y Morata, 1990). En el contexto del
gineceo de Arabidopsis, FUL actuaría impidiendo la función en la valva de las proteínas
propias del replum (Fig. IV-23).
114
IV- DISCUSIÓN
Además de FUL, otras funciones génicas deben estar regulando negativamente la
acatividad de KNAT1 y/o RPL en la valva, ya que incluso en los frutos as1 ful sigue
existiendo una región que no se transforma en replum y que retiene propiedades de
valva, ya que se activa en ella la expresión del gen testigo GUS bajo el control del
promotor de FUL. Esa región siempre coincide con la zona más lateral del ovario, es
decir, el centro del territorio correspondiente a la valva, lo que sugiere que los productos
génicos de la valva involucrados en la inhibición de las proteínas propias del replum no
se distribuyen homogéneamente, sino que su actividad es mayor en la zona central de la
valva. Esto permite plantear un modelo en el que las proteínas propias de la valva se
distribuirían formando un gradiente cuya máxima concentración se encontraría en el
centro de la valva, y la mínima concentración en las proximidades del replum. La
expresión ectópica de KNAT1 y RPL no tendría ningún efecto en presencia de niveles
relativamente elevados de productos específicos de la valva, pero sí que sería capaz de
desencadenar la formación de replum en zonas con niveles bajos de dichos productos.
A
B
Fig. IV-23. Dos modelos hipotéticos mostrando las relaciones entre los genes que participan en la
regionalización del ovario. La línea discontinua indica que la regulación es postranscripcional.
La idea de que existe un gradiente en la distribución de las proteínas JAG, FIL y YAB3
en la valva ya ha sido expuesta en Dinneny et al. (2005), donde se sugiere que podrían
actuar como morfógenos, controlando diferentes dianas dependiendo de su
concentración. Concentraciones elevadas de estos genes activarían la expresión de FUL,
mientras que niveles más bajos activarían la transcripción de los genes SHP,
determinando de este modo la posición de la valva y el margen de valva (Dinneny et al.,
2005). Por otra parte, se ha demostrado en trabajos anteriores que FIL y YAB3 tienen
IV- DISCUSIÓN
115
actividad represora sobre genes KNOX en los primordios de los órganos laterales
(Kumaran et al., 2002), lo que señala a estos productos como posibles inhibidores de la
función de KNAT1 en la valva (Fig. IV-23).
En resumen, dos tipos de funciones parecen restringir el tamaño y la posición del
replum en el ovario de las plantas silvestres (Fig. IV-23). En primer lugar, los genes
AS1 y AS2 son represores transcripcionales de KNAT1 en la valva, impidiendo también
de este modo la expresión de RPL en esta región. Adicionalmente, existiría un sistema
que impediría la función de las proteínas KNAT1 y RPL en la valva, pero no su
transcripción. En este sistema estarían implicados FUL y, probablemente, FIL, YAB3 y
JAG. Estos últimos se expresarían formando un gradiente con su mínima concentración
en las proximidades del replum. El tamaño del territorio ocupado por el replum y la
valva se establecería dependiendo de los niveles relativos de funciones propias de cada
región. En ausencia de AS1, la expresión de los genes de identidad de replum se
extiende a la valva, donde entrarían en competencia con los productos propios de esa
zona. Sólo en las posiciones donde éstos se encontrarían a niveles más bajos, es decir,
en las proximidades del replum, se produciría la transformación hacia esta estructura.
8- El margen de valva se desplaza al expresar ectópicamente KNAT1.
Otra cuestión que queda por resolver es el papel de KNAT1 en el margen de valva,
donde ya se está expresando en las plantas silvestres, aunque probablemente a niveles
bajos que no activan la expresión de RPL. En los mutantes as1 o en las plantas
35S::KNAT1, el margen de valva se desplaza hacia una posición más lateral, pero no
desaparece y sigue separando la valva y el replum. Hemos comprobado que la
dehiscencia y el patrón de lignificación no están alterados en esas plantas, y que el gen
SHP2 se expresa de forma aparentemente normal en la nueva posición del margen de
valva.
Una posible explicación para este comportamiento es que el margen de valva se
forma donde confluyen las actividades antagónicas del replum y de la valva,
expresándose los genes propios de ambas regiones a niveles lo suficientemente elevados
como para evitar la diferenciación hacia valva o hacia replum. De esta manera, al
sobreexpresar KNAT1 el equilibrio se desplazaría hacia una zona más lateral del ovario,
donde se formaría el nuevo margen de valva a pesar de la expresión de RPL. Sin
embargo, esto supone un conflicto, ya que para la formación del nuevo margen de valva
sería necesaria la expresión de los genes FIL, YAB3 y JAG en presencia de la proteína
116
IV- DISCUSIÓN
RPL. Posiblemente, en la nueva posición del margen de valva, las proteínas FIL, YAB3
y JAG se encuentran a una concentración lo suficientemente elevada como para
contrarrestar el efecto represor de RPL, que sólo provocaría una disminución de sus
niveles, permitiendo una actividad suficiente para activar a los genes SHP pero
insuficiente para activar a FUL.
9- La relación funcional entre los genes AS1, KNAT1 y RPL en el estilo es
diferente a la que muestran en el replum.
El estilo en los frutos de Arabidopsis es una estructura con simetría radial, que
comunica el estigma con el ovario y facilita el paso del tubo polínico a su interior a
través del tracto transmisor. Las células de la capa más externa se asemejan a las del
replum, con forma cuadrangular, pero presentan estomas intercalados y están
recubiertas de una cutícula de ceras (Sessions y Zambryski, 1995). Se ha descrito en
trabajos anteriores que el gen KNAT1 se expresa en las células corticales del estilo,
situadas inmediatamente por debajo de la epidermis (Venglat et al., 2002). Está
aparentemente implicado en el mantenimiento de la simetría radial del estilo, ya que en
el mutante bp dicha simetría se ve alterada debido a una disminución en la tasa de
elongación y diferenciación de las células de la epidermis y del córtex (Venglat et al.,
2002).
En este trabajo, hemos detectado la expresión de AS1 en la médula del estilo, un
territorio interior al córtex en el que no se expresa KNAT1, por lo que es probable que
las actividades antagónicas entre ambos se mantengan en el estilo. En los frutos as1, el
estilo experimenta un notable aumento de tamaño que se suprime cuando se elimina la
función de KNAT1 en el doble mutante as1 bp, lo que parece indicar que el fenotipo de
la pérdida de función de as1 se debe a la expresión ectópica de KNAT1. Los frutos
as1 bp mantienen el estilo con sección ovalada característico de bp.
Sorprendentemente, los frutos 35S::KNAT1 no presentan el mismo fenotipo que el
mutante as1, como ocurría en la silicua. Este resultado sugiere la existencia de un factor
adicional que interviene en el fenotipo del estilo en el mutante as1, y cuya función, o
ausencia de función, es necesaria junto con la presencia de KNAT1 para provocar el
incremento de tamaño observado. Otra interpretación es que AS1 ejerce otra función en
el estilo además de reprimir a KNAT1, y que es capaz de realizarla pese a la presencia
ectópica de KNAT1, manteniendo el tamaño normal del estilo.
IV- DISCUSIÓN
117
El fenotipo aditivo que muestran las mutaciones pny y bp es coherente con que sus
funciones sean independientes en el estilo. Se ha descrito previamente la expresión de
RPL en el estilo (Roeder et al., 2003), pero no con la suficiente resolución como para
determinar si su patrón de expresión es solapante con el de KNAT1. Un estudio en
profundidad de este punto permitiría especular acerca del papel del gen RPL en el estilo,
aunque la similitud de los fenotipos pny y as1 en esta estructura sugiere que realiza una
función similar a AS1 y, por tanto, opuesta a la que ejerce en el ovario.
10- Implicaciones evolutivas del caracter meristemático del replum.
La aparición de las Angiospermas, o plantas con flores, durante el periodo
Cretácico supuso una revolución en el reino vegetal y provocó cambios radicales en
todos los ecosistemas terrestres, influyendo enormemente en la evolución de los
animales. Los carpelos constituyen la estructura clave que define a las Angiospermas,
término que proviene del griego y significa “semillas en un recipiente”. Su función
básica es almacenar los óvulos, pero a lo largo de la evolución el desarrollo del fruto
trajo consigo nuevos mecanismos que permitían proteger las semillas durante su
desarrollo y facilitar su dispersión.
En 1790, Goethe propuso que los órganos florales eran en realidad hojas
modificadas. Esta hipótesis ha quedado en la actualidad totalmente demostrada al
comprobarse que la expresión ectópica de genes homeóticos florales en las hojas puede
provocar su transformación en órganos florales individuales (Honma y Goto, 2001;
Pelaz et al., 2001). Mediante un enfoque opuesto, nuestro trabajo confirma esta idea al
demostrar que los genes que participan en la diferenciación de las hojas y en la función
del meristemo tienen también un papel en la especificación y la localización de las
diferentes regiones del gineceo.
Pero, ¿cómo se produce, durante la evolución, la fusión de dos hojas para dar lugar
a un ovario bicarpelar como el de Arabidopsis? El replum, que es el equivalente al
margen foliar en los carpelos y la zona por donde se fusionan, presenta características
meristemáticas que son probablemente indispensables para que los carpelos
permanezcan unidos durante su crecimiento; un indicio de ello es la mutación stm-2,
que tiene como resultado la formación de estructuras carpeloides no fusionadas (Byrne
et al., 2002). Por tanto, la adquisición de funciones meristemáticas en el borde de las
hojas tuvo que ser un paso previo a su fusión. Algunas observaciones llevadas a cabo en
Arabidopsis indican que el borde de las hojas vegetativas ya presenta una mayor
118
IV- DISCUSIÓN
totipotencia que el resto del limbo foliar. Por ejemplo, la expresión de KNAT1 en las
hojas de las plantas 35S::KNAT1 provoca la formación de meristemos ectópicos que
siempre aparecen asociados a regiones concretas del margen foliar (Chuck et al., 1996).
Además, en los mutantes as1, en los que se desreprimen genes KNOX en la hoja, el
margen foliar es la zona más alterada y la que presenta mayores niveles de expresión de
dichos genes (Ori et al., 2000). Sin embargo, las características genéticas que confieren
al margen de las hojas una mayor capacidad de expresar genes propios del meristemo,
con las consecuencias que ello conlleva, siguen siendo desconocidas.
11- Nuevas perspectivas.
Pese a los recientes avances en el conocimiento de los mecanismos que participan
en el desarrollo y la diferenciación del fruto, muchos puntos permanecen aún sin
resolver. Nuestro trabajo supone una interesante aportación a la comprensión de este
proceso, al relacionar el desarrollo de las estructuras que componen el gineceo con el
patrón de expresión de genes meristemáticos y genes que promueven la diferenciación.
Sin embargo plantea nuevas cuestiones, como por ejemplo cuál es la relación entre los
genes AS1 y AS2, y los genes JAG, FIL y YAB3. En el futuro también será necesario
comprobar cómo la expresión de los genes del margen de valva, como los SHP, se
relaciona con las señales de funciones meristemáticas; en este sentido ya se ha apuntado
que WUS, a través de AG, podría actuar activando la expresión de estos genes (Flanagan
et al., 1996; Lohmann et al., 2001; Savidge et al., 1995).
Otra aproximación al estudio del desarrollo del fruto es la identificación y
caracterización de los productos génicos que actúan aguas abajo de los factores de
transcripción que ya se conocen, productos que son los verdaderos efectores de la
diferenciación de las distintas estructuras del fruto. La utilización de técnicas de análisis
genómico, como las micromatrices de DNA, permitirá identificar genes cuya expresión
se ve alterada en mutantes como ful o rpl, y que son candidatos a desempeñar dichas
funciones.
Las fitohormonas son una importante fuente de información posicional durante el
desarrollo de la planta. Aunque ya han sido publicados algunos trabajos que relacionan
un gradiente de auxinas en el eje basal-apical del fruto con su correcta diferenciación
(Dinneny y Yanofsky, 2004; Nemhauser et al., 2000), la demostración de que AS1 y
KNAT1 intervienen en el desarrollo del gineceo aporta nuevas perspectivas. Por una
parte, existen publicaciones que ponen de manifiesto el papel de KNAT1 como inhibidor
IV- DISCUSIÓN
119
del transporte de auxinas (Scanlon 2003; Zgurski et al., 2005), y de STM y otros genes
KNOX como represores de la síntesis de giberelinas (Hay et al., 2002; Sakamoto et al.,
2004). Además, los genes KNOX de clase I son capaces de inducir la síntesis de
citoquininas, así como la respuesta a estas hormonas (Jasinski et al., 2005; Yanai et al.,
2005). Por otra parte, se ha comprobado que la distribución asimétrica de la respuesta a
las auxinas en las hojas de los mutantes as1 y as2 precede a los defectos en su
desarrollo, y que el margen foliar es una fuente de estas fitohormonas (Zgurski et al.,
2005). Ante estos resultados, resulta tentador especular acerca del papel de un gradiente
hormonal valva-replum en la especificación de los territorios del ovario. Las auxinas y
las giberelinas estarían promoviendo la diferenciación en este modelo hipotético, dando
lugar a la formación de las valvas, mientras que las citoquininas impulsarían la
formación y el mantenimiento del replum. El estrecho equilibrio entre estas actividades
hormonales podría dictar el tamaño y la posición de cada región en el ovario.
V
Conclusiones
V- CONCLUSIONES
123
CONCLUSIONES
I- La mutación zpl, generada en nuestro laboratorio mediante una mutagénesis con
EMS, afecta a la morfogénesis del gineceo y al desarrollo del fruto tras la fertilización
siguiendo un patrón de herencia monogénico recesivo con penetrancia completa.
II- En el mutante zpl, el gineceo y el fruto son más cortos y anchos que en el
silvestre. Además, los frutos zpl presentan ondulaciones en sus valvas. Estos fenotipos
están provocados presumiblemente por alteraciones en la dirección del crecimiento
celular, así como por la mayor irregularidad en el tamaño de sus células.
III- El mutante zpl muestra frecuentes alteraciones en el patrón filotáctico, y sus
frutos pueden estar compuestos por más de dos valvas. Estos defectos sugieren la
implicación del gen ZPL en la función de los meristemos.
IV- Las interacciones genéticas de la mutación zpl sugieren que la función del gen
en el gineceo es parcialmente independiente de FUL y complementaria a la de CRC.
V- Como resultado colateral de nuestro estudio, hemos comprobado que el gen
CRC se expresa en el meristemo de inflorescencia, lo que sugiere que ejerce una
función en dicha estructura y no está restringido al gineceo como se había descrito
previamente.
VI- La mutación zpl está situada en un estrecho intervalo del cromosoma 5 que sólo
incluye dos genes candidato, At5g16210 y At5g16220.
VII- La estirpe 260-4, procedente de una mutagénesis con EMS sobre el fondo
ful-1, es portadora de la mutación puntual as1-104 en homocigosis. Esta mutación
genera un codón de parada prematuro en el gen AS1, y es responsable de la
modificación del fenotipo Ful en estas plantas.
124
V- CONCLUSIONES
VIII- AS1 es un regulador negativo de la transcripición de KNAT1 en la valva. La
expresión ectópica de KNAT1 en esta región del ovario provoca el incremento del
número de células en el replum y su reducción en la valva, alterando las proporciones de
estas estructuras.
IX- KNAT1 es un activador transcripcional de RPL.
X- FUL, junto con otros productos génicos de la valva, inhibe la actividad de
KNAT1 y RPL en dicha región del ovario, pero no impide su transcripción.
XI- Proponemos un modelo en el que las proporciones del replum y de la valva se
establecen a través del antagonismo entre las funciones génicas propias de cada región.
Los genes KNOX promueven la identidad de replum, reprimiendo directa o
indirectamente la expresión de genes de la valva y activando a RPL. En la valva, AS1 y
AS2 reprimen la transcripción de los genes KNOX, mientras que otros productos
génicos propios de esta región son capaces de inhibir su efecto de forma dependiente de
la concentración.
XII- La sobreexpresión de KNAT1 en el estilo no fenocopia la pérdida de función
de AS1, lo que indica una relación funcional entre estos genes distinta a la que tiene
lugar en el ovario.
VI
Bibliografía
VI- BIBLIOGRAFÍA
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